PL249778B1 - Biosensor do specyficznego i jednoczesnego oznaczania 2,3-dioksygenazy indolaminy IDO-1 oraz interferonu gamma IFN-γ w ludzkim materiale biologicznym z wykorzystaniem techniki powierzchniowego rezonansu plazmonów w wersji Imaging - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest biosensor do specyficznego i jednoczesnego oznaczania 2,3-dikosygenazy indolaminy IDO-1 oraz interferonu gamma IFN-ă w ludzkim materiale biologicznym z wykorzystaniem techniki powierzchniowego rezonansu plazmonów w wersji Imaging, który stanowi płytkę szklaną pokrytą warstwą złota na podłożu tytanu oraz siatkę polimeru tworzącą pęk miejsc aktywnych zawierających warstwę receptorową. Warstwę receptorową stanowią biotynylowane monoklonalne królicze przeciwciała specyficzne na IDO-1 lub IFN-ă (9), zimmobilizowane na powierzchni złota (3) pokrytej hydrofobową folią o grubości 20 µm (4), tworzącą dwanaście miejsc aktywnych (5) w matrycy 4x3, przy czym przeciwciało (9) połączone jest z 50 nm warstwą złota (3), umieszczoną na 1 nm warstwie tytanu (2) pokrywającą płytkę szklaną (1), poprzez oddziaływania ze streptawidyną (8), która wiązaniem kowalencyjnym związana jest z warstwą karboksymetylodekstranu (7) za pośrednictwem linkera w postaci 3-merkapto-1-olu (6).

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest biosensor, wykorzystujący jako metodę detekcji powierzchniowy rezonans plazmonowy do jednoczesnych i selektywnych oznaczeń 2,3-dioksygenazy indolaminy (IDO-1) oraz interferonu gamma (IFN-γ) w ludzkim materiale biologicznym.

L-tryptofan (L-Trp) jest jednym z najważniejszych aminokwasów i nieustannie ulega procesowi metabolizmu. Proces ten zapoczątkowany oraz kontrolowany jest przez enzym IDO-1, którego poziom ekspresji zależy natomiast od IFN-γ. Wzrost ekspresji IDO-1 wywołany działaniem IFN-γ uruchamia szlak kinureninowy metabolizmu L-Trp, który prowadzi do syntezy najważniejszych metabolitów L-Trp, czyli kinureniny (KYN), 3-hydroksykinureniny (3-HK) oraz kwasu 3-hydroksyantranilowego (3-HAA). Fiore, A.; Murray, P.J. Tryptophan and Indole Metabolism in Immune Regulation. Curr Opin Immunol 2021,70, 7-14, doi:10.1016/J.COI.2020.12.001.

Ekspresja IDO-1 regulowana jest przez odpowiednie szlaki sygnalizacyjne, przy udziale także IFN-γ. W mikro środowisku nowotworu IDO-1 działa immunosupresyjnie i ma związek z progresją nowotworu. Fujiwara, Y.; Kato, S.; Nesline, M.K.; Conroy, J.M.; DePietro, P.; Pabla, S.; Kurzrock, R. Indoleamine 2,3-Dioxygenase (IDO) Inhibitors and Cancer Immunotherapy. Cancer Treat Rev 2022, 110, 102461, doi:10.1016/J.CTRV.2022.102461.

W organizmie ludzkim enzym ten ulega konstytutywnej ekspresji m.in. w komórkach śródbłonka łożyska i płuc, komórkach nabłonka żeńskich narządów płciowych, komórkach w narządach limfatycznych oraz komórkach β wysp trzustkowych u osób zdrowych. Wspomniana zależność ekspresji IDO-1 zależna od IFN-γ może stanowić mechanizm odpowiedzi przeciwzapalnej, który jest szeroko wykorzystywany przez nowotwory dla ułatwienia tzw. ucieczki immunologicznej. Pallotta, M.T.; Rossini, S.; Suvieri, C.; Coletti, A.; Orabona, C.; Macchiarulo, A.; Volpi, C.; Grohmann, U. Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1 (IDO1): An up-to-Date Overview of an Eclectic Immunoregulatory Enzyme. FEBS J 2022, 289, 6099-6118, doi:10.1111/FEBS.16086. Poza tym, IDO-1 to ważny enzym kontrolujący układ odpornościowy, dzięki czemu IDO-1 odpowiada za regulację istotnych funkcji fizjologicznych i przyczynia się do modulacji patogenezy i nasilenia stanów zapalnych, chorób zakaźnych, zaburzeń alergicznych oraz autoimmunologicznych, chorób neurologicznych i nowotworowych. Yeung, A.W.S.; Terentis, A.C.; King, N.J.C.; Thomas, S.R. Role of Indoleamine 2,3-Dioxygenase in Health and Disease. Clin Sci (Lond) 2015, 129, 601-672, doi:10.1042/CS20140392.

