PL63006B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest spo¬ sób wytwarzania nowego antybiotyku, oznaczonego w dalszym ciagu numerem 13.057 RP.Poniewaz stwierdzono, ze surowemu antybioty¬ kowi 13.057 RP towarzyszy antybiotyk 13.213 RP w dalszej czesci opisu, dla uproszczenia, antybio¬ tyk 13.057 RP zawierajacy antybiotyk 13.213 RP oznaczono numerem 9.865 RP.Antybiotyk 13.057 RP jest szczególnie wazny ze wzgledu na bardzo zdecydowane dzialanie anty- rakowe. Antybiotyk ten odznacza sie ponadto sil¬ nym dzialaniem bakteriobójczym zarówno na dro¬ bnoustroje Gram dodatnie, jak i na Gram ujem¬ ne. Ta wlasciwosc ma tym wieksze znaczenie, ze antybiotyk ten zachowuje silna aktywnosc wo¬ bec drobnoustrojów (a zwlaszcza gronkowców) uodpornionych na zwykle antybiotyki, a nawet na niektóre antybiotyki przeciwrakowe, jak na przyklad aktynomycyna i rufochromomycyna.Ten nowy antybiotyk produkuje sie przez ho¬ dowanie w odpowiednich warunkach jednego z dwóch mikroorganizmów, szczególowo opisanych ponizej, które naleza do rodzaju streptomyces i sa oznaczone jako „Streptomyces 8899" i „Strepto¬ myces 31.723" (NRRL 3046 i NRRL 3045).Antybiotyk 9.865 RP jest dobrze rozpuszczalny w rozpuszczalnikach zawierajacych chlor, jak na przyklad chloroform i dwuchloroetan, wzglednie rozpuszczalny w wódzie zakwaszonej do wartosci pH w granicach miedzy 3 i 4, jest bardzo slabo 10 25 80 rozpuszczalny w alkoholach i praktycznie nieroz¬ puszczalny w wodzie, benzenie i eterze.Antybiotyk 9.865 RP zawiera wegiel, wodór, tlen i azot. Jego sklad podstawowy jest nastepujacy: C—61,0% H—6,2% O—28,15% N—2,65% Charakteryzuje sie nastepujacymi wlasciwoscia¬ mi fizycznymi: wyglad — proszek bezpostaciowy barwy czerwono-pomaranczowej, widmo w ultra* fiolecie (dane uzyskane w 96% roztworze etano- lowym): maksimum absorpcji przy 236 m|x — E 1 ^ lem minimum absorpcji przy 245 mji — E 1* lem maksimum absorpcji przy 255 mix — E J ™ 1 cm minimum absorpcji przy 280 mix— E maksimum absorpcji przy 290 m[i — E 1% 1 cm 1% 1 cm minimum absorpcji przy 325 mix — E } ™ 1 cm maksimum absorpcji przy 495 mix — E przegiecie przy 533 mjx —E 1% 1 cm 1% 1 cm = 425 284 = 308 = 108 = 114 20 = 146 - 80 Widmo to jest przedstawione na fig. 1.Widmo w podczerwieni (dane ze sprasowanej mieszaniny z bromkiem potasu): widmo to jest przedstawione w postaci wykresu na fig. 2, na której na osi rzednych podano z jednej strony 6300663006 dlugosci fal wyrazone w mikronach (podzialka dolna), z drugiej zas strony — czestotliwosc fal na cm-1 (podzialka górna), natomiast na osi od¬ cietych naniesiono % transmisji.W tablicy I podane sa glówne pasma absorpcyj¬ ne widma w podczerwieni dla tego antybiotyku.Tablica I 1 okolo 5450 2925 1715 1615 1580 1445 1410 1377 1350 1282 1260 1230 1205 okolo 1190 1147 F F F F F F tF F F tF P.F tF P.P- 1113 1080 1067 1030 1005 990 okolo 945 917 873 840 815 793 764 okolo 690 F 1 F F F tF tF P. m m m 1 m m m m tF — bardzo silna F "— silna m — srednia p. — przegiecie Antybiotyk 9.865 RP mozna zidentyfikowac za pomoca chromatografii bibulowej. Antybiotyk chromatografuje sie na papierze Arches nr 302, nasyconym roztworem buforowym fosforanu przy wartosci pH = 4,8, w ukladzie n-butanolu nasyco¬ nego woda przy zastosowaniu techniki splywowej.Chromatogram wywoluje sie za pomoca bioauto- grafii na plytce pozywki obsianej bakteriami Ba- cillus subtilis lub Klebsiella penumoniae. Chro¬ matogram ten wykazuje, ze antybiotyk 9.865 RP zawiera substancje czynne, oznaczone 13.057 RP i 13.213 RP, których Rf wynosi odpowiednio 0,3 i 0,7.Antybiotyk 13.057 RP moze wystepowac w po¬ staci zasady lub soli.Zasadowy antybiotyk 13.057 RP jest rozpuszczal¬ ny w alkoholach i w chloroformie, bardzo slabo rozpuszczalny w wodzie i ketonach, praktycznie nierozpuszczalny w benzenie i eterze.Zasadowy antybiotyk 13.057 RP zawiera wegiel, wodór, tlen i azot. Jego sklad elementarny jest nastepujacy: C—59,8% H—5,85% N—2,3% O—29,45% Cechy fizyczne tej substancji sa nastepujace: wyglad — czerwony proszek bezpostaciowy temperatura topnienia 155—170°C (rozpad) widmo w ultrafiolecie (w 96% roztworze etanolo- wym): maksimum absorpcji przy 236 mu — E1^ 1 cm minimum absorpcji przy 245 mu— E 1% 1 cm maksimum absorpcji przy 255 mu — E * % 1 cm minimum absorpcji przy 280 mu — E 1 % 1 cm 378 = 426 = 122 maksimum absorpcji przy 290—295 mu —E \ Jm 1 % minimum absorpcji przy 325 mu —E. maksimum absorpcji przy 482—498 mu —E 1% 1 cm przegiecie przy 533 35 50 55 — E 1% 1 cm = 135 = 10 = 230 = 127 15 20 25 Widmo to jest przedstawione na fig. 3.Widmo w podczerwieni (ze sprasowanej miesza¬ niny z bromkiem potasu): widmo to jest przed¬ stawione na fig. 4, na której podzialki sa iden¬ tyczne jak na fig. 2.W tablicy II podane sa glówne pasma absorpcji infraczerwonej dla tego antybiotyku.Tablica II okolo 3450 tF 2925 F 1715 m 1615 F 1582 F 1447 F 1410 F 1380 F 1355 F 1282 F 1262 p. 1230 F 1205 F okolo 1190 p. 1150 p. 1117 F 1 1090 m 1080 m 1068 m 1033 m 1010 F 983 F 950 f 918 f 867 f 1 okolo 840 f 815 m 790 m 762 m tF — bardzo silna F — silna m — srednia i — slaba p. — przegiecie Antybiotyk 13.057 RP w postaci soli kwasu sol¬ nego rozpuszcza sie w wodzie i alkoholach, slabo w chloroformie i praktycznie nie rozpuszcza sie w benzenie i eterze.Sklad chlorku antybiotyku 13.057 RP jest na¬ stepujacy: C—55,4% H—5,45% O—28,8% N—2,3% Cl—6,15% Jego wlasciwosci fizyczne sa nastepujace: wyglad — igielki barwy czerwono-pomaranczowej temperatura topnienia 225—230°C (rozpad) skrecalnosc (a) 20 = + 240° (c = 1,0, metanol) widmo w ultrafiolecie (w 96% roztworze etano- lowym): maksimum absorpcji przy 236 mu — E 1% minimum absorpcji przy 245 mu — E t 1 cm 1% cm 1% = 594 = 360 = 621 maksimum absorpcji przy 255 raji-E. = 410 60 65 1 % minimum absorpcji przy 280 mu — E ^ maksimum absorpcji przy 290—295 mu — E 1% 1 cm minimum absorpcji przy 325 mu — E } °'° r 1 cm = 118 = 129 = 1063006 1 % =218 5 maksimum absorpcji' przy 482—498ni|x —E i _ n 1 cm 1 % przegiecie przy 533 mu —E l cm = 120 Widmo to jest przedstawione w postaci wykresu na fig. 5.Widmo w podczerwieni (oznaczenie wykonane na pastylkach w mieszaninie z bromkiem potasu): widmo to jest przedstawione na wykresie na fig. 6, na której podzialki sa takie same jak na fig. 2 i 4.W tablicy III podane sa pasma absorpcyjne w podczerwieni dla tego produktu.Tablica III okolo 3450 tF okolo 2925 F 1707 F 1610 tF 1575 tF 1439 tF 1 1408 tF 1 1370 F 1350 F 1282 tF 1260 p. 1228 F 1205 tF | okolo 1190 p. okolo 1145 p. 1112 tF 1080 F 1064 F 1028 F 1000 tF 982 tF 950 m 935 m 912 m 882 m 867 F 838 F 813 F - 788 F 762 F okolo 692 m tF — bardzo silne F — silne m — srednie p. — przegiecie Antybiotyk 13.213 RP jest dobrze rozpuszczalny w rozpuszczalnikach zawierajacych chlor, jak na przyklad chloroform i w dwumetyloformamidzie, wzglednie jest rozpuszczalny w wodzie zakwaszo¬ nej do wartosci pH 3—4, bardzo slabo rozpusz¬ czalny w alkoholach i praktycznie nierozpuszczal¬ ny w wodzie, benzenie i eterze.Skladnik 13.213 RP zawiera wegiel, wodór, tlen i azot. Jego elementarny sklad jest nastepujacy: C — 58,6% H — 6,2% N — 2,2% Skladnik ten posiada nastepujace cechy fizycz¬ ne: wyglad — proszek bezpostaciowy czerwono- -pomaranczowy widmo w ultrafiolecie (w 96% roz¬ tworze etanolowym): E maksimum absorpcji przy 236 ... minimum absorpcji przy 245 ... maksimum absorpcji przy 255 minimum absorpcji przy 280 maksimum absorpcji przy 290—295 minimum absorpcji przy 325 maksimum absorpcji przy 480—495 E przegiecie przy 533 E E E E 1% 1 cm 1% 1 cm 1% 1 cm 1% 1 cm 1% lem 1% 1 cm 1% 1 cm 1% 1 cm = 425 = 274 = 297 = 103 = 108 = 20 = 155 = 90 20 50 60 65 Widmo to jest przedstawione na wykresie na fig. 7. Widmo w podczerwieni (oznaczenie wyko¬ nano na pastylkach w mieszaninie z bromkiem potasu): widmo to jest przedstawione na wykre¬ sie na fig. 8, na której podzialki sa takie same jak na fig. 2, 4 i 6.W tablicy IV podane sa glówne pasma absorp¬ cji w podczerwieni dla tego antybiotyku.Tablica IV 1 okolo 3450 F okolo 2925 m 1715 m 