Sposób kapsulkowania olejów w komórkach drozdzowych. Przedmiotem wynalazku jest sposób kapsulkowania olejów w komórkach drozdzowych. Oleje jadalne tradyc:jnie stanowia. uznane i cenione zródlo energii oraz skladników odzywczych w diecie czlowieka. Wynika to z ich ogólnej dostl;pnosci, umiarkowanej kosztochlonnosci oraz cz.;;sto bogactwa skladnikó,, o frmkcjach prozdro,, otnych. W sród olcjó,, jadalnych szczególne zainteresowanie posw1.;;ca si.;; olejom bogatym w wielonienasycone kwasy tluszczo,,e z rodzajów omega-3 i omega-6, które posiadaja. powszechnie znany i dobrze udowodniony naukowo wplyw na ograniczenie ryzyka wystapienia wielu chorób. Technologia zywnosci tzw. funkcjonalnej (prozdrowotnej) od wielu lat rozwija sie w kierunku wzbogacania produktów w oleje lub ich mieszanki, zawierajace optymalne ilosci kwasów wielonienasyconych takich jak kwas eikozapentaenowy (EPA), dokozaheksaenowy (DHA), linolowy (LA), alfa-linolenowy (ALA) i innych. Poszukuje sie naturalnych zródel tych kwasów, które najczesciej stanowia oleje pozyskiwane z organizmów i mikroorganizmów morskich oraz oleje tloczone z nasion roslin oleistych. Ich powszechne stosowanie w zywnosci jest jednak ograniczone z powodu ich niestabilnosci. Kwasy tluszczowe wielonienasycone ulegaja szybkiemu utlenianiu w typowych warunkach produkcji, pakowania i przechowywania zywnosci, szczególnie w warunkach dostepu tlenu, swiatla oraz w podwyzszonej temperaturze. Produkty utleniania tych kwasów prowadza do pogorszenia jakosci sensorycznej (tworzenie niepozadanych zwiazków wplywajacych na aromat produktu oraz smak), obnizaja stabilnosc przechowalnicza i wplywaja na ogólne obnizenie jakosci produktów wzbogaconych w oleje jadalne. Kolejnym utrudnieniem w zastosowaniu olejów jadalnych w zywnosci jest ich nierozpuszczalnosc w wodzie, co utrudnia ich szerokie zastosowanie w produktach, szczególnie produktach suchych i o wysokiej zawartosci wody. Mikrokapsulkowanie jest metoda stabilizacji hydrofobowych (np. oleje jadalne, witaminy, olejki eteryczne) oraz hydrofilowych substancji lub skladników zywnosci poprzez ich otaczanie inna substancja, tzw. matryca lub nosnikiem. Powoduje to wytworzenie ukladu, w którym substancja chroniona, np. olej, jest otoczona ciagla lub nieciagla bariera z innej substancji. Kapsulkowanie ma za zadanie przede wszystkim ograniczenie parowania, maskowanie nieakceptowalnego smaku lub aromatu, albo poprawe niektórych parametrów, na przyklad rozpuszczalnosci. PL 440018 A1 2/26Stosowane w przemysle spozywczym i farmaceutycznym technologie mikrokapsulkowania mozna podzielic na dwie glówne grupy: fizykochemiczne i mechaniczne. Do pierwszej grupy zaliczaja sie metody oparte na zastosowaniu emulsji, koacerwacji, ekstruzji i tworzeniu kompleksów wlaczeniowych. Do drugiej grupy naleza metody fizyczne wykorzystujace suszenie i zestalanie rozpylowe, liofilizacje oraz otoczkowanie fluidalne. Obiecujaca alternatywe dla dotychczas stosowanych technologii mikrokapsulkowania moze stanowic wykorzystanie struktur komórkowych jako naturalnych, wstepnie uformowanych nosników dla róznorodnych substancji aktywnych. Sposród szeregu nosników tego typu najwiecej uwagi poswieca sie zastosowaniu komórek mikroorganizmów, przede wszystkim grzybów, bakterii oraz alg. Biomasa drozdzy piekarskich, ze wzgledu na swój niski koszt, latwosc pozyskania i powszechna akceptowalnosc w produktach spozywczych, moze stanowic atrakcyjna alternatywe dla substancji chemicznych stanowiacych nosnik (otoczke) hydrofobowych olejów jadalnych. W ogólnym zarysie, procedura tej metody mikrokapsulkowania zostala opracowana przez Bishop i in. (1998) i sklada sie z kilku etapów, z których najistotniejszym jest moment inkubacji wodnej emulsji lub dyspersji substancji kapsulkowanej z odpowiednio przygotowana biomasa drozdzowa. W trakcie inkubacji zachodzi proces biernego (pasywnego) wnikania kapsulkowanych zwiazków do wnetrza komórek i ich immobilizacji w formie zwiazanej z strukturami komórki lub w formie kropel wewnatrzkomórkowej emulsji. Osiagane ta metoda wydajnosci zwykle oscyluja w granicach 20-40% wag. zawartosci kapsulkowanej substancji w gotowym produkcie. Biomasa drozdzowa, przed jej zastosowaniem jako nosnika dla substancji hydrofobo"ych, musi zostac poddana obróbce ,vstc;pnej polegajacej na zabiegach majacych na celu standaryzacje; i usunic;cie uszkodzonych lub pofragmentowanych komórek, a takze resztek podlozy hodo,danych i innych substancji mogacych znajdov\ ac sic; \\ ,,surowej" biomasie. Naty,rne komórki drozdzowe \\ ykazuja ograniczona zdolnosc do biernego \\Chlaniania i magazynov\ania substancji hydrofobowych, dlatego przed procesem poddaje sie je obróbce majacej zwiekszyc porowatosc komórek oraz przestrzen wewnatrzkomórkowa dla substancji magazynowanych. Zabiegi te polegaja najczesciej na usuwaniu rozpuszczalnych skladników komórki na drodze autolizy, plazmolizy lub hydrolizy, a takze na dzialaniu enzymami i detergentami, zwiekszajacymi przepuszczalnosc sciany i blony komórkowej komórek drozdzowych. Znane jest rozwiazanie wedlug RU2678130 w jakim slodycze takie jak „Kremowe Toffi" wytwarzane sa z wykorzystaniem metody produkcji kapsulkowanego oleju roslinnego obejmuja produkcje mieszanki bialkowo-polisacharydowej BPS z suchej serwatki, gumy arabskiej, karageniny i gumy ksantanowej oraz PL 440018 A1 3/26wody, a nastypnic podgrzanie mieszanki do 60°C i pycznicnic przez --l-0-60 minut. Nastypnic BPS rzepaku, siemienia lnianego, oleju z orzecha wloskiego i ich mieszanin. Do BPS ,vprowadzana jest druga czysc substancji slodzacych: sorbitolu, ksylitolu i izomaltu, a calosc jest mieszana. Po,, staly syrop podgrzcv,a siy i gotuje do temperatury 110-115 °C. Do gotowanego syropu wprowadza sie melase i olej roslinny. Mase utrzymuje sie w temperaturze ll3-l l5°C. nastepnie schladza do 90-l00°C i ,,ykonuje sie z niej kapsulki. Znany j_;st tez wynalaz_;k NZ2393--l-9 v, jakim ni_;rozpuszezalne kapsulki utworzone z hydrofilow_;go materialu koloido\\ego i mieszanki polimerÓ\\ pochodzacych z rozkladu polisacharydó\\: produkty olejne ,, kapsulkach: zastosowano do powlekania papieru i zywnosci. Pochodne polisacharydów o krótkim lancuchu. takie jak hydrolizaty jonowych pochodnych celulozy. stosuje sie do tworzenia kapsulek przez polaczenie pochodnych polisacharydu o krótkim laf1cuchu z innym polimerem. Substancje przeznaczone do kapsulkowania sluza jako ja.dra, wokól których tworza siy kropelki koaccrnatu. Naladowany polimer o krótkim lal'1cuchu zawiera produkty degradacji pochodnych polisacharydów o srednim stopniu polim_;ryzacji ,v zakresie od 3 do okolo 500. \\' zgloszeniu Luawniono sposoby stosowania kapsulek do dostarczania lub przechm\ywania. okjów i innych substancji. \Vyna.la.zek ujawnia róvvniez zastosowani_; kapsulek w produktach spozywczych, paszo\\ ych, farmaceutycznych, kosmetycznych i higieny osobistej oraz w powlekaniu papieru mikroskopijnymi pekaja.cymi kapsulkami zawieraja.cymi plyn drukarski. Znane metody pozwalaja co prawda na kapsulkowani_; w zela.tynie lub innych substancjach miydzy innymi olejów. jednak jak pokazuja przeprowadzone analizy i badania, efektywna. przenikalnosc czv zdolnosc do m,alniania zakapsulkowanej substancji siega najczesciej 5-10%. Przeprowadzone badania mialy na celu opracowanie nowej metody. w oparciu o wykorzystanie biomasy drozdzy piekarskich ('laccharomyces ccrcvisiae), blendów olejów tloczonych na zimno o cechach prozdrowotnych z wykorzystaniem blcndó,v zawierajacych zoptymalizm,anc mieszaniny olejów, jakie zawieraja olej ryzowy w ilosci od 39 do 91 % wagowych, jaki zmieszany jest korzystnie z olejem rzepakowym w ilosci od 39% do 55% wagowych, korzystnie 45% wagowych, albo korzystnie z olejem konopnym w ilosci od 8% do 28% wagowych, korzystnie 15% wagowych albo korzystnie z olejem lnianym w ilosci od 9% do 14% wagowych, korzystnie 11 % wagowych albo korzystnie