Opublikowano dnia 28 listopada 1958 r.POLSKIEJ RZECZYPOSPOLITEJ LUDOWEJ OPIS PATENTOWY Nr 41449 KI. 30 h, 2/04 Warszaiuska Wytiuórnia Surouric i Szczepionek *) Warszawa, Polska Sposób otrzymywania hialuronidazy jadrowej Patent trwa od dnia 4 stycznia 1957 r.Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzy¬ mywania hialuronidazy jadrowej.Dotychczas otrzymywanie hialuronidazy opiera sie na nastepujacych procesach: ekstrakcji en¬ zymu z gruczolów, frakcjonowaniu ekstratów za pomoca soli olowiu, usuwaniu nadmiaru jo¬ nów olowiu przez dialize, frakcjonowaniu pozo¬ stalosci po dializie za pomoca siarczanu amono¬ wego, usuwaniu nadmiaru siarczanu amono¬ wego przez dialize, wreszcie zageszczaniu, fil¬ tracji i wyjalowianiu gotowego juz produktu.Po selektywnym frakcjonowaniu za pomoca soli olowiu, otrzymuje sie enzym — hialuroni- daze w postaci zwiazku kompleksowego z dwu- wartosciowym jonem olowiu. Przy dalszej prze¬ róbce konieczne jest usuniecie jonów olowiu z kompleksu hialuronidaza — olów, poniewaz jony te uniemozliwiaja calkowicie prowadzenie dalszych procesów produkcyjnych.Dotychczas jony te usuwa sie przez dialize *) Wlasciciel patentu oswiadczyl, ze wspól¬ twórcami wynalazku sa Andrzej Budzynski i Teresa Drecka. wobec wody w temperaturze okolo 4°C, co jest procesem zmudnym, czasochlonnym, (trwaja¬ cym w obecnych warunkach okolo 3 tygodni) i nieekonomicznym, poniewaz pomimo zacho¬ wania wszelkich srodków ostroznosci, nastepu¬ je strata miana w wysokosci okolo 20°/o.Powyzsze wady usuwa sposób wedlug wyna¬ lazku, który eliminuje dialize kompleksu hialu¬ ronidaza — olów.Stwierdzono, ze werseniany, jako znane zwiazki sekwestrujace, posiadaja dzialanie kon¬ kurencyjne w stosunku do kompleksu hialuro¬ nidaza — olów i ze wychwytuja z tego kom¬ pleksu olów, w sposób ilosciowy, przy czym re¬ akcja zachodzi nawet w srodowisku alkalicz¬ nym. Równoczesnie werseniany wychwytuja i inne jony metali ciezkich, miedzy innymi jo¬ ny zelaza, które inaktywuja ten enzym juz w stezeniach rzedu 10-4 mola. Na skutek tego mozna wyeliminowac calkowicie dlugotrwala dialize przeprowadzona w celu usuniecia olo¬ wiu. Ponadto dzieki zastosowaniu werseiiianów, mozna równiez odzyskac powazne ilosci aktyw-nej hialuronidazy z enzymu zinaktywowanego w czasie produkcji metalami ciezkimi, a w szcze¬ gólnosci zelazem.* Dodanie niewielkiego nadmiaru wersenianu (okolo 5%-ego) chroni preparat w czasie dalszej przeróbki przed ewentualna inaktywacja przez metale ciezkie.Sposób wedlug wynalazku jest prosty w wy¬ konaniu i nie wymaga zadnych dodatkowych nakladów pienieznych, zwiazanych z zastoso¬ waniem jego w produkcji.Roztwór hialuronidazy, który wedlug dotych¬ czas stosowanego sposobu powinien byc pod¬ dany dializie, usuwajacej olów, alkalizuje sie 2n amoniakiem do pH 8,2, po czym dodaje sie do niego tyle 5°/&-go roztworu wodnego werse¬ nianu dwusodowego (a najkorzystniej werse¬ nianu dwusodowo — wapniowego) az nastapi calkowite rozpuszczenie powstalego osadu. Po¬ niewaz w czasie reakcji pH roztworu spada do wartosci okolo 5,8, ponownie wprowadza sie do niego 2n — amoniak do uzyskania pH = 8,2 i dodaje znowu 5*/o-ego roztworu wersenianu.Otrzymany roztwór poddaje sie frakcjonowa¬ niu za pomoca siarczanu amonowego w dotych¬ czas stosowany sposób i dalej przerabia w zna¬ ny sposób.Przyklad: Przy uzyciu 2300 ml hialuro¬ nidazy, sklarowanej na filtrze Seitza, o mianie 200 TRU/ml (lacznie 460000 TRU) zuzyto na do¬ prowadzenia pH roztworu do 8,2 — 185 ml 2n — amoniaku, 400 ml 5Vo-go wersenianu dwu¬ sodowego, nastepnie jeszcze 30 ml 2n — amo¬ niaku na ponowne doprowadzenie pH do 8,2 i dodatkowo 20 ml 5Vo-go roztworu wersenianu dwusodowego. Nastepnie otrzymany roztwór poddano w sposób znany frakcjonowaniu za po¬ moca siarczanu amonowego i wydializowano calkowicie jony NA4+. Otrzymano 2100 ml roz¬ tworu hialuronidazy o mianie 740 TRU/ml czyli lacznie 1550000 TRU.Przy przerobie tej samej ilosci hialuronidazy (460000 TRU) za pomoca dotychczas stosowanej dializy w celu usuniecia jonów olowiu otrzy¬ mano zaledwie 200.000 TRU. PL