PL56331B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 25.XI.1968 56331 KI. 12 o, 25/04 MKP C 07 c UKD «ll Wspóltwórcy wynalazku: mgr Wieslawa Kotula, mgr inz. Wieslaw Le- wenstein, mgr Jadwiga Golonka, mgr Irena Eysymontt Wlasciciel patentu: Instytut Farmaceutyczny, Warszawa (Polska) Sposób wytwarzania zwiazków ^1'4-3-ketosterydowych Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zwiazków ^M-3-ketosterydowych szeregu androsta- nu przez odwodornienie na drodze mikrobiologicz¬ nej odpowiednich substratów sterydowych. Sa to zwiazki o dzialaniu leczniczym, albo tez produkty posrednie do ich wytwarzania.Znane sposoby otrzymywania tych zwiazków me¬ toda mikrobiologiczna polegaja na zastosowaniu szczepów takich jak Pseudomonas testosteroni, Di- dymella lycopersici, niektórych szczepów Nocardia i innych.*Odwodornienie przy uzyciu tych szczepów przebiega dosc wolno. Tak wiec np. w przypadku szczepów z rodzaju Nocardia, np. Nocardia opaca lub Nocardia globorula, czas przygotowania ho¬ dowli i transformacji wynosi lacznie okolo 96 go¬ dzin i w niektórych tylko przypadkach moze byc skrócony do 72 godzin (opis patentowy brytyjski 789 363), a przy uzyciu szczepu Didymella lycopersi- ci samo tylko przygotowanie hodowli wymaga 6 dni, a transformacja 3—6 dni (opis patentowy USA 2 929 763).Okazalo sie, ze czas przygotowania hodowli i transformacji mozna jeszcze bardziej skrócic, je¬ zeli w znanym procesie dehydrogenacji mikrobio¬ logicznej zamiast wymienionych szczepów zastosuje sie nowe, nieznane dotad i nie opisane szczepy z ro¬ dzaju Cephalosporium, a mianowicie Cephalospo- rium sp. C-5 i Cephalosporium sp. C-9, uzyskane na drodze selekcji z dwóch dzikich szczepów macie¬ rzystych wyizolowanych z ziemi kompostowej. Do 20 25 30 tej pory nie stwierdzono obecnosci dehydrogenaz zli-sterydowych w szczepach z rodzaju Cephalospo¬ rium i w zwiazku z tym zaden ze znanych szcze¬ pów nalezacych do tego rodzaju nie byl stosowany do wytwarzania zwiazków zlM-3-ketosterydowych.Wedlug wynalazku zwiazek zl4-3-ketosterydowy szeregu androstanu poddaje sie dzialaniu hodowli szczepu Cephalosporium sp. C-5 lub Cephalospo¬ rium sp. C-9, lub zawiesiny grzybni tych mikroor¬ ganizmów w wodzie z ewentualnym dodatkiem substancji buforowych, lub otrzymanych z tych mikroorganizmów preparatów enzymatycznych w obecnosci tlenu powietrza sposobem konwencjonal¬ nym, po czym otrzymany zwiazek ZlM-3-ketostery- dowy szeregu androstanu wyodrebnia sie i oczyszcza w znany sposób.Hodowle szczepu Cephalosporium C-5 i Cepha¬ losporium C-9 mozna przygotowac np. w pozywce plynnej, przy czym juz po uplywie 18—24 godzin hodowle mozna uzyc do transformacji. Zamiast ho¬ dowli mikroorganizmów mozna uzyc odsaczonej grzybni zawieszonej w wodzie w ewentualnej obec¬ nosci substancji buforowych, np. 0,03 molowym bu¬ forze fosforanowym, dzieki czemu eliminuje sie barwniki i inne ciala balastowe powstale podczas przygotowywania hodowli mikroorganizmu i uzys¬ kuje sie produkt mniej zanieczyszczony. Mozna równiez uzyc preparatu enzymatycznego zawiera¬ jacego dehydrogenaze Al -sterydowa otrzymana z grzybni w znany sposób. W procesie transforma- 56 33156 331 4 *cji czas 20—24 godziny przy zastosowaniu szczepu Cephalosporium C-5 lub Cephalosporium C-9 wy¬ starcza najzupelniej dla przeprowadzenia reakcji do konca. Transformacja wedlug wynalazku prze¬ biega w jednym kierunku, bez tworzenia sie pro¬ duktów ubocznych, a