z olejem rydzowym w ilosci od 10% do 15% wagowych, korzystnie 12% wagowych, przy czym, w przypadku zastosowania oleju konopnego sklad mieszaniny uzupelniony jest do 100% olej em rzepakowym, a wzajemny stosunek kwasów tluszczowych omega 6 do omega 3 (w6/w3) opracowanej blendy zawarty jest w przedziale od 4: 1 do 6: 1. Sposób kapsulkowania blendów w komórkach drozdzowych wedlug wynalazku polega na tym, ze PL 440018 A1 4/26material wyjscimvy, jaki stanowia drozdze piekarskie, korzystnie prasowane drozdze piekarskie o zawartosci suchej masy nic mniejszej niz 25% ,,agmvych, poddaje si-; procesowi plukania i suszenia liofilizacyjnego. Biomas-; \\ st-;zcniu 10~ o "ag. plucze si-; \\ 0,0 IM roztworze bcz\\odncgo \\Odorofosforanu dipotasu o pH 6,8, po czym oddziela siy na drodze wirmvania (3950 x g, 10 min) i uzyskana. mase o zawartosci suchej substancji nie mniejszej niz 20% wag. umieszcza sie na stalowych tacach liofilizacyjnych i zamraza w temp. -80°C przez 12 h. Zamrozona. biomase poddaje sie liofilizacji przy cisnieniu OJ)6 mbar przez 48 h. W uzyskanym proszku oznacza sie metoda ekstrakcji odczynnikiem Fol cha zawartosc lipidów calkowitych, która wynosila 4,7 ± 0,55 g I 00 g 1 proszku, oraz liczebnosc calkowita komórek metoda oparta o bezposredni pomiar w komorze Ncubaucra, w·ynoszaca 3,6 X 10 g· 1 proszku Nast-;pnic prowadzi si-; obróbk-; ,vst-;pna biomasy. tak, ze ,v 10% wag. za\\icsinic suchej masy drozdzy o pH 5,2, ,v butlach szklanych typu „pyrex'', inkubuje si-; zmvicsim; ,, tcmpcraturzc nic mnicjszcj niz 35°C i nie ,vyzszej niz 75°C. Równoczesnie korzystnie, gdy stosuje sie dodatek octanu etylu lub chlorku sodu do wspomagania procesu ekstrakcji skladników wewnatrzkomórkowych (plazmolizy). Korzystnie do biomasy dodaje sie dodatek octanu etylu o wielkosci w ilosci od 0_5 do 6_5% wag. (w stosunku do masy zawiesiny) oraz dodatek chlorku sodu w ilosci od 5 do 40% wag .. po czym prowadzi sie plazmolize w temperaturze nie mniejszej niz 50°C. i nic wyzszej niz 60°C., korzystnie w trakcie procesu plazmolizy stosuje sic; temperatur<; 55°C. Nast-;pnic " proccs1c hydrolizy enzymatycznej, przygotowana wczesnie.i zaw1csm-; drozdzowa poddaje siy wstepnej pasteryzacji ,v 95°C przez 10 minut celem inakty\\ acji endogennych enzymów. Do tak przygotowanej biomasy dodaje sie glukanaze (Glucanex R200: 0.2 U/mg) w ilosci od 0,0015 do 1.5% wag .. po czym prowadzi sie inkubacje w temperaturze od 45°C do 55°C. korzystnie 50°C przez nie krócej niz 24 h. Nastepnie prowadzi sie proces wiazania blendów olejów w biomasie drozdzy piekarskich metoda Bishop i in. (1998), przy czym w naczyniach typu „pyrex" o pojemnosci 100 ml odwaza sic; porcje; 40 g wody dejonizowanej zawierajacej 2% wag. dodatku emulgatora w postaci monooleinianu polioksyetylenosorbitolu (Tween 80, E433), dopuszczonego do zastosowania w zywnosci, i dodaje sie nawazke blendu olejów, po czym wytwarza sie emulsje typu o/w metoda homogenizacji rotor/stator przez minut przy predkosci I O OOO min• 1 w homogenizatorze szybkoobrotowym. Przy czym przez blendy olejowe rozumie sie mieszaniny olejów, jakie zawieraja olej ryzowy w ilosci od 39 do 91 % wagowych, jaki zmieszany jest korzystnie z olejem rzepakowym w ilosci od 39% do 55% wagowych, korzystnie 45% wagowych, albo korzystnie z olejem konopnym w ilosci od 8% do 28% wagowych, korzystnie 15% wagowych albo korzystnie z olejem lnianym w ilosci od 9% do 14% wagowych, PL 440018 A1 /26korzystnie 11 % wagowych albo korzystnie z olejem rydzowym w ilosci od I 0% do I 5~1, ,vagowych, korzystnie 12~~ wagowych, przy czym, ,v przypadku zastosowania oleju konopnego sklad mieszaniny uzupelniony jest dol00% olcjGm rzepakowym, a ,vzajGmny stosunek k\rnsÓ\'V tluszczo,\ych omega 6 do omega 3 (w6/,d) opraco,\anej blendy za,varty jest w przedziale od 4: l do 6: l. Korzvstnie. gdv zastosowane blendy olejowe maja nastepujac, sklad ilosciowv: % % % Skladnik I Skladnik li Skladnik Ili wag wag wag Olej ryzowy Rzepakowy - 55 45 - Olej ryzowy Olej Rydzowy - 88 12 - Olej ryzowy Olej Lniany - 89 11 - Olej ryzowy Olej Konopny Rzepakowy 55 15 30 Do tak V\ ytworzoncj emulsji dodajG Sly odwazona porcjy liofilizowanej biomasy drozdzowej. Mieszanine kapsulku:ia.ca. inkubuje sie nastepnie przez czas nie krótszy niz 8 h i przy ciaglym mieszaniu równym 200 min 1 . Po zak01i.czeniu inkubacji. zawartosc naczyn oddziela sie od mieszaniny poreakcyjnej na drodze wirowania przy przyspieszeniu nie mniejszym niz 3950 x g przez okres nie krótszy niz I O min. Oddzielona paste drozdzowa plucze sie nastepnie co najmniej trzykrotnie woda dejonizowana celem usuniycia resztek mieszaniny reakcyjnej. Mokra biomasy przenosi siy do naczyi'1 do liofilizacji i zmraza w temp. -80°C przez 12 h., po czym liofilizuje przy cisnieniu 0,125 mbara przez min. 48 h. W uzyskanych lizatach oraz w hydrolizacie okreslono wydajnosc procGsu „rozpuszczania·· (YA), stezenie uwolnionego bialka ogólnego oraz uwolnion~j O-glukozy. bedacej produktem hydrolizy enzymatycznej beta-glukanów sciany komórkowej. Wyniki wyrazono w miligramach danej substancji na gram suchej masy ekstraktu drozdzowego (mg g· 1 ). Wydajnosc obróbki wstepnej mierzy sie posrednio, w oparem o ilosc (wage) substancji rozpuszczalnych w wodzie, uwolnionych z danej ilosci biomasy. W tym celu z kazdej butli pobrano l O ml zawiesiny i oddzielono biomase na drodze wirowania (3950 x g, 10 min). Objetosc zebranego supematantu zmierzono za pomoca cylindra miarowego, po czym pozostaly osad drozdzowy zawieszono w identycznej objetosci wody dejonizowanej i ponownie zwirowano. Uzyskane supernatanty polaczono i oznaczono w nim zawartosc suchej masy na drodze suszenia w 105°C, zgodnie z norma PN-A-79005-4: 1997P. Wydajnosc procesu autolizy okreslono jako procent suchej masy biomasy drozdzowej przeksztalcony do PL 440018 A1 6/26postaci rozpuszczalnej: gdzie: mE - masa ekstraktu, g, mY - masa zawiesiny drozdzowej, g, SM - sucha masa próbki, g. A-C MY[%waJ = (B x Bm) X 100% \V uzyskanym ekstrakcie o znanej zawartosci suchej masy, okreslono stc;zenie rozpuszczalnego bialka calkowitego oraz stezenie uwolnionej glukozy. Wyniki wyrazono w miligramach danej substancji na gram suchej masy ekstraktu drozdzowego (mgg- 1 ). Okreslenie ilosci bialka calkowitego w próbach prowadzono przy wykorzystani zmodyfikm,anej metody Lowry· ego. Do okreslenia i I osci uwolnionej glukozy wykorzystano metoda wysokosprawnej chromatografii cieczm,ej (HPLC) Stosowano kolumne Amine:x HPX87H (Bi o-Rad. USA) oraz 0,00) N H2S04 jako faze rnchoma. Pomiar ilosci O-glukozy okreslano na podstawie krz:nvej kalibracyjnej sporzadzonej dla czystej O-glukozy (kalibracja zc,vrn;;trzna). Pomiar ilosci blcndu olejów, kapsulko,\anego \\ewnatrz komórek drozdzy, wykonano metoda ekstrakcji w aparacie Soxhleta eterem naftowym. Na\\azke ok. 2,5 g (masa okreslona z dokladnoscia do d=0.00 lg) suchych mikrokapsulek umieszczono w celulozowej gilzie i zamknieto korkiem z waty szklanej. Ekstrakcje prowadzono przez 2 h za pomoca I 00 ml etem naftowego w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Uzyskany ekstrakt przeniesiono ilosciowo do v,yprazonej i wstepnie zwazonej (d=0.000 I g) kolby miarowej i odparowano rozpuszczalnik w temp. 40°C za pomoca rotacyjnej wyparki prózniowej. Zawa1tosc kolby suszono dodatkowo w 95°C przez godzirn;;. l\fasc; oleju uzyskanego z danej porcJl mikrokapsulek okreslono na podstawie róznicy\\ masach kolby zawierajacej olej oraz kolby pustej. Pomiar ilosci blendu olejów, wystepujacego na powierzchni mikrokapsulek drozdzowych, mierzono metoda szybkiej ekstrakcji heksanem. W tym celu nawazke 1 g suchych mikrokapsulek umieszczono w kolbie miarowej o pojemnosci 250 ml i napelniono 100 ml heksanu, po czym wytrzasano recznie przez 5 min. Komórki oddzielono poprzez filtracje przez bibule filtracyjna Nr 3 (Whatman). Pozostalosc biomasy plukano dodatkowa porcja heksanu (100 ml). Uzyskane