PL43448B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano dnia 15 wrzesnia 1960 r. £ y"y, 4l POLSKIEJ RZECZYPOSPOLITEJ LUDOWEJ OPIS PATENTOWY Nr 43448 KI. 6 b, 16/03 Instytut Antybiotyków Warszawa, Polska Sposób otrzymywania chlorotetracykliny Patent trwa od dnia 20 czerwca 1959 r.Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania chlorotetracykliny.Jest rzecza znana, ze chlorotetracykline otrzymuje sie na drodze fermentacji glebino¬ wej mikroorganizmów z gatunku Streptomyces.Wszystkie dotychczas opisane metody otrzy¬ mywania chlorotetracykliny charakteryzuja sie dlugim okresem fermentacji, trwajacym po¬ wyzej 48 godzin.Stwierdzono, ze mozna otrzymywac chloro¬ tetracykline w czasie krótszym od dotychczas wymaganego, a mianowicie w czasie 36—48 go¬ dzin, jezeli proces biosyntezy prowadzi sie w obecnosci szczepu Streptomyces species J.A.K.-51 wyizolowanego z gleby w Polsce.W procesie tym obok chlorotetracykliny po¬ wstaja równiez slady tetracykliny oraz innych niezidentyfikowanych antybiotyków X i Y. Do wytwarzania antybiotyku stosuje sie szczep poddany uprzednio dzialaniu powszechnie zna¬ nych czynników mutagennych np. promieni ultrafioletowych, promieni X, iperytu azoto¬ wego oraz adoptowany do wysokich stezen an¬ tybiotyku w podlozu agarowym. Zarodniki te¬ go szczepu mozna przechowywac w postaci liofilizatu w piasku, w konserwie piaskowej oraz na kaszy. Konserwy moga byc przecho¬ wywane w temperaturze pokojowej w okresie do 2 lat bez spadku wydajnosci.\ $ V t^% Pozywka ^ syntetyczna celuloza skrobia mleko ziemniak zelatyna agar dekstfy- nowy A-Cbarak^rystyka szczepu Streptomyces species fcfrosl* slaby bardzo slaby sredni slaby dobry slaby sredni Zarodnikowanie slabe . slady zarodników — szare slabe — czarne obraczka na po¬ wierzchni dobre — czarne brak dobre rózowo- wrzosowe do czar¬ nego Grzybnia powietrzna slabo rozwinieta skórzasta skórzasta srednio rozwinieta brak ciemno pomaran¬ czowa do ceglastej JAJC.-51 Pigment zólty brak brak jasno brazowy zólty brudno wisniowy Uwagi nie rozklada nie hydrolizuje koaguluje slady rozpusz¬ czenia agar aspa¬ raginowy dobry dobre biala rózowo- wrzosowa do czar¬ nego zielono- brunatny brak spira zarodniki okragle o srednicy 0.85 jj, brak plynu re- spiracyjnego agar otre¬ bowy dobry dobre szaro-rózo- we do mysiego zólta do ciemno brazowej zielono- brunatny W sposobie wedlug wynalazku, jako zródlo wegla w pozywce fermentacyjnej stosuje sie: sacharoze, glukoze, melase itp., jako zródlo azotu organicznego make sojowa, arachidy, wyciag namokowy kukurydzy itp., jako sole mineralne chlorek sodowy, azotan amonowy, siarczan amonowy, chlorek amonowy, fosfo¬ ran potasowy itp. Wazne jest dla tego no¬ wego szczepu, aby zawartosc fosforu nieorga¬ nicznego w pozywce wynosila 3 mg procent.Do fermentacji mozna uzywac wody wodo¬ ciagowej lub glebinowej, która dostarcza do¬ stateczna ilosc mikroelementów, nie moze jed¬ nak ona zawierac organicznych zwiazków siar¬ ki oraz siarkowodoru i jego soli. W celu utrzy¬ mania odpowiedniego stezenia jonów wodoro¬ wych uzywa sie weglanu wapniowego jako zwiazku buforujacego. Do gaszenia piany sto¬ suje sie oleje roslinne.Proces fermentacji prowadzi sie w tankach zelaznych przy zachowaniu warunków jalo- wosci, dostarczajac w czasie fermentacji 0,2—0,5 objetosci jalowego powietrza na obje¬ tosc pozywki na minute.Maksymalne ilosci antybiotyku otrzymuje sie w czasie od 30 do 48 "godziny fermentacji, przy utrzymywaniu temperatury fermentacji w granicach 28—32°C i przy zachowaniu war¬ tosci pH podloza w granicach 5,5—7,5.Ilosc inoculum wegetatywnego hodowanego na pozywce innej niz produkcyjna, moze wy¬ nosic 1—10%. Wiek inoculum powinien wyno¬ sic 24—39 godzin.Aktywnosc brzeczek fermentacyjnych ozna¬ cza sie znanymi metodami biologicznymi i fi¬ zykochemicznymi. Chromatografia bibulowa brzeczek wyizolowanego szczepu oraz jego mu¬ tantów wykazuje obecnosc trzech antybioty¬ ków oprócz chloTOtetracyktfay, z