Każda ze znanych cytokin wykazuje działanie prozapalne lub przeciwzapalne oraz regulacyjne. Spora grupa z nich może wywoływać te dwa efekty jednocześnie. Taką cytokiną jest m.in. IFN-γ, który uznany jest za cytokinę immunostymulującą. Ponad to, IFN-γ wywołuje nadekspresję cząsteczek przeciwzapalnych, w tym wcześniej wielokrotnie wspomnianej cząsteczki IDO-1. Sam IFN-γ wytwarzany jest głównie przez komórki NK (ang. natural killer), komórki T CD4+ i CD8+ oraz komórki NKT. IFN-γ i IDO-1 działają synergistycznie i przy tym przyczyniają się do szybszego rozkładu L-Trp, a dzięki temu są niezwykle istotne w obronie przeciwwirusowej, a poza tym, podnoszą odporność na patogeny wewnątrzkomórkowe. Fallarino, E; Grohmann, U.; Puccetti, P. Indoleamine 2,3-Dioxygenase: From Catalyst to Signaling Function. Eur J Immunol 2012, 42, 1932-1937, doi:10.1002/EJI.201242572.

Biorąc zatem pod uwagę opisane wyżej funkcje i wzajemne zależności między IDO-1 a IFN-γ w organizmie ludzkim, zasadne jest opracowanie nowej metody jednoczesnych oznaczeń IDO-1 oraz IFN-γ w ludzkich płynach ustrojowych. Obecnie, analiza ilościowa IDO-1 możliwa jest do przeprowadzenia jedynie testem ELISA. Zoga, M.; Oulis, P.; Chatzipanagiotou, S.; Masdrakis, V.G.; Pliatsika, P.; Boufidou, F.; Foteli, S.; Soldatos, C.-R.; Nikolaou, C.; Papageorgiou, C. Indoleamine 2,3-Dioxygenase and Immune Changes Under Antidepressive Treatment in Major Depression in Females. In Vivo 2014, 28, 633-638. Większość badań nad poziomem tego enzymu skupia się na pomiarach jego aktywności, poprzez wyznaczenie stosunku stężeń KYN do L-Trp, Wongpraparut, N.; Pengchata, P.; Piyophirapong, S.; Panchavinnin, P.; Pongakasira, R.; Arechep, N.; Kasetsinsombat, K.; Maneechotesuwan, K. Indoleamine 2,3 Dioxygenase (IDO) Level as a Marker for Significant Coronary Artery Disease. BMC Cardiovasc Disord 2021, 21, 1-10, doi:10.1186/S12872-021-02140-0, co stwarza trudność w postaci konieczności opracowania metod oznaczeń zarówno KYN, jak i L-Trp. Pozostałe metodyki badania aktywności IDO-1 również w pewnym stopniu powiązane są z syntezą KYN z L-Trp. Przykładowo, opracowano metodę spektrofotometryczną, w której o aktywności IDO-1 świadczy ilość mierzonego żółtego barwnika pochodzącego z KYN. Inna metoda opiera się na oznaczaniu powstających in situ fluoroforów pochodzących z N-formylkinureniny (produkt pośredni między L-Trp a KYN). Test NFK GreenScreen™, który działa w oparciu o powstające na drodze rozpadu L-Trp do KYN i w obecności odczynnika NFK

GreenScreen™ cząsteczki emitujące fluorescencję, także wykorzystywany jest do oznaczania aktywności IDO-1. Zhao, Y.; Wang, B.; Liu, J.; Sun, P.; Liu, H. An Overview on the Methods of Determining the Activity of Indoleamine 2,3-Dioxygenase 1. J Drug Target 2019, 27, 724-731, doi:10.1080//1061186Χ.2018.1523416.