ekstrakty laczono i, po przeniesieniu do kolby okraglodennej, okreslono ilosc pozyskanego oleju metoda identyczna jak dla ekstrakcji oleju z wnetrza komórek. Wydajnosc mikrokapsulkowania (ang. microencapsulation yield, MY) okreslono jako procentowy PL 440018 A1 7/26zawartosc kapsulkowanej substancji w danej masie mikrokapsulek i wyznaczano z ponizszego równania: A-C MY[%wag.] = (B X Bm) X 100% A - masa oleju pozyskanego w ekstrakcji metoda Soxhlcta, g, C - masa oleju pozyskana w ekstrakc_ji heksanem. g. B - masa nav,azki mikrokapsulek, g, Bm - sucha masa mikrokapsulek. g. Stabilnosc oksydacyjna blcndu olejów, stabilizowanego wewnatrz komórek drozdzy, mierzono w trakcie 30 dni przcchowy'\\ania \\ temperaturze pokojo,\cj i w ,vanmkach wilgotnosci\\ zgh;:dncj otoczenia V\ynoszacych O, 43 i 90~o. W tym celu nawazki suchych mikrokapsulek (10 g) rozsypano na szalkach Petriego o srednicy 5 cm i umieszczono \\ eksykatorach zawierajacych wyprazony zel krzemionkowy (0%i wilgotnosci wzglednej, w.w.). nasycony roztwór K2C03 (43% w.w.) lub KNO3 (90% w.w.). Co 5 dni pobierano ok. I g mikrokapsulek i. po pozyskaniu oleju na drodze ekstrakcji mierzono stopien utlenienia oleju poprzez pomiar liczby nadtlenkowej (LOO). zgodnie z procedura PN-ISO 3960: 1996P (Oleje i tluszcze roslinne oraz z"ierzece. Oznaczanie liczby nadtlenkm,ej ) Uzyskany wynik wyrazono jako mikrorównowaznik aktywnego tlenu na l kg oleju (mcq,O2-kg 1 ). \V celach porównawczych przcprmvadzono dos,\ iadczcnie dla natyv\ ncgo blcndu olejów vv formie zemulgowanej. Dla zminimalizowania ,vplywu ekstrakcji na \\zrost liczby nadtlenkowej zrczygnmvano z ekstrakcji metoda Soxhleta na rzecz ekstrakcji heksa.nem. W tym celu nawazke l g kapsulek za\\ieszono w 10 ml zimnego heksa.nu i dezintegrowano poprzez sonikacje przez 10 min przy uzyciu sonikatora. W trakcie procesu dezintegracji zawiesina byla chlodzona. w lazni lodowej celem zminimalizowania przyrostu temperatury. Uzyskany ekstrakt przesaczono przez bibule filtracyjna i plukano pozostalosc dwiema porcjami swiezego heksanu. Zebrane ekstrakty polaczono i odparm,ano rozpuszczalnik w strnmicniu azotu. Uzyskany olej przccho,\ywano \\ szczelnie zamknic;tym naczyniu ,v temperaturze -20°C. Rozwiazanie wedlug wynalazku przedstawiono w przykladach wykonania. Przyklad I Sposób kapsulkowania blendów w komórkach drozdzowych wedlug wynalazku polega na tym, ze material wyjsciowy, jaki stanowia drozdze piekarskie, korzystnie prasowane drozdze piekarskie o zawartosci suchej masy nie mniejszej niz 25% wagowych, poddaje sie procesowi plukania i suszenia PL 440018 A1 8/26liofilizacyjnego. Biomasc;; w stc;;zcniu 10% wag. plucze sic;; w 0,0 IM roztworze bez" odncgo wodorofosforanu dipotasu o pH 6,8, po czym oddziela sic;; na drodze wirowania (3950 x g, 10 min) i uzyskana masc;; o zawartosci suchej substancji nic mniejszej niz 20% ,, ag. umieszcza sic;; na stalowych tacach liofilizacyjnych i zamraza w temp. -80°C przez 12 h. Zamrozona biomase poddaje sie liofilizacji przy cisnieniu 0,06 mbar przez 48 h. W uzyskanym proszku oznacza sie metoda. ekstrakcji odczynnikiem Folcha zawartosc lipidów calkowitych. która wynosila 4. 7 ± 0.55 g I O O g 1 proszku. oraz liczebnosc calkowita. komórek metoda. oparta. o bezposredni pomiar w komorze Neubauera. ,,ynosza.ca. 3.6 X I owg- 1 proszku Nastc;;pnic prowadzi sic;; obróbkc;; wstc;;pna biomasy tak, ze w I 0% wag. za\\icsinic suchej masy drozdzy o pH 5,2, ,v butlach szklanych typu „pyrex", inkubuje sic;; zawicsinc;; ,, temperaturze nic mniejszej niz 35°C i nic wyzszej niz 75°C, korzystnie ,v temperaturze 55°C. Równoczesnie korzystnie, gdy stosuje sic;; dodatek octanu etylu lub chlorku sodu do wspomagania procesu ekstrakcji skladnikóvv wewnatrzkomórkowych (plazmolizy). Korzystnie do biomasy dodaje sie dodatek octanu etylu o ,,ielkosci w ilosci od 0,5 do 6,5% wag. (w stosunku do masy zawiesiny). korzystnie 1.5% \\ag .. oraz dodatek chlorku sodu w ilosci od 5 do 40% wag .. korzystnie I 0% \\ag .. po czym prowadzi sie plazmolize w temperaturze nie mniejszej niz 50°C i nie wyzszej niz 60°C. korzystnie w trakcie procesu plazmolizy stosuje sie temperature 55°C. Nastc;;pnic w procesie hydrolizy enzymatycznej, przygotowana wczesniej zawicsinc;; drozdzowa poddajc sic;; wstc;;pnej pasteryzacji w 95°C przez 10 minut celem inaktywacji endogennych enzymów. Do tak przygotowanej biomasy dodajc sic;; glukanazc;; (Glucanex R200: 02 U/mg) w ilosci od 0,0015 do L5~~ wag., korzystnie 0,15% wag., po czym prowadzi sie inkubacje w temperaturze od 45°C do 55°C, korzystnie 50°C przez nie krócej niz 24 h. Nastepnie prowadzi sie proces wiazania blendów olejów w biomasie drozdzy piekarskich metoda. Bishop i in. ( 1998). przy czym w naczyniach typu .,pyrex" o pojemnosci I 00 ml od,,aza sie porcje 40 g wody dejonizowanej za,,1era.1aceJ 2% wag. dodatku emulgatora w postaci monooleinianu polioksyctylcnosorbitolu (Twccn 80, E433), dopuszczonego do zastosowania w zywnosci, i dodaje sic;; nawazke blendu olejów, po czym wytwarza sie emulsje typu o/w metoda homogenizacji rotor/stator przez minut przy predkosci I O OOO min• 1 w homogenizatorze szybkoobrotowym. Przy czym przez blendy olejowe rozumie sie mieszaniny olejów, jakie zawieraja olej ryzowy w ilosci od 55% wagowych, jaki zmieszany jest korzystnie z olejem rzepakowym w ilosci 45% wagowych, a wzajemny stosunek kwasów tluszczowych omega 6 do omega 3 (w6/w3) opracowanej blendy zawarty jest w przedziale od 4: 1 do 6: 1. Korzystnie, gdy zastosowane blendy olejowe maja nastepujacy sklad ilosciowy: PL 440018 A1 9/26% % % Skladnik I Skladnik li Skladnik Ili wag wag wag Olej ryzowy Rzepakowy - 55 45 - Do tak \\ ytworzonej emulsji dodaje s19 odwazona porcj9 liofilizowanej biomasy drozdzowej. Mieszanine kapsulkujaca inkubuje sie nastepnie przez czas nie krótszy niz 8 h i przy ciaglym mieszaniu równym 200 min- 1 . Po zak011czeniu inkubacji. zawartosc naczyn oddziela sie od mieszaniny poreakcyjnej na drodze wirowania przy przyspieszeniu nie mniejszym niz 3950 x g przez okres nie krótszy niz er4wl O min. Oddzielona past9 drozdzowa plucze sic;: nastc;:pnic co najmniej trzykrotnie woda dejonizowana celem usuni9cia resztek mieszaniny reakcyjnej. Mokra biomas9 przenosi sic;: do naczy11 do liofilizacji i zmraza ,v temp. -80°C przez 12 h., po czym liofilizuje przy cisnieniu 0,125 mbara przez min. 48 h. W uzyskanych lizatach oraz w hydrolizacie okreslono ,vydajnosc procesu „rozpuszczania'' (YA), stezenie uwolnionego bialka ogólnego oraz uwolnionej O-glukozy. bedacej produktem hydrolizy enzymatycznej beta-glukanów sciany komórkowej. Wyniki wyrazono w miligramach danej substancji na gram suchej masy ekstraktu drozdzm,ego (mg g- 1 ) Wydajnosc obróbki "st9pncj mierzy sic;: posrednio, w oparem o ilosc (wag9) substancji rozpuszczalnych ,v ,vodzic, uwolnionych z danej ilosci biomasy. \V tym celu z kazdej butli pobrano 10 ml zawiesiny i oddzielono biomas-; na drodze \\ iro\\ ania (3950 x g, 1 O min). Objytosc zebranego supernatantu zmierzono za pomoca cylindra miarowego, po czym pozostaly osad drozdzo,, y zawieszono \\ identycznej objetosci wody dejonizowanej i ponownie zwirowano. Uzyskane supernatanty polaczono i oznaczono w nim zawartosc suchej masy na drodze suszenia w I 05°C. zgodnie z nom1a PN-A-79005-4: 1997P. Wydajnosc procesu autolizy okreslono jako procent suchej masy biomasy drozdzowej przeksztalcony do postaci rozpuszczalnej: gdzie: mE - masa ekstraktu, g, mY- masa zawiesiny drozdzowej, g, SM - sucha masa próbki, g. A-C MY[%wag.] = (B X Bm) x 100% W uzyskanym ekstrakcie o znanej zawartosci suchej masy, okreslono stezenie rozpuszczalnego bialka PL 440018 A1 /26calkowitego oraz styzcnic uwolnionej glukozy. \Vyniki wyrazono w miligramach danej substancji na gram suchej masy ekstraktu drozdzowego (mgg 1 ). Okreslenie ilosci bialka calkmvitcgo w próbach prowadzono przy wykorzystani zmodyfiko,rnnej metody Lowry· ego. Do