1615 F 1583 F okolo 1445 F 1412 F 1377 F 1352 F 1282 F 1262 F 1230 F 1 1205 F okolo okolo okolo okolo okolo okolo 1190 1180 1117 1080 1032 1008 995 837 812 796 765 690 p. 1 P. tF F F F F m F F m m tF — bardzo silne F — silne m — srednie p. — przegiecie 30 Kwasowa hydroliza antybiotyku 9.685 RP po¬ woduje jego rozpad na aminocukry i na zabar¬ wiona grupe chromoforowa, która stanowi agli- kon. Aglikon jest rozpuszczalny w alkoholach, octanie etylowym i chloroformie, slabo rozpusz- 35 czalny w benzenie i eterze i nierozpuszczalny w wodzie.Ma on nastepujacy sklad elementarny: C — 63,4% H — 5,7% O — 30,4% N — ponizej 0,2% Jego cechy fizyczne sa nastepujace: wyglad — igielki czerwono-pomaranczowe temperatura topnienia 160°C, pózniej 225—230°C widmo w ultrafiolecie (w 96% roztworze etanolor wym): 45 maksimum absorpcji przy 236 m^— E minimum absorpcji przy 245 m\i — E maksimum absorpcji przy 255 m\i — E minimum absorpcji przy 280 m\i — E maksimum absorpcji przy 290—295mu — E minimum absorpcji przy 325 m\i — E maksimum absorpcji przy' 470—495m\i — E przegiecie przy 533 m\\ — E % cm % cm % cm % cm % cm % cm % cm % cm = 835 = 510 = 570 = 149 = 167 =.blisko 0 = 272 = 145 Widmo to jest przedstawione w .postaci wykre¬ su na fig. 9.Widmo w podczerwieni (oznaczenie wykonano na pastylkach w mieszaninie z bromkiem potasu): widmo to przedstawione jest na fig. 10, na której podzialki sa identyczne, jak na fig. 2, 4, 6 i 8.03006 7 8 Aglikon w antybiotyku 9.865 RP mozna ziden¬ tyfikowac za pomoca kolistej chromatografii bi¬ bulowej. Wykonuje sie ja na papierze Arches nr 302, nasyconym roztworem acetonu, zawierajacym 5 20% formamidu za pomoca mieszaniny chlorofor¬ mu i benzenu (2:1) nasyconej formamidem. W ten sposób udalo sie wykazac obecnosc tylko jed¬ nej substancji posiadajacej wspólczynnik Rf — — 0,86. 10 Dzialanie bakteriostatyczne antybiotyku 9.865 RP wobec pewnej liczby drobnoustrojów zostalo stwierdzone za pomoca jednej z powszechnie sto¬ sowanych w tej dziedzinie metod rozciencza- 15 nia.Dla kazdego drobnoustroju ustalono minimalne stezenie substancji, które w okreslonych warun¬ kach zahamowuje wszelki widoczny rozwój naod- 20 nosnej pozywce. Wyniki róznych badan sa poda¬ ne w tablicy VI, na której minimalne stezenia bakteriostatyczne sa wyrazone w mikrogramach substancji na cm8 badanego srodowiska.Tablica VI Widma przeciwbakteryjne Badany mikroorganizm Staphylococcus aureus szczep 209 P-ATCC 6538P „ „ szczep Oxford-ATCC 9144 „ „ szczep 133 (Instytut Pasteura) „ „ szczep B8 (odporny na strepto¬ mycyne i penicyline) „ „ szczep Hb (odporny na tetracy- kline i penicyline) „ „ szczep Launoy I (odporny na te- tracykline, streptomycyne, na chlo¬ ramfenikol i na penicyline) „ „ szczep Launoy 2 (odporny na te- tracykline, streptomycyne i na penicyline) „ „ szczep Beaujon 3 (odporny na te- tracykline, streptomycyne, na chlo¬ ramfenikol i na penicyline) „ „ szczep 2700 R — odporny na streptotryeine " " szczep 1142 R — odporny na kongocydyne " • * szczep 3486 R — odporny na spiramycyne 99 " szczep odporny na karbomycyne " " szczep odporny na erytromycyne ¦ M " ' szczep odporny na chloramfenikol 99 " szczep odporny na nowobiocyne | 9.865 RP Minimalne stezenie bakterio¬ statyczne mcg/cm* 0,20 0,26 0,14 0,35 0,32 0,21 0,17 0,16 0,21 0,17 0,21 0,23 0,11 0,08 0,12 | 13.057 RP Minimalne stezenie bakterio¬ statyczne mcg/cml 4,3 4,2 4,2 5,2 5,3 7,1 4,8 4,4 4,7 2,1 5,2 5,3 3,8 4,1 3,9 13.213 RP Minimalne stezenie bakterio¬ statyczne mcg/cm* 0,14 1 0,15 0,083 0,20 0,17 0,091 0,091 0,068 0,10 0,10 0,091 0,12 0,055 0,045 0,075 1 W tablicy V podane sa glówne pasma absorp¬ cyjne w podczerwieni dla tego produktu.Tablica V okolo 3430 okolo 2910 1707 1610 1575 1440 1415 1375 1350 1275 1228 1210 1185 F F F tF tF tF tF tF F tF tF tF P. 1150 m 1117 F okolo 1083 F 1065 F 1032 F 988 tF 941 m 918 m 858 m 835 F 808 F 790 F 762 F 737 m 718 m 695 F | tF — bardzo silne F — silne m — srednie p. — przegiecie63006 10 dalszy ciag tablicy VI Staphylococcus aureus szczep odporny na streptogramine " " szczep odporny na aktinomycyne " " szczep 662 R (odporny na rufo- chromomycyne) Micrococcus citreus — ATCC 8,411 99 lysodeikticus Gaffkya tetrageba (Fac. Phie) Sarcina lutea — ATCC 9.341 alba (Fac. Phie) Streptococcus faecalis (Enterocoaue de Thiercelin, Fac.Phie) Streptococcus faecalis — ATCC 9.790 " viridans (Instytut Pasteura) " pyogenes hemolyticus (szczep Dig 7, Insty¬ tut Pasteur'a) Diplococcus pneumoniae (szczep Til. Instytut Pasteur'a) Neisseria catarrhalis (Fac. Phie) f Corynebacterium pseudodiphtericum (Fac. Phie) Lactobacillus casei — ATCC 7469 Bacillus subtilis — ATCC 6633 99 " szczep ZO 5 A, Fac. Phie szczep 3 R 9575, Merck — ATCC 9524 Bacillus cereus — ATCC 6630 brevis — ATCC 8185 Bacillus mycoides megatherium (NRRL B 1125) polymyxa (NCTC 4747) Mycobacterium smegmatis — ATCC 607 99 phlei — Instytut bakteriologiczny w Lyo¬ nie 99 para-smegmatis (A 75 — Lozanna) Escherichia coli — ATCC 9637 Shigella dysenteriae — Shiga L — Instytut Faste- ur'a Salmonella typhimurium (Instytut Pasteura) 99 paratyphi A (Lacasse, Instytut Pasteur'a) 99 schottmuelleri (paratyphi B) Fougenc Insty¬ tut Pasteur'a) Bacillus lactis aerogenes (Fac. Phie) Aerobacter aerogenes — ATCC 8308 Alcaligenes faecalis — ATCC 8749 Proteus vulgaris (Fac. Phie) " X 19 Klebsiella pneumoniae — ATCC 10.031 Serratia marcescens (A. 476, Lozanna) Pseudomonas aeruginosa (sche Bass — Instytut Pasteur'a) Brucella bronchiseptica (CN 387 — Wellcomme Instytut) Pasteurella multocida (A. 125 — Instytut Pasteur'a) 0,16 0,19 0,29 0,71 0,21 0,44 0,15 0,38 1,2 2,1 0,11 0,075 0,31 0,026 0,035 0,12 0,12 0,12 0,24 0,14 0,14 0,25 0,70 0,13 0,041 0,069 4,3 16 31 3,9 16 1,9 7,8 0,18 16 3,9 1 7,8 16 0,24 1.9 5,8 6,3 4,2 2,5 6,7 1,2 3,3 19 30 43 1,6 0,89 2,2 1,7 1,2 1,2 1,5 1,8 2,2 1,4 1,8 1,3 4,4 1,2 5 2,2 500 2000 1000 16 1000 120 1000 1.8 2000 62 8,9 120 1000 62 1,8 0,076 0,10 0.16 0,19 0,068 0,23 0,088 0,18 0,55 1 2,1 0,17 0,05 0,12 0,017 0,017 0,058 0,044 0,052 | 0,084 0,083 0,049 0,15 0,83 0.21 0,035 0,09 5,1 13 13 13 6,3 0,065 25 8,1 0,88 6,3 12 6,3 0,07 Te rózne wyniki wykazuja, ze dzialanie bakte- riostatyczne antybiotyku 9.865 RP obejmuje licz¬ ne bakterie wsród których znajduja sie szczepy uodpornione na jeden lub kilka sposród nastepu¬ jacych antybiotyków: penicylina, tetracyklina, streptomycyna, streptotrycyna, neomycyna, kongo- cydyna, erytromycyna, karbomycyna, spiramycy- na, streptogramina, chloramphenikol, nowobiocyna oraz nastepujace antybiotyki przeciwrakowe: akti- nomycyna i rufochromomycyna.Dzialanie przeciwrakowe antybiotyku 9.865 RP zo¬ stalo wykazane laboratoryjnie, przy czym antybio- 65 60 65 tyk ten wykazal szczególna aktywnosc wobec no¬ wotworów przeszczepialnych u myszy, jak na przy¬ klad ascite Ehrlicha, sarkoma 180, sarkoma ben- zopyrenowa oraz bialaczka limfoblastyczna AKR.Toksycznosc antybiotyku 13.057 RP badano glów¬ nie u myszy. Jego dawka smiertelna 50% (lub DL50) zostala wyznaczona w drodze zastrzyku pod¬ skórnego: DL50 — 47 mg/kg (podskórnie).Wyznaczono równiez dawke smiertelna 50% (lub DL60) (jeden zastrzyk raz dziennie w ciagu 5 dni) w drodze zastrzyków dozylnych lub podskórnych:11 63006 12 DLM — 8,75 mg/kg (dozylnie), DL50 — 13,65 mg/kg (podskórnie).Organizmy wytwarzajace antybiotyk 9.865 RP naleza do rodzaju Streptomyces i zostaly ozna¬ czone nazwami Streptomyces 8899 i Streptomy¬ ces 31.723. Zostaly one zdeponowane w Northern Regional Research Laboratory, Peoria, III., Stany Zjednoczone Ameryki, pod numerami: NRRL 3046 i NRRL 3045.Mikroorganizmy te zostaly wyodrebnione z grun¬ tów pobranych w dwóch róznych rejonach Algierii.Metoda izolacji jest nastepujaca: Próbke gruntu umieszcza sie w postaci zawie¬ siny w wysterylizowanej wodzie destylowanej, po¬ tem zawiesine te rozciencza sie do róznych stop¬ ni koncentracji. Drobna ilosc kazdego roztworu umieszcza sie w naczyniach PetrTego zawieraja¬ cych pozywke agarowa.Po kilkudniowej inkubacji w temperaturze 26° przeszczepia sie