wydajnosc procesu wedlug analizy chromatograficznej wynosi blisko 100%.Szczepy Cephalosporium C-5 i Cephalosporium C-9, podobnie jak znane szczepy z rodzaju Cepha- • losporium, charakteryzuja sie brakiem organów rozmnazania plciowego, wystepowaniem grzybni podstawowej i powietrznej. Grzybnia podzielona i rozgaleziona, hialinowa, tworzy sploty synnema- 10 ta. Pojedyncze strzepki lub synnemata moga two¬ rzyc petle. Zarodniki tworzace sie na koncach ko¬ nidioforów stopniowo przemieszczaja sie tworzac glówki. Glówki konidialne sa osadzone na nieroz- detych szczytach konidioforów, zawieraja po kilka zarodników zlepionych substancja kleista — mu- cus — latwo rozpadaja sie. Konidiofory sa proste, niepodzielone lub z jednym podzialem poprzecz¬ nym. Wyrastaja pod katem prostym wokól strzepki i na calej jej dlugosci. Konidia hialinowe jednoko¬ mórkowe moga byc owalne, elipsoidalne, o wymia¬ rach 9—10^ na 3,5—4,0 u i 3,4—10,0^ na 2,4—6,0^.Zdarzaja sie zarodniki o ksztaltach fusariopodob- nych.Nazwa podloza Szczep C-9 Szczep C-5 Agar Czapek Dox z sacha¬ roza Kolonie okragle, lekko wypukle, srednica okolo 5 mm, biale zabarwiajace sie na kolor rózowolososiowy. Grzyb¬ nia powietrzna bialawa, krótka, w postaci wzniesionych prostych ostro zakonczonych igielek, czesto sklejonych z wielu pojedynczych strzepek synnemata o dlugosci 780— 830 /u i srednicy podstawy 18—37 fx lub strzepek pojedyn¬ czych i ich splotów (ropes). Konidiofory w ksztalcie bu¬ telki o srednicy podstawy 3—5 jlc i 2,5—3,5 /u. Na szczycie konidioforów zlepione zarodniki tworza glówki. Konidia hialinowe, jednokomórkowe, owalne, elipsoidalne lub lód- kowato wygiete o wymiarach 3—4 (x X 7—10 p.Kolonie kremowe o srednicy 2—4 mm, grzybnia podstawowa wrasta¬ jaca w podloze. Grzybnia powietrz¬ na biala krótka, splatana, welnista, silnie rozgaleziona, wyzsza na srodku kolonii, wystepuje w po¬ staci pojedynczych strzepek i grub¬ szych splotów. Konidiofory o dlu¬ gosci 10—60 /u, srednicy podstawy 1,5—2,5 \x. Bez podzialu lub z jed¬ nym podzialem poprzecznym. Glów¬ ki konidialne kuliste, spotyka sie zlepione w ksztalcie < tulipana. Ko¬ nidia owalne, elipsoidalne o wy¬ miarach 4—10 ix na 2,3—4 ix zawie¬ raja drobne granulki o charakterze lipoidalnym.Agar ziemn a- czany wedlug Waks- mana Kolonie okragle o srednicy 8,5—10 mm, rózowo-lososiowe, wypukle. Grzybnia podstawowa wrastajaca w podloze.Grzybnia powietrzna lososiowa, gesta krótka w postaci igielek synnemata — o srednicy podstawy okolo 45 /ll lub skreconych welniscie pojedynczych strzepek i ich splotów.Konidiofory o dlugosci 4—24 /u i srednicy podstawy 2,5— 3 [x bez lub z jednym podzialem poprzecznym, spotyka sie niekiedy dwa podzialy. Wystepuja na grzybni powietrznej wzdluz synnemata oraz pionowo na grzybni podstawowej.Glówki konidialne o srednicy 7,5—25 /a w ksztalcie tulipa¬ na z wysunietym jednym konidium. Konidia elipsoidalne lub lódkowate jednokomórkowe, w starszych kulturach staja sie wrzecionowate lub fusariopodobne, czesto z jed¬ nym podzialem poprzecznym. Cytoplazma konidii drobno granulowana. Konidia oblepiaja nici grzybni powietrznej lub leza na podlozu. Grzybnia podstawowa tworzy petle.Kolonie biale, okragle, wypukle, o srednicy 8—9 mm. Grzybnia pod¬ stawowa bezbarwna tworzy obrze¬ zenie kolonii, strzepki zagiete w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Grzybnia po¬ wietrzna biala w ksztalcie rzad¬ kich, dlugich prostych, wniesionych igielek — synnemata — skladaja¬ cych sie z wielu pojedynczych strzepek, dlugosci 1010—1380 p i srednicy podstawy 11—83 \x. Koni¬ diofory o dlugosci 5—25 fx i o sred¬ nicy podstawy 2,5—3 fx bez lub z jednym podzialem poprzecznym wyrastaja wokól i na calej dlugo¬ sci synnemata oraz pionowo z grzybni podstawowej. Glówki ko¬ nidialne kuliste, konidia owalne, i elipsoidalne o wymiarach 2—3 \x na 4—11 \x. Zawieraja po kilka drobnych lipoidalnych granulek.56 331 5 6 Nazwa podloza Szczep 09 Szczep C-5 Agar o wsiany Kolonie okragle o srednicy 5 mm brudno-rózowe, plaskie z wyraznie zaznaczonym srodkiem. Grzybnia podstawowa rózowawa, nieregularnie rozgaleziona. Grzybnia powietrz¬ na w postaci kilku strzepek tylko na srodku kolonii. Ko- nidiofory o dlugosci 0,75—5,5 \i bez lub z jednym podzia¬ lem poprzecznym wyrastaja pionowo z grzybni podstawo¬ wej. Glówki konidialne nieregularne o srednicy 7,5—22,5 pi.Konidia owalne, elipsoidalne lub zóltkowate. W starszych hodowlach sa wrzecionowate lub fusariopodobne. Czesto z jednym, niekiedy z dwoma podzialami poprzecznymi.Wymiary: 7—17 ^ na 2,5—4 (x. Cytoplazma konidii drobno granulowana.Kolonie okragle o srednicy 2—4 mm, bezbarwne, plaskie z wyraz¬ nie zaznaczonym srodkiem. Grzyb¬ nia podstawowa bezbarwna, niere¬ gularnie rozgaleziona, o srednicy 1—2,5 pi. Grzybnia powietrzna jest slabo rozwinieta i wystepuje tylko na srodku kolonii. Konidiofory wy¬ rastaja pionowo z grzybni podsta¬ wowej, posiadaja jeden podzial lub nie posiadaja zadnego. Wymiary: dlugosc 7,5—2,5 \i i srednica pod¬ stawy 1—1,2 ia. Glówki konidialne kuliste o srednicy 5—15 //, w star¬ szych kulturach zlepiaja sie two¬ rzac nieregularna glowe na kilku konidioforach. Konidia owalne, elipsoidalne o wymiarach 6—12 \i na 2—3 /u. Cytoplazma w równych granulkach.Przyklad I. Zarodniki szczepu Cephalospo- Tium sp. C-5 uzyskane z 10-dniowej hodowli na agarze skosnym Czapek Doxa zawieszono w 5 ml jalowej wody. Zawiesina ta posiano kolbe o po¬ jemnosci 1 1 wypelniona 100 ml pozywki o skladzie: 5 g ekstraktu drozdzowego, 5 g hydrolizatu enzy¬ matycznego krwi bydlecej i 500 ml brzeczki bro¬ warnianej o gestosci 8,7° Big. i woda do 1 000 ml.Kolbe umieszczono na trzesawce wahadlowej (100 ud./min., dlugosc wychylenia 8,5 cm) na 23 godziny w temperaturze 28°C do uzyskania obfitego wzro¬ stu. Hodowli tej uzyto do posiania 5 kolb jednoli- trowych wypelnionych po 200 ml pozywki o skla¬ dzie: 5 g ekstraktu drozdzowego, 5 g hydrolizatu enzymatycznego krwi bydlecej, 250 ml brzeczki browarnianej o gestosci 8,7° Big. i woda do 1000 ml. Kolby umieszczono na trzesawce i inkubowano w tych samych warunkach co pierwsze stadium.Po 23 godzinach, gdy wzrost byl obfity, dodano do kazdej kolby po 60 mg 17a-metylptestoteronu roz¬ puszczonego w 2,5 ml metalu. Zawartosc kolb in¬ kubowano w tych samych warunkach przez 23 godziny, to jest do chwili, gdy chromatografia bi¬ bulowa wykazala wylacznie jedna plame zli-po- chodnej 17cc-metylotestosterenu, po czym zawartosc kolb ekstrahowano kilkakrotnie po 40 ml chloro¬ formu. Ekstrakt osuszono bezwodnym siarczanem sodowym i odparowano pod zmniejszonym cisnie¬ niem. Pozostalosc po rozpuszczeniu w mieszaninie cykloheksan — benzen 1:1 oczyszczono na kolumnie chromatograficznej z tlenku glinowego o aktyw¬ nosci III stosujac do elucji benzen z wzrastajacym dodatkiem etanolu. Sklad frakcji kontrolowano za pomoca chromatografii cienkowarstwowej. Frakcje zawierajace czysta Zli^pochodna odparowano do su¬ cha, uzyskujac 270 mg l-dehydro-17a-metylotesto- steronu. Po krystalizacji z etanolu produkt wyka¬ zywal temperature topnienia 159—161°C, E = 15200 iprzy ;max = 243, [a] JJ= + 2,0° (chloroform, c = 1).Przyklad II. Do hodowli szczepu Cephalospo- 45 50 rium sp. C-9, uzyskanej w sposób analogiczny do sposobu opisanego w przykladzie I dla Cephalospo- rium sp. C-5, dodano do kazdej z 5 kolb po 60 mg 17a-metylotestosteronu rozpuszczonego w 2 ml me¬ tanolu, po czym zawartosc kolb inkubowano po¬ nownie w ciagu 24 godzin w warunkach podanych w przykladzie I. Po kilkakrotnej ekstrakcji chloro¬ formem polaczone ekstrakty osuszono za pomoca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowano pod zmniejszonym cisnieniem, po czym pozostalosc oczyszczono chromatograficznie w sposób opisany w przykladzie I, uzyskujac 274 mg 1-dehydro- -17a-metylotestosteronu. Po krystalizacji z etanolu produkt wykazywal temperature topnienia 160— 161°C, E = 15250 przy (chloroform, C = 1). ^max = 243, [a]^°=+l,9 65 Przyklad III. Do hodowli szczepu Cephalo- sporium sp. C-9, uzyskanej w sposób analogiczny do sposobu opisanego w przykladzie I dla Cepha- losporium sp. C-5, dodano do kazdej z 5 kolb po 40 mg androsten-4-dionu-3,17 rozpuszczonego w 2 ml metanolu, po czym zawartosc kolb inkubowa¬ no ponownie w ciagu 24 godzin w warunkach po¬ danych w przykladzie I. Po kilkakrotnej ekstrakcji chloroformem polaczone ekstrakty osuszono za po¬ moca bezwodnego siarczanu sodowego i odparowa¬ no pod zmniejszonym cisnieniem, po czym pozo¬ stalosc oczyszczono chromatograficznie w sposób opisany w przykladzie I, uzyskujac androstadien- -l,4-dion-3,17 z wydajnoscia 78%. Po krystalizacji z metanolu produkt wykazywal temperature top¬ nienia 137—139°C, E = 15200 przy Xmax = 243, M]5= + 116° (chloroform, c = 1).Przyklad IV. Przygotowano hodowle podpo- wierzchniowa szczepu Cephalosporium sp. C-5 w sposób opisany w przykladzie I, po czym grzybnie oddzielono od brzeczki przez odwirowanie przy 3000 obr./min. w ciagu 20 minut i plyn znad grzyb¬ ni zlano. Grzybnie z kazdej kolby zawieszono w7 56 331 8 100 ml 0,03 molarnego buforu fosforanowego o war¬ tosci pH = 7 i do zawiesiny dodano po 60 mg 17a-metylotestosteronu w 2 ml metanolu. Zawar¬ tosc kolb inkubowano na trzesawce w temperatu¬ rze 28°C w ciagu 18 godzin, to jest do chwili, gdy chromatogram na bibule nie wykazal obecnosci substratu, lecz jedynie plame produktu. Po ekstrak¬ cji chloroformem, odparowaniu rozpuszczalnika i oczyszczeniu chromatograficznym w sposób opi¬ sany w przykladzie I otrzymano zli-pochodna 17a-metylotestosteronu z wydajnoscia 92°/o. Po krystalizacji z etanolu produkt wykazywal tempe¬ rature topnienia 160,5—162°C, E = 15350 przy 2max = 243, [a]^°= + 2,0° (chloroform, c = 1). PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania zwiazków zlM-3-ketostery-- dowych szeregu androstanu metoda mikrobiolo¬ giczna, znamienny tym, ze zwiazek Zl4-3-ketostery- dowy szeregu androstanu poddaje sie dzialaniu ho¬ dowli szczepu Cephalosporium sp. C-5 lub Cepha- losporium sp. C-9, lub zawiesiny grzybni tych mi¬ kroorganizmów w wodzie z ewentualnym dodat¬ kiem substancji buforowych lub otrzymanych z niej preparatów enzymatycznych, w obecnosci tlenu powietrza w warunkach konwencjonalnych, po czym otrzymany produkt wyodrebnia sie-* i oczyszcza w znany sposób. 5 10 Bltk 3:67/68 310 egz. A4 PL