W przypadku analiz ilościowych IFN-γ najszerzej wykorzystuje się metody elektrochemiczne. W literaturze obecne są opisy biosensorów do oznaczeń IFN-γ, za pomocą których dokonywano oznaczeń w ślinie - Sanchez-Tirado, E.; Gonzalez-Cortes, A.; Yanez-Sedeno, P.; Pingarrón, J.M. Electrochemical Immunosensor for the Determination of the Cytokine Interferon Gamma (IFN-γ) in Saliva. Talanta 2020, 211, 120761, doi:10.1016/J.TALANTA.2020.120761 i surowicy Ruecha, N.; Shin, K.; Chailapakul, O.; Rodthongkum, N. Label-Free Paper-Based Electrochemical Impedance Immunosensor for Human Interferon Gamma Detection. Sens Actuators B Chem 2019, 279, 298-304, doi:10.1016/J.SNB.2018.10.024 oraz biosensorów, które zostały opracowane, ale nie użyto ich do oznaczeń IFN-γ w próbkach rzeczywistych, jak opisano w pracach: Dijksma, M.; Kamp, B.; Hoogvliet, J.C.; Van Bennekom, W.P. Development of an Electrochemical Immunosensor for Direct Detection of Interferon-γ at the Attomolar Level. Anal Chem 2001, 73, 901-907, doi:10.1021/AC001051H/ASSET/IMAGES/LARGE/AC001051HF00008. JPEG; Wang, X.; Han, X.; Ma, A.; Chen, L.; Liang, H.; Litifu, A.; Xue, F. Fabrication of Electrochemical Immunosensor for Interferon-γ Determination and Its Application of Tuberculosis Diagnosis. Int J Electrochem Sci 2017, 12, 7262-7271, doi:10.20964/2017.08.67; Xia, J.; Song, D.; Wang, Z.; Zhang, F.; Yang, M.; Gui, R.; Xia, L.; Bi, S.; Xia, Y.; Li, Y.; et al. Single Electrode Biosensor for Simultaneous Determination of Interferon Gamma and Lysozyme. Biosens Bioelectron 2015, 68, 55-61, doi:10.1016/J.BIOS.2014.12.045 oraz Januarie, K.C.; Uhuo, O. V.; Iwuoha, E.; Feleni, U. Recent Advances in the Detection of Interferon-Gamma as a TB Biomarker. Anal Bioanal Chem 2022, 414, 907921, doi:10.1007/S00216-021-03702-Z/TABLES/3.

Poza metodami oznaczeń wykorzystujących biosensory elektrochemiczne, badacze korzystali z elektroforezy kapilarnej, Hang, H.; Jin, W. Determination of Different Forms of Human Interferon-γ in Single Natural Killer Cells by Capillary Electrophoresis with on-Capillary Immunoreaction and LaserInduced Fluorescence Detection. Electrophoresis 2004, 25, 1090-1095, doi:10.1002/ELPS.200305803, aptasensora fluorescencyjnego, Chen, P.; Peng, W.; Qu, R.; He, Y.; Liu, T.; Huang, J.; Ying, B. Fluorescence Aptasensor of Tuberculosis Interferon-rin Clinical Samples Regulated by Steric Hindrance and Selective Identification. Anal Chem 2022, 94, 9122-9129, doi:10.1021/ACS. ANALCHEM.2C01530/ASSET/IMAGES/LARGE/AC2C0153 0_0005.JPEG, cytometrii przepływowej Carrock Sewell, W.A.; North, M.E.; Webster, A.D.B.; Farrant, J. Determination of Intracellular Cytokines by Flow-Cytometry Following Whole-Blood Culture. J Immunol Methods 1997, 209, 67-74, doi:10.1016/S0022-1759(97)00150-6 i multipleksowego testu immunologicznego. Lieberman, J.A.; Moscicki, A.B.; Sumerel, J.L.; Ma, Y.; Scott, M.E. Determination of Cytokine Protein Levels in Cervical Mucus Samples from Young Women by a Multiplex Immunoassay Method and Assessment of Correlates. Clinical and Vaccine Immunology 2008, 15, 49-54, doi:10.1128/CVI.00216-07. Aktualnie, nie opracowano jeszcze biosensora do jednoczesnych oznaczeń IDO-1 i IFN-γ w próbkach rzeczywistych. Opracowanie nowego biosensora do jednoczesnych oznaczeń IDO-1 i IFN-γ stanowi więc krok rozwojowy w kierunku metod oznaczeń tych dwóch białek, od których zależy jeden z najważniejszych procesów życiowych w stanach fizjologicznych i patologicznych, a więc metabolizm tryptofanu.