mikroorganizmy, które moga byc wyizolowane na podloze z agarem umieszczonym ukosnie w celu otrzymania wiekszej objetosci ho¬ dowli.Studiujac nowoczesna literature klasyfikacyjna dotyczaca identyfikacji promieniowców (S. A. Wak- sman, „The Actinomycetes", The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, cz. II — „Ber- gey's Manual of Determinative Bacteriology", 7 wydanie, The Williams and Wilkins Company, Baltimore 1957 — L. Ettlinger i inni, Archiv fur Mikrobiologie 31, 326 (1958), nie spotykamy opisu gatunku, którego cechy hodowlane pokrywalyby sie z cechami Streptomyces 8899 i 31.723.Jednakze w opracowaniu G. F. Gause i inni „Zur Klassifizierung der Actinomycetes", VEB Gustaw Fisher Verlag, Iena, 1958, omówiony jest gatunek Streptomyces coeruleorubidus, którego opis dosc dokladnie przypomina wlasciwosci ni¬ niejszych szczepów. Aczkolwiek wedlug S. A. Wak- sman'a, „The Actinomycetes", The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961, cz. Ii, str. 323— —326, opis ten nie jest szczególowy, mozna jednak znalezc podobienstwo Streptomyces 8899 i Strep¬ tomyces 31.723 z gatunkiem Streptomyces coerule¬ orubidus i zarejestrowac odpowiednio pod nazwa Streptomyces coeruleorubidus — szczep 8899 i pod nazwa Streptomyces coeruleorubidus — szczep 31.723. Aby to zagadnienie dokladnie sprecyzowac, podano ponizej szczególowe cechy obu szczepów Streptomyces 8899 i Streptomyces 31.723, podajac równolegle cechy Streptomyces coeruleorubidus w sposób opisany przez G. F. Gause i wspólpracow¬ ników.Sporulacja Streptomyces 8899 i 31.723 jest trud¬ na do zaobserwowania ze wzgledu na jej zlozo¬ nosc, Mozna ja obserwowac albo na podlozach „syntetycznych?, jakie na przyklad opisuje Grun- dy, Antib. & Chemoth 1, 309 (1951), albo na pod¬ lozach zlozonych, jakim jest podloze Benetta (K.L. Jones, J. Bacteriol, 57, 142 (1949).Hodowle obserwowane pod mikroskopem wy¬ kazuja tworzenie sie nitek rozgalezionych i lan¬ cuchów spor, charakterystycznych dla gatunku Streptomyces. Nitki sporonosne, przedstawiajace najwyzszy stopien rozwoju posiadaja postac spi¬ ral wielozwojowych o zwojach zwartych. Mozna czesto naliczyc ponad 5 zwojów. Spory sa owalne i od wielkosci okolo 0,6—0,9 do 0,8—1,2^.Powiazanie nitek sporonosnych jest niekiedy jed- noskretne, najczesciej jednak dwuskretne. Te 5 strukture mozna zaobserwowac pod mikroskopem jedynie wtedy, kiedy nitki ukladaja sie w spirale o jednym lub dwóch zwojach, albo ograniczaja sie do jednej petli, inaczej natomiast zbytnia rozbu¬ dowa spiral maskuje ich powiazanie i przeszkadza 10 w obserwacji struktury wewnetrznej.Biorac pod uwage cechy morfologiczne, które stanowia najbardziej pelne stadium organizacyj¬ ne, mozna stwierdzic ze typ ustroju sporonosne- go Streptomyces 8899 i 31.723 odpowiada typowi 15 Biverticillus spira, opisanemu w klasyfikacji T.G. Pridhan^a Applied Microbiology, 6, 52 (1958).Wiedzac, jak to podano ponizej, ze grzybnia po¬ wietrzna dobrze rozwinietych hodowli jest jasno¬ niebieska i nawiazujac do powyzszej klasyfika- 201 cji seryjnej, Streptomyces 8899 i 31.723 zalicza sie do serii niebieskiej Biverticillus spira, w któ¬ rej nie figuruje zaden opisany gatunek, podczas gdy Streptomyces coeruleorubidus figuruje w se¬ rii niebieskiej Spira tejze klasyfikacji. 25 W tak zwanych srodowiskach „syntetycznych" Streptomyces 8899 i 31.723 wytwarzaja na ogól grzybnie wegetatywna, której barwa na poczatku hodowli jest najczesciej rózowa lub rózowo-po- maranczowa, a w miare postepu inkubacji barwa 30 staje sie bardziej intensywna przybierajac w kon¬ cu odcien zywej czerwieni. W srodowiskach „orga¬ nicznych" grzybnia wegetatywna jest brazowo- *-zólta lub brazowo-czerwona. Grzybnia powietrzna przy obu rodzajach srodowiska jest na ogól do- 85 brze rozwinieta.Na poczatku swego rozwoju jest ona biala, po¬ tem zabarwia sie bardzo szybko na kolor jasno¬ niebieski, okreslony nizej terminem niebiesko- turkusowym. W zaleznosci od stopnia rozwoju 40 lub charakteru srodowiska natezenie zabarwienia moze ulegac drobnym zmianom lub barwa moze byc lekko przyciemniona. Mozna zaobserwowac tworzenie sie pigmentów rozpuszczalnych o bar¬ wie czysto czerwonej lub czerwono-pomaranczo- 45 wej o zmiennej intensywnosci w zaleznosci od wie¬ ku hodowli w srodowiskach „syntetycznych" oraz o przyciemnionej barwie czerwonej (brazowo-czer¬ wona, brazowo-rózowa) w srodowiskach „organicz¬ nych". 50 W srodowisku Williams i Mc Coy'a daje sie zauwazyc obfite tworzenie sie charakterystycznego czarnego pigmentu melaminowego.Cechy hodowlane i wlasciwosci biochemiczne Streptomyces 8899 i 31.723 zostaly okreslone przy g5 zastosowaniu pozywek agarowych lub plynnych, jakich sie zwykle uzywa do identyfikacji szcze¬ pów Streptomyces. Wyniki obserwacji sa szcze¬ gólowo podane ponizej na tablicy VII i dotycza one hodowli przechowywanych okolo miesiaca w temperaturze 26°. Podano tam stan koncowy hodowli, poniewaz ewolucja zabarwienia zostala podana w rozdziale zatytulowanym „Cechy ogól¬ ne". Bibliografia oraz sklad srodowisk sa podane ponizej. Do tablicy dolaczony jest opis Strepto¬ myces coeruleorubidus wedlug G. F. Gause, do- 65 stosowujac w miare moznosci srodowiska hodo¬ wlane o zblizonym skladzie.63006 13 14 TablicaVII Srodowisko hodowlane Agar Czapek (z sacharoza) (ref. 1 srodowisko Nr 1) Agar Czapek (z glukoza) (ref. 1—A) Agar z jablczanem wapniowym (ref. 2) Agar z tyrozyna (ref. 3) Agar ze skrobia (ref. 1 srodowisko Nr 10) Streptomyces 8899 Grzybnia wegetatywna: skapa, gladka, rózowa, prze¬ chodzaca w zywo czerwona Grzybnia napowietrzna: niebiesko-turkusowa Pigment rozpuszczalny: jasnoczerwony Grzybnia wegetatywna: skapa, sfaldowana, popekana, rózowa, przechodzaca w ró- zowo-pomaranczowa Grzybnia napowietrzna: niebiesko-turkusowa Pigment rozpuszczalny: czerwono-pomaranczowy Grzybnia wegetatywna: skapa, gladka, przechodzaca w bladorózowa Grzybnia napowietrzna: niebiesko-turkusowa Pigment rozpuszczalny: bladorózowy Uwaga: calkowite uplynnie¬ nie jablczanu w ciagu 1 mies.Grzybnia wegetatywna: skapa, pofaldowana, brazo- wo-czarna Grzybnia napowietrzna: slady, szarawo-biala Pigment rozpuszczalny: ciemnobrazowy Uwaga: nie uplynnia tyrozyny Grzybnia wegetatywna: gesta, lekko pofaldowana, czerw.-zóltawa przechodzaca . w plowo-rózowa Grzybnia napowietrzna: niebiesko-turkusowa Pigment rozpuszczalny: pomaranczowo-czerw.Streptomyces 31.723 Grzybnia wegetatywna: skapa, porysowana, rózowo- zóltawa, przechodzaca w sre- dnio-czerwona Grzybnia napowietrzna: niebiesko-turkusowa Pigment rozpuszczalny: srednio-czerwony Grzybnia wegetatywna: skapa, porysowana, rózowo- zóltawa, przechodzaca w sre- dnio-czerwona Grzybnia napowietrzna: niebiesko-turkusowa Pigment rozpuszczalny: srednio-czerwony Grzybnia wegetatywna: skapa, gladka, przechodzaca w bladoplowa Grzybnia napowietrzna: bardzo slabo rozwinieta, biala do niebiesko-turkusowej Pigment rozpuszczalny: rózowo-plowy Uwaga: calkowite uplynnie¬ nie jablczanu w ciagu 1 mies.Grzybnia wegetatywna: dosc gesta, pofaldowana, bar¬ dzo ciemnobrazowa Grzybnia napowietrzna: ' brak Pigment rozpuszczalny: ciemnobrazowy Uwaga: nie uplynnia tyrozyny Grzybnia wegetatywna: gesta, delikatna, pofaldowana, przechodzaca w matowo- czerw.Grzybnia napowietrzna: niebiesko-turkusowa | Pigment rozpuszczalny: pomaranczowo-czerw.Streptomyces Coeruleorubidus Srodowisko wegetatywne Nr 1 Grzybnia wegetatywna: czerwono-poziomkowa do sza- | ro-brazowej Grzybnia napowietrzna: niebieskawa Pigment rozpuszczalny: czerwono-poziomkowy do sza- ro-brazowego Grzybnia wegetatywna: bezbarwna lub rózowa Grzybnia napowietrzna: niebieskawo-frialawa Pigment rozpuszczalny: brak Nie hydrolizuje lub slabo hy- drolizuje skrobia63006 15 16 dalszy ciag tablicy VII Agar glukozowy (ref. 1 srodowisko Nr 7 Agar asparaginowo- glicerynowy (ref. 1 srodowisko Nr 3) 1 Agar Benetta (ref. 4) Agaz ze skrobia i fo¬ sforanem 1 amonowym |(ref. 5) Agar z maltoza i tryptonem (ref. 6) Zelatyna (ref. 7) Grzybnia wegetatywna: delikatnie pofaldowana, zlob¬ kowana, przechodzaca