których je¬ den zidentyfikowano jako teiracykline a dwa pozostale oznaczono jako antybiotyk Xi Y, Chromatografia ukladu octan etylu nasycony woda: — 2 —chlorotetracyklina slady tetracykliny antybiotyk X antybiotyk Y .R1--1 Rf —0,4 Rf —0,28 Rf —0,15 Z brzeczki fermentacyjnej izoluje sie anty¬ biotyk przez ekstrahowanie ehlorótetracykliny z czwartorzedowymi zasadami amoniowymi, w srodowisku alkalicznym za pomoca miesza¬ niny rozpuszczalników organicznych, przez reekstrakcje do wody w srodowisku kwasnym i wysalanie przez dodanie chlorku sodowego.Mozna równiez wytracic kompleksowe polacze¬ nie ehlorótetracykliny z wyzej wymienionymi zasadami amoniowymi, nastepnie ekstrahowac je rozpuszczalnikiem organicznym i zakwasic w celu otrzymania krysztalów chlorowodorku ehlorótetracykliny.Przyklad I. Szczep Streptomyces sp.J.A.K.-51 hoduje sie na podlozu agarowym o nastepujacym skladzie: asparagina fosforan petasowy wyciag miesny glukoza agar siarczan zelaza wartosc pH -0,1% — 0,25% — 0,2% — 1% — 2,5% — 0,001% -7,0 Z pozywki agarowej zbiera sie zarodniki I przenosi do pozywki posiewowej o skladzie: drozdze chlorek siarczan fosforan glukoza weglan sodowy amonowy potasowy wapniowy — 0,5% — 0,25% — 0,3% — 0,02% — 3% — 0,6% wartosc pH = 6,5 (przed sterylizacja) Pozywke sterylizuje sie przez 30 minut w temperaturze 115—117°C. Inkubacja mate¬ rialu posiewowego trwa 24—39 godzin, po czym przeszczepia sie go na pozywke produkcyjna o nastepujacym skladzie: arachidy maka kartoflana wyciag namoku kuku¬ rydzy melasa sacharoza ¦¦ • siarczan amonowy chlorek sodowy weglan wapniowy wartosc pH = 7,0 — 2% — 2% — 0,4% — 0;2% — 3% — 0,3% — 0,4% — 0,6% Pozywke te sterylizuje sie w ciagu 30 mi¬ nut w temperaturze 115—117*C, po czym pod¬ daje sie ja fermentacji w ciagu 36—48 godzin.Brzeczke z kolb w ilosci 2 1 zakwasza sie kwasem szczawiowym do wartosci pH = 2,8 i saczy. Do klarownego przesaczu dodaje sie 0,2% chlorku etylopirydyniowego, 0,05°/T chlor¬ ku dwumetylolaurylobenzyloamoniowego i 20% mieszaniny octanu butylu z butanolem w sto¬ sunku 9:1, po czym wartosc pH calosci do¬ prowadza sie do okolo 8,0 przy uzyciu roz¬ tworu NaOH. Po ekstrakcji trwajacej 1 go¬ dzine oddziela sie klarowna faze organiczna.Ekstrakcje powtarzasie dwukrotnie. Zebrane klarowne fazy organiczne laczy sie, odparo- wywuje polowe ilosci rozpuszczalnika pod próznia, po czym dodaje sie 10% wody do¬ prowadzajac wartosc pH mieszaniny do 2,8 przy uzyciu HzSOa (1:3). Ekstrakcje do wo¬ dy prowadzi sie dwukrotnie w czasie po 0,5 godziny. Do oddzielnej klarownej fazy wod¬ nej dodaje sie 18% chlorku sodowego i pozo¬ stawia na kilka godzin do krystalizacji. Otrzy¬ muje sie 0,74 g krysztalów chlorowodorku ehlorótetracykliny o mocy 938 meg/mg.Przyklad II. 2 I brzeczki fermentacyjnej zakwasza sie kwasem szczawiowym do war¬ tosci pH = 2,8 i saczy. Do klarownego prze¬ saczu dodaje sie 0,2% chlorku etylopirydynio¬ wego i 0,3% ziemi okrzemkowej, po czym roz¬ twór nastawia sie na wartosc pH = 9,0 za pomoca NaOH. Wytracony, odsaczony i wy¬ suszony osad ekstrahuje sie metanolem zawie¬ rajacym 8% CaCU. Ekstrakcje prowadzi sie trzykrotnie a polaczone ekstrakty metano¬ lowe zageszcza do uzyskania koncentracji 120.000 mcg/ml.Uzyskany koncentrat zakwasza sie 12-pro- centowym metanolowym roztworem HCl (25- procentowym) i miesza do rozpoczecia krysta¬ lizacji. Po kilkunastu godzinach otrzymuje sie 0,792 g krysztalów chlorowodorku ehlorótetra¬ cykliny o mocy 965 meg/mg. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania ehlorótetracykliny me¬ toda fermentacji glebinowej przy uzyciu mi¬ kroorganizmów z gatunku Streptomyces, zna¬ mienny tym, ze proces biosyntezy prowadzi sie w obecnosci szczepu Streptomyces species J.A.K.-51 w okresie czasu nizszym od 48 go¬ dzin w temperaturze 28—32°C, przy zachowa¬ niu wartosci pH podloza w granicach 5,5—7,5. Instytut Aiitybiotyków — 3 —Wzór Jednoraz. Stól. Zakl.' Graf. - WG. Zam. 789, 100 egz., Al plsm., ki. III. PL