Detekcja oparta jest natomiast o Powierzchniowy Rezonans Plazmonowy w wersji obrazowej, którego istota oraz najnowsze trendy i zastosowania aplikacyjne przedstawione zostały w pracach m.in.:

• Gorodkiewicz, E.; Lukaszewski, Z. Recent Progress in Surface Plasmon Resonance Biosensors (2016 to Mid-2018). Biosensors 2018, 8, 1-18, doi:10.3390/bios8040132;

• Amine, A.; Arduini, F.; Moscone, D.; Palleschi, G. Recent Advances in Biosensors Based on Enzyme Inhibition. Biosensors and Bioelectronics 2016, 76, 180-194, doi:10.1016/- /j.bios.2015.07.010;

• Bockovaacute, M.; Slabyacute, J.; Scaronpringer, T.; Homola, J. Advances in Surface Plasmon Resonance Imaging and Microscopy and Their Biological Applications. Annual Review of Analytical Chemistry 2019, 12, 151-176, doi:10.1146/annurev-anchem-061318-115106;

• Wang, D.; Loo, J.F.C.; Chen, J.; Yam, Y.; Chen, S.C.; He, H.; Kong, S.K.; Ho, H.P. Recent Advances in Surface Plasmon Resonance Imaging Sensors. Sensors 2019, 19, 1266, doi:10.3390/s19061266;

• Jebelli, A.; Oroojalian, F.; Fathi, F.; Mokhtarzadeh, A.; de la Guardia, M. Recent Advances in Surface Plasmon Resonance Biosensors for MicroRNAs Detection. Biosens Bioelectron 2020, 169, 112599, doi:10.1016/j.bios.2020.112599;

• Bonyar, A. Label-Free Nucleic Acid Biosensing Using Nanomaterial-Based Localized Surface Plasmon Resonance Imaging: A Review. ACS Appl Nano Mater 2020, 3, 8506-8521, doi:10.1021/acsanm.0c01457;

• czy Wu, W.; Yu, X.; Wu, J.; Wu, T.; Fan, Y.; Chen, W.; Zhao, M.; Wu, H.; Li, X.; Ding, S. Surface Plasmon Resonance Imaging-Based Biosensor for Multiplex and Ultrasensitive Detection of NSCLC-Associated Exosomal MiRNAs Using DNA Programmed Heterostructure of Au-on-Ag. Biosens Bioelectron 2021, 175, 112835, doi:10.1016/j.bios.2020.112835.

Biosensor wychwytuje wyłącznie oznaczaną substancję z roztworu, a aparatura SPRi reaguje na przyrost masy na powierzchni biosensora i przekształca go w sygnał analityczny. Rozwiązanie takie charakteryzuje prostota zarówno wykonania biosensora, jak i przeprowadzenia procesu pomiarowego. Dlatego rozwiązanie to, może konkurować z obecnie stosowanymi metodami oznaczania substancji biologicznie aktywnych. Według obecnego stanu techniki istnieją liczne biosensory SPRi umożliwiające oznaczania stężenia substancji bioaktywnych. Takie biosensory ujawniają przykładowe opisy JP2009133844 (A), US6239255, PL223400, PL210052, czy też PL222548.

Istotą wynalazku jest biosensor do specyficznego i jednoczesnego oznaczania 2,3-dioksygenazy indolaminy IDO-1 oraz interferonu gamma IFN-γ w ludzkim materiale biologicznym z wykorzystaniem techniki powierzchniowego rezonansu plazmonów w wersji Imaging. Opracowany biosensor wykorzystuje biotynylowane monoklonalne królicze przeciwciała specyficznie rozpoznające IDO-1, jak i IFN-γ jako ligand (warstwa receptorowa), czyli element wychwytujący analit (IDO-1, jak i IFN-γ) z roztworu próbki. Biosensor według wynalazku zawiera płytkę szklaną, pokrytą 50 nm warstwą złota, umieszczoną na 1 nm warstwie tytanu, oraz przyklejoną do złotej powierzchni hydrofobową i odporną chemicznie cienką folię o grubości 20 μm, która tworzy dwanaście odrębnych miejsc aktywnych - w matrycy 3x4, z którymi na drodze reakcji chemicznych, sprzęgana jest warstwa ligandów. Ligandami są wymienione wyżej przeciwciała, zimmobilizowane na powierzchni złota poprzez oddziaływania ze streptawidyną, która wiązaniem kowalencyjnym związana jest z warstwą karboksymetylodekstranu. Funkcję łącznika karboksymetylodekstranu (a zatem i całej reszty biosensora) z warstwą metaliczną (złoto) stanowi 3- merkapto-1-ol.