w ja- snozólto-brazowa Grzybnia napowietrzna: slabo rozwinieta, biala do turkusowo-nieb.Pigmen L rozpuszczalny: zólto-brazówy do jasnorózo- wo-brazowego Grzybnia wegetatywna: skapa, lekko pofaldowana, przechodzaca od blado-poma- ranczowo-rózowej do poma- ranczowo-rózowej Grzybnia napowietrzna: turkusowo-niebieska Pigment rozpuszczalny: | blady pomaranczowo-rózowy Grzybnia wegetatywna: dosc gesta, delikatnie pofal¬ dowana, jasnoczerwono-bra- zowa, przechodzaca w ciem¬ nobrazowa Grzybnia napowietrzna: turkusowo-niebieska Pigment rozpuszczalny: czerwono-brazowy Grzybnia wegetatywna: skapa, gladka, przechodzaca w blado-zóltawa do niebie¬ skawej Grzybnia napowietrzna: bardzo dobrze rozwinieta, tur¬ kusowo-niebieska Pigment rozpuszczalny: brak Grzybnia wegetatywna: bardzo gesta, sfaldowana, spe¬ kana, przechodzaca w czarno -brazowa Grzybnia napowietrzna: bardzo dobrze rozwinieta, tur¬ kusowo-niebieska do szaro- niebieskiej Pigment rozpuszczalny: pigment melaninowy, inten¬ sywny brazowo-czarny, cha¬ rakterystyczny Grzybnia wegetatywna: skapa pokrywa, przechodzaca w zóltawa Grzybnia napowietrzna: slabo rozwinieta, pozostaje biala Pigment rozpuszczalny: sredniobrazowy Uwaga: opóznione i niepelne uplynnienie zelaty¬ ny | Grzybnia wegetatywna: skapa i bardzo delikatnie fal¬ dowana, czerwono-zóltawa, potem rózowawo-brazowa Grzybnia napowietrzna: slady, biala Pigment rozpuszczalny: jasnozóltawo-brazowy Grzybnia wegetatywna: dosc gesta i pofaldowana, ja- snorózowa, przechodzaca w pomaranczowo-czerwona Grzybnia napowietrzna: turkusowo-niebieska Pigment rozpuszczalny: blady, pomaranczowo-rózowy Grzybnia wegetatywna: skapa i bardzo delikatnie po¬ faldowana, czerwono-krewet- kowa, przechodzaca w czer- wonawo-brazowa Grzybnia napowietrzna: turkusowo-niebieska Pigment rozpuszczalny: slaby, rózowo-brazowy Grzybnia wegetatywna: skapa, gladka, bezbarwna, przechodzaca w lekko-rózowa Grzybnia napowietrzna: bardzo dobrze rozwinieta, turkusowo-niebieska Pigment rozpuszczalny: brak Grzybnia wegetatywna: gesta, sfaldowana, spekana, przechodzaca w czarno-brazo- wa Grzybnia napowietrzna: bardzo dobrze rozwinieta tur¬ kusowo-niebieska do szaro- niebieskiej Pigment rozpuszczalny: pigment melaninowy, inten¬ sywny, brazowo-czarny, cha¬ rakterystyczny Grzybnia wegetatywna: fragmentaryczna pokrywa przechodzaca w zóltawo-rózo- wa Grzybnia napowietrzna: slabo rozwinieta, biala Pigment rozpuszczalny: zólto-brazowy, niezbyt obfity Uwaga: opóznione i niepelne uplynnienie zelatyny Srodowisko organiczne Nr 2 Gause i wspólpracownicy Grzybnia wegetatywna: rózowawo-brazowa Grzybnia napowietrzna: obfita, bialawa Pigment rozpuszczalny: rózowawo-brazowy Grzybnia wegetatywna: ciemnozólta lub szaro-brazowa Pigment rozpuszczalny: szaro-brazowy Uwaga: opóznione i niepelne uplynnienie zelatyn^17 dalszy ciag tablicy VII 08006 18 Ziemniak (ref. 1 srodowisko Nr 27) Mleko odcia¬ gane (ref. 8) Roztwór skrobi (ref. 1- srodowisko Nr 19) „Syntetyczny" roztwór azota¬ nowy (ref. 7) Morfologia mikroskopowa (srodowisko: ref. 4 i 5) Grzybnia wegetatywna: gesta, delikatnie sfaldowana, jasna brazowo-zólta, potem rózowawo-brazowa Grzybnia napowietrzna: turkusowo-niebieska Pigment rozpuszczalny: ciemny, czerwono-brazowy Grzybnia wegetatywna: obraczka gesta, ciemna, zólta- wo-brazowa Grzybnia napowietrzna: slady, biala Pigment rozpuszczalny: brazowy Uwagi: nie ma koagulacji ani peptonizacji, rozwój pH bardzo slaby od 6,3—6,5 do 6,0—6,3 Grzybnia wegetatywna: skapa pokrywa, zywo czer¬ wona Grzybnia napowietrzna: slabo rozwinieta, biala do tur- kusowo-niebieskiej Pigment rozpuszczalny: pomaranczowo-czerwony Uwagi: calkowita hydroliza skrobi w ciagu mie¬ siaca Grzybnia wegetatywna: slabo rozwinieta, skapa po¬ krywa, bezbarwna Grzybnia napowietrzna: brak Pigment rozpuszczalny: brak Uwaga: nie redukuje azoty¬ nów Wlókna sporonosne w postaci spirali ulozonych zgodnie ze struktura skretów wewnetrz¬ nych.Grzybnia wegetatywna: gesta i sfaldowana, pomaran- czowo-czerwona do czerwona- wo-brazowej Grzybnia napowietrzna: 1 turkusowo-niebieska Pigment rozpuszczalny: ciemny, czerwono-brazowy Grzybnia wegetatywna: skapa obraczka, rózowo-zólta- wa do rózowawo-brazowej Grzybnia napowietrzna: slady, biala Pigment rozpuszczalny: brazowy Uwagi: nie ma koagulacji ani peptonizacji, rozwój pH bardzo slaby od 6,3—6,5 do 6,0—6,3 Grzybnia wegetatywna: skapa pokrywa, zywo czerwo¬ na Grzybnia napowietrzna: slady, biala Pigment rozpuszczalny: pomaranczowo-czerwony Uwagi: calkowita hydroliza skrobi w ciagu mie¬ siaca Grzybnia wegetatywna: kilka izolowanych kolonii, zól¬ tawe Grzybnia napowietrzna: brak Pigment rozpuszczalny: brak Uwaga: nie redukuje azoty¬ nów Jak Streptomyces 8899 Spory owalne, krótkie Grzybnia wegetatywna: blyszczaca bezbarwna, zólta¬ wa lub ciemnorózowa Grzybnia napowietrzna: bialo-niebieska, niebieska lub zielono-niebieska, niektóre szczepy rózowo-niebieskie Pigment rozpuszczalny: niekiedy ciemnorózowy Grzybnia wegetatywna: bezbarwna lub zóltawa Pigment rozpuszczalny: brazowo-szary Uwagi: koagulacja i peptoni- zacja wystepuja w zaleznosci od szczepu 1 Grzybnia wegetatywna: bezbarwna Pigment rozpuszczalny: niekiedy zólty Uwaga: redukcja wystepuje lub nie — w zalez¬ nosci od szczepu Spirale o 5—7 zwojach i Spory kuliste Odnosniki literaturowe i sklad podloza (1) S. A. Waksman „The Actinomycetes", Chronica Botanica Company, Waltham (Mass.) U.S.A., 1950, str. 193—197. (1—A) Dane uzyskane po zastapieniu sacharozy ta sama iloscia wagowa glukozy w poprzedniej recepturze. (2) Jablczan wapniowy 1%, chlorek amoniowy 0,05%, fosforan dwupotasowy 0,05%, agar 2%. 65 (3) Pepton 0,5%, wyciag miesny 0,3%, tyrozyna 0,5%, agar 2%. (4) K. L. Jones, J. Bacteriology 57, 142 (1949). (5) Grandy i inni Antib. and Chemoth 1, 309 (1951). (6) A. M. Williams Mc Coy, Appl. Microbiol. 1, 307 (1953). (7) Manual of Methods for pure culture study of bacteria, Society of American Becteriologists (II 50—18).88006 19 20 (8) Odciagane mleko w proszku, rekonstytuowane wedlug wskazówek producenta.Wykorzystanie róznych weglowodanów badano wedlug metody T. G. Pridham'a i D. Gottlieb'a, J. Bact. 56, 467 (1946).Hodowla odbywa sie na podlozu z agarem skos¬ nym, inkubacja zas dokonuje sie w temperaturze 26°. Do weglowodanów wywolujacych regularnie szybki i calkowity wzrost szczepów, naleza: ksy- loza, arabinoza, ramnoza, glukoza, galaktoza, ma- noza, laktoza, maltoza, rafinoza, dekstryna, ami- don, gliceryna (tylko dla szczepu S. 8899), adonit, manit, sorbit, inozyt (tylko dla szczepu S. 8899).Natomiast sorboza, inulina (tylko dla szczepu S. 31.723), eskulina, erytryt i dulcyt nie pozwalaja na rozwój, wzglednie wywoluja rozwój bardzo ogra¬ niczony.Wreszcie do substancji wywolujacych wzrost nie¬ regularnie, zaleznie od próbki, wzglednie srednio lub slabo, naleza: riboza, lewulóza, sacharoza, inu¬ lina (tylko dla S. 8899), gliceryna (tylko dla S. 81.723), inozyt (tylko dla S. 31.723).Cechy, które nalezy wziac pod uwage dla syste¬ matyzacji szczepów 8899 i 31.723 Streptomyces coerileorubidus sa nastepujace: niebiesko-turkuso- wa barwa grzybni powietrznej, dwuskretna struk¬ tura spiral ukladu sporonosnego, dodatnia reakcja melaminowa hodowli na odpowiednich podlozach, charakterystyczny czerwony kolor grzybni glów¬ nej na odpowiednich podlozach, charakterystycz¬ ny czerwony kolor rozpuszczalnych pigmentów na odpowiednich podlozach.Dwie pierwsze cechy klasyfikuja szczepy 8899 i 31.723 S. coeruleorubidus w grupie Biverticillus spira, seria niebieska klasyfikacji Pridham'a, gdzie nie figuruje zaden opisany gatunek.Zespól cech klasyfikuje szczepy 8899 i 31.723 Streptomyces coeruleorubidus wedlug nowej kla¬ syfikacji S. A. Waksmana „The Actinomyces" (The Williams & Wilkins Cy, Baltimore, 1961) cz. II, str. 155, do grupy melaminowej +, seria 5 (wzrost barwy czerwonej przechodzacej w czerwonawo- pomaranczowy). W tej serii nie figuruje zaden ga¬ tunek o niebieskiej grzybni powietrznej. Szczepy 8899 i 31.723 S. coeruleorubidus moga figurowac