PL373518A1 - Nowe szczepy z rodzaju Lactobacillus i kompozycja składająca sie z nowych szczepów z rodzaju Lactobacillus - Google Patents

Description

14 przez 3 minuty. Preparat oceniano mikroskopowo przy powiększeniu 1000 x. Liczono komórki Lactobacillus przylegające do 20 komórek nabłonkowych i obliczano wartość średnią, wyniki podano w tabelach 4.

Tabela 4. Wyniki badania adherencyjnych właściwości szczepów Lactobacillus pochodzenia pochwowego do ludzkiej linii komórkowej A 431.

Nr szczepu Adherencja do komórek linii A431 L. fermentum 57A +4-/++4- L, planiarum 57B ++ L. gasseri 57C + L. plantarum 78B ++

Określenie stopnia adherencji dla tkanki Λ-431

Liczba komórek bakteryjnych powyżej 100 +4"f- powyżej 40 -ł~f w zakresie 20 do 40 + poniżej 20 - Liczbę komórek bakteryjnych poc aje się jako średnią z 20 pól wadzenia w preparacie

Do badań stosuje się 24 godzinną hodowlę tkanki A-431

Określenie iekooporności szczepów. W badaniach zastosowano standardową metodę dyfuzyjno-krąźkową według ogólnych standardów NCCLS (Brak standardów szczegółowych dla Lactobacillus). Badane pojedyncze szczepy Lactobacillus, posiewano po wieloboku na płytki MRS, a następnie inkubowano w warunkach beztlenowych i/lub tlenowych w temperaturze 37°C. Po 24+48h uzyskano pojedyncze kolonie, które zawieszano w Iml płynnego podłoża MRS i inkubowano w tych samych warunkach. Po 24 h stężenie zawiesiny bakteryjnej doprowadzono do gęstości 0,5 wg skali Mc Farlanda, rozcieńczając hodowle solą fizjologiczną. Następnie ΙΟΟμΙ takiego inokulum przenoszono do Iml NaCl. Rozcieńczoną hodowlę rozprowadzono przy użyciu jałowego wacika na całej powierzchni uprzednio przygotowanych płytek z podłożem stałym MRS Agar (Oxoid), Po ich wyschnięciu na płytki nakładano krążki z antybiotykami (po 7 krążków na każdą), a następnie inkubowano w warunkach tlenowych w temperaturze 37°C przez 24 h (24-48 h dla podłoża Bruceila Agar). Po zakończeniu okresu inkubacji zmierzono za pomocą linijki strefy zahamowania 15 wzrostu bakterii wokół krążka. Średnicę stref podano w mm, uwzględniając również średnicę krążka. Oznaczenia powtarzano w celu uzyskania wartości średnich. Wyniki podano w Tabeli 5.

Tabela 5. Wrażliwość badanych szczepów Lactobacillus na antybiotyki oznaczona metodą krążkową wobec szczepów kontrolnych

Antybiotyk stężenie Szerokość strefy zahamowania wzrostu (mm) dla: L. fermentum 57 A L. plantarum 57 B L. plantarum 78 B L, gasseri 57 C Penicylina 10 pg 31 26 35 45 Ampicylina 10 pg 26 27 30 30 Gentamycyna 10 pg 12 14 17 12 Wankomycyna 30 pg 5 5 5 23 Klindamycyna 2 pg 30 17 24 25 Metronidazol 50 pg 5 5 5 5 Sulfametoksazol 25 pg 5 24 30 5 Norfloksacyna 10 pg 5 5 5 5 Kwas nalidyksowy 30 pg 5 5 5 5 Chloramfenikol 30 pg 30 30 37 35 Tetracyklina 30pg | | 28 24 32 35

Badane szczepy wykazują oporność na antybiotyki zgodnie ze wzorcem oporności dla poszczególnych gatunków Lactobacillus przy zastosowaniu metody izolacji DNA plazmidowego z rodzajów takich bakterii jak Lactobacillus i Lactococcus. Nie stwierdzono obecności plazmidów w badanych szczepach.