Biosensor do jednoczesnego oznaczania stężenia IDO-1 i IFN-γ w płynach ustrojowych i homogenatach tkankowych w przykładzie realizacji, został przedstawiony na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schemat biosensora a fig. 2 prezentuje krzywą kalibracyjną metody jednoczesnych oznaczeń IDO-1 i IFN-γ - zmienność liniową sygnału w zależności od stężenia IDO-1, jak i IFN-γ.

Biosensor do specyficznego i jednoczesnego oznaczania 2,3-dioksygenazy indolaminy IDO-1 oraz interferonu gamma IFN-γ w ludzkim materiale biologicznym z wykorzystaniem techniki powierzchniowego rezonansu plazmonów w wersji Imaging składa się z płytki szklanej 1 pokrytej 1 nm warstwą tytanu 2, 50 nm warstwą złota 3 oraz hydrofobowej folii 4 tworzącej dwanaście miejsc aktywnych (w matrycy 4x3) - przykład miejsca aktywnego 5. Na każdym z nich, znajduje się warstwa linkera - 3-merkapto-1-olu 6 stanowiąca łącznik między warstwą metaliczną a pozostałymi częściami biosensora. Do warstwy linkera przyłączona jest warstwa karboksymetylodekstranu 7, z którą wiązaniem kowalencyjnym związana jest streptawidyna 8. Biotynolowany ligand specyficzny dla IDO-1, jak i IFN-γ 9 oddziałuje ze streptawidyną na zasadzie oddziaływań fizykochemicznych, charakteryzujących się wysokim powinowactwem biotyny do streptawidyny. Ligand specyficznie wyłapuje IDO-1, jak i IFN-γ 10 z badanego roztworu.

Fig. 2 rysunku prezentuje krzywą kalibracyjną metody jednoczesnych oznaczeń IDO-1 (A) i IFN- γ (B) - zmienność liniową sygnału w zależności od stężenia IDO-1, jak i IFN-γ. Biosensor SPRi zapewnia pomiary w zakresie stężeń dostosowanym do poziomu występującego w krwi i innych płynach ustrojowych oraz homogenatach tkankowych. Odpowiedź biosensora jest liniowa, co jest istotne dla dokładnego wyznaczenia wyniku. Biosensor zapewnia dobrą precyzję i dokładność pomiaru. Poza tym, wykazuje granice wykrywalności (LOD) i oznaczalności (LOQ), pozwalające na ilościowy pomiar stężenia IDO-1 oraz IFN-γ w ludzkich płynach ustrojowych - LODido-1 = 0.27 ng/mL, LOQido-1 =0.81 ng/mL; LO DiFN-γ = 1.76 pg/mL, LOQifn-t = 5.29 pg/mL.

Biosensor jest specyficzny w tym sensie, że wychwytuje tylko IDO-1 oraz IFN-γ spośród innych substancji obecnych w płynach ustrojowych. Mierzalnym parametrem specyficzności jest wyznaczona wartość stężenia IDO-1 i IFN-γ w próbce standardowej, w której znajdowała się mieszanina białek o stężeniach 5 ng/mL, ale w próbce nie było IDO-1, jak i IFN-γ. Wyznaczone wartości stężeń IDO-1 i IFN-γ

PL 249778 Β1 znajdowały się poniżej LODido-i oraz poniżej LODifn-_y co oznacza, iż zastosowane ligandy nie reagują z innymi, niż docelowe anality białkami obecnymi w próbce. W tabeli 1 zestawiono wyniki z przeprowadzonych badań.

Tabela 1.

Wyniki badań nad specyficznością opracowanej metody jednoczesnych oznaczeń IDO-1 i IFN-γ.

