PL43450B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano dnia 20 wrzesnia 1960 r.POLSKIEJ RZECZYPOSPOLITEJ LUDOWEJ OPIS PATENTOWY Nr 43450 KI. 6 b, 16/03 Instytut Antybiotyków Warszawa, Polska Sposób otrzymywania nowego antybiotyku Patent trwa od dnia 7 wrzesnia 1959 r.Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania nowego antybiotyku Kandystyny na drodze bio¬ syntezy za pomoca nowego szczepu Streptomy¬ ces species INA-7/58. Kandystyna podobna jest do znanego antybiotyku Fungicydyny, co stwier¬ dzono na podstawie widma w nadfiolecie, skre- calnosci optycznej i wartosci RF w chroma¬ tografii bibulowej.Szczep Streptomyces sp. INA-7/58 otrzymany na drodze selekcji naturalnej nieznanego szcze¬ pu Actinomyces sp. A-94 rózni sie od dotych¬ czas opisanych producfentów Fungicydyny.Na podlozu zawierajacym: KJ1P04 (Merck) - 1,0 g, NaCl 1,0 g, (NH4)£04 - 2,0 g, CaCOs - 2,0 g, skrobie rozpuszczalna Difco - 10,0 g, agar Difco — 20,0 g, 500 ml wody wodociagowej, szczep Streptomyces sp. INA 7/58 wytwarza sporofory wedlug nomenklatury" Pridhama i Gottlieba okreslone jako „spirala", a spory ksztaltu owalnego.Na podlozu zawierajacym: glicerol (Merck) — 10,0 g, asparagine (Merck) - 1,0 g, K2HPO^ (Merck) —1,0 g, agar Difco - 20,0 g wode wodo¬ ciagowa — 1000 ml., grzybnia podstawowa szcze¬ pu Streptomyces sp. INA 7/58 ma zabarwienie bialozólte, a powietrzna bialo-szare. Na podlozu zawierajacym Bacto-tryptone Difco — 1,0 g, Bacto-Yeast Extract Difco - 1,0 g, NaCl — 8,5 g, agar — 17 g, wode wodociagowa 1000 ml, szczep Streptomyces sp. INA 7/58 nie wytwarza pig¬ mentu typu melaniny. Nizej podano wlasci¬ wosci biologiczne szczepu Streptomyces sp. INA 7/58 w porównaniu z odpowiednimi wlasci¬ wosciami szczepu Streptomyces noursei ATCC 11455 producenta Fungicydyny.Charakterystyka szczepu na podlozu Czapek- Doxa: NaNOs - 2,0 g, K^IPOA - 1,0 g, MgS04 * 7H20 - 0,5 g, KCl -" 0,5 g, FeS04 - 0,01 g, sacharoza - 30,0 g, agar - 20,0 g, woda destylowana - 1000 ml.Jjzczep Wzrost' w temp. 37'C Grzybnia powietrzna Pigment rozpuszczalny Sfrept noursei ATCC ln55 brak - - - - - Strept. sp.INA 7/58 dobry dobre biala, wl6ft godz. siara - Charakterystyka szczepu na podlozu 2 aspa- ragina: glukoza — 100 g, asparagina — 0,5 g, K2HP04 - 0,5 g, agar - 20,0 & Szczep Wzrost w temp. 28*C Zarodnikowanie Grzybnia powietrzna Pigment rozpuszczalny Strept. noursei ATCC 11455 dobry dobre bialo-szara ciemno-szary Strept. sp.INA 7/58 dobry dobre bialo-szara brak Charakterystyka szczepu na podlozu zawie¬ rajacym: azotan potasowy — 1,0 g, wyciag miesny, szczep ATCC 11455, wykazuje slady redukcji azotanów do azotynów, podczas gdy szczep Streptomyces sp. INA 7/58 nie redukuje azotanów do azotynów.Charakterystyka szczepu na podlozu trypto- nowo-glukozowym stalym: trypton — 1,0 g, glukoza - 1,0 g, agar - 2,0 g, woda destylo¬ wana - 100 ml.Szczep Temperatura Wzrost Zarodniko¬ wanie Grzybnia powietrzna Strept. noursei ATCC 11455 3THC dobry dobre kremowa 28*C obfity dobre szara Strept. sp.INA^/58 37*C 28«C dobry dobry dobre dobre biala biala male ilos- zólto- brazo- male ci, jasno* brazo*- wy ilosci Pigment rózowy wp-zie- zólto- lony brazo¬ wy -Charakterystyka szczepu na podlozu trypto- nowo-glukozowym plynnym: trypton-1,0 g, glu¬ koza — 1,0 g, woda destylowana — 100 ml.Szczep Temper.Warost Zarodniko¬ wanie Grzybnia powietrzna Pigment Strept. noursei Strept. sp.ATCC 11455 INA 7/58 37°C dobry dobre bialo- szara' 28°C dobry obfite bialo- szara granatowo-czer- wony Wytwa¬ rza H2S 37°C dobry obfite biala nie wy¬ twarza rza H2S 27°C dobry obfite bialo- szara brak Wyizolowany szczep Streptomyces sp. INA 7/58 sluzyl do otrzymania mutantów produk¬ cyjnych na drodze selekcji naturalnej oraz przy pomocy naswietlania promieniami nadfio- letoW^tii.Agar ziemniaczany z glukoza jest podlozem sporulacyjnym i podlozem do przechowywania szczepu Streptomyces sp. INA 7/58. Kultury na skosach inkubuje sie w temperaturze 28°C w ciagu 7 — 10 dni. Gdy grzybnia powietrzna przybierze barwe szara, szczep przechowuje sie w chlodni w temperaturze 4°C. Poza tym szczep mozna przechowywac na kaszy perlowej, w ziemi i w postaci zliofllizowanej.Sposób wedlug wynalazku polega na prowa¬ dzeniu procesu biosyntezy na pozywce fermen¬ tacyjnej w obecnosci szczepu Streptomyces sp.INA 7/58, ponizej temperatury 30*C, najkorzyst¬ niej w temperaturze 27 — 29°C, az do czasu wytworzenia przez ten szczep w grzybni Kan- dystyny, co trwa 60 — 84 godzin. Z przefer- mentowanej brzeczki oddziela sie grzybnie, np. przez odwirowania lub przez filtrowanie, a uzy¬ skana grzybnie ekstrahuje sie rozpuszczalni¬ kiem np. metanolem. Wyciag metanolowy, za¬ wierajacy Kandystyne zageszcza sie w prózni, a otrzymany szlam poddaje sie ponownej eks¬ trakcji metanolowym roztworem CaÓ2 1 wy¬ traceniu woda. Osad po przemyciu eterem lub innym nie rozpuszczajacym Kmndystyny orga¬ nicznym rolpusrctolnikiem, suszy sie w tem¬ peraturze nie przekraczajacej 50°C. W celu uzyskania czystego krystalicznego produktu powtarza sie proces ekstrakcji metanolowym — 2 —roztworem CaCl2 lub innymi: rozpuszczalntka- mi, w których Kandystyna jest dobrze roz¬ puszczalna.Przyklad I. Dwustadiowa fermenta- «cja w kolbach na trzesawce.Stadium I. W kolbie o pojemnosci 750 ml umieszcza sie 100 ml pozywki posiewowej o skladzie: wyciag namoku kukurydzy — 0,5%, suchej substancji skrobii ziemniaczanej — 2,0% JNH4)£04 - 0,4%, CaCOs - 0,5%. Pozywke ?doprowdza sie do wartosci pH = 6,0, wyja¬ lawia w sposób powszechnie stosowany, po czym zaszczepia sie zawiesina zarodników ^w 0,85%-owym wodnym roztworze NaCl, uzy¬ skanym przez splukanie z jednego skosu. Calosc poddaje sie inkubacji na trzesawce w tempe¬ raturze 28°C przez 48 godzin.Stadium II. 100 ml wyjalowionej pozywki produkcyjnej o skladzie: wyciag namoku ku¬ kurydzy — 0,5% (suchej substancji), glukozy — 4,0%, (NHJjSO, - 0,4%, CaCOs - 0,8% dopro¬ wadzonej do wartosci pH okolo 8,0, szczepi sie w kolbie 750 ml 10% objetosciowymi wegeta¬ tywnego inoculum, uzyskanego z stadium I i poddaje fermentacji na trzesawce przez 96 godzin.Przyklad II. Trzystadiowa fermen¬ tacja w fermentorach. I stadium posiewowe przeprowadza sie w kolbach w sposób podany jak w przykladzie I.Stadium II prowadzi sie w fermentorze a po¬ jemnosci np. 100 1. Podloze produkcyjne o skla¬ dzie jak wyzej, zawierajace ponadto olej so¬ jowy w ilosci 0,3%, wyjalawia sie w tempe¬ raturze 115°C przy 0,8 atm. w ciagu jednej igodziny. Sterylna brzeczke w ilosci 70 1 szcze¬ pi sie 48-godzinnym materialem posiewowym % kolb w ilosci 1% objetosciowego i poddaje 16 — 48-godzinnej fermentacji w temperaturze :28°C, przy napowietrzaniu 20 — 70 \ powietrza Jia minute.Stadium III prowadzi sie w fermentorze 0 pojemnosci np. 1500 1 na podlozu produk¬ cyjnym wykonanym w sposób podany dla sta¬ dium II i przy utrzymaniu tychze parametrów lecz napowietrzaniu 200 — 600 1 powietrza/mi- mute przez okres srednio 70 godzin. Koniec fermentacji nastepuje przy pH okolo 7,0 czyli z poczatkiem autolizy grzybni.Oznaczenie Kandystyny w wyciagu z grzybni 1 w brzeczce przeprowadza sie za pomoca me¬ tody plytkowo-cylinderkówej, uzywajac - jako szczepu wzorcowego, szczep Candida albicans 102 lub Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763.Z uzyskanej w fermentacji brzeczki oddziela sie grzybnie np. przer odwirowanie /ra ^wirówce koszowej, lub przez filtrowanie na ramowej prasie filtracyjnej, po czym grzybnie umiesz¬ cza sie w reaktorze o pojemnosci okolo 500 i, zadaje 200 — 300 objetosciaml wodnego 20 — 40%-go roztworu metanolu i ekstrahuje mie¬ szajac do calkowitego wyciagniecia Kandy¬ styny. Wyciag metanolowy antybiotyku odpa- rowywuje sie w niskiej prózni, w tempera¬ turze 'nie przekraczajacej 30°C, do uzyskania suchego szlamu barwy kremowej, który z ko¬ lei poddaje sie ekstrakcji metanolowym roz¬ tworem CaCl2 w stosunku 2 — 3 czesci roztwo¬ ru na 1 czesc szlamu i nastepnie odwirowaniu lub odsaczeniu na nuczy.Z otrzymanego przesaczu, wytraca sie Kan- dystyne przez zadanie pieciokrotna iloscia wody destylowanej. Wytracona surowa Kandystyne odsacza sie na nuczy, przemywa eterem i suszy powietrzem.W celu uzyskania czystego krystalicznego produktu ostatnia operacje ekstrakcji roztwo¬ rem metanolowym CaCl2 powtarza sie i kilka¬ krotnie rekrystalizuje z eteru. Wydajnosc Kan¬ dystyny wynosi 55 — 65% substancji wyjscio¬ wej. PL

Claims (3)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania nowego antybiotyku Kandystyny, znamienny tym, ze proces bio¬ syntezy prowadzi sie metoda fermentacji glebinowej w obecnosci szczepu Streptomy- ces species INA 7/58, w temperaturze po¬ nizej 30°C na pozywce zawierajacej przy¬ swajalny wegiel, azot i sole mineralne, do czasu wytworzenia przez «ten szczep w grzyb¬ ni antybiotyku, który izoluje sie metoda ekstrakcji i wytracenia.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze powstaly w grzybni antybiotyk ekstrahuje sie kilkakrotnie wodnym 20 — 40%-ym roz¬ tworem metanolu, po czym wyciag odsacza sie i odparowuje w prózni w temperaturze nie przekraczajacej 30°C, a uzyskany szlam ekstrahuje sie metanolowym roztworem CaCl2 i z ekstraktu wytraca antybiotyk za pomoca wody, z kolei osad przemywa sie eterem lub innym nie rozpuszczajacym an¬ tybiotyku organicznym rozpuszczalnikiem, a w koncu suszy go w temperaturze nie przekraczajacej 50°C i ewentualnie* poddaje rekrystalizacji. Instytut AntybiotykówBIB- ¦:niov.'egol Wzór Jednoraz. Stól. Zakl. Graf. — WG. Zam. 78
3. 3. 100 egz.. Al pism., ki. III. PL