okreslenia ilosci mvolnionej glukozy \\ ykorzystano metoda wysokosprawnej chromatografii cieczo\\ ej (HPLC). Stosowano kolwnne Aminex HPX8 7H (Bi o-Rad. U SA) oraz 0,005 N H2S04 jako faze ruchoma. Pomiar ilosci O-glukozy okreslano na podstawie krzywej kalibracyjnej sporzadzonej dla czystej O-glukozy (kalibracja zewnetrzna). Pomiar ilosci blendu olejów, kapsulkmrnnego "ewnatrz komórek drozdzy, wykonano metoda ekstrakcji w aparacie Soxhlcta eterem naftowy111. Nawazky ok. 2,5 g (masa okreslona z dokladnoscia do d=0,00 lg) suchych mikrokapsulek umieszczono ,v celulozowej gilzie i zamkniyto korkiem z waty szklanej. Ekstrakcjy prov,adzono przez 2 h za pomoca 100 ml Gteru naftowego \N temperaturn.; wrzenia rozpuszczalnika. Uzyskany ekstrakt przeniesiono iloscio\\o do \\yprazonej i \\Stepnie zwazonej (d=0.0001 g) kolby miarowej i odparowano rozpuszczalnik w temp. 40°C za pomoca rotacyjnej wyparki prózniowe.i. Zawartosc kolby suszono dodatkowo w 95°C przez godzine. Mase oleju uzyskanego z danej porc_11 mikrokapsulek okreslono na podstawie róznicy" masach kolby zawierajacej olej oraz kolby puste.i. Pomiar ilosci blcndu olejów, wystypujaccgo na powierzchni mikrokapsulek drozdzo"ych, mierzono metoda szybkiej ekstrakcji heksanem. W tym celu nawazky 1 g suchych mikrokapsulek umieszczono w kolbie miarowej o pojemnosci 250 ml i napelniono 100 ml heksanu, po czym w )trzasano rycznie przez 5 min. Komórki oddzielono poprzez filtracji,) przez bibuly filtracyjna Nr 3 (Whatman). Pozostalosc biomasy plukano dodatkowa porcja heksanu (100 ml). Uzyskane ekstrakty laczono i, po przeniesieniu do kolby okraglodennej. okreslono ilosc pozyskanego oleju metoda identyczna jak dla ekstrakcji oleju z wnetrza komórek. \Vydajnosc mikrokapsulkowania (ang. microencapsulation yield. MY) okreslono jako procentowy zawartosc kapsulkowanej substancji w danej masie mikrokapsulek i wyznaczano z ponizszego równania: A-C MY[%wa9.] = (B X Bm) X 100% A - masa oleju pozyskanego w ekstrakcji metoda Soxhleta, g, C - masa oleju pozyskana w ekstrakcji heksanem, g, B - masa nawazki mikrokapsulek, g, Bm - sucha masa mikrokapsulek, g. Stabilnosc oksydacyjna blendu olejów, stabilizowanego wewnatrz komórek drozdzy, mierzono w trakcie 30 dni przechowywania w temperaturze pokojowej i w warunkach wilgotnosci wzglednej otoczenia PL 440018 A1 11/26wynoszacych O, 4~ i 90%. W tym celu nawazki suchych mikrokapsulek (I O g) rozsypano na szalkach Petricgo o srednicy 5 cm i umieszczono w eksykatorach za,,icrajacych wyprazony zel krzemionkowy (O~~ ,,ilgotnosci wzgh;dncj, w.,,.), nasycony roztwór K2CO.1 (43% ,, .w.) lub KNO3 (90% w.\\.). Co 5 dni pobierano ok. l g mikrokapsulek i, po pozyskaniu oleju na drodze ekstrakcji mierzono stopie11 utlenienia oleju poprzez pomiar liczby nadtlenkowej (LOO), zgodnie z procedura. PN-lSO 3960: 1996P (Oleje i tluszcze roslinne oraz zwierzece. Oznaczanie liczby nadtlenkowej.) Uzyskany wynik wyrazono jako mikrorównowaznik aktywnego tlenu na kg oleju (meq,O 1 -kg- 1 ). W celach porównawczych przeprowadzono dos"·iadczenie dla natywnego bi endu olejów w fom1ie zemulgowanej. Dla zminimalizowania wplywu ekstrakcji na wzrost liczby nadtlenkowej zrezygnowano z ekstrakcji metoda Soxhlcta na rzecz ekstrakcji heksanem. \\' tym celu nawazky 1 g kapsulek zawieszono ,v 10 ml zimnego heksanu i dezintegrowano poprzez sonikacjy przez 10 min przy uzyciu sonikatora. \V trakcie procesu dezintegracji zawiesina byla chlodzona w lazni lodowej celem zminimalizowania przyrostu temperatury. Uzyskany ekstrakt przesaczono przez bibule filtracyjna. i plukano pozostalosc dwiema porcjami swiezego heksanu. Zebrane ekstrakty polaczono i odparo,vano rozpuszczalnik w stmmieniu azotu. Uzyskany olej przechmvywano" szczelnie zamknietym naczyniu w temperaturze -20°C. Przvklad TI Przeprowadzone badania mialy na celu opracowamc nowej metody, w oparem o wykorzystanie biomasy drozdzy piekarskich (Sau.:haro,nyc:es cere vi siae), blcndó\'v olejów tloczonych na zinrno o cechach prozdrowotnych z w ykorzystanicm blcndów zaw icrajacych zoptymalizo,rnnc mieszaniny olejów, jakie zawieraja. olej ryzowy w ilosci 88% wagowych, jaki zmieszany jest z olejem rydzowym ,, ilosci 12~o, a wzajemny stosunek kwasów tluszczowych omega 6 do omega 3 (w6/w3) opracowanej blendy zawarty jest w przedziale od 4: I do 6: I. Sposób kapsulkowania bi endów w komórkach drozdzowych wedlug vvynalazku polega na tym, ze material wyjsciowy, jaki stanowia drozdze piekarskie, korzystnie prasowane drozdze piekarskie o zawartosci suchej masy nie mniejszej niz 25% wagowych, poddaje sie procesowi plukania i suszenia liofilizacyjnego. Biomase w stezeniu 10% wag. plucze sie w O,OlM roztworze bezwodnego wodorofosforanu dipotasu o pH 6,8, po czym oddziela sie na drodze wirowania (3950 x g, 10 min) i uzyskana mase o zawartosci suchej substancji nie mniejszej niz 20% wag. umieszcza sie na stalowych tacach liofilizacyjnych i zamraza w temp. -80°C przez 12 h. Zamrozona biomase poddaje sie liofilizacji przy cisnieniu 0,06 mbar przez 48 h. W uzyskanym proszku oznacza sie metoda ekstrakcji odczynnikiem Folcha zawartosc lipidów calkowitych, która wynosila 4,7 ± 0,55 g 100 g 1 proszku, oraz liczebnosc calkowita komórek metoda oparta o bezposredni pomiar w komorze Neubauera, wynoszaca 3,6 X l0 g· 1 proszku PL 440018 A1 12/26Nastc;pnic prowadzi sic; obróbkc; wstc;pna biomasy. tak, ze w 10~1i wag. zm,icsinic suchej masy drozdzy o pH 5,2, ,v butlach szklanych typu „pyrex", inkubuje sic; zavvicsinc; \\ temperaturze nic mniejszej niz 35°C i nic wyzszej niz 75°C, korzystnie ,v temperaturze 55°C. Równoczesnie korzystnie, gdy stosuje sic; dodatek octanu etylu lub chlorku sodu do wspomagania procesu ekstrakcji skladnikóvv wewnatrzkomórkowvch (plazmolizy). Korzystnie do biomasy dodaje sie dodatek octanu etylu o wielkosci w ilosci od 0.5 do 6.5% wag. (w stosunku do masy za,,iesiny). korzystnie 1.5% wag .. oraz dodatek chlorku sodu w ilosci od 5 do 40% wag .. korzystnie I 0% wag .. po czym prowadzi sie plazmolize,, temperaturze nie mniejszej niz 50°C. i nie wyzszej niz 60°C., korzystnie w trakcie procesu plazmolizy stosuje sie temperature 55°C. Nastc;pnic w procesie hydrolizy enzymatycznej, przygotowana wczesniej zawiesin<; drozdzowa poddaje sic; wstc;pnej pasteryzacji ,v 95°C przez 10 minut celem inaktywacji endogennych enzymów. Do tak przygotowanej biomasy dodajc sic; glukanazc; (Glucanex R200: 02 U/mg) v, ilosci od 0,0015 do L5% wag., korzystnie l,Yi'o ,,ag., po czym prowadzi sie inkubacje ,v temperaturze od 45°C do 55°C, korzystnie 50°C przez nie krócej niz 24 h. Nastepnie prowadzi sie proces wiazania blendów olejów w biomasie drozdzy piekarskich metoda. Bishop i in. (1998). przy czym w naczyniach typu .,pyrex" o pojemnosci 100 ml odwaza sie porcje 40 g wody dejonizowanej za,,1 CraJaCCJ 2 01 o wag. dodatku emulgatora w postaci monoolcinianu polioksyctylcnosorbitolu (Twccn 80, E433), dopuszczonego do zastosowania w zywnosci, i dodaje sic; na,\azkc; blcndu olejów, po czym \V)twarza sic; emulsje; typu o/w metoda homogenizacji rotor/stator przez minut przy prc;dkosci 10 OOO min- 1 ,v homogenizatorze szybkoobrotmvym. Przy czym przez blendy olejowe rozumie sie mieszaniny olejów, jakie zawieraja olej ryzo,, y w ilosci 88% wagowych. jaki zmieszany jest z olejem rydzowym w ilosci 12%. a wzajemny stosunek k\\asów tluszczowych omega 6 do omega 3 (w6/w3) opracowanej blendy zawarty jest w przedziale od 4: 1 do 6: 1. Korzystnie, gdy zastosowane blendy olejmve maja nastepujacy sklad ilosciowy: % % % Skladnik I Skladnik li Skladnik Ili wag wag wag Olej ryzowy Olej Rydzowy - 88 12 - Do tak wytworzonej emulsji dodaje sie odwazona porcje liofilizowanej biomasy drozdzowej. Mieszanine kapsulkujaca inkubuje sie nastepnie przez czas nie krótszy niz 8 hi przy ciaglym mieszaniu równym 200 min- 1 . Po zakonczeniu inkubacji, zawartosc naczyn oddziela sie od mieszaniny poreakcyjnej na drodze wirowania przy przyspieszeniu nie mniejszym niz 3950 x g przez okres nie krótszy nizlO min. PL 440018 A1 13/26Oddzielona pastc; drozdzowa plucze sic; nastc;pnie co najmniej trzykrotnie woda dejonizowana celem usunic;cia resztek mieszaniny reakcyjnej. Mokra biomasc; przenosi sic; do naczy11 do liofilizacji i zmraza w temp. -80°C przez 12 h., po czym liofilizuje przy cisnieniu 0,125 mbara przez min. 48 h. W uzyskanych lizatach oraz w hydrolizacie okreslono wydajnosc procesu ,.rozpuszczania'' (Y A), stezenie uwolnionego bialka ogólnego oraz mvolnion~i O-glukozy. bedacej produktem hydrolizy enzymatycznej beta-glukanów sciany komórkowej. Wyniki ,,yrazono w miligramach danej substancji na gram suchej masy ekstraktu drozdzowego (mg g- 1 ) Wydajnosc obróbki wstc;pnej mierzy sic; posrednio, w oparem o ilosc (wagc;) substancji rozpuszczalnych ,v wodzie, uwolnionych z danej ilosci biomasy. \V tym celu z kazdej butli pobrano 10 ml za,\ icsiny i oddzielono biomasc; na drodze \\ iro\\ ania (3950 x. g, l O min). Objc;tosc zebranego supcmatantu zmierzono za pomoca cylindra miarowego, po czym pozostaly osad drozdzo\\ y zawieszono \\ identycznej objetosci wody dejonizowanej i ponownie zwirowano. Uzyskane supematanty polaczono i oznaczono w nim zawartosc suchej masy na drodze suszenia w I 05°C zgodnie z nom1a PN-A-79005-4: 1997P. Wydajnosc procesu autolizy okreslono jako procent suchej masy biomasy drozdzowej przeksztalcony do postaci rozpuszczalnej: gdzie: mE - masa ekstraktu. g, nw- masa zawiesiny drozdzowej, g, SM - sucha masa próbki, g. \V uzyskanym ekstrakcie o znanej zmvartosci suchej masy, okreslono stc;zcnic rozpuszczalnego bialka calkowitego oraz stezenie uwolnionej glukozy. Wyniki wyrazono w miligramach danej substancji na gram suchej masy ekstraktu drozdzowego (mgg- 1 ). Okreslenie ilosci bialka calkowitego w próbach prowadzono przy wykorzystani zmodyfikowanej metody Lowry'ego. Do okreslenia ilosci uwolnionej glukozy wykorzystano metoda wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Stosowano kolumne Aminex HPX87H (Bio-Rad, USA) oraz 0,005 N H2S04 jako faze ruchoma. Pomiar ilosci O-glukozy okreslano na podstawie krzywej kalibracyjnej sporzadzonej dla czystej O-glukozy (kalibracja zewnetrzna). Pomiar ilosci blendu olejów, kapsulkowanego wewnatrz komórek drozdzy, wykonano metoda PL 440018 A1 14/26ekstrakcji w aparacie Soxhlcta eterem nafto,v:111. Nawazkc; ok. 2,5 g (masa okreslona z dokladnoscia do d=0,00 lg) suchych mikrokapsulck umieszczono ,v celulozowej gilzie i za1.nknic;to korkiem z waty szklanej. Ekstrakcjy pro,,adzono przez 2 h za pomoca 100 ml eteru naftowego \N temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Uzyskany ekstrakt przeniesiono ilosciowo do wyprazonej i wstepnie zwazonej (d=0,0001 g) kolby miarowej i odparowano rozpuszczalnik w temp. 40°C za pomoca. rotacyjnej ·wyparki prózniowe_i. Zawartosc kolby suszono dodatkowo w 95°C przez godzine. Mase oleju uzyskanego z danej porc.11 mikrokapsulek okreslono na podstawie róznicy" masach kolby zawierajacej olej oraz kolby puste.i. Pomiar ilosci blendu olejów, wystepujacego na powierzchni mikrokapsulek drozdzo\\ych. mierzono metoda szybkiej ekstrakcji heksanem. W tym celu nawazkc; 1 g suchych mikrokapsulek umieszczono w kolbie miarowej o pojemnosci 250 ml i napelniono 100 ml heksanu, po czym \\)trzasano rycznie przez 5 min. Komórki oddzielono poprzez filtracje; przez bibuly filtracyjna Nr 3 (Whatman). Pozostalosc biomasy plukano dodatkowa. porcja. heksanu (100 ml). Uzyskane ekstrakty laczono i. po przeniesieniu do kolby okraglodennej. okreslono ilosc pozyskanego oleju metoda. identyczna. jak dla ekstrakcji oleju z wnetrza komórek. Wydajnosc mikrokapsulkmrnnia (ang. microencapsulation yield. MY) okreslono jako procentowy zawartosc kapsulkowanej substancji w danej masie mikrokapsulek i wyznaczano z ponizszego równania: A-C MY[%wag.] = (B X Bm) X 100% A - masa oleju pozyskanego v, ekstrakcji metoda Soxhleta, g, C - masa oleju pozyskana w ekstrakcji heksanem. g. B - masa nawazki mikrokapsulck, g, Bm - sucha masa mikrokapsulek, g. Stabilnosc oksydacyjna blendu olejów, stabilizowanego wewnatrz komórek drozdzy, mierzono w trakcie 30 dni przechowywania,, temperaturze pokojm,ej i w warunkach wilgotnosci \\zglc;dnej otoczenia wynoszacych O, 43 i 90%. W tym celu nawazki suchych mikrokapsulek (10 g) rozsypano na szalkach Petriego o srednicy 5 cm i umieszczono w eksykatorach zawierajacych wyprazony zel krzemionkowy (0% wilgotnosci wzglednej, w.w.), nasycony roztwór K2CO3 (43% w.w.) lub KNO3 (90% w.w.). Co 5 dni pobierano ok. 1 g mikrokapsulek i, po pozyskaniu oleju na drodze ekstrakcji mierzono stopien utlenienia oleju poprzez pomiar liczby nadtlenkowej (LOO), zgodnie z procedura PN-ISO 3960: 1996P (Oleje i tluszcze roslinne oraz zwierzece. Oznaczanie liczby nadtlenkowej.). Uzyskany wynik wyrazono jako mikrorównowaznik aktywnego tlenu na 1 kg oleju (meqvO2-kg- 1 ). W celach porównawczych przeprowadzono doswiadczenie dla natywnego blendu olej ów w formie zemulgowanej. PL 440018 A1 /26Dla zminimalizowania ,vplywu ekstrakcji na wzrost liczby nadtlenkowej zrezygnowano z ekstrakcji metoda Soxhlcta na rzecz ekstrakcji heksanem. \V tym celu nawazkc; 1 g kapsulck zawieszono ,v 10 ml zimnego heksanu i dezintegrowano poprzez sonikacjc; przez 10 min przy uzyciu sonikatora. \V trakcie procesu dezintegracji zawiesina byla chlodzona w lazni lado\\ ej celem zminimalizo\\ ania przyrostu temperatury. Uzyskany ekstrakt przesaczono przez bibule filtracyjna. i plukano pozostalosc dwiema porcjami swiezego heksanu. Zebrane ekstrakty polaczono i odparo\\ano rozpuszczalnik w strnmieniu azotu. Uzyskany olej przechm,ywano " szczelnie zamknietym naczyniu w temperaturze -20°C. Przvklad TIT Sposób kapsulkowania blcndów w komórkach drozdzmvych ,,cdlug ,vynalazku polega na tym, ze material W)jsciowy, jaki stanowia drozdze piekarskie, korzystnie prasmvanc drozdze piekarskie o zav,artosci suchej masy nic mniejszej niz 25% \\agmvych, poddaje sic; procesowi plukania i suszenia liofilizacyjnego. Biomase \\ stezeniu l o wodorofosforanu dipotasu o pH 6.8. po czym oddziela sie na drodze wirowania (3950 x g. 10 min) i uzyskana. mase o zawartosci suchej substancji nie mniejszej niz 20% wag. umieszcza sie na stalowych tacach liofilizacyjnych i zamraza w temp. -80°C przez 12 h. Zamrozona biomase poddaje sie liofilizacji przy cisnieniu 0,06 mbar przez --1-8 h. W uzyskanym proszku oznacza sic; metoda ekstrakcji odczynnikiem Folcha zawartosc lipidów calkowitych, która wynosila 4, 7 ± 0,55 g 1 O O g I proszku, oraz liczebnosc calkowita komórek metoda oparta o bezposredni pomiar w komorze Neubaucra, \\ynoszaca 3,6 X 10 1 ng- 1 proszku Nastepnie prmvadzi sie obróbke ,vstepna biomasy. tak, ze ,v 10% wag. zm\iesinie suchej masy drozdzy o pH 5,2, w butlach szklanych typu .,pyrex··. inkubuje sie zawiesine\\ temperaturze nie mniejszej niz 35°C i nie wyzszej niz 75°C:. korzystnie w temperaturze 55°C. Równoczesnie korzystnie. gdy stosqje sie dodatek octanu etylu lub chlorku sodu do wspomagania procesu ekstrakcji skladników wewnatrzkomórkowych (plazmolizy). Korzystnie do biomasy dodaje sie dodatek octanu etylu o wielkosci w ilosci od 0,5 do 6.5% wag. (w stosunku do masy za,,icsiny), korzystnie 1,5~~, wag., oraz dodatek chlorku sodu w ilosci od 5 do 40% wag., korzystnie 10% wag., po czym prowadzi sie plazmolize w temperaturze nie mniejszej niz 50°C. i nie wyzszej niz 60°C., korzystnie w trakcie procesu plazmolizy stosuje sie temperature 55°C. Nastepnie w procesie hydrolizy enzymatycznej, przygotowana wczesniej zawiesine drozdzowa poddaje sie wstepnej pasteryzacji w 95°C przez 10 minut celem inaktywacji endogennych enzymów. Do tak przygotowanej biomasy dodaje sie glukanaze (Glucanex R200; 0,2 U/mg) w ilosci od 0,0015 do 1,5% wag., korzystnie O, 15% wag., po czym prowadzi sie inkubacje w temperaturze od 45°C do 55°C, korzystnie 50°C przez nie krócej niz 24 h. Nastepnie prowadzi sie proces wiazania blendów olejów w biomasie drozdzy piekarskich metoda PL 440018 A1 16/26Bishop i in. (1998), przy czym w naczyniach typu „pyrex" o pojemnosci 100 ml odwaza sic; porcje; 40 g wody dejonizowanej za,ncraJaCC.J 2% ,vag. dodatku emulgatora ,v postaci monooleinianu polioksyctyknosorbitolu (Twccn 80, E433), dopuszczonego do zastosowania ,v zyv,nosci, i dodaje siy nav,azke blendu olejów, po czym wyt\\arza sie emulsje typu o/\'-i metoda homogenizacji rotor/stator przez minut przy predkosci 10 OOO min 1 w homogenizatorze szybkoobrotowym. Przy czym przez blendy olejowe rozumie sie mieszaniny olejów. jakie zawieraj a olej ryzowy w ilosci 8()% wagowych. jaki zmieszany jest z olejem lnianym w ilosci 11 % wagowych. a wzajemny stosunek kwasów tluszczowych omega 6 do omega 3 ("6/w3) opracowanej blendy zawarty jest w przedziale od 4: I do 6: 1. Korzystnie, gdy zastosowane blendy olejowe maja nastypujacy sklad ilosciowy: % % % Skladnik I Skladnik li Skladnik Ili wag wag wag Olej ryzowy Olej Lniany - 89 11 - Do tak wytworzonej emulsji dodaje sie odwazona porcje liofilizowanej biomasy drozdzowe_i. Mieszanine kapsulkujaca inkubuje sie nastepnie przez czas nie krótszy niz 8 h i przy ciaglym mieszaniu równym 200 min· 1 . Po zakol'1czcniu inkubacji, zawartosc naczyn oddziela sic; od mieszaniny porcakc)jncj na drodze wirowania przy przyspieszeniu nic mniejszym niz 3950 x g przez okres nic krótszy nizlO min. Oddzielona pasty drozdzo\\ a plucze sic; nastc;pnie co najmniej trzykrotnie \\ oda dejonizowana celem usunic;cia resztek mieszaniny reakcyjnej. Mokra biomas<; przenosi sic; do naczy11 do liofilizacji i zmraza w temp. -80°C przez 12 h .. po czym liofilizuje przy cisnieniu 0,125 mbara przez min. 48 h. W uzyskanych lizatach oraz w hydrolizacie okreslono wydajnosc procesu „rozpuszczania" (Y A). stezenie uwolnionego bialka ogólnego oraz uwolnionej D-glukozy, bedacej produktem hydrolizy enzymatycznej beta-glukanów sciany komórkowej. Wyniki wyrazono w miligramach danej substancji na gram suchej masy ekstraktu drozdzowego (mg g· 1 ). Wydajnosc obróbki wstepnej mierzy sie posrednio, w oparem o ilosc (wage) substancji rozpuszczalnych w wodzie, uwolnionych z danej ilosci biomasy. W tym celu z kazdej butli pobrano 10 ml zawiesiny i oddzielono biomase na drodze wirowania (3950 x g, 10 min). Objetosc zebranego supematantu zmierzono za pomoca cylindra miarowego, po czym pozostaly osad drozdzowy zawieszono w identycznej objetosci wody dejonizowanej i ponownie zwirowano. Uzyskane supematanty polaczono i oznaczono w PL 440018 A1 17/26nim zawartosc suchej masy na drodze suszcma w 105°C zgodnie z nom1a PN-A-79005-4: 1997P. \Vydajnosc procesu autolizy okreslono jako procent suchej masy biomasy drozdzowej przeksztalcony do postaci rozpuszczalnej: gdzie: mE - masa ekstraktu, g, mY - masa zawiesiny drozdzov\ ej, g, SM - sucha masa próbki, g. A-C MY[%wag.] = (B X Bm) X 100% W uzyskanym ekstrakcie o znanej zawartosci suchej masy. okreslono stezenie rozpuszczalnego bialka calkowitego oraz stezenie uwolnionej glukozy. Wyniki wyrazono w miligramach danej substancji na gram suchej masy ekstraktu drozdzowego (mgg- 1 ). Okreslenie ilosci bialka calkowitego w próbach prowadzono przy ,vykorzystani zmodyfikmrnnej metody Lowry" ego Do okreslenia ilosci uwolnionej glukozy wykorzystano metoda wysokosprawncj chromatografii cieczowej (HPLC) Stosowano koltmrnc; A.mincx HPX8 7H (Bi o-Rad, USA) oraz 0,005 N H2SO-1 jako fazc; ruchoma. Pomiar ilosci O-glukozy okreslano na podstav\ ie krzywej kalibracyjnej sporzadzonej dla czystej O-glukozy (kalibracja zcwnc;trzna). Pomiar ilosci blendu olejów. kapsulkowanego wewnatrz komórek drozdzy. wykonano metoda. ekstrakcji w aparacie Soxhleta eterem naftowym. Nawazke ok. 2.:5 g (masa okreslona z dokladnoscia do d=0.00lg) suchych mikrokapsulek umieszczono w celulozowej gilzie i zamknieto korkiem z waty szklanej. Ekstrakcje; prowadzono przez 2 h za pomoca 100 ml etem naftowego ,v temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Uzyskany ekstrakt przeniesiono ilosciowo do wyprazonej i \\stc;pnic zwazonej (d=0,0001 g) kolby miarowej i odparowano rozpuszczalnik w temp. 40°C za pomoca rotacyjnej \\ yparki prózniowej. Zawartosc kolby suszono dodatkowo w 95°C przez godzine. Mase oleju uzyskanego z danej porcji mikrokapsulek okreslono na podstawie róznicy w masach kolby zawierajacej olej oraz kolby pustej. Pomiar ilosci blendu olejów, wystepujacego na powierzchni mikrokapsulek drozdzowych, mierzono metoda szybkiej ekstrakcji heksanem. W tym celu nawazke 1 g suchych mikrokapsulek umieszczono w kolbie miarowej o pojemnosci 250 ml i napelniono 100 ml heksanu, po czym wytrzasano recznie przez 5 min. Komórki oddzielono poprzez filtracje przez bibule filtracyjna Nr 3 (Whatman). Pozostalosc biomasy plukano dodatkowa porcja heksanu (100 ml). Uzyskane ekstrakty laczono i, po przeniesieniu do kolby okraglodennej, okreslono ilosc pozyskanego oleju metoda identyczna jak dla ekstrakcji oleju z wnetrza PL 440018 A1 18/26komórek. \Vydajnosc mikrokapsulkowania (ang. mieroencapsulation yicld, MY) okreslono jako procentowy zav\artosc kapsulkowanej substancji w danej masie mikrokapsulek i ,vyznaczano z ponizszego rÓv\nania: A-C MY[%wa,a] = (B X Bm) X 100% A - masa oleju pozyskanego w ekstrakcji metoda. Soxhleta. g. C - masa oleju pozyskana w ekstrakcji heksanem, g, B - masa nawazki mikrokapsulek, g, Bm - sucha masa mikrokapsulek. g. Stabilnosc oksydacyjna blcndu olejów, stabilizowanego wewnatrz komórek drozdzy, mierzono \V trakcie 30 dni przechovvy,rnnia \\ temperaturze pokoJO\\eJ i w warunkach wilgotnosci\\ zglt,:dnej otoczenia wynoszacych O. 43 i 90~o. W tym celu nawazki suchych mikrokapsulek ( l O g) rozsypano na szalkach Petriego o srednicy 5 cm i umieszczono w eksykatorach zawieraja.cych wyprazony zel krzemionkowy (0% wilgotnosci wzglednej. w,, ). nasycony roztwór K 1 CO~ (43% w w.) lub KNO~ (90%i '"w) Co 5 dni pobierano ok. I g mikrokapsulek i, po pozyskaniu oleju na drodze ekstrakcji mierzono stopien utlenienia oleju poprzez pomiar liczby nadtlenkowej (LOO), zgodnie z procedura PN-ISO 3960: 1996P (Oleje i tluszcze roslinne oraz Z\\ierzyce. Oznaczanie liczby nadtlcnko,\ ej.). Uzyskany wynik wyrazono jako mikrorównowaznik aktywnego tlenu na l kg oleju (meq, O2-kg 1 ). W celach porównawczych przeprowadzono doS\\ iadczenie dla natywnego blendu olejów w formie zemulgowanej. Dla zminimalizowania wplywu ekstrakcji na wzrost liczby nadtlenkowej zrezygnowano z ekstrakcji metoda. Soxhleta na rzecz ekstrakcji heksanem. W t~111 celu nawazke I g kapsulek zawieszono w I O ml zimnego heksanu i dezintegrowano poprzez sonikacje przez I O min przy uzyciu sonikatora. W trakcie procesu dezintegracji zawiesina byla chlodzona w lazni lodowej celem zminimalizowania przyrostu temperatury. Uzyskany ekstrakt przesaczono przez bibuly filtrac)jna i plukano pozostalosc dwiema porcjami swiezego heksanu. Zebrane ekstrakty polaczono i odparowano rozpuszczalnik w strumieniu azotu. Uzyskany olej przechowywano w szczelnie zamknietym naczyniu w temperaturze -20°C. Przyklad IV Sposób kapsulkowania blendów w komórkach drozdzowych wedlug wynalazku polega na tym, ze material wyjsciowy, jaki stanowia drozdze piekarskie, korzystnie prasowane drozdze piekarskie o zawartosci suchej masy nie mniejszej niz 25% wagowych, poddaje sie procesowi plukania i suszenia PL 440018 A1 19/26liofilizacyjnego. Biomasc;; w stc;;zcniu 10% wag. plucze sic;; w 0,0 IM roztworze bez" odncgo wodorofosforanu dipotasu o pH 6,8, po czym oddziela sic;; na drodze wirowania (3950 x g, 10 min) i uzyskana masc;; o zawartosci suchej substancji nic mniejszej niz 20% ,, ag. umieszcza sic;; na stalowych tacach liofilizacyjnych i zamraza w temp. -80°C przez 12 h. Zamrozona biomase poddaje sie liofilizacji przy cisnieniu 0,06 mbar przez 48 h. W uzyskanym proszku oznacza sie metoda. ekstrakcji odczynnikiem Folcha zawartosc lipidów calkowitych. która wynosila 4. 7 ± 0.55 g I O O g 1 proszku. oraz liczebnosc calkowita. komórek metoda. oparta. o bezposredni pomiar w komorze Neubauera. ,,ynosza.ca. 3.6 X I owg- 1 proszku Nastc;;pnic prowadzi sic;; obróbkc;; wstc;;pna biomasy. tak, ze w I 0% wag. za\\icsinic suchej masy drozdzy o pH 5,2, ,v butlach szklanych typu „pyrex", inkubuje sic;; zawicsinc;; ,, temperaturze nic mniejszej niz 35°C i nic wyzszej niz 75°C, korzystnie ,v temperaturze 55°C. Równoczesnie korzystnie, gdy stosuje sic;; dodatek octanu etylu lub chlorku sodu do wspomagania procesu ekstrakcji skladnikóvv wewnatrzkomórkowych (plazmolizy). Korzystnie do biomasy dodaje sie dodatek octanu etylu o ,,ielkosci w ilosci od 0,5 do 6,5% wag. (w stosunku do masy zawiesiny). korzystnie 1.5% \\ag .. oraz dodatek chlorku sodu w ilosci od 5 do 40% wag .. korzystnie I 0% \\ag .. po czym prowadzi sie plazmolize w temperaturze nie mniejszej niz 50°C. i nie wyzszej niz 60°C.. korzystnie w trakcie procesu plazmolizy stosuje sie temperature 55°C. Nastc;;pnic w procesie hydrolizy enzymatycznej, przygotowana wczesniej zawicsinc;; drozdzowa poddaje sic;; wstc;;pnej pasteryzacji w 95°C przez 10 minut celem inaktywacji endogennych enzymów. Do tak przygotowanej biomasy dodajc sic;; glukanazc;; (Glucanex R200: 02 U/mg) w ilosci od 0,0015 do L5~~ wag., korzystnie 0,15% wag., po czym prowadzi sie inkuba~je ,v temperaturze od 45°C do 55°C, korzystnie 50°C przez nie krócej niz 24 h. Nastepnie prowadzi sie proces wiazania blendów olejów w biomasie drozdzy piekarskich metoda. Bishop i in. ( 1998). przy czym w naczyniach typu .,pyrex" o pojemnosci I 00 ml od,,aza sie porcje 40 g wody dejonizowanej zm,1era1aceJ 2% wag. dodatku emulgatora w postaci monooleinianu polioksyctylcnosorbitolu (Twccn 80, E433), dopuszczonego do zastosowania w zywnosci, i dodaje sic;; nawazke blendu olejów, po czym wytwarza sie emulsje typu o/w metoda homogenizacji rotor/stator przez minut przy predkosci I O OOO min• 1 w homogenizatorze szybkoobrotowym. Przy czym przez blendy olejowe rozumie sie mieszaniny olejów, jakie zawieraja olej ryzowy w ilosci 55 % wagowych, jaki zmieszany jest z olejem konopnym w ilosci 15% wagowych i olejem rzepakowym w ilosci 30%, a wzajemny stosunek kwasów tluszczowych omega 6 do omega 3 (w6/w3) opracowanej blendy zawarty jest w przedziale od 4: 1 do 6: 1. Korzystnie, gdy zastosowane blendy olejowe maja nastepujacy sklad ilosciowy: PL 440018 A1 /26% % % Skladnik I Skladnik li Skladnik Ili wag wag wag Olej ryzowy Olej Konopny Rzepakowy 55 15 30 Do tak \\ ytworzonej emulsji dodaje s19 odwazona porcj9 liofilizowanej biomasy drozdzowej. Mieszanine kapsulkujaca inkubuje sie nastepnie przez czas nie krótszy niz 8 h i przy ciaglym mieszaniu równym 200 min- 1 . Po zak011czeniu inkubacji. zawartosc naczyn oddziela sie od mieszaniny poreakcyjnej na drodze wirowania przy przyspieszeniu nie mniejszym niz 3950 x g przez okres nie krótszy niz 10 min. Oddzielona pasty drozdzov,a plucze siy nastc;pnie co najmniej trzykrotnie ,,oda dejonizowana celem usuni9cia resztek mieszaniny reakcyjnej. Mokra biomasy przenosi sic; do naczy11 do liofilizacji i zmraza ,v temp. -80°C przez 12 h., po czym liofilizuje przy cisnieniu 0,125 mbara przez min. 48 h. W uzyskanych lizatach oraz w hydrolizacie okreslono ,vydajnosc procesu „rozpuszczania'' (YA), stezenie uwolnionego bialka ogólnego oraz uwolnionej O-glukozy. bedacej produktem hydrolizy enzymatycznej beta-glukanów sciany komórkowej. Wyniki wyrazono w miligramach danej substancji na gram suchej masy ekstraktu drozdzo\\ego (mg g- 1 ) Wydajnosc obróbki \\stc;pncj mierzy siy posrednio, w oparem o ilosc (wagy) substancji rozpuszczalnych ,v ,vodzic, uwolnionych z danej ilosci biomasy. \V tym celu z kazdej butli pobrano 10 ml zawiesiny i oddzielono biomas-; na drodze \\ iro\\ ania (3950 x g, 1 O min). Objytosc zebranego supernatantu zmierzono za pomoca cylindra miarowego, po czym pozostaly osad drozdzo,, y zawieszono \\ identycznej objetosci wody dejonizowanej i ponownie zwirowano. Uzyskane supernatanty polaczono i oznaczono w nim zawartosc suchej masy na drodze suszenia w I 05°C. zgodnie z nom1a PN-A-79005-4: 1997P. Wydajnosc procesu autolizy okreslono jako procent suchej masy biomasy drozdzowej przeksztalcony do postaci rozpuszczalnej: gdzie: mE - masa ekstraktu, g, A-C MY[%wag.] = (B X Bm) x 100% mY- masa zawiesiny drozdzowej, g, SM - sucha masa próbki, g. W uzyskanym ekstrakcie o znanej zawartosci suchej masy, okreslono stezenie rozpuszczalnego bialka PL 440018 A1 21/26calkowitego oraz styzcnic uwolnionej glukozy. \Vyniki wyrazono w miligramach danej substancji na gram suchej masy ekstraktu drozdzowego (mgg 1 ). Okreslenie ilosci bialka calkmvitcgo w próbach prowadzono przy wykorzystani zmodyfiko,rnnej metody Lowry· ego. Do okreslenia ilosci mvolnionej glukozy \\ ykorzystano metoda wysokosprawnej chromatografii cieczo\\ ej (HPLC). Stosowano kolwnne Aminex HPX8 7H (Bi o-Rad. U SA) oraz 0,005 N H2S04 jako faze ruchoma. Pomiar ilosci O-glukozy okreslano na podstawie krzywej kalibracyjnej sporzadzonej dla czystej O-glukozy (kalibracja zewnetrzna). Pomiar ilosci blendu olejów, kapsulkmrnnego "ewnatrz komórek drozdzy, wykonano metoda ekstrakcji w aparacie Soxhlcta eterem naftowy111. Nawazky ok. 2,5 g (masa okreslona z dokladnoscia do d=0,00 lg) suchych mikrokapsulek umieszczono ,v celulozowej gilzie i zamkniyto korkiem z waty szklanej. Ekstrakcjy prov,adzono przez 2 h za pomoca 100 ml Gteru naftowego \N temperaturn.; wrzenia rozpuszczalnika. Uzyskany ekstrakt przeniesiono iloscio\\o do \\yprazonej i \\Stepnie zwazonej (d=0.0001 g) kolby miarowej i odparowano rozpuszczalnik w temp. 40°C za pomoca rotacyjnej wyparki prózniowe.i. Zawartosc kolby suszono dodatkowo w 95°C przez godzine. Mase oleju uzyskanego z danej porc_11 mikrokapsulek okreslono na podstawie róznicy" masach kolby zawierajacej olej oraz kolby puste.i. Pomiar ilosci blcndu olejów, wystypujaccgo na powierzchni mikrokapsulek drozdzo"ych, mierzono metoda szybkiej ekstrakcji heksanem. W tym celu nawazky 1 g suchych mikrokapsulek umieszczono w kolbie miarowej o pojemnosci 250 ml i napelniono 100 ml heksanu, po czym w )trzasano rycznie przez 5 min. Komórki oddzielono poprzez filtracji,) przez bibuly filtracyjna Nr 3 (Whatman). Pozostalosc biomasy plukano dodatkowa porcja heksanu (100 ml). Uzyskane ekstrakty laczono i, po przeniesieniu do kolby okraglodennej. okreslono ilosc pozyskanego oleju metoda identyczna jak dla ekstrakcji oleju z wnetrza komórek. Wydajnosc mikrokapsulkowania (ang. Microencapsulation yield, MY) okreslono jako procentowy zawartosc kapsulkowanej substancji w danej masie mikrokapsulek i wyznaczano z ponizszego równania: A-C MY[%wa9.] = (B X Bm) X 100% A- masa oleju pozyskanego w ekstrakcji metoda Soxhleta, g, C - masa oleju pozyskana w ekstrakcji heksanem, g, B - masa nawazki mikrokapsulek, g, Bm - sucha masa mikrokapsulek, g. Stabilnosc oksydacyjna blendu olejów, stabilizowanego wewnatrz komórek drozdzy, mierzono w trakcie 30 dni przechowywania w temperaturze pokojowej i w warunkach wilgotnosci wzglednej otoczenia PL 440018 A1 22/26wynoszacych O, 4~ i 90%. W tym celu nawazki suchych mikrokapsulek (I O g) rozsypano na szalkach Petricgo o srednicy 5 cm i umieszczono w eksykatorach za,,icraja.cych wyprazony zel krzemionkowy (O~~ ,,ilgotnosci wzgh;dncj, w.,,.), nasycony roztwór K2CO.1 (43% ,, .w.) lub KNO3 (90% w.\\.). Co 5 dni pobierano ok. l g mikrokapsulek i, po pozyskaniu oleju na drodze ekstrakcji mierzono stopie11 utlenienia oleju poprzez pomiar liczby nadtlenkowej (LOO), zgodnie z procedura. PN-lSO 3960: 1996P (Oleje i tluszcze roslinne oraz zwierzece. Oznaczanie liczby nadtlenkowej.) Uzyskany wynik wyrazono jako mikrorównowaznik aktywnego tlenu na kg oleju (meq,O 1 -kg- 1 ). W celach porównawczych przeprowadzono dos"·iadczenie dla natywnego bi endu olejów w fom1ie zemulgowanej. Dla zminimalizowania wplywu ekstrakcji na wzrost liczby nadtlenkowej zrezygnowano z ekstrakcji metoda. Soxhlcta na rzecz ekstrakcji heksanem. \\' tym celu nawazky 1 g kapsulek zawieszono ,v 10 ml zimnego heksanu i dezintegrowano poprzez sonikacjy przez 10 min przy uzyciu sonikatora. \V trakcie procesu dezintegracji zawiesina byla chlodzona w lazni lodowej celem zminimalizowania przyrostu temperatury. Uzyskany ekstrakt przesaczono przez bibule filtracyjna. i plukano pozostalosc dwiema porcjami swiezego heksanu. Zebrane ekstrakty polaczono i odparo,Yano rozpuszczalnik w stmmieniu azotu. Uzyskany olej przechmYywano" szczelnie zamknietym naczyniu w temperaturze -20°C. PL 440018 A1 23/26Zastrzezenia patentowe 1. Sposób kapsulkowania blcndów \V komórkach drozdzmvych znanucnny tym, ze material wGjsciov\ y, jaki stanowia drozdzG piGkarskic o zawartosci suchGj masy nic mniGjszcj niz 25~ ~ wagov. ych, poddaje sie procesowi plukania i suszenia liofilizacyjnego, nastepnie prov. adzi sie obróbke wstepna. biomasy tak. ze w 10% wag. zm\iesinie suchej masy drozdzy o pH 5.2. w butlach szklanych typu .,pyrex". inkubuje sie zawiesine w temperaturze nie mniejszej niz 35°C i nie wyzszej niz 75°C. po czym w procesie hydrolizy enzymatycznej. przygotowana ,,czesniej zawiesine drozdzowa poddaje siy wstc;pncj pasteryzacji w 95°C przez 1 O minut i do tak przygotowanej biomasy dodaje siy glukanazy (Glucancx R200; 0,2 U/mg) w ilosci od 0,0015 do 1,5% ,vag., po czym prov,adzi siy inkubacjy w temperaturze od -l-5°C do 55°C, korzystnie 50°C przez nic krócej niz 24 h, po czym prowadzi siy proces \\ iazania blcndóvv olejów w biomasie drozdzy piekarskich metoda. Bishop i in. ( 1998 ), przy czym w naczyniach typu „pyrex·· o pojemnosci l 00 ml odwaza sie porcje 40 g wody dejonizowanej zawieraja.cej 2% wag. dodatku emulgatora w postaci monooleinianu polioksyetylenosorbitolu (Tween 80. E-1-33). dopuszczonego do zastosowania w zywnosci. i dodaje sie nawazke blendu olejów. po czym w:-,iwarza sie emuls.ie typu o/w metoda homogenizacji rotor/stator przez 5 minut przy prc;dkosci 1 O OOO min-1 w homogenizatorze szybkoobrotowym, przy czym przez blendy olcjo\\c rozumie sic; mieszaniny olcjów,jakie zawieraja okj ryzmvy V\ ilosci od 39 do 91 % wagowych,jaki zmieszany jest korzystnie z olejem rzcpakov\ ym w ilosci od 39% do 55~u wagowych, korzystnie 45% v.agowych, albo korzystnie z olejem konopnym w ilosci od 8% do 28% v. agowych, korzystnie 15% wa.gov. ych albo korzystnie z ole_jem lnianym w ilosci od 9% do 1-1-% wagowych. korzystnie 11 % \\agowych albo korzystnie z olejem rydzo\\ym w ilosci od I 0% do 15% wagowych. korzystnie 12% wagowych. przy czym. w przypadku zastosm,ania oleju konopnego sklad mieszaniny uzupelniony jest do 100% olejem rzcpakm,:1n, a wzajemny stosunek kwasów tluszczowych omega 6 do omega 3 (w6/w3) opracowanej blendy zawarty jest w przedziale od 4: l do 6: 1, a do tak wytworzonej emulsji dodaje sie odwazona porcje liofilizowanej biomasy drozdzowej i mieszanine kapsulkujaca inkubuje sie nastepnie przez czas nie krótszy niz 8 h i przy ciaglym mieszaniu równym 200 min-1, a po zakonczeniu inkubacji, zawartosc naczyn oddziela sie od mieszaniny poreakcyjnej na drodze wirowania przy przyspieszeniu nie mniejszym niz 3950 x g przez okres nie krótszy nizlO min, po czym oddzielona paste drozdzowa plucze sie co najmniej trzykrotnie woda dejonizowana celem usuniecia resztek mieszaniny reakcyjnej, a mokra biomase przenosi sie do naczyn do liofilizacji i zmraza w temp. -80°C przez 12 h., po czym liofilizuje przy cisnieniu O, 125 mbara przez min. 48 h. PL 440018 A1 24/262. Sposób wedlug zastrz 1 znmmcnny tym, ze biomas<; w stc;zcniu 10°~ wag. plucze sic; ,v 0,011\1 roztvvorzc bcz,,odncgo ,vodorofosforanu dipotasu o pH 6,8, po czym oddziela sic; na drodze wirowania (3950 x g, 1 O min) i uzyskana masc; o za,, artosci suchej substancji nic mniej szcj niz 20~ ~ wag. umieszcza sie na stalov. ych tacach liofilizacyjnych i zamraza w temp. -80°C przez 12 h, po czy zamrozona. biomase poddaje sie liofilizacji przy cisnieniu 0.06 mbar przez 48 h. 3. Sposób wedlug zastrz I albo 2 znamienny tym. ze korzystnie. gdy do biomasy stosuje sie dodatek octanu etvlu lub chlorku sodu do wspomagarna procesu ekstrakcji skladników wewnatrzkomórkowych (plazmolizy). 4. Sposób ,,cdlug zastrz 3 znamienny tym, ze do biomasy dodaje sic; dodatek octanu etylu o wielkosci ,v ilosci od 0,5 do 6,5% ,vag. (w stosunku do masy zawiesiny) oraz dodatek chlorku sodu w ilosci od 5 do 40% wag., po czym prowadzi sic; plazmolizc; w temperaturze nic mniejszej niz 50°C. 1 me wyzszej niz 60°C. . Sposób wedlug zastrz 4 znamienny tym. ze w trakcie procesu plazmolizy stosuje sie temperature 55°C. 6. Sposób ,vcdlug zastrz I albo 2 alb 3 albo 4 albo 5 znamienny tym, ze zastosowane blendy olejowe maja nastc;pujacy sklad iloscio,,y % % % Skladnik I Skladnik li Skladnik 111 wag wag wag Olej ryzowy Rzepakowy - 55 45 - Olej ryzowy Olej Rydzowy - 88 12 - Olej ryzowy Olej Lniany - 89 11 - Olej ryzowy Olej Konopny Rzepakowy 55 15 30 PL 440018 A1 /26al. Niepodleglosci 188/192 00-950 Warszawa, skr. poczt 203 URZAD PATENTOWY RZECZYPOSPOLITEJ POLSKIEJ tel.: (+48) 22 579 05 55 I fax: (+48) 22 579 00 01 e-mail: kontakt@uprp.gov.pl I www.uprp.gov.pl SPRAWOZDANIE O STANIE TECHNIKI ZGLOSZENIA NR P.440018 Klasyfikacja zgloszenia: A23P10/30 (2016.01); A23L31/10 (2016.01); A23D9 /00 ( 2006.01); A23L33/115; A23L3/44 (2006.01); 801)13/02 (2006.01) Poszukiwania prowadzone w klasach: A23D9/00; A23L31/10; A23Ll/29; A23Ll/30; A23L3/44 ;; A23L33/115; A23P10/30; A61K9/50; 801)13/02 Bazy komputerowe, w których prowadzono poszukiwania: esp@cenet; EPOQUENET; bazy UPRP; Google, STN Kategoria Dokumenty - z podana identyfikacja Odniesienie dokumentu do zastrz. A GB2418654 A (MICAP PLC [GB]) 05-04-2006 1-6 A EP0242135 A (AD2 LIMITED [GB]) 21-10-1987 1-6 A FR2179528 A (SEROZYM LABORATOIRES [FR]) 23-11-1973 1-6 A PL426836 A (SZKOLA GLÓWNA GOSPODARSTWA WIEJSKIEGO W 1-6 WARSZAWIE, WARSZAWA [PL]) 09-03-2021 A PL395052 A (NOVELINVENT SPÓLKA Z OGRANICZONA 1-6 ODPOWIEDZIALNOSCIA, KRAKÓW [PL]) 03-12-2012 D Dalszy ciag wykazu dokumentów na nastepnej stronie A - dokument okreslajacy ogólny stan techniki, który nie jest uwazany za posiadajacy szczególne znaczenie, E - dokument stano\\'iacy wczesniejsze zgloszenie lub patent, ale opublikowany w lub po dacie zgloszenia, L - dokument, który moze poddawac w watpliwosc zastrzegane pierwszehstwo(-wa), lub przytoczony w celu ustalenia claty publikacji innego L')'tcnvanego doku1nentu lub z innego szczególnego pcnvoclu, O - dokument odnoszaty sie do ujawnienia ustnego przez zastosowanie, wystawienie lub ujawnienie w inny sposób, r - dokument opublikowany przed data zgloszenia, ale pózniej niz zastrzegana data pierwszenstwa, T - dokument pózniejszy, opublikowany po dacie zgloszenia lub w dacie pierwszenstwa i niebedacy w konflikcie ze zgloszeniem, ale cytowany w celu zrozumienia rnsad lub teorii lezacych u podstaw \\ynal8zku, X - dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany wynalazek nie moze byc uwazany za no\\Y lub nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom wynalazczy, jezeli ten dokument brany jest pod uwage samodzielnie, y dokument o szczególnym znaczeniu; zastrzegany ,rynalazek nie moze byc uwazany za posiadajacy poziom ,\ynalazczy, jezeli ten dokument zostanie polaczony z jednym lub kilkoma tego typu dokumentami, a takie polaczenie bedzie oczywiste dla znawcy, & - dokument nalezacy do tej samej rodziny patentowej. Sprawozdanie wykonali-a: Krzysztof Szymanski - Ekspert data 02.09.2022r. /-podpisano kwalifikowanym podpisem elektronicznym-/ Pismo wydane w formie dokumentu elektroniczne_go Uwagi do zgloszenia Sprawozdanie zostalo wykonane w oparciu o wersje zastrzezen patentowych z 29-12-2021 r„ PL 440018 A1 26/26 PL PL