PL249598B1 - Syntetyczny regulator ekspresji genów, kodująca go kaseta ekspresyjna i wektor ekspresyjny ją zawierający oraz sposób otrzymywania męsko-sterylnych roślin z ich wykorzystaniem - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest syntetyczny regulator ekspresji genów, kodująca go kaseta ekspresyjna i wektor ekspresyjny zawierający taką kasetę oraz sposób otrzymywania męsko-sterylnych roślin z ich wykorzystaniem.

Ogólnie, wynalazek dotyczy otrzymywania męsko-sterylnych roślin poprzez zastosowanie syntetycznych regulatorów i ich wykorzystanie do hodowli heterozyjnych odmian roślin uprawnych. Systemy męskiej sterylności są podstawą programów hodowli roślin heterozyjnych. Efekt heterozji podnosi produktywność roślin uprawnych, co szczególnie manifestuje się w uprawach mieszańców kukurydzy i ryżu. Jednym z dogmatów hodowli roślin jest założenie, że plony z upraw roślin mieszańcowych (heterozyjnych) są wyższe niż w uprawach roślin homozygotycznych linii wsobnych. Uprawa mieszańców jest podstawą produkcji kukurydzy na całym świecie. Ocenia się, że obecnie jedna piąta upraw ryżu to odmiany hybrydowe wprowadzone przez Yuan Longping’a w latach siedemdziesiątych ubiegłego wieku. Podwyższenie plonów ryżu o około 30% zapewniło żywność dla milionów ludzi, szczególnie w Afryce i Azji. Odmiany heterozyjne roślin charakteryzują się również wieloma innymi cennymi cechami, do których należą m.in. stabilność plonowania oraz wyższa tolerancja na stresy środowiskowe.

Nieliczne, zarejestrowane i uprawiane obecnie mieszańce heterozyjne pszenicy (np. Hybred F1, Hy-mack F1, Hystar F1, Hymalaya F1, Hyvega F1 hodowli Saaten-Union GmbH) plonują zwykle na poziomie o 3-15% wyższym w porównaniu z odmianami konwencjonalnymi. Tworzenie tego typu odmian jest wobec tego wysoce uzasadnione i oczekiwane zarówno przez hodowców, jak i rolników, dystrybutorów materiału siewnego oraz przemysł płodów rolnych. Odmiany heterozyjne pszenicy mogą być uprawiane na słabszych glebach i w systemie low input farming zapobiegającego nadmiernemu zanieczyszczeniu środowiska, ponieważ na ogół charakteryzują się lepszą wydajnością wykorzystania pierwiastków, w tym azotu.

Brak efektywnych metod produkcji mieszańców innych roślin zbożowych takich jak pszenica czy jęczmień zdecydowanie ogranicza postępy prac hodowlanych i produkcję ziarna z tych roślin. (1,2).

Mieszańce roślin o kwiatostanach jednopłciowych (kukurydza) uzyskuje się poprzez mechaniczne usuwanie kwiatostanów męskich w roślinach rodzicielskich. Nie można tego realizować w przypadku roślin o kwiatostanach obupłciowych, w szczególności roślin klejstogamicznych (zapylenie zachodzi przed otwarciem kwiatów), które są roślinami samopylnymi (ryż, pszenica, jęczmień itp.). W przypadku tej grupy roślin wykorzystuje się obserwację, że uszkodzenia mitochondriów mogą prowadzić do sterylności roślin matecznych (cytoplazmatyczna męska sterylność). Ich krzyżowanie z roślinami posiadającymi cechę przywracania płodności („restorer”) prowadzi do powstania płodnych mieszańców. Metoda ta nie jest jednak pozbawiona wad. Uszkodzone mitochondria obniżają odporność roślin na czynniki zewnętrzne, a proces przywracania płodności może nie być całkowicie efektywny. Alternatywnym sposobem jest chemiczne zabijanie pyłku w celu uzyskania sterylności. Jednak metoda ta jest działaniem skomplikowanym technicznie, a ze względu na konieczność stosowania agresywnych odczynników chemicznych sposobem szkodliwym dla środowiska. Stąd też istnieje nadal zapotrzebowanie na ulepszony sposób produkcji roślin heterozyjnych, zwłaszcza nadający się do wykorzystania w programach hodowli roślin przeznaczonych do produkcji rolniczej.

Męska sterylność jest cechą genetyczną obserwowaną w roślinach i jest krytyczna dla systemów produkcji mieszańców roślin o kwiatostanach obupłciowych. Mutacje dotyczą głównie genów odpowiedzialnych za rozwój ziaren pyłku lub pylników. Są to głównie genetyczne cechy recesywne, które wymagają produkcji homozygotycznych roślin zmutowanych w celu wytworzenia form rodzicielskich (3). Takie rośliny nie produkują pyłku więc trudno jest je namnażać jako homozygotyczne linie wsobne. Ponadto, recesywna cecha sterylności jest trudna do osiągnięcia i utrzymania w multiploidalnych roślinach takich jak pszenica (4), których genomy posiadają kilka kopii mutowanych genów.