w tej serii z oznaczeniem: „grzybnia powietrzna niebieska".Sposób wytwarzania antybiotyku 13.057 RP we¬ dlug wynalazku polega na hodowli szczepu Stre¬ ptomyces coeruleorubidus (NRRL 3045 lub NRRL 3046) w ciagu 2-^5 dni w cieklym, aerobowym "sro¬ dowisku odzywczym, przy wartosci pH 6—8 i w temperaturze 20—35°C, zawierajacym zródla wegla i azotu, takie jak weglowodany, tluszcze, amino¬ kwasy, sole amonowe, azotany i naturalne pro¬ dukty kompleksowe zawierajace te substancje t zawierajacym jednoczesnie sole mineralne takie jak chlorki, siarczany, fosforany i weglany metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych.Hodowle Streptomyces 8899 lub Streptomyces 31.723 mozna prowadzic dowolna powietrzna me¬ toda hodowli powierzchniowej lub glebinowej, przy czym ta ostatnia jest dogodniejsza. Stosuje sie do tego celu rózna aparature, bedaca obecnie w powszechnym uzyciu w przemysle fermenta¬ cyjnym.W szczególnosci mozna przyjac nastepujacy cykl kolejnych procesów: kultura Streptomyces 8899 (lub Streptomyces 31.723), hodowla agarowa, ho¬ dowla na trzesawce, hodowla inoculum w zbior- B niku fermentacyjnym, hodowla antybiotyku w zbiorniku fermentacyjnym.Srodowisko fermentacyjne powinno zasadniczo zawierac zródlo wegla oraz zródlo przyswajalne¬ go azotu, skladniki mineralne i ewentualnie czyn¬ niki regulujace wzrost, przy czym wszystkie te skladniki mozna wprowadzic badz w postaci okres¬ lonych substancji, badz tez w postaci zlozonych mieszanin, jakie wystepuja w biologicznych sub¬ stancjach róznego pochodzenia.Jako zródlo przyswajalnego wegla mozna sto¬ sowac weglowodany takie jak glukoza, sacharoza, laktoza, dekstryny, skrobia, melasy lub inne sub¬ stancje weglowodorowe, jak alkoholo-cukry i ma- nitol lub jak niektóre kwasy organiczne na przy¬ klad kwas mlekowy, cytrynowy, winowy. Niektó¬ re oleje pochodzenia zwierzecego lub roslinnego, jak na przyklad olej smakowy lub sojowy, mo¬ ga z pozytkiem zastapic te rózne zródla weglowo¬ dorowe albo stanowic dodatek do nich.Odpowiednie zródla przyswajalnego azotu sa bar¬ dzo róznorodne. Moga to byc bardzo proste sub¬ stancje chemiczne jak azotany, nieorganiczne i or¬ ganiczne sole amonowe, mocznik, aminokwasy.Mozna je równiez wprowadzac za pomoca sub¬ stancji zlozonych, zawierajacych glównie azot w postaci proteidów, a mianowicie: kazeiny, lakto- albuminy, glutenu oraz produktów ich hydrolizy, maki sojowej, maki z orzeszków ziemnych, macz¬ ki rybnej, ekstraktów miesnych, drozdzy, rozpusz¬ czalnych destylatów, namoku kukurydzowego.Niektóre sposród dodawanych skladników nie¬ organicznych moga dzialac jako substancje bufo¬ rowe lub neutralizujace, jak na przyklad fosfo¬ rany metali alkalicznych lub metali ziem alka¬ licznych albo weglany wapnia i magnezu.Inne wprowadzaja równowage jonowa koniecz¬ na dla rozwoju Streptomyces 8899 i 31.723 i do wytworzenia antybiotyku, jak na przyklad chlor¬ ki i siarczany metali alkalicznych i metali ziem alkalicznych. Inne wreszcie dzialaja szczególnie ja¬ ko aktywatory reakcji przemiany materii szcze¬ pów Streptomyces 8899 i 31.723, sa to sole cynku, kobaltu, zelaza, miedzi i manganu.Wartosc pH srodowiska fermentacyjnego przy rozpoczeciu hodowli winna wynosic miedzy 6,0 i 7,8, najlepiej 6,5 a 7,5. Optymalna temperatura dla fermentacji jest 25—28°C, zadowalajace jednak wyniki produkcyjne otrzymuje sie juz w tempe¬ raturach miedzy 23° a 35°C. Napowietrzanie sro¬ dowiska fermentacyjnego moze sie wahac w dosc szerokich granicach. Stwierdzono jednak, ze szcze¬ gólnie korzystne jest doprowadzenie od 0,3 do 2 litrów powietrza na litr bulionu i na 1 minute.Maksymalna wydajnosc antybiotyku uzyskuje sie po 2—5 dniach hodowli, czas ten zalezy jednak glównie od zastosowanego srodowiska.Z powyzszego wynika, ze ogólne warunki ho¬ dowli Streptomyces 8899 i Streptomyces 31.723 dla produkcji antybiotyku 13.057 RP moga zmieniac 20 25 30 35 40 45 50 66 6068006 sie w dosc znacznym stopniu i mozna je dostoso¬ wac do kazdej potrzeby.Antybiotyk 13.057 RP mozna wyodrebnic z brzeczki fermentacyjnej róznymi sposobami.Brzeczke filtruje sie przy wartosci pH miedzy 1)5 a 9 i w tych warunkach znaczna czesc aktyw¬ nej substancji przechodzi do przesaczu. Po prze¬ myciu woda placek filtracyjny praktycznie nie za¬ wiera juz substancji czynnej. Korzystnie jest czyn¬ nosc te wykonac w srodowisku kwasnym, a zwlasz¬ cza przez zakwaszenie do wartosci pH miedzy 1,5 i 2 przy pomocy kwasu szczawiowego. Mozna rów¬ niez filtrowac przy wartosci pH miedzy 2 a 7, naj¬ lepiej jednak w poblizu 2, w obecnosci alkoholu alifatycznego zawierajacego 1 do 3 atomów wegla.W wyniku powyzszych czynnosci ekstrakcyjnych otrzymuje sie antybiotyk 9.865 RP w roztworze wodnym lub wodnoalkoholowym, a nastepnie prze¬ prowadza sie go w roztwór organiczny przez ek¬ strakcje przy pomocy rozpuszczalnika organicz¬ nego, nie mieszajacego sie z woda, jak butanol, metyloizobutyloketon, octan etylowy lub chloro¬ form, przy wartosci pH miedzy 5,5—9, najlepiej w poblizu 7,5. Te ekstrakcje moze ewentualnie po¬ przedzic zastosowanie wymieniacza jonowego.W tym przypadku roztwór wodny doprowadza sie do wartosci pH okolo 4, która nastepnie ustala sie na zywicy karboksylowej, stanowiacej wymie¬ niacz kationów, najlepiej Amberlit IRC 50. Ko¬ lumne przemywa sie nastepnie roztworem wodno- -alkoholowym zawierajacym kwas lub sól, najle¬ piej metanolem zawierajacym 10% wody i 1% chlor¬ ku sodu. Eluat zageszcza sie nastepnie w celu usu¬ niecia alkoholu, a potem ekstrahuje, jak opisano powyzej.Brzeczke fermentacyjna mozna równiez poddac procesowi ekstrakcji przy pomocy organicznego roz¬ puszczalnika nie mieszajacego sie z woda, jak bu¬ tanol, octan etylowy lub chloroform, przy wartos¬ ci pH miedzy 5,5 a 9, najlepiej okolo 7,5. W tym przypadku cala aktywna substancja przechodzi do fazy organicznej, która sie oddziela od fazy wod¬ nej klasycznymi metodami.Bez wzgledu na wybór sposobu ekstrakcji otrzy¬ muje sie ostatecznie antybiotyk 9.865 RP w roz¬ tworze organicznym. W tym stadium moze okazac sie korzystnym oczyszczanie produktu przez suk¬ cesywne przeprowadzenie antybiotyku w roztwór wodny, a nastepnie w roztwór organiczny przez zmiane wartosci pH.Surowy antybiotyk 13.057 RP (lacznie z antybio¬ tykiem 13.213 RP) mozna nastepnie wyizolowac z roztworu organicznego uzyskanego ostatecznie przez zageszczanie lub wytracanie przy pomocy rozpusz¬ czalnika w którym antybiotyk zle sie rozpuszcza, takiego jak heksan. Szczególnie korzystna metoda izolacji jest zakwaszenie roztworu organicznego do wartosci pH okolo 4, najlepiej przy pomocy kwasu octowego, a nastepnie zageszczenie go pod obni¬ zonym cisnieniem do malej objetosci. Dodanie rozpuszczalnika w którym antybiotyk 13.057 RP zle sie rozpuszcza, jakim jest heksan, do uzyska¬ nego koncentratu powoduje wytracenie surowego antybiotyku.Dla otrzymania czystego antybiotyku 9.865 RP mozna stosowac powszechnie znane metody kla¬ syczne, jak chromatografie na rozmaitych adsor¬ bentach, rozdzielanie w przeciwpradzie, lub po¬ dzial miedzy rózne rozpuszczalniki. Szczególnie ko¬ rzystne okazalo sie stosowanie jedne} i dwóch na¬ stepujacych metod: chromatografia surowego an¬ tybiotyku rozpuszczonego w butanolu na kolumnie z tlenkiem glinowym o wartosci pH = 4, lub roz¬ puszczenie surowego antybiotyku w mieszaninie chlorek metylenowy — czterochlorek ' wegla .