Oznaczenia IDO-1
interferent	stężenie interferenta	sygnał SPRi	sygnał SPRi średni	Stężenie IDO-1 [ng/mL]
I	11	111
IFN-γ	5 ng/mL	1539.71	1531.35	1544.79	1538.62	0.01 (<LOD)
YEGF-A	1541.59	1536 93	1556,67	1545,06	O 02 (<LOD)
YEGF-R2	1537,2	1545,28	1540,48	1540,99	0,02 (<!.()!))
FGF-2	1539.88	1538.97	1537.41	1538.75	0.01 (<LOD)
NRP-1	1531.05	1544.03	1547,76	1540,95	0,02 (<LOD)
Kat B	1544.18	1531.47	1534.76	1536.80	0 01 (<LOD)
KatS	1546.58	1545,14	1535,12	1542,28	0,02 (<LOD)
Oznaczenia IFN-γ
interferent	stężenie interferenta	sygnał SPRi	sygnał SPRi średni	Stężenie IFN-γ [pg/mL]
I	11	III
IDO-1	5 ng/mL	3240.09	3240.19	3238.08	3239.45	1 54 (<LOD)
VEGF-A	3236.85	3240.61	3239,24	3238,90	0,73 (<LOD)
VEGF-R2	3240.66	3238.8	3239.12	3239.53	1 64 (<LOD)
FGF-2	3239.65	3240,11	3237,06	3238,94	0 79 (<LOD)
NRP-1	3240.68	3237.89	3237.38	3238.65	0.36
KatB	3238.01	3241.37	3236,94	3238,77	0 54 (<LOD)
KatS	3235.86	3240.96	3240.63	3239.15	1.09 (<I.()T>)

Precyzja pomiaru, dokonywanego za pomocą biosensora SPRi czułego na IDO-1 i IFN-γ, sprawdzona została poprzez 3-krotny pomiar znanych stężeń roztworów standardowych o stężeniach 0.81; 1.00; 5.00; 10.00 ng/mL dla IDO-1 oraz o stężeniach 5.29; 10.00; 1000.00; 10 000.00 pg/mL dla IFN-γ. Obliczono współczynnik zmienności (CV)*, którego wartość dla oznaczeń IDO-1 waha się w granicach 0.36-6.51%, natomiast dla oznaczeń IFN-γ mieści się w przedziale 0.07-4.15%. Ponieważ we wszystkich przypadkach współczynnik ten jest mniejszy niż 25%, pomiary stężenia IDO-1 i IFN-γ za pomocą biosensora uznano za precyzyjne. W tabeli 2 zestawiono wyniki z przeprowadzonych badań.

Tabela 2.

Zestawienie wyników precyzji pomiaru IDO-1 i IFN-γ skonstruowanym biosensorem.

Oznaczenia IDO-1	Stężenie roztworu standardowego [ng/mL]
0.81	1	5	10
Stężenie oznaczone [ng/mL]
I	0.87	1.01	5.03	9.89
II	0.94	0.89	4.93	9.94
III	0,83	0,98	5,01	9.96
Średnia wartość stężenia [ng/mL]	0.88	0.96	4.99	9.93
SD | ng/mL|	0.06	0.06	0.05	0.04
CV[%]	6.33	6.51	1.06	0.36

PL 249778 Β1

Oznaczenia IFN-γ	Stężenie roztworu standardowego [pg/mL]
5.29	10	1000	10000
Stężenie oznaczone [pg/mL]
I	5.78	9.92	996.76	9998.64
II	5.69	10.46	1002.45	9985.35
III	5.34	9.79	993.32	9997.75
Średnia wartość stężenia [ng/mL]	5.60	10.06	997.51	9993.91
SD [ng/mL]	0.23	0.36	4.61	7.43
CV[%J	4.15	3.53	0.46	0.07

SD

4= CV= -100%

C średnie

SD - odchylenie standardowe ^średnie ~ średnia arytmetyczna stężenia z 3 powtórzeń pomiaru

Powtarzalność pomiaru za pomocą biosensora zbadana została poprzez 5-krotne powtórzenie pomiaru stężenia IDO-1 i IFN-γ w próbce rzeczywistej surowicy i homogenatu tkankowego. Powtarzalność określono za pomocą CV, których wartości zestawiono w tabeli 3.

Tabela 3.

Zestawienie wartości CV dla obliczeń powtarzalności pomiarów skonstruowanym biosensorem.