Przedstawione badania dowodzą, że nowe szczepy Lactobacillus plantarum 57B. Lactobacillus plantarum 78B. Lactobacillus fermentum 57Λ i Lactobacillus gasseri 57C spełniają wszystkie wymagania stawiane produktom probiotycznym. Na podstawie przeprowadzonych testów można wnioskować, że nowe szczepy są korzystniejsze w porównaniu z innymi przebadanymi szczepami. Dodatkowo każdy z wyselekcjonowanych 16 i zdeponowanych szczepów posiada silną cechę wiodącą. Nowe szczepy Lactobacillus plantarum 57B i Lactobacillus plantarum 78B charaktery żyją się silnymi właściwościami antagonistycznymi szczególnie na patogeny takie jak: Gardnerella vaginalis i Escherichia coli. Lactobacillus fermentum 57A bardzo dobrze przylega do komórek ustroju gospodarza, zaś Lactobacillus gasseri 57C wytwarza duże ilości nadtlenku wodoru.

Nieoczekiwanie zaobserwowano, że w mikroflorze pochwy zdrowych kobiet najczęściej występuje po kilka gatunków Lactobacillus. Wykazano, że gatunkami najczęściej izolowanymi były szczepy z grupy acidophilnej: L. acidophilus (35%), L. fermentum (30%) i L. plantarum (30%).

Można przypuszczać, że forma symbiozy pomiędzy szczepami różnych gatunków stwarza szansę skuteczniejszej obrony przed niepożądanymi drobnoustrojami wchodzącymi w skład lokalnej mikroflory. Zastosowano kompozycję bakterii składającą się z Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B i Lactobacillus gasseri 57C w ilościach wyznaczonych przez proporcję: 0.5 : 05: 1. Poniżej przedstawiono wynik badania adherencji kompozycji Lactobacillus wobec szczepów wskaźnikowych (tabela 6) oraz badanie antagonizmu kompozycji szczepów Lactobacillus wobec szczepów wskaźnikowych (tab. 7).

Kompozycja Al zawiera L. fermentum 57A, L. plantarum 57B. i L. gasseri 57C w proporcjach: 0.5 : 0.5 : 1

Tabela 6.

Kompozycja Szczepy Proporcja Stopień adherencji A 1 57A, 57B, 57C 0,5:0,5:1 ++

Tabela 7.

Szczepy wskaźnikowe Strefy zahamowania wzrostu [mm] Escherichia coli 18/18 Streptococcus agalactiae 22/20 Gardnerella vaginaiis 22/21 17 17 Prevotella bivia 18/18 Candida albicans ++/++

Na podstawie powyższych testów można wnioskować, że stosowanie kompozycji zawierającej L. fermentum 57A, L. plantarum 57B, i L. gasseri 57C w proporcjach: 0.5 : .0.5 : 1 jest bardzo korzystne. Tak dobrana kompozycja badanych szczepów posiada skonsolidowane cechy wiodące każdego ze szczepów. t

Rzec:

Claims (1)

1. Zastrzeżenia patentowe Nowy szczep Lactobacillus fermentom 57A zdeponowany pod numerem B/00007, Λ Nowy szczep Lactobacillus plantarum 57B zdeponowany pod numerem 1100008. n Nowy szczep Lactobacillus gasseri 57C zdeponowany pod numerem B/00009, 4. Nowy szczep Lactobacillus plantarum 78B zdeponowany pod numerem B/00010, 5. Kompozycja nowych szczepów z rodzaju Lactobacillus znamienna tym, że zawiera trzy szczepy Lactobacillus fermentom 57A zdeponowany pod numerem B/00007. Lactobacillus plantarum 57B zdeponowany pod numerem B/00008, Lactobacillus gasseri 57C zdeponowany pod numerem B/00009 i których względne ilości wyznacza proporcja 0.5 : 0.5 : 1. RiecznL p·.-ar. Alina' Sr; 7 ;a