—< woda (w stosunku objetosciowym 5:1:6), odce^: dzenie fazy wodnej, nastepnie ekstrahowanie je} chlorkiem metylenowym, polaczenie, produktów ekstrakcji chlorkiem metylenowym, potem zagesz¬ czenie ich pod zmniejszonym cisnieniem i wresz¬ cie dodanie heksanu do uzyskanego koncentratu, a celu wytracenia oczyszczonego antybiotyku. Moz- na równiez stosowac podobna metode, zastepujac chlorek metylenowy octanem etylowym.Jest rzecza zrozumiala, ze te rózne metody eks^ trakcji i izolacji antybiotyku 0.865 RP mozna pow¬ tarzac kilkakrotnie zaleznie od wymagan produk¬ cyjnych dla uzyskania tego antybiotyku w posta¬ ci odpowiedniej dla przewidywanego stosowania; Wyizolowany w ten sposób antybiotyk 9.865 RP mozna nastepnie rozdzielic na antybiotyk 13.057 RP i 13.213 RP. Te separacje mozna przeprowa¬ dzic klasycznymi metodami stosowanymi dla roz¬ dzielania antybiotyku na jego czesci skladowe, jak na przyklad chromatografia na róznych ad¬ sorbentach albo rozdzial w przeciwpradzie. Stwier¬ dzono, ze ta ostatnia daje najlepsze rezultaty, zwlaszcza jezeli stosuje sie jeden z nastepujacych procesów, wymienionych jedynie jako korzystne przyklady.W celu otrzymania antybiotyku 13.057 RP sto¬ suje sie rozdzial w przeciwpradzie antybiotyku 9.865 RP w ukladzie butanol — fosforanowa mie¬ szanina buforowa o wartosci pH = 7 — 7,5. Dla otrzymania samego antybiotyku 13.213 RP prowa¬ dzi sie rozdzial w przeciwpradzie antybiotyku 9.865 RP w ukladzie butanol — octan etylowy — mieszanina buforowa o wartosci pH = 4. Dla otrzymania z antybiotyku 9.865 RP jego skladni¬ ków oddzielnie przeprowadza sie dwa sukcesywne rozdzialy w przeciwpradzie: najpierw przy pomo¬ cy ograniczonej ilosci przeplywów w ukladzie zlo¬ zonym z dwóch weglowodorów alifatycznych za¬ wierajacych chlor i mieszaniny buforowej o war¬ tosci pH = 5,8, co pozwala na otrzymanie dwóch frakcji: z jednej strony w fazie wodnej antybio¬ tyk 13.057 RP zanieczyszczony antybiotykiem 13.213 RP, a z drugiej strony w fazie organicznej antybiotyk 13.213 RP z zanieczyszczeniem 13.057 RP, nastepnie oddzielne potraktowanie obu w ten sposób otrzymanych frakcji systemem: octan ety¬ lowy — metanol — fosforowa mieszanina buforo¬ wa o wartosci pH = 5,5, co pozwala na otrzyma¬ nie z jednej strony 13.057 RP, a z drugiej oddziel¬ nie 13.213 RP.Przed tymi róznymi operacjami rozdzielania w przeciwpradzie albo po nich moga oczywiscie na¬ stapic rózne klasyczne operacje oczyszczajace, a mianowicie ekstrakcja i rekrystalizacja, w celu otrzymania trzech poszukiwanych skladników w postaci odpowiadajacej przewidywanemu zastoso¬ waniu.Nastepujace przyklady nie ograniczajac wyna¬ lazku, wykazuja w jaki sposób mozna go stosowac 10 15 20 25 80 35 40 45 50 55 6093 63000 94 w praktyce. W przykladach tych okreslono wsze¬ dzie aktywnosc metoda turbidymetrii, stosujac Klebsiella pneumoniae jako czuly zarodek i po¬ równujac z próbka 9.865 RP o znanej aktywnosci w charakterze wzorca. Aktywnosc ta jest wyra¬ zona w jednostkach (u) na mg w przypadku pro¬ duktu stalego i w jednostkach na cm* w przy¬ padku roztworu (jednostka stanowi najmniejsza ilosc produktu, który po rozpuszczeniu w 1 cm* odpowiedniego srodowiska, wstrzymuje wzrost Kle¬ bsiella pneumoniae w okreslonych warunkach).Temperatury w przykladach podano w stopniach Celsjusza.Przyklad I. Do zbiornika fermentacyjnego o pojemnosci 170 litrów laduje sie: namok kuku¬ rydziany 2,400 kg, sacharoza 3,600 kg, weglan wap¬ niowy 0,900 kg, siarczan amoniowy 0,240 kg, wo¬ da dopelniona do 100 litrów.Srodowisko to posiada wartosc pH = 6,15. Ste¬ rylizuje sie je w ciagu 40 minut przez wprowa¬ dzenie pary o temperaturze 122° za pomoca bel- kotki. Po oziebieniu objetosc bulionu wynosi 120 litrów, a wartosc pH = 7,20. Nastepnie obsiewa sie srodowisko przy pomocy 200 cm* hodowli szcze¬ pu Streptomyces 31.723 wstrzasanej w kolbie Erlen- mayer*a. Hodowla odbywa sie w temperaturze 26— —27° w ciagu 27 godzin przy wstrzasaniu i napo¬ wietrzaniu wyjalowionym powietrzem i wówczas nadaje sie do obsiewu hodowli produkcyjnej.Hodowla produkcyjna odbywa sie w zbiorniku fermentacyjnym o pojemnosci 800 litrów, zalado¬ wanym nastepujacymi substancjami: maka sojowa 20 kg, „Distillers'solubles" 2,500 kg, skrobia 10 kg, elej sojowy 2,500 litra, chlorek sodowy 5 kg, woda dopelniona do 465 litrów.Otrzymane w ten sposób pH srodowiska do¬ prowadza sie do wartosci = 7,20 za pomoca 400 cm* 10 n roztworu weglanu sodowego. Nastepnie sterylizuje sie je w ciagu 40 minut przez dopro¬ wadzenie pary o temperaturze 122° za pomoca belkotki Po oziebieniu objetosc bulionu wynosi 500 litrów, a wartosc pH = 6,75. Wtedy sie go obsiewa 50 litrami poprzedniej hodowli ze zbior¬ nika 170 litrowego. Hodowla odbywa sie w tem¬ peraturze 28° w ciagu 67 godzin przy wstrzasa¬ niu i napowietrzaniu wyjalowionym powietrzem.Wartosc pH srodowiska wynosi wtedy 7,40, a obje¬ tosc brzeczki 520 litrów. Hosc antybiotyku 9.865 RP w tym srodowisku wynosi 29 j/cm*.Przyklad II. Hodowla inoculum odbywa sie w zbiorniku 170-litrowym w tych samych warun¬ kach, jak w przykladzie I, lecz posiewu dokonuje sie 200 cm* hodowli szczepu Streptomyces 8899, znajdujacej sie we wstrzasanej kolbie Erlenmey- er'a.Hodowla produkcyjna odbywa sie nastepnie w zbiorniku 800-litrowym, zaladowanym jak w przy¬ kladzie I. Wartosc pH srodowiska doprowadza sie wtedy do 8,10 za pomoca 750 cm* 10 n roztworu weglanu sodowego. Nastepnie sterylizuje sie je w ciagu 40 minut doprowadzajac przy pomocy belkotki pare o temperaturze 122°. Po ochlodzeniu objetosc bulionu wynosi 500 litrów, a wartosc pH = 6,80. Wtedy nastepuje posiew 75 litrami po¬ przedniej kultury ze zbiornika 170-litrowego. Ho¬ dowla odbywa sie w temperaturze 26—27° w cia¬ gu 67 godzin przy wstrzasaniu i napowietrzaniu wyjalowionym powietrzem. Wartosc pH osrodka wynosi potem 7,40, a objetosc brzeczki 545 litrów.Ilosc antybiotyku 9.865 RP w tym srodowisku wy- 5 nosi 9,1 j/cm*.Przyklad III. Brzeczke otrzymana w przy¬ kladzie I (520 litrów o zawartosci 29 j/cm* anty¬ biotyku 9.865 RP) wprowadza sie do zbiornika zao¬ patrzonego w mieszadlo i doprowadza sie wartosc 10 pH do 1,8 za pomoca stezonego roztworu kwasu szczawiowego. Brzeczke miesza sie w ciagu godzi¬ ny, potem dodaje sie 20 kg pomocniczego srodka filtracyjnego, takiego jak ziemia okrzemkowa. Mie¬ szanine przesacza sie przez prase filtracyjna, a 15 placek filtracyjny przemywa sie 100 litrami wody zakwaszonej kwasem szczawiowym do wartosci pH = 2. Do przesaczu, którego objetosc wynosi 612 litrów, dodaje sie 10 n roztworu weglanu so¬ dowego az pH osiagnie wartosc 4,5. Nastepnie prze- 20 puszcza sie przesacz przez kolumne zawierajaca 20 litrów Ambeirlitu IRC 50 w cyklu kwasowym (srednica kolumny = 15,2 cm, wysokosc = 200 cm, wysokosc wymieniacza w kolumnie wynosi w sta¬ nie spoczynku 110 cm).Filtrat przechodzi warstwe Amberlitu od dolu do góry z szybkoscia 40 litrów na godzine. Na¬ stepnie przemywa sie kolumne najpierw 100 li¬ trami wody przeplywajacej z dolu do góry z szyb¬ koscia 50 litr/godzine, a potem 75 litrami 10% roz¬ tworu wodnego metanolu przeplywajacego z góry 30 w dól z szybkoscia 50 litr/godzine w ciagu 1,5 go¬ dziny. Przesacz odrzuca sie, a kolumne eluuje roz¬ tworem o skladzie nastepujacym: chlorek sodowy 10 g, woda 100 cm*, metanol uzupelniony do 1.000 cm*. 85 Eluat zawierajacy wieksza czesc antybiotyku 9.865 RP ma objetosc 100 litrów. Zageszcza sie go pod zmniejszonym cisnieniem przy temperaturze 35° do objetosci 10 litrów.Nastepnie przy wartosci pH = 7,5 ekstrahuje 40 sie koncentrat sukcesywnie dwa razy 5 litrami chloroformu. Ekstrakt chloroformowy doprowadza sie do wartosci pH = 4 za pomoca roztworu kwa¬ su octowego w chloroformie (w stosunku objetos¬ ciowym 10 :100), potem zageszcza w temperaturze 45 30° pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 100 cm*. Nastepnie antybiotyk 9.865 RP straca sie 1 li¬ trem heksanu, odwirowuje, przemywa i suszy. W ten sposób otrzymuje sie 9 g bezpostaciowego proszku czerwonego o aktywnosci 1.400 \i/mg. 50 Przyklad IV. 17,1 g nieoczyszczonego pro¬ duktu otrzymanego wedlug przykladu III (aktyw¬ nosc 1530 ii/mg) rozpuszcza sie, wstrzasajac, w mieszaninie zawierajacej 1,5 litra chlorku metyle¬ nowego, 0,3 litra czterochlorku wegla i 1,8 litra 55 wody. Wartosc pH doprowadza sie nastepnie do 3 przez dodanie 8 cm* normalnego kwasu solnego.Po dekantacji dodaje sie do fazy wodnej 7 litrów chlorku metylenowego i 200 cm* 0,1 n roztworu sody, aby doprowadzic wartosc pH do 7,5. Znowu 60 nastepuje dekantacja i ekstrakcja fazy wodnej o wartosci pH = 7,5 za pomoca 3,5 litra chlorku metylenowego.Produkty ekstrakcji chlorkiem metylenowym la¬ czy