IDO-1 (surowica)	Stężenie |ng/mL]	IDO-1 (homogenaty tkankowe)	Stężenie [ng/mL]
I	38.28	I	22.66
II	35.97	II	21.75
III	37.64	III	23.02
IV	39.76	IV	22.89
V	37.55	V	20.93
Średnia wartość stężenia [ng/mL]	37.84	Średnia wartość stężenia [ng/mL]	22.25
SD | ng/mL|	1.37	SD | ng/mL |	0.89
CV[%]	3.62	CV[%]	4.00
IFN-γ (surowica)	Stężenie |pg/mL|	IFN-γ (homogenaty tkankowe)	Stężenie |pg/mL|
I	190.1	I	2.40
II	188.76	II	2.23
III	195.03	111	2.51
IV	183.54	IV	2.42
V	197.37	V	2.32
Średnia wartość stężenia [pg/mL]	190.96	Średnia wartość stężenia [pg/mL]	2.38
SD [pg/mL]	5.44	SD [pg/mL]	0.11
CV[%J	2.85	CV[%]	4.46

Wartości CV wskazują na powtarzalny pomiar stężenia IDO-1 i IFN-γ w próbkach rzeczywistych, z wykorzystaniem biosensora SPRi.

PL 249778 Β1

Biosensorw przykładzie działania został wykorzystany do oznaczania IDO-1 i IFN-γ w serii próbek surowicy od pacjentów ze stwierdzoną białaczką i homogenatów tkankowych pacjentów ze stwierdzonym glejakiem mózgu. Przed każdym pomiarem próbki rozcieńczano buforem HBS-ES (skład buforu: 10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0.01% Tween-20): próbki surowicy 2-krotnie, próbki homogenatów tkankowych 5-krotnie. Na odpowiednie miejsca aktywne nanoszono tą samą uprzednio rozcieńczoną próbkę (czyli miejsce aktywne przygotowane do oznaczeń IDO-1, jak i IFN-γ) o objętości 3 pL. Próbkę pozostawiano na 5 minut, czyli optymalny czas potrzebny do wysycenia wszystkich dostępnych ligandów analitem. Po upływie 5 minut, odsysano pozostałe na miejscach aktywnych próbki, a następnie każde z nich było 1-krotnie przemywane buforem HBS-ES. Dokonywano akwizycji danych i pomiaru sygnału SPRi, a następnie z krzywej kalibracji odczytywano wartość stężenia IDO-1 i IFN-γ po uwzględnieniu rozcieńczenia próbki. Z serii oznaczeń otrzymano wartości stężeń IDO-1 i IFN-γ, które zestawiono w tabeli 4.

Tabela 4.

Zestawienie wartości stężenia IDO-1 i IFN-γ po uwzględnieniu rozcieńczenia próbki.

Oznaczenia w surowicy
Numer próbki	Stężenie IDO-1 [ng/mL]	Stężenie IFN-γ [pg/mL]
1	28.48	205.15
2	22.20	337.28
3	38.28	190.10
4	55.11	309.74
5	18.71	223.87
6	39.01	315.54
Oznaczenia w homogenatach tkankowych
Numer próbki	Stężenie IDO-1 [ng/mL]	Stężenie IFN-γ [pg/mL]
1	12.85	1613.37
2	29.38	3961.87
3	30.51	2390.22
4	10.60	1439.01
5	20.98	2817.23
6	32.80	2604.62

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   1. Biosensor do specyficznego i jednoczesnego oznaczania 2,3-dioksygenazy indolaminy IDO-1 oraz interferonu gamma IFN-γ w ludzkim materiale biologicznym z wykorzystaniem techniki powierzchniowego rezonansu plazmonów w wersji Imaging, który stanowi płytkę szklaną pokrytą warstwą złota na podłożu tytanu oraz siatkę polimeru tworzącą pęk miejsc aktywnych zawierających warstwę receptorową, znamienny tym, że warstwę receptorową stanowią biotynylowane monoklonalne królicze przeciwciała specyficznie rozpoznające IDO-1, jak i IFN-γ (9), zimmobilizowane na powierzchni złota (3) pokrytej hydrofobową folią o grubości 20 μπι (4), tworzącą dwanaście miejsc aktywnych (5) w matrycy 4x3, przy czym przeciwciała (9) połączone są z 50 nm warstwą złota (3), umieszczoną na 1 nm warstwie tytanu (2) pokrywającą płytkę szklaną (1), poprzez oddziaływania ze streptawidyną (8), która wiązaniem kowalencyjnym związana jest z warstwą karboksymetylodekstranu (7), za pośrednictwem linkera w postaci 3-merkapto-1-olu (6).