Opracowano skomplikowane systemy hodowlane wykorzystujące recesywne geny sterylności do produkcji mieszańców kukurydzy, takie jak na przykład platforma SPT (5). System SPT wykorzystuje recesywne mutacje sterylności, a zmutowane rośliny są namnażane poprzez genetyczne transformacje z genem odtwarzającym płodność. Obecność tego genu jest monitorowana poprzez geny markerowe, a rośliny sterylne są izolowane poprzez sortowanie. Ponadto, w procesie namnażania roślin sterylnych, ziarna pyłku zawierające gen płodności są zabijane poprzez ekspresję połączonego genu a-amylazy. Zastosowanie tego systemu w roślinach innych niż kukurydza (na przykład, heksaploidalnych roślinach pszenicy) wydaje się być jednak bardzo skomplikowane i problematyczne.

Techniki hodowlane oparte na dominujących genach sterylności mogą otwierać nowe możliwości hodowli roślin heterozyjnych, szczególnie tych o skomplikowanych genomach (2). Dominujących genów sterylności jest jednak niewiele. Na przykład, w 1972 roku zidentyfikowano dominujący gen sterylności MS2 w pszenicy (6). Jest on produktem przypadkowej naturalnej mutacji. Udało się połączyć ten gen z fenotypową cechą karłowatości, tworząc w ten sposób system do produkcji roślin heterozyjnych. Jego praktyczne zastosowanie doprowadziło do wyprodukowania mieszańców pszenicy o zwiększonym plonie. Jest to jednak skomplikowany proces hodowlany wymagający wielopokoleniowych hodowli i selekcji.

Celem przedmiotowego wynalazku jest dostarczenie uniwersalnych narzędzi pozwalających na względnie proste otrzymywanie roślin z męską sterylnością, które będą nadawały się do uzyskiwania roślin heterozyjnych. Podstawą przedmiotowego wynalazku są syntetyczne regulatory transkrypcji genów określających fenotypowe cechy męskiej sterylności u roślin zbożowych.

Znane są syntetyczne regulatory transkrypcji (SRTs). Są one często wykorzystywane do badań modelowych (8), jednak ich praktyczne zastosowania były ograniczone ze względu na brak zdolności do wiązania specyficznych sekwencji DNA na naturalnych promotorach. Podłączenie białka Cas9 do naturalnych aktywatorów umożliwiło rozszerzenie zastosowań syntetycznych aktywatorów (9). Wirusowa domena aktywacyjna VP-64 oraz domena represora KRAB są popularnymi komponentami syntetycznych aktywatorów, jakkolwiek istnieje wiele innych opcji (9-11).

Kolejnym celem wynalazku jest uzyskanie sposobu wytwarzania mieszańców roślin uprawnych.

Dotychczasowe metody produkcji mieszańców roślin zbożowych z wykorzystaniem jądrowych genów płodności (GMS) opierają się na ich mutacjach prowadzących do powstania cechy męskiej sterylności, a następnie odtwarzaniu płodności poprzez wprowadzanie dodatkowych kopii genów płodności. W takim genetycznym środowisku, dodatkowe kopie genów płodności stają się dominującą cechą, którą następnie można identyfikować.

Istota przedmiotowego wynalazku wiąże się z zastosowaniem syntetycznego regulatora ekspresji genów płodności jako genetycznego czynnika powodującego powstanie dominującej cechy męskiej sterylności. Dzięki temu, geny płodności nie są w żaden sposób trwale modyfikowane (mutowane), a odtworzenie płodności polega na rozsegregowaniu (usunięciu) syntetycznego regulatora w potomstwie (nasionach) roślin rodzicielskich.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest syntetyczny regulator ekspresji genów roślin uprawnych oraz sposób wytwarzania mieszańców roślin uprawnych z jego zastosowaniem.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest syntetyczny regulator ekspresji genu roślinnego związanego z fenotypową cechą męskiej sterylności zawierający białko posiadające białkową domenę wiążącą się z DNA genu roślinnego związanego z fenotypową cechą męskiej sterylności oraz połączoną z nią białkową domenę aktywatora lub represora procesu transkrypcji tego genu, przy czym białkowa domena wiążącą się z DNA tworzy kompleks z cząsteczką RNA posiadającą sekwencję komplementarną do elementu kontrolującego ekspresję genu sterylności, przy czym:

- gen roślinny związany z fenotypową cechą męskiej sterylności jest genem rośliny zbożowej, korzystnie genem pszenicy,

- cząsteczka RNA posiadająca sekwencję komplementarną do elementu kontrolującego ekspresję genu sterylności została wybrana z grupy obejmującej: cząsteczki RNA określane jako tracrRNA i crRNA lub ich syntetyczne wersje określane jako sgRNA będące składnikami systemu CRISPR,

- białkowa domena aktywatora została wybrana z grupy obejmującej: naturalne domeny czynników transkrypcyjnych takich jak VP-16 i jego syntetyczne pochodne SunTag lub TV,

- białkowa domena wiążąca się z DNA posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną jako sekw. nr 2, natomiast

- białkowa domena represora została wybrana z grupy obejmującej: domeny naturalnych represorów takich jak JAZ, ZTC1, SRDX, domeny represorów KRAB lub domeny represorów prokariotycznych na przykład TetR.

Korzystnie, białkowa domena aktywatora posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną jako: sekw. nr 2, sekw. nr 4 albo sekw. nr 5.

Równie korzystnie, cząsteczka RNA posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 3.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kaseta ekspresyjna kodująca regulator ekspresji według wynalazku określony powyżej.

Korzystnie, posiada ona sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 13.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny zawierający kasetę ekspresyjną według wynalazku określoną powyżej.

Korzystnie, posiada on sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 14.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania męsko-sterylnych roślin, znamienny tym, że do komórek zarodków roślinnych wprowadza się wektor ekspresyjny syntetycznego regulatora genów sterylności lub płodności, identyfikuje się komórki zawierające taki regulator ekspresji, namnaża się zidentyfikowane komórki, a następnie wykorzystuje się je do regeneracji męsko-sterylnych roślin, przy czym korzystnie do komórek zarodków roślinnych wprowadza się wektor ekspresyjny według wynalazku określony powyżej, identyfikuje się komórki zawierające regulator ekspresji według wynalazku określony powyżej, namnaża się zidentyfikowane komórki, a następnie wykorzystuje się je do regeneracji męsko-sterylnych roślin.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku DNA wektora ekspresyjnego wprowadza się do komórek zarodka poprzez mikrowstrzeliwanie.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku komórki zawierające regulator ekspresji identyfikuje się poprzez analizę ich genomowego DNA na zawartość fragmentów genu syntetycznego regulatora, zwłaszcza obecność transkryptów mRNA tego genu, korzystnie techniką PCR.

W kontekście przedmiotowego wynalazku jako „gen związany z fenotypową cechą męskiej sterylności” należy rozumieć gen kodowany przez DNA znajdujące się w jądrze komórkowym, którego produkt prowadzi do zaburzeń w rozwoju mikrospor i formowania ziaren pyłku lub prowadzi do zaburzeń w rozwoju pylników; struktur, w których następuje rozwój ziaren pyłku. Geny te oznacza się akronimem GMS („genic male sterility”) (12).

Przykładami znanych roślinnych genów związanych z fenotypową cechą męskiej sterylności, które mogą być stosowane zgodnie z przedmiotowym wynalazkiem są: ZmMs7, ZmMs20, ZmMs30, ZmMs26 w kukurydzy (12, 13, 28), TaMsl, TaMs2 w pszenicy (7, 14), TaNPI w pszenicy lub OsNPI w ryżu i ZmIPEI w kukurydzy (4). Ponad 100 genów GMS jest znanych w roślinach, warunkiem ich zastosowania do przedmiotowego wynalazku jest znajomość struktury i sekwencji elementów kontrolujących ich ekspresję.

W kontekście przedmiotowego wynalazku jako „białkową domenę wiążącą się z DNA” należy rozumieć cząsteczkę peptydu, oligopeptydu, lub polipeptydu posiadającą właściwość wiązania się z cząsteczką DNA o określonej sekwencji DNA. Przykładami znanych „białkowych domen wiążących się z DNA”, które mogą być stosowane zgodnie z przedmiotowym wynalazkiem są: domeny wiążące DNA czynników transkrypcyjnych określanych jako palce cynkowe (15, 16), domeny wiążące DNA aktywatorów transkrypcji określanych jako efektory TAL (17), syntetyczne domeny wiążące DNA endonukleaz takich jak I-Cre\ (13), nieaktywne endonukleazy lub ich fragmenty wiążące się specyficznie z DNA poprzez kompleksy z cząsteczkami RNA takie jak białka Cas systemu CRISPR (18, 19).

W kontekście przedmiotowego wynalazku jako „cząsteczkę RNA posiadającą sekwencję komplementarną do elementu kontrolującego ekspresję genu sterylności” należy rozumieć oligolub polirybonukleotyd, którego część lub cała sekwencja jest komplementarna do sekwencji znajdujących się w promotorach, których aktywność podlega regulacji przez syntetyczny regulator. Przykładami znanych „cząsteczek RNA posiadających sekwencję komplementarną do elementu kontrolującego ekspresję genu sterylności”, które mogą być stosowane zgodnie z przedmiotowym wynalazkiem są cząsteczki RNA określane jako tracrRNA i crRNA (20) lub ich syntetyczne wersje określane jako sgRNA będące składnikami systemu CRISPR (21). W kontekście przedmiotowego wynalazku jako „białkową domenę aktywatora” należy rozumieć cząsteczkę peptydu, oligopeptydu, lub polipeptydu, którego obecność w rejonie promotora prowadzi do aktywacji genu, którego ekspresja jest kontrolowana przez ten promotor. Przykładami znanych „białkowych domen aktywatorów”, które mogą być stosowane zgodnie z przedmiotowym wynalazkiem są: naturalne domeny czynników transkrypcyjnych takich jak VP-16 i jego syntetyczne pochodne (SunTag, TV) (9, 22).

W kontekście przedmiotowego wynalazku jako „białkową domenę represora” należy rozumieć cząsteczkę peptydu, oligopeptydu, lub polipeptydu, którego obecność w rejonie promotora prowadzi do inaktywacji genu, którego ekspresja jest kontrolowana przez ten promotor. Przykładami znany ch „białkowych domen represorów”, które mogą być stosowane zgodnie z przedmiotowym wynalazkiem są: domeny naturalnych represorów takich jak JAZ (23), ZTC1 (24), SRDX (11,25), domeny represorów KRAB („Kruppel-associsted boxes”) (26) lub domeny represorów prokariotycznych na przykład TetR („tetracycline-family repressors”) (27).

Szczegółowy opis wynalazku

W celu ułatwienia zrozumienia istoty wynalazku został on dodatkowo wyjaśniony na figurze 1. Elementem genetycznym determinującym męską sterylność jest endogenny gen sterylności, którego produktem jest gametocyd prowadzący do zaniku męskich spor (mikrospor). W roślinach płodnych, jego aktywność jest naturalnie ograniczona przez element kontrolujący. Element kontrolujący jest endogennym, nieaktywnym promotorem ekspresji genu sterylności. Poprzez wprowadzenie do komórki syntetycznego regulatora ekspresji genu sterylności i jego połączenia z elementem kontrolującym, następuje aktywacja ekspresji poprzez aktywator zawarty w syntetycznym regulatorze, prowadząca do uzyskania roślin męsko sterylnych. Obecność syntetycznego regulatora jest cechą dominującą i może on kontrolować ekspresję wielu genów związanych z cechą fenotypową sterylności. W korzystnej realizacji, syntetyczny regulator może też być zaprojektowany do zatrzymania ekspresji recesywnych genów sterylności tworząc w ten sposób sterylne rośliny. W takim wariancie wynalazku, syntetyczny regulator jest syntetycznym represorem, który jest określany jako genetyczna cecha dominująca.

Białka endonukleaz Cas (element systemu CRISPR) posiadają zdolność rozpoznawania specyficznych sekwencji genomowego DNA. Jest to cecha określana przez cząsteczki RNA. Według wynalazku, białko endonuklezy Cas9 zostało wykorzystane jako białko wiążące DNA zawarte w syntetycznym regulatorze. W wyniku dołączenia, za pomocą łącznika peptydowego, do tego białka wiążącego DNA domeny białkowej aktywatora lub represora, uzyskana została struktura syntetycznego regulatora umożliwiająca włączanie lub wyłączanie funkcji konkretnych genów. Uzyskany w ten sposób syntetyczny regulator ekspresji genów, pozwala na modelowanie aktywności genów odpowiedzialnych w roślinach za produkcję spor, a zwłaszcza mikrospor.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania mieszańców roślin uprawnych z wykorzystaniem syntetycznego regulatora ekspresji genów. Stosowany zgodnie z wynalazkiem syntetyczny regulator jest kompleksem białka i RNA. Zaprojektowany zgodnie z wynalazkiem syntetyczny regulator obejmuje domenę białkową będącą białkiem wiążącym DNA oraz domenę aktywatora zdolną do aktywacji ekspresji genów w miejscu wiązania aktywatora lub domenę represora zdolną do wyciszania ekspresji genów w miejscu wiązania represora. W korzystnej realizacji wynalazku specyficzność wiązania DNA przez kompleksy regulatora określają cząsteczki RNA tworzące kompleks z białkiem wiążącym DNA.

Syntetyczny regulator nie jest genem sterylności. Spełnia on rolę przełącznika genetycznego. Zgodnie z wynalazkiem syntetyczny regulator można określić jako dominujący, nie recesywny, czynnik genetyczny determinujący cechę sterylności. Jest to cecha dominująca nawet w przypadku, gdy syntetyczny represor działa na recesywne geny męskiej sterylności. Zaburzenia w regulacji ekspresji genów męskiej sterylności faktycznie mogą prowadzić do produkcji sterylnych roślin (28).

Przykład 1. Syntetyczny regulator ekspresji genów zawierający domenę aktywatora.

Na Fig. 1 przedstawiona została schematyczna budowa syntetycznego regulatora pełniącego funkcję syntetycznego aktywatora. Syntetyczny regulator składa się z trzech elementów: domeny kierującej aktywator do miejsca aktywacji (białko wiążące DNA), domeny powodującej aktywację ekspresji genu(ów) wywołujących męską sterylność (aktywator), oraz element łączący te dwie domeny w jedno białko (łącznik). Oddzielnie, elementy syntetycznego regulatora są znane genetykom molekularnym i istnieją liczne dowody na ich skuteczność w innych zastosowaniach (29).

W prezentowanym przykładzie realizacji wynalazku jako białko wiążące DNA użyto białka nieaktywnej endonukleazy tadCas9, jakkolwiek inne znane białka specyficznie wiążące sekwencje DNA mogą być wykorzystane zgodnie z wynalazkiem. Sekwencja nukleotydową genu kodującego tadCas9 została przedstawiona na Fig. 15 (Sekw. Nr 1), natomiast jego sekwencja aminokwasowa na Fig. 16 (Sekw. Nr 2). Białko tadCas9 zawiera dwie domeny endonukleotyczne - RuvC i HNH. Obie domeny zostały zinaktywowane w syntetycznym regulatorze poprzez wymianę kodonu kwasu asparaginowego w pozycji 20 (GAC) na kodon alaniny (GCC) (domena RuvC) i wymianę kodonu histydyny w pozycji 850 (CAT) na kodon alaniny (GCC) (domena HNH) (Fig. 16). Zmiany te nie wpływają na zdolności białka do wiązania DNA, przy czym eliminują enzymatyczną aktywność endonukleaz, których aktywności nie są pożądane w syntetycznym aktywatorze (30).

W prezentowanym przykładzie realizacji wynalazku specyficzność wiązania syntetycznego aktywatora do sekwencji DNA jest uzyskiwana poprzez cząsteczki sgRNA, które są wprowadzane do komórek roślinnych razem z syntetycznym aktywatorem w sposób opisany w przykładzie 10. Sekwencje przykładowych cząsteczek RNA, określanych także jako sgRNA, są przedstawione na Fig. 17 (Sekw. Nr 3 i Sekw. Nr 4). Sekwencje komplementarne do dwóch miejsc wiązania syntetycznego aktywatora do promotora genu MS2 (M1 i M2) są zaznaczone tłustym drukiem. Pozostałe sekwencje określają koniec transkrypcji cząsteczki sgRNA (TTTTTTT) i element strukturalny umożliwiający utworzenie kompleksu z białkiem tadCas9.

W przykładowej realizacji fuzja domeny wiążącej DNA (tadCas9) z domeną aktywatora VP128 (tadCas9::VP128) jest strukturalną podstawą syntetycznego regulatora. Domena aktywatora VP128 składa się z ośmiu powtórzeń 5’ końcowej domeny aktywatora czynnika transkrypcyjnego wirusa HSV (31). Sekwencja aminokwasowa domeny aktywatora jest przedstawiona na Fig. 18 (Sekw. Nr 5).

Podstawową jednostką aktywatora jest domena aktywacyjna wirusowego aktywatora VP16 (DALDDFDLDML). W naturalnym aktywatorze jest ona zlokalizowana w 5’ końcowej 81 aminokwasowej części aktywatora, jakkolwiek wykazano, że jedenasto aminokwasowy peptyd jest wystarczający do zachowania funkcji aktywatora. Jego cztery powtórzenia oddzielone dwupeptydem GS stanowią aktywator VP64, którego aktywność została już przetestowana na roślinach (32). W przedstawianym syntetycznym regulatorze (Sekw. Nr 5) element VP64 został powtórzony i rozdzielony dwoma łącznikami (Fig. 18) (9, 33). Sekwencje kodujące aktywatora i łączników zostały zoptymalizowane do ekspresji w komórkach pszenicy.

Domena aktywacyjna VP128 jest strukturą modułową, która może być modyfikowana w celu podniesienia jej aktywności. Istniejącym przykładem takich aktywatorów jest domena aktywacyjna TV (9). Zawiera ona sześć kopii aktywatora TAL i dwie kopie aktywatora VP64. Wariant tego syntetycznego aktywatora zaprojektowany do aktywacji promotorów w roślinach jednoliściennych (w szczególności w pszenicy) jest przedstawiony na Fig. 19 (Sekw. Nr 6).

Przykład 2. Gen powodujący męską sterylność i jego aktywacja.

Aktywowanym genetycznym czynnikiem sterylności może być każdy fragment genomowego DNA, którego ekspresja prowadzi do powstania fenotypowej cechy sterylności. W przykładowej realizacji wynalazku użyto fragmentu genomowego DNA z genomu pszenicy, określanego jako MS2, który nie ma określonej funkcji i nie podlega ekspresji w roślinach pszenicy (7, 34).

Gen MS2 znajduje się na krótkim ramieniu chromosomu 4D w komórkach pszenicy. Jest zbudowany z ośmiu egzonów i siedmiu intronów (Fig. 2). Jego homologi w subgenomach A i B są strukturalnie zmutowane. W płodnych roślinach pszenicy gen MS2 jest nieaktywny pomimo faktu, że jego promotor zawiera elementy strukturalne w pełni funkcjonalnych promotorów (elementy TATA i CAT). Aktywacja tego genu poprzez naturalną mutację (integracja retrotranspozonu TRIM w sekwencje promotora) prowadzi do powstania męsko sterylnych roślin (34). Sekwencja promotora MS2 w pszenicy odmiany BobWhite jest przedstawiona na Fig. 25 (Sekw. Nr 16). Sekwencja TATA zaznaczona tłustym drukiem, sekwencje podlegające transkrypcji zaznaczone kursywą, początek translacji białka MS2 - końcowy kodon ATG podkreślony.

Promotor MS2 został użyty jako przykład ilustrujący aktywację ekspresji poprzez syntetyczne regulatory według wynalazku. Para starterów (ACTGTCTCGCGATTTGAGCA (Sekw. Nr 27) i TCTCCGTCCCAATCCTGGAT (Sekw. Nr 28)) została użyta do amplifikacji genomowego fragmentu (1142 par zasad) zawierającego promotor genu MS2. W oparciu o sekwencje promotora MS2 zaprojektowano cząsteczki sgRNAM1 i sgRNAM2 (Fig. 17) nakierowujące syntetyczny regulator do wiązania się z sekwencjami promotora MS2 w odległości około 200 par zasad od początku transkrypcji. Miejsca wiązania białka wiążącego DNA wchodzącego w skład syntetycznego regulatora i sekwencje M1 i M2 są przedstawione na Fig. 3. Jakkolwiek cząsteczki RNA nie stanowią integralnej części syntetycznego regulatora, jednak ich projektowanie i struktura są postawą prawidłowego funkcjonowania syntetycznego regulatora w opisywanym przykładzie realizacji.

W przypadku użycia innych rodzajów domen wiążących DNA w syntetycznych regulatorach według wynalazku, cząsteczki RNA mogą być pominięte.

Przykł ad 3. Wektor kodujący elementy syntetycznego regulatora zawierającego domenę aktywatora.

Metody syntezy wektorów wprowadzających obce genetyczne elementy do komórek organizmów eukariotycznych są powszechnie znane dla genetyków i biologów molekularnych. W przykładowej realizacji wynalazku użyto wektorów DNA bazujących na znanych wektorach określanych jako pBract211 (John Innes Centre), a w szczególności wektora pBract211-cmCas9-sgRNA przedstawionego na Fig. 4 (35). Sekwencję kodującą genu cmCas9-int wymieniono na sekwencje kodującą syntetycznego aktywatora - tadCas9::VP128 (Sekw. Nr 17, Fig. 26). Kasetę taU6-sgRNA zmodyfikowano w celu zwiększenia wydajności syntezy cząsteczek sgRNA. Gen selekcyjny 35S-Hyg-int wymieniono na oryginalny gen selekcyjny ppt-EmGFP o podwójnej funkcji (marker selekcji wizualnej i chemicznej). Wymieniono również promotor p-Ubi na jego inny wariant o zmienionej strukturze. Tak zaprojektowany i wykonany wektor jest określany przez akronim pBL. Konieczne elementy genetyczne potrzebne do przykładowej realizacji wynalazku i ich położenie w cząsteczce wektora pBL są przedstawione na Fig. 5 (patrz również Fig. 27 i 28 oraz Sekw. Nr 18 i 19). Na Fig. 27 i 28 sekwencje komplementarne do promotora MS2 zostały przedstawione tłustym drukiem.

Wklonowanie 20 nukleotydowych sekwencji komplementarnych do miejsc wiązania syntetycznego aktywatora przedstawionych na Fig. 17 pomiędzy dwa miejsca restrykcyjne Bsal wektora pBL- Ubi_tadCas9::VP128_sgRNA doprowadza do stworzenia funkcjonalnych syntetycznych aktywatorów genu MS2 w pszenicy - pBL-Ubi_tadCas9::VP128_sgRNA M1 (Sekw. Nr 18) i pBL-Ubi_tadCas9::VP128_sgRNA M2 (Sekw. Nr 19).

Syntetyczne regulatory mogą być kierowane do specyficznych tkanek lub organów poprzez kontrolę ich ekspresji i akumulacji. W przykładowej realizacji wynalazku, promotor kontrolujący ekspresję syntetycznego aktywatora zastał wymieniony na specyficzny promotor ryżu, który jest aktywny w pylnikach - OsLTP6 (36). Dwa wektory pBL-OsLPT6_tadCas9::VP128_sgRNA M2 i pBL-OsLPT6_tadCas9::VP128_sgRNA M1 są przedstawione na Fig. 6 (patrz również Fig. 29 i 30 oraz Sekw. Nr 20 i 21). Na Fig. 29 i 30 sekwencje komplementarne do promotora MS2 zostały przedstawione tłustym drukiem.

Przykład 4. Syntetyczny regulator ekspresji genów zawierający domenę represora.

Czynniki transkrypcyjne zawierające domeny represorów są powszechne w organizmach żywych. Ponad 700 represorów o strukturze palców cynkowych jest znanych w genomie człowieka, a około 300 z nich zawiera domenę represora określaną jako „Kruppel-associated box” (KRAB) (16). Są to polipeptydy około 50-70 aminokwasów podzielone na dwa segmenty „boxA” i „boxB”. Ich funkcjonalność w połączeniu z domeną białka Cas9 była testowana; domena ZIM3 KRAB okazała się być jedną z najlepszych KRAB domen w ludzkich komórkach (26).

W prezentowanym przykładzie realizacji wynalazku, syntetyczny regulator ograniczający ekspresję genu roślinnego związanego z fenotypową cechą męskiej sterylności zawiera ZIM3 KRAB domenę represora połączoną poprzez łącznik z domeną wiążącą się z DNA (Fig. 8). Struktura aminokwasowa domeny represora KRAB (z łącznikiem) jest przedstawiona na Fig. 20 (Sekw. Nr 7).

W prezentowanym przykładzie realizacji wynalazku, syntetyczny regulator ograniczający ekspresję genu roślinnego związanego z fenotypową cechą męskiej sterylności zawiera SRDX domenę represora czynnika transkrypcyjnego ERF (37), połączoną poprzez łącznik z domeną wiążącą się z DNA. Struktura aminokwasowa domeny represora SRDX (z łącznikiem) jest przedstawiona na Fig. 21 (Sekw. Nr 8).

W prezentowanym przykładzie realizacji wynalazku, syntetyczny regulator ograniczający ekspresję genu roślinnego związanego z fenotypową cechą męskiej sterylności zawiera fuzję domen KRAB i SRDX. Cztery polipeptydy SRDX są połączone z sobą poprzez mostki GS. Struktura aminokwasowa domeny represora KRAB::SRDX (z łącznikiem) jest przedstawiona na Fig. 22 (Sekw. Nr 9).

Przykład 5. Gen powodujący męską płodność i jego wyciszanie.

Zahamowanie ekspresji genów płodności NP1 w pszenicy jest przykładem zastosowania przedmiotowego wynalazku. Geny NP1 kodują oksydoreduktazę glukozo-metanol-choliny. Ich mutacje (eliminacja syntezy funkcjonalnego produktu) powodują cechę męskiej sterylności w pszenicy (4). Sterylne rośliny pszenicy uzyskano poprzez zastosowanie systemu CRISPR do mutacji genów NP1. W prezentowanym przykładzie realizacji wynalazku, wykorzystuje się syntetyczny regulator do ograniczenia ekspresji genów NP1. Jego połączenie ze wspólnymi sekwencjami promotorów może prowadzić do zahamowania ekspresji wszystkich trzech recesywnych genów NP1 (załącznik A).

Sekwencje trzech promotorów kontrolujących ekspresję NP1A, NP1B i NP1D w pszenicy są przedstawione na Fig. 23 (Sekw. Nr 10, Sekw. Nr 11 oraz Sekw. Nr 12). Sekwencje promotorów genów NP1 nie są identyczne, natomiast zawierają one wspólne elementy, które można wykorzystać do podłączenia represorów (Fig. 24).

Przykład 6. Wektor kodujący elementy syntetycznego regulatora zawierającego domenę represora.

Struktura kasety syntetycznego represora jest przedstawiona na Fig. 8 oraz na Sekw. Nr 13. Zawiera ona domenę KRAB połączoną do końca sekwencji kodującej tadCas9. Łącznik pomiędzy dwoma domenami represora jest identyczny jak w kasetach aktywatorów. Wektory syntetycznych represorów uzyskuje się poprzez wymianę domeny aktywatora - VP128 w wektorach pBL-Ubi_tadCas9::VP128_sgRNA. W efekcie uzyskano wektor pBL-Ubi_tadCas9::KRAB_sgRNA (Sekw. Nr 14). Genetyczne elementy kaset sgRNA projektuje się i integruje w sposób analogiczny jak przedstawiono dla aktywatorów.

Przykład 7. Weryfikacja skuteczności syntetycznego regulatora zawierającego domenę aktywatora w aktywacji promotora genu MS2.

Do funkcjonalnej weryfikacji przykładowej realizacji wynalazku użyto wektorów syntetycznych regulatorów w połączeniu z syntetycznym genem markerowym zawierającym promotor MS2. Wektory zostały wprowadzone do komórek pszenicy poprzez wstrzeliwanie cząsteczek złota otoczonych DNA testowanych wektorów. Metoda przygotowania cząsteczek złota do strzelania i niedojrzałych zarodków pszenicy jest opisana w przykładzie 9. Gen żółto-zielonej fluorescencji taCitrine stanowi wizualny marker aktywności promotora MS2, gdyż jego sekwencja kodująca jest połączona z fragmentem promotora MS2. Promotor MS2 nie jest funkcjonalny/aktywny w komórkach skutellum (tarczki) pszenicy. Dlatego też, nie obserwuje się świecących komórek na powierzchni skutellum po strzelaniu cząsteczkami złota pokrytymi wektorem MS2-taCitrine (Fig. 11, część A). Natomiast po strzelaniu cząsteczkami złota pokrytymi wektorem MS2-taCitrine i wektorem pBL-Ubi_tadCas9::VP128_sgRNA M1, na powierzchni skutellum pojawiają się świecące punkty wskazujące na aktywację genu taCitrine (Fig. 11, część B). Przedstawione wyniki wskazują na aktywację promotora MS2 poprzez syntetyczny regulator tadCas9::VP128.

Opisana procedura może być stosowana do funkcjonalnego testowania syntetycznych regulatorów według wynalazku i ich wariantów.

Przykład 8. Wprowadzanie do roślin syntetycznego regulatora według wynalazku.

Metody wprowadzania elementów genetycznych do komórek roślinnych są znane genetykom molekularnym roślin. W przykładowej realizacji wynalazku użyto metody wstrzeliwania wektorów DNA do komórek niedojrzałych zarodków pszenicy. Przedstawiona metoda prowadzi do identyfikacji komórek zawierających syntetyczny regulator oraz ich namnożenie. Komórki te następnie używa się do regeneracji męsko-sterylnych roślin.

Uprawa roślin

Suche nasiona są sterylizowane w 70% etanolu przez 1 minutę a następnie przez 20 minut w 1% podchlorynie sodu (1:4 domestos : woda producent Unilever). Po inkubacji w podchlorynie sodu, nasiona są płukane 3 razy w sterylnej wodzie. Wysterylizowane nasiona umieszcza się na szalkach Petriego zawierających nasączoną wodą bibułę (1-1.5 ml) i inkubuje w temperaturze 24°C w ciemności przez 4 dni.

Skiełkowane nasiona są przenoszone do doniczek (19x15 cm średnica/wysokość, 2 rośliny na doniczkę) z podłożem Substralnatural - podłoże gotowe do siewu, bogate w próchnicę i biokompost. Podłoże poddaje się obróbce termicznej w temperaturze 80°C przez 6 h. Następnie do podłoża zmieszanego z wodą jest dodawane 200 g (do 20 litrów ziemi) wapna nawozowo-węglanowego zawierającego magnez (DOLOMIT 50, producent PPHU Dolpol). Tak przygotowane podłoże jest następnie mieszane z keramzytem (producent KiK Krajewscy 1972) w stosunku 4:1. Po wypełnieniu doniczek, do każdej doniczki dodaje się 150 ml 0.4% roztwór nawozu KRISTALON ZIELONY 18-18-18 (producent YARA).

Rośliny są uprawiane w temperaturze 20°C /15°C (dzień/noc) przy 15/9 godzin fotoperiodzie, wilgotności 40-50%, naświetleniu 300-350 μM na poziomie doniczek - ok. 1 m od szkła chroniącego lampy (600 W lampy metalohalogenkowe i 600 W lampy HPS). Rośliny są regularnie podlewane codziennie i nawożone raz w tygodniu 150 mililitrami na jedną doniczkę 0.4% roztworu KRISTALON ZIELONY. Do ochrony roślin przed grzybami stosuje się TILT-Turbo (Syngenta). Spryskiwanie przeprowadza się w miarę potