PL52722B1 - - Google Patents

Description

Podczas gdy naturalna kortikotropine mozna 35 oczyscic tylko uciazliwymi i drogimi metodami i praktycznie zawsze jeszcze zawiera wysokocza- steczkowe bialkowe zanieczyszczenia, które moga spowodowac grozne reakcje anafilaktyczne, to no¬ wy syntetyczny zwiazek moze byc otrzymany bez- 40 posrednio w stanie bardzo czystym bez jakichkol¬ wiek zanieczyszczen cialami o charakterze bialko¬ wym. Poza tym wytwarzanie nowego syntetyczne¬ go zwiazku jest niezalezne od dysponowania gru¬ czolami przysadki mózgowej, których otrzymanie 45 jest ograniczone i drogie.Szczególna zaleta jest fakt, ze nowy tetrakoza¬ peptyd w pozycji 4 nie zawiera reszty metioniny tak jak znany juz zwiazek 1 - serylo - 1 - tyrozylo- 1 - serylo - 1 - metionylo - 1 - glutamylo - 1 - hi- 50 stydylo - 1 - fenyloalanilo - 1 - arginilo - 1 - trypto- fanylo - glicylo - 1 - lizylo - 1 -prolilo - 1 - walilo- -glicylo - 1 - lizylo - 1 - lizylo - 1 - arginilo - 1 - ar¬ ginilo - 1 - prolilo - 1 - walilo -1 - lizylo - 1 - wa¬ lilo - 1 - tyrozylo - 1 - prolfna i naturalne ACTH. 55 Reszta metioniny jak wiadomo latwo sie utlenia i wskutek tego wymienione substancje przeksztal¬ caja sie w postac nieaktywna. Nowy polipeptyd otrzymany wedlug wynalazku zawiera reszte nor- leucyny, która posiada te same steryczne wlasci- 6C wbsci jak reszta metioniny, natomiast jest odpor¬ na na utlenienie. Nowy zwiazek moze byc podob¬ nie jak naturalne ACTH podany w postaci prepa¬ ratu ó przedluzonym dzialaniu, na przyklad z ze- lzrtyfia/ karbometoksyceluloza, kwasem poligalak- 65 turonowym lub innymi wyfcOkoczattetikowyini zwiazkami, zawierajacymi grupy kW*fW0.W ponizszych przykladach objasniajacych spo¬ sób wedlug wynalaku zastosowano nastepujace skróty: cbo = karbobenzoiloksy tri = trityl = trójfenylometyl (fer) = formyl (przy grupie a-amindwej lizyny) (toz) = tozyl — p-toluenosulfonyl (przy grupie gua- nidynowej argininy) ctb = III rzed. butyloksy ocp — 2, 4, S-trójchlorofenoksy arg = 1-arginil glu = 1-glutamyl gli = glicyl his = 1-histydyl IIz = lrli2yI nie = 1-norleucyl fe = l-fenylpalanil pro = 1-prolil ser = 1-seryl try —l-tryptofanyl tyr = 1-tyrozyl wal =*l-wattl leu = 1-leucyl ala = 1-alanil Przyklad I. Synteze objasniono na rysunku a) H-wal-gli-(for) liz-(for) liz-arg-arg-pro-OH 12 g cbo-wal-gli-(for) liz-(for)liz-(toz)arg-(toz) arg-pro-OH rozpuszcza sie w 5 litrach suchego cie¬ klego amoniaku i podczas silnego mieszania dodaje kawalki sodu az do trwalego, ciemnoniebieskiego zabarwienia. Nastepnie dodaje sie 2 g chlorku amonowego, odparowuje amoniak, suszy pozosta¬ losc w wysokiej prózni i rozpuszcza w 250 ml 0,2 n kwasu octowego. Nieorganiczne sole usuwa sie we¬ dlug Dixona (Biochem. Biophys. Acta 34, 251 (1959)), odparowuje uwolniony od soli roztwór, rozpuszcza pozostalosc w metanolu i wytraca przy pomocy ete¬ ru etylowego. Otrzymuje sie octan H-wal-gli-(for) 22 liz-(foT)liz-arg-arg-pro-OH [aj D = — 49 w 1-n kwasie octowym. b) H-glu-(otb)-his-fe-arg-try-gli-(for) liz^pró-OH 10 g cbo-his-fe-ttoz)arg-try-gli-(for) liz-pro-OH rozpuszcza sie w 5 litrach suchego, cieklego amo¬ niaku, dodaje kawalki sodu az do trwalego niebie¬ skiego zabarwienia. Nastepnie zadaje sie calosc chlorkiem amonowym, odparowuje roztwór, roz¬ puszcza pozostalosc w 0,2 n kwasie octowym, usu¬ wa nieorganiczne sole wedlug Dixona (Biochem.Biophys. Acta 34, 251 (1959)), . odparowuje pozba¬ wiony soli roztwór, rozpuszcza pozostalosc w mata- nolu i wytraca za pomoca eteru etylowego. Otrzy¬ muje sie jednooctan H-his-fe-arg-try-gli-(for) liz- 22 -pro-OH (temperatura topnienia 180°C; [a] D = — —25° w 1 n kwasie octowym), który rozpuszcza sie z 4 g cbo-glu-(otb)-ocp w 50 ml dwumetylóforma^ fnidu. Pozostawia sie przez dwa dni w temperatu¬ rze pokojowej, zadaje eterem * etylowym, saczy 1 otrzymuje 7,1 g cbo-glu-(otb)-his-fe-arg-try-gii- -(for)liz-pro^OH, która rozpuszcza sie w 200 ml "dwumetylófdrmamidu i uwodornia w obecnoscium katalizatora palladowego. Po odsaczeniu 1 przemy¬ ciu eterem etylowym otrzymuje sie octan H-glu (otb)-his-fe-arg-try-gli-(for) liz-pro-OH (tempera- 22 tttra topniwiia 190gC; [aj D = —19° w 1 n kwasie octowym). c) tri-ser-tyr-aer-nle-ghi- -(for) liz-pro-wal-giMforJliz-(for) liz-arg-arg-pro- -OH. 0 g octanu H-glu liz-pro-OH i 6 g tri-ser-tyr-ser-nte-N, rozpuszcza ^ sie w 50 ml dwumetyloformamidu, pozostawia w ciagu 16 godzin, odparowuje i krystalizuje pozo¬ stalosc z goracego metanolu. Otrzymuje sie 5,1 g octanu tri-ser-tyr-ser-nle-glu(otb)-his-fe-arg-try- -gli-(for)liz-pro-OH (temperatura topnienia 220°C; 15 22 [a] D = — 23° w dwumetyloformamidzie), który rozpuszcza sie w 50 ml dwumetyloformamidu i za¬ daje 1 g kwasu trójmetylooctowego.W wysokiej prózni odparowuje sie do polowy objetosci, chlodzi do —5° i zadaje 0,36 g chlorku trójmetyloacetylu i 0,3 g trójetyloaminy. Po 10 mi¬ nutach zadaje sie roztworem 2,8 g octanu H-wal- -gli-(for) liz-(for) liz-arg-arg-pro-OH i 0,3 ml trój¬ etyloaminy w 200 ml dwumetyloformamidu. 25 Pozostawia sie w ciagu 4 godzin i wytraca ace¬ tonem. Otrzymuje sie trójmetylooctan tris-ser-tyr- -ser-nle-glu-(otb)-his-fe-arg-try-gli-(for) liz-pro- -wal-gli-(for)liz-(for) liz-arg-arg-pro-OH, który mozna oczyscic przez saczenie przez kolumne z ze- ^ lem krzemionkowym w 50% wodnym roztworze metanolu. 20 35 40 Przyklad ^11. 4 g tri-ser-tyr-ser-nle-glu(otb)- -his-fe-arg-try-gli-(for) liz-pro-wal-gli-(for) liz- -(for)-liz-arg-arg-pro-OH rozpuszcza sie w 40 ml dwumetyloformamidu, dodaje 40 ml pirydyny i 0,6 g kwasu toluenosulfonowego, odparowuje w wy¬ sokiej prózni do polowy objetosci, chlodzi do —5° i zadaje roztworem 4 równowazników H-wal-(for)- -liz-wal-tyr-pro-otb i 1 g dwucykloheksylokarbo- dwuimidu. Pozostawia sie przez noc i zadaje ace¬ tonem.Nastepnie saczy sie, suszy w wysokiej prózni i otrzymuje 4 g tri-ser-tyr-ser-nle-glu-(otb)his-fe- 45 -arg-try-gli-(for)liz-pro-wal-gli-(for) liz-(for) liz- arg-arg-pro-wal-(for)liz-wal-tyr-pro-otb, które o- grzewa sie w 3 litrach 0,1 n kwasu solnego pod¬ czas 3 godzin w temperaturze 100° bez dostepu tlenu. 50 Odparowuje sie w prózni, przemywa sie pozosta¬ losc acetonem i eterem etylowym i suszy w prózni.Po rozdziale przeciwpradowym w ukladzie kwas trójfluorooctowy (II rzedowy butanol) woda (1:120: :160) otrzymuje sie 2,5—3,0 g glównej frakcji, któ- 55 ra wykazuje aktywnosc kortikotropiny i która za¬ chowuje sie jak substancja jednorodna przy chro¬ matografii i elektroforezie. Migracja przy elektro¬ forezie bibulowej przy pH 5,8 i 40 v/cm wynosi 60 mm (uzyta jako substancja wzorcowa histydy- «o na wedruje 70 mm).Migracja przy elektroforezie bibulowej przy pH 1,9 i 40 v/cm wynosi 93 mm (uzyty jako substan¬ cja wzorcowa kwas glutaminowy wedruje w tych 65 samych warunkach dl ifira). Otrzymuje sie poli- peptyd o wzorze H-ser-tyr***r-itle-ghi-his-»f**arg- try - gli - liz - ptd - wal - gli - liz .liz - arg - arg- -pro - wal - Hz - wal - tyr =¦ ftro- OH* *o kwasnej hy¬ drolizie w temperaturze 110° podczas 16 godzin daje on nastepujacy frklM aminokwasów; ser2 9 tt*2,o nleu «ltfo,9 hKi fei.o ¦«¦*.! *»*• liz3.9 P*0*,* wal3,f Otrzymany produkt moze byc uiywany jako taki lub po przeprowadzeniu w inna Sdl Przechowywa¬ ny moze byc w stanie stalym w roztworze lub ja¬ ko adsorbat. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego polipeptydu 1-se- rylo - 1 - tyrozylo - 1 - serylo - 1 - norleucylo - 1 - glutamylo - 1 - histydylo - 1 - fenyloalanilo - 1 - arginilo - 1 - tryptofanylo - glicylo - 1 - li¬ zylo - 1 - prolilo - 1 - walilo - glicylo - 1 - lizy- lo - 1 - lizylo - 1 - arginilo - 1 - arginilo - 1 - prolilo - 1 - walilo - 1 - lizylo - 1 - walilo - 1 - tyrozylo - 1 - proliny, znamienny tym, ze od estru III rzed. butylowego R - 1 - serylo - I - tyrozylo - 1 - serylo - 1 - norleucylo - y - o - III rzed butylo - 1 - glutamylo - 1 -- histydylo - 1 - fenyloalanilo - 1 - arginilo - 1 - tryptofanylo - glicylo - e - N - formylo - 1 - lizylo - 1 - pro¬ lilo - 1 - walilo - glicylo - e - N - formylo - 1 - lizylo - s - N - formylo - 1 - lizylo - 1 - arginilo - 1 - arginilo - prolilo - 1 - walilo - e - N - for¬ mylo - 1 - lizylo - 1 - walilo - 1 - tyrozylo - 1 - proliny, w którym R oznacza grupe zabezpie¬ czajaca wolna grupe aminowa, odszczepia sie grupy ochronne w kwasnym srodowisku w jed-: nym lub kilku stopniach.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze grupy ochronne odszczepia sie od pochodnej, w której grupe ochronna R stanowi grupa kar- bobenzoiloksylowa, acetylowa, formylowa, kar- bo- III rzed.butoksylowa, p-nitrokarbobenzoilo- ksylowa lub trójfenylometylowa.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze grupy ochronne odszczepia sie od estru III rzed. butylowego N - R - 1 - serylo - 1 - tyrozylo -1 - serylo - 1 - norleucylo - y - o - III rzed. buty¬ lo - 1 - glutamylo - histydylo - 1 - fenyloalani¬ lo - 1 - arginilo - 1 - tryptofanylo - glicylo - s- N - formylo - 1 - lizylo - 1 - prolilo - 1 - walilo- glicylo - s - N - formylo - 1 - lizylo - 1 - argi¬ nilo - 1 - arginilo - 1 - prolilo - 1 - walilo - s - N - formylo - 1 - lizylo - 1 - walilo - 1 - tyro¬ zylo - 1 - proliny, w którym R ma wyzej poda¬ ne znaczenie, wytworzonego na drodze reakcji estru III rzed. butylowego 1 - walilo - e - N - formylo - 1 - lizylo - 1 - walilo - 1 - tyrozylo -1 - proliny z N - R - 1 - serylo - 1 - tyrozylo - 1 - serylo - 1 - norleucylo - y - o - III rzed. buty¬ lo - 1 - glutamylo - 1 - histydylo - 1 - fenylo¬ alanilo - 1 - arginilo - 1 - tryptofanylo - glicy¬ lo - e - N - formylo - 1 - lizylo - 1 - prolilo - 1 - walilo - glicylo - e - N - formylo - 1 - lizylo - e - N - formylo - 1 - lizylo - I - arginilo - 1 -52722 7 8 argiriilo - 1 - prolina, w której R ma wyzej po¬ dane znaczenie, otrzymana na drodze konden¬ sacji N-- R - 1 - serylo - 1 - tyrozylo - 1 - sery- lo - 1 - norleucylo - y - o - III rzed. butylo - 1 - glutamylo - 1 - histydylo - 1 - fenyloalanilo - 1 - 5 arginilo - 1 - tryptofanylo - glicylo - s - N - for¬ mylo - 1 - lizylo - 1 - proliny, w której R ozna¬ cza grupe ochronna, korzystnie grupe benzoilo- ksylowa, acetylowa, formylowa, karbo - III - rzed. butoksylowa p - nitrokarbobenzoiloksylo- 10 wa lub trójfenylornetyIowa, z 1 - walilo - glicy¬ lo - e - N - formylo - 1 - lizylo - s - N - formy- lo - 1 - lizylo - 1 - arginilo - 1 - arginilo - 1 - prolina, która z kolei wytwarza sie przez reak¬ cje pochodnej heptapeptydu o wzorze N - kar- bobenzoiloksy - 1 - walilo - glicylo - s - N - formylo . 1 - lizylo - e - N - formylo - 1 - lizy¬ lo - N - tozylo - 1 - arginilo - N - tozylo - 1 - arginilo - 1 - proliny z sodem w suchym ciek¬ lym amoniaku.toz h cboj his -fe - arg -try- qtl - Uz - pro A OH otb for cbotglu Aocp h\ his -fe - arg -try - qh -Uz -pro \0H otb /?' cbolglu-his - fe -qrg - try - git - U z -pro \OH otb tri -| 5er - tyr - ser - nie |/V3 H otb _& glu -hts - fe - arg - try -git - Uz ' pro -\°H CboA wal - gli - Liz - liz -org - org - pro -+0H (or for toz toz frr f?r 9? tri A ser- tyr - ser - nie -glu - his - fe - arg - try - 9** - Ux - pro A OH hi ] wal -qli - liz - lit - arg - arg - pro -4-OH otb t? (or for F?r tri ber-tgr - ser - nie - glu -his - (e - org - try - gil -Ul - pro - ual - git - Uz -liz -arg-arg -pro -\0H H wal -liz h/o/ -tyr- pro l otb tri- H- otb ser - t(yr - Ser - nie - qlu - his ser - tyr - ser - nie -glu -his '(e -fe - arg - try - arg - try -9'< -9i, for ~ClX, -pro -wal - qli -Li/Jt - pro - wal - qtt ff - liz -liz For -liz -hz - arg - arg - pro - arg - arg -pro for hr-al - liz — hfol - Uz — m/ - tyr - pro A h/ol - tur -pro \ PL