sie i zageszcza do objetosci 100 cm*. Po do- 65 daniu do koncentratu 1 litra heksanu straca sie25 produkt, który zostaje poddany filtracji, przemy¬ ciu i wysuszeniu w temperaturze 30° pod zmniej¬ szonym cisnieniem. Otrzymujemy w ten sposób 9,15 g antybiotyku 9.865 RP w postaci czerwono- -pomaranczowego proszku bezpostaciowego o ak¬ tywnosci 2.180 |i/mg.P r z y k l a d V. Przygotowuje sie mieszanine: chlorek metylenowy — czterochlorek wegla — mie¬ szanina buforowa Mac Ilvaine'a o wartosci pH = = 5,8 (20 cm1 tej mieszaniny buforowej sporza¬ dza sie z 12,09 cm* NafHP04 0,2 M oraz 7,91 cm* kwasu cytrynowego 04 M) w stosunku objetoscio¬ wym 2:1,3, kiedy mieszanina jest w równowadze, rozdziela .sie obie fazy. Rozpuszcza sie 10 g anty¬ biotyku 9.865 RP o aktywnosci 1750 j/mg (uzyska¬ nego wedlug przykladu IV) w mieszaninie zawie¬ rajacej po 1 litrze kazdej fazy. Ten uklad pod¬ daje sie rozdzialowi w przeciwpradzie o 6 prze¬ plywach w balonach 5-litrowych, wykorzystujac faze ciezka (rozpuszczalnik) jako faze ruchoma, a faze lekka (wodna) jako faze stacjonarna i sto¬ sujac kazdorazowo po 1 litrze kazdej fazy. Zbiera sie oddzielnie mieszanine faz dolnych (mieszanina A) i górnych (mieszanina B) z czterech pierwszych balonów oraz mieszanine faz dolnych (mieszanina C) i górnych (mieszanina D) z trzech ostatnich balonów.Mieszanine B doprowadza sie do wartosci pH = = 7,5 przez dodanie 300 cm1 1 n roztworu sody, pózniej ekstrahuje sie sukcesywnie za pomoca 4 litrów, 2 litrów i 1 litra chloroformu. Ekstrakty chloroformowe i mieszanine A laczy sie i za¬ geszcza pod zmniejszonym cisnieniem do 700 cm*.Koncentrat przemywa sie 2 porcjami po 350 cm8 wody o wartosci pH = 7,5 a roztwory — matki z przemywania ekstrahuje sie 2 porcjami po 100 cm* chloroformu. Przemyty koncentrat i ekstrakty chloroformowe laczy sie i zageszcza pod zmniej¬ szonym cisnieniem do objetosci 70 cm8. Wtedy do¬ daje sie 700 cm8 heksanu i otrzymany osad filtruje sie, przemywa i suszy pod zmniejszonym cisnie¬ niem przy 30°, w ten sposób otrzymuje sie 5,1 g frakcji Fizawierajacej glównie antybiotyk 13.057 RP.Z drugiej strony ekstrahuje sie mieszanine D sukcesywnie 3 litrami, potem 1,5 litra chlorku me¬ tylenowego. Ekstrakty chlorku metylenowego i mie¬ szanine C laczy sie i zageszcza pod zmniejszonym cisnieniem do 800 cm8. Koncentrat przemywa sie 400 cm8 wody, pózniej znów zageszcza do 700 cm8.Potem dodaje sie 1 litr heksanu i otrzymany osad filtruje sie, przemywa i suszy pod zmniejszonym cisnieniem przy 30°, w ten sposób otrzymuje sie 3,7 g frakcji F2 zawierajacej glównie skladnik 13.213 RP.Przyklad VI. 10 g produktu podobnego do wyzej wymienionej frakcji Ft poddaje sie — po rozpuszczeniu w 200 cm8 mieszaniny: octan ety¬ lowy — metanol — bufor fosforowy M/15 o war¬ tosci pH = 5,5 w stosunku objetosciowym 8:3:5 — rozdzieleniu w przeciwpradzie o 110 przeplywach w aparacie Craig'a liczacym 50 komór (50 przeply¬ wów w aparacie i 60 przeplywów wedlug techniki „single withdrawal") rozpoczynajac od dwóch pierwszych komór. Mieszanine faz górnych z ko¬ mór od 0—37 (3,8 litra) zbiera sie i zageszcza do 300 cm*. 08006 26 Otrzymany w ten sposób koncentrat oraz mie¬ szanine faz dolnych z komór od 0—37 {3,8 litra) znowu sie laczy i zageszcza do, 800 cm8. Wtedy do¬ prowadza sie wartosc pH do 8 przez dodanie 180 5 cm8 1 n roztworu sody, a otrzymany roztwór eks¬ trahuje sie sukcesywnie 800 cm8, potem 400 cm1 chloroformu.Ekstrakty chloroformowe zageszcza sie do 400 cm8 i przemywa 400 cm8 wody zalkalizowanej io do wartosci pH=8, przy czym roztwory — matki z przemywania ekstrahuje sie 200 cm8 chlo¬ roformu. Przemyty koncentrat i ekstrakty chlo¬ roformowe laczy sie, zageszcza do 400 cm8, prze¬ mywa 400 cm8 zalkalizowanej wody o wartosci 15 pH = 8, zageszcza do 100 cm8, dodaje 200 cm8 bu¬ tanolu i znów zageszcza do 100 cm8, Otrzymany w ten sposób roztwór butanolowy doprowadza sie do wartosci pH = 3,5 przez doda¬ nie 30 cm8 butanolu nasyconego 1 n kwasem sol- 20 nym i oziebia przez 12 godzin w temperaturze 4°.Powstaja krysztaly, które filtruje sie, przemywa i suszy. W ten sposób otrzymuje sie pierwsza porcje 4,55 g nieoczyszczonego chlorowodorku 13.057 RP. Przez zageszczenie roztworów — ma- 25 tek krystalizacji do 100 cm8, dodanie 1 litra he¬ ksanu, potem filtracje, przemycie i osuszenie otrzy¬ manego osadu otrzymuje sie druga porcje 2,5 g nieoczyszczonego chlorowodorku 13.057 RP.Przyklad VII. 3,75 g chlorowodorku 133)57 80 RP w stanie nieoczyszczonym otrzymanego w spo¬ sób podany w przykladzie VI, rozpuszcza sie w 40 cm8 dioksanu, zawierajacego 20% wody. Uzy¬ skany roztwór filtruje sie i dodaje do niego naj¬ pierw 15 cm8 bezwodnego dioksanu w ciagu 2 go- 85 dzin, potem 235 cm8 bezwodnego dioksanu w cia¬ gu 30 minut. Wykrystajizowuje sie produkt, który sie odwirowuje, przemywa i suszy, otrzymujac w ten sposób 2,75 g chlorowodorku 13.057 RP w po¬ staci czerwono-pomaranczowych igielek, topnieja^ 40 cy w temperaturze 225—230° przy jednoczesnym rozpadzie i o mocy 151 n/mg. 0,208 g tego produktu rozpuszcza sie w miesza¬ ninie 200 cm8 wody i 150 cm8 butanolu. Do te¬ go dodaje sie 3,4 cm8 0,1 n roztworu sody, de- 45 kantuje sie i wreszcie ekstrahuje faze wodna za pomoca 50 cm8 butanolu. Ekstrakty butanolowe laczy sie, przemywa 2 razy 100 cm8 wody zalka¬ lizowanej do wartosci pH = 8 i zageszcza do 10 cm8. Uzyskany koncentrat poddaje sie dziala- 50 niu 50 cm8 heksanu i otrzymany osad filtruje sie, przemywa i suszy, w ten sposób otrzymuje sie 0,0945 g antybiotyku 13.057 RP w postaci bezpo¬ staciowego proszku czerwonego o mocy 160 n/mg.Przyklad VIII. 5 g produktu podobnego do 55 frakcji F2, otrzymanej wedlug przykladu V, po rozpuszczeniu w 200 cm8 mieszaniny zawierajacej octan etylowy — metanol — bufor fosforowy M/15 o wartosci pH = 5,5 w stosunku objetosciowym 8:3:5, poddaje sie rozdzielaniu identycznemu do eo opisanego w przykladzie VI. Zbiera sie miesza¬ nine faz wyzszych z komór 36—89 (5,3 litra) i za¬ geszcza sie ja do 500 cm8. Otrzymany koncentrat i mieszanine faz dolnych z komór 36—89 (5,3 li¬ tra) laczy sie i zageszcza do 800 cm8. Potem eks- 65 trahuje sie koncentrat sukcesywnie dwiema por-63006 28 cjami po 800 cm8 chlorku metylenowego, pózniej 800 cm8 chloroformu.Otrzymane ekstrakty laczy sie, zageszcza do 400 cm8, przemywa 2 razy 400 cm8 wody o war¬ tosci pH = 7,5 i wreszcie zageszcza sie do 10 cm8.Przez dodanie 100 cm8 heksanu straca sie produkt, który podlega filtracji, przemyciu i wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem, w ten sposób otrzy¬ muje sie 1,1 g antybiotyku 13.213 RP jako bez¬ postaciowy proszek czerwono-pomaranczowy o mocy 2650 ji/mg.Przyklad IX. 500 litrów brzeczki fermenta¬ cyjnej, otrzymanej jak w przykladzie II, poddaje §ie obróbce jak w przykladzie III. Otrzymuje sie w ten sposób 8,5 g nieoczyszczonego antybiotyku 9.865 RP o mocy 395 j/mg. 17 g produktu, podobnego do otrzymanego wyzej oczyszcza sie wedlug opisu podanego w przykla¬ dzie IV, lecz zamiast chlorku metylenowego sto¬ suje sie octan etylowy. W ten sposób otrzymuje sie 3 g antybiotyku 9.865 RP o mocy 1300 j/mg.Przyklad X. 12,4 g antybiotyku 9.865 RP otrzymanego jak w przykladzie IX poddaje sie w mieszaninie butanol-bufor fosforowy M/3 o war¬ tosci pH = 7,3 (roztwór buforowy zawierajacy fosforany metali alkalicznych np. P04Na2H+ -f-P04NaH2 w roztworze wodnym M/3, to jest 1/3 P04 w litrze) procesowi rozdzielania w przeciw- pradzie o 50 przeplywach.W wyniku ekstrakcji butanolowej dolnych faz z komór 12—35, zageszczenia ekstraktów butano- lowych, przemycia i dodania heksanu otrzymuje sie pierwsza porcje w ilosci 1 g chlorowodorku 13.057 RP, a pózniej po zageszczeniu roztworów — matek, druga porcje 1,1 g chlorowodorku 13.057 RP. Te dwa osady, po rekrystalizacji w wodnym roztworze dioksanu wystepuja w postaci czerwo- no-pomaranczowych igielek o temperaturze top¬ nienia 225—230° przy jednoczesnym rozpadzie i o mocy 67 j/mg.Podobna procedura zastosowana do komór 36— 49 daje w wyniku 1,1 g surowego antybiotyku 13.213 RP o mocy 1800 j/mg, który po poddaniu procesowi rozdzielania w przeciwpradzie o 50 prze¬ plywach w ukladzie: butanol ^- octan etylowy — bufor Mac Ilvaine'a o pH 4 w stosunku objetoscio¬ wym 3:7:10 pozwala na otrzymanie 0,5 g pro¬ duktu 13.213 RP, w postaci czerwono-pomaran- czowego proszku bezpostaciowego o mocy 2000 j/mg.Przyklad XI. 625 litrów brzeczki przygoto¬ wanej wedlug opisu podanego w przykladzie II wprowadza sie do wstrzasanego zbiornika. Wartosc pH doprowadza sie do 9 za pomoca 10 n roztworu weglanu sodowego. Wstrzasanie trwa 30 minut, potem dodaje sie 32 kg dodatku filtracyjnego, ta¬ kiego jak ziemia okrzemkowa.Mieszanine przesacza sie przez prase filtracyjna i przemywa 275 litrami wody. Do filtratu, które¬ go objetosc wynosi 780 litrów, dodaje sie 156 kg chlorku sodowego, potem doprowadza sie wartosc pH do 3 za pomoca 12 n kwasu solnego. Przesacz ekstrahuje sie nastepnie 260 litrami butanolu. Wy¬ ciag butanolowy zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 35° do objetosci 4 li¬ trów. Koncentrat filtruje sie. Surowy antybiotyk straca sie z wyklarowanego roztworu za pomoca 5 32 litrów eteru naftowego, odwirowuje, przemy¬ wa i suszy w suszarce przy 30° w prózni. Otrzy¬ muje sie tu 227 g surowego antybiotyku 9.865 RP jako proszek brazowo-czerwony o mocy 45 j/mg. 50 g powyzszego surowego produktu rozpuszcza 10 sie w 200 cm8 butanolu nasyconego woda i otrzy¬ many roztwór chromatografuje sie przy wartosci pH = 4 przez kolumne zawierajaca 500 cm8 tlen¬ ku glinowego. Po zaadsprbowaniu antybiotyku rozwija sie i eluuje go 4 litrami butanolu nasy- 15 conego woda. W ten sposób otrzymuje sie 3 za¬ barwione frakcje o objetosciach 450 cm8, 1500 cm8 i 1500 cm8. Pierwsza frakcje zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem do 50 cm8, potem zada¬ je sie ja 500 cm8 heksanu otrzymujac 8,3 g anty- 20 biotyku 9.865 RP o mocy 68,5 j/mg. Obie pozo¬ stale frakcje zageszcza sie oddzielnie pod zmniej¬ szonym cisnieniem do 100 cm8 i kazda frakcje za¬ daje 1 litrem heksanu. W wyniku otrzymuje sie z jednej frakcji 4,4 g antybiotyku 9.865 RP o mo- 25 cy 216 J/mg, a z drugiej frakcji — 1,35 g 9.865 RP o mocy 800 j/mg.Przyklad XII. 425 litrów brzeczki przygo¬ towanej w sposób opisany w przykladzie I (moc = 40 j/cm8) zakwasza sie do wartosci pH = 1,8 za 30 pomoca kwasu szczawiowego i filtruje. Placek fil¬ tracyjny przemywa sie 100 litrami wody zakwa¬ szonej kwasem szczawiowym do wartosci pH = = 2 i otrzymuje sie w ten sposób 500 litrów prze¬ saczu. Przesacz ekstrahuje sie przy wartosci pH = 86 = 8, dwa razy sukcesywnie 150 litrami wody, po¬ tem 100 litrami chloroformu. Ekstrakty sie laczy i znów ekstrahuje woda doprowadzona do warto¬ sci pH = 4, raz 80 litrami, potem 50 litrami.Otrzymany wodny ekstrakt alkalizuje sie do war¬ tosci pH = 8 1 n roztworem sody i ekstrahuje naj¬ pierw 40 litrami, pózniej 20 litrami chloroformu.Ekstrakty chloroformowe zakwasza sie do warto¬ sci pH = 4 roztworem kwasu octowego w chloro¬ formie (10 :100 objetosciowo). Zakwaszony eks¬ trakt zageszcza sie przy 30° pod zmniejszonym ci¬ snieniem do objetosci 50 cm8. Potem straca sie surowy antybiotyk 500 cm8 heksanu, odwirowuje sie, przemywa i suszy w suszarce przy 30° w pró¬ zni. Wreszcie otrzymuje sie 680 mg antybiotyku 9.865 RP w postaci czerwonego proszku, którego moc wynosi 1080 j/mg.Przyklad XIII. 500 mg antybiotyku 9.865 RP otrzymanego w sposób opisany w przykladzie IV 55 rozpuszcza sie w 100 cm8 normalnego kwasu siar¬ kowego i otrzymany roztwór podgrzewa sie w cia¬ gu 20 minut w wodnej kapieli. Po ochlodzeniu ekstrahuje sie trzykrotnym zadaniem 200 cm8 octa¬ nu etylowego. Ekstrahowany roztwór organiczny suszy sie za pomoca bezwodnego siarczanu sodu, filtruje i zageszcza do malej objetosci. Po prze- filtrowaniu, przemyciu i osuszeniu otrzymuje sie 218,5 mg produktu krystalicznego. 150 mg tych krysztalków rozpuszcza sie w 3 65 cm8 chloroformu i 1,5 cm8 benzenu i otrzymany 40 45 5068000 29 roztwór chromatografuje sie na 20 arkuszach pa¬ pieru Arches nr 310 nasyconego roztworem ace¬ tonu o zawartosci 20% formamidu i wywoluje sie w ciagu 90 minut przy pomocy mieszaniny chlo¬ roform — benzen (2:1) nasyconej formamidem.Na 20 arkuszach wycina sie glówna strefe o RF = =• 0,86 i te 20 wycietych stref rozciera sie w „mi¬ kserze" w obecnosci metanolu. Otrzymana mie¬ szanine przesacza sie, zageszcza i dodaje do niej 10 objetosci wody. Otrzymany osad odsacza sie, przemywa i suszy pod zmniejszonym cisnieniem.W wyniku otrzymuje sie w ten sposób 120 mg produktu krystalicznego. 170 mg krysztalków identycznych z otrzymany¬ mi wedlug powyzszego sposobu rozpuszcza sie w 15 cm8 dioksanu o zawartosci 20% wody, dodajac kroplami wode zakwaszona do wartosci pH = 4 0,1 n kwasem solnym. Powstale krysztaly odsacza sie, przemywa i suszy, po czym otrzymuje sie 130 mg aglikonu 9.865 RP w postaci czerwono- pomaranczowych igielek, o temperaturze topnie¬ nia 160°, pózniej 225—230°.Przyklad XIV. 500 mg antybiotyku 13.057 RP otrzymanego w sposób opisany w przykladzie VII poddaje sie dzialaniu kwasu siarkowego, jak w przykladzie XIII, w odniesieniu do 9.865 RP.Otrzymuje sie w ten sposób 300 mg produktu kry¬ stalicznego, który po oczyszczeniu go metoda opi¬ sana w tymze przykladzie XIII dostarcza 202 mg aglikonu 13.057 RP w postaci czerwono-pomaran- czowych igielek o temperaturze topnienia 160°, pózniej 225—230°. Ten aglikon jest identyczny z aglikonem 9.865 RP. 30 PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego antybiotyku 13.057 RP, znamienny tym, ze szczep Streptomyces coeruleorubidus (NRRL 3045 lub NRRL 3046) pod- 5 daje sie hodowli w ciagu 2—5 dni w aerobowym, cieklym srodowisku odzywczym przy wartosci pH = 6—8 i w temperaturze 20—35°C, zawieraja¬ cym zródla wegla i azotu, takie jak weglowodany, tluszcze, aminokwasy, sole amonowe, azotany i na- io turalne produkty kompleksowe zawierajace te substancje i zawierajacym jednoczesnie sole mi¬ neralne takie jak chlorki, siarczany, fosforany i weglany metali alkalicznych i metali ziem alka¬ licznych, nastepnie wyodrebnia sie antybiotyk u 13.057 RP ze srodowiska hodowlanego przez eks¬ trakcje rozpuszczalnikiem nie mieszajacym sie z woda takim jak butanol, metyloizobutyloketon, octan etylu lub chloroform, przy wartosci pH w zakresie 5,5—9 badz bezposrednio, badz po prze- 20 saczeniu srodowiska przy wartosci pH w zakre¬ sie 1,5—9, nastepnie zatezenie otrzymanego roz¬ tworu, wytracenie surowego antybiotyku 13.057 RP, lacznie z antybiotykiem 13.213 RP, przez do¬ danie rozpuszczalnika, w którym antybiotyk zle 25 sie rozpuszcza, takiego jak eter naftowy lub cy¬ kloheksan, przesaczenie i wreszcie oczyszczenie antybiotyku 13.057 RP metoda fizykochemiczna taka jak chromatografia lub rozdzielanie w prze- ciwpradzie. 80

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w przypadku wytwarzania surowego antybiotyku 13.057 RP wyodrebnia sie bezposrednio osad otrzy¬ many jx) dodaniu rozpuszczalnika, w którym anty¬ biotyk zle sie rozpuszcza, do zatezonego roztworu.KI. 30 h, 6 63006 MKP C 12 d, 9/14 SM *OK lW Kon 1000 ilOO H«0 IWO <10B "tt Hi fti fi w *j.2KI. 30 h,6 63006 MKP C 12 d, 9/14 fla.k •*—i—i—i—i—• | • i—i i | l l i « \ « t i l—|—i—i-i—i—| « i—i i f 2S0 ^00 360 400 450 500 X*hj* Ff-7 i—i « ' • » i—i i i « i i—i—i—i i i—i i i—|—i—i i i—i—i—i—i—r^- 150 300 350 AOO 450 500 v A. fllM. , A P 1 / / «i_ Pr T I r n 1 1 I' 1 1 fi \ u \ \\\ W l ¦ 1 li. U l pfl n\k v l/r k \ h l 1 Ml W " | I [V i W- 4 T Irk- i/\Kl/W] i II 1 [ 1 | 1 m 1 T^JJ Pi 1 r—1 ¦il n fig. 6KI. 30 h, 6 63006 MKP C 12 d, 9/14 gafl- j—w / ¦ " 1 t±=y looo ino itr U i T J ^ I f 1 i ' a«oo —i- •U itt i L 4 i 1 «' 1 1 1 i 11 • «O0 **0 1 1tt9 i W l I ' \ ij i» H i i i J r \ \j \i i \, V i i i i + ^ L 1/ I \ i—j-1 / ^ HO l» m i j./ V A A •u t i UJ 55 n ^"" IM m \ \ K i t 1 T T n cb / -X - u 41 1 1 60 4 i 1- 1 T T i u^ \ v— *—_ Ito m f i i -j ii jl 1« #g.8 250 1-^—I 1—| 1 T I "| | 300 350 1 1 1 1 1 1 | l F 1-1 1- 400 J\50 500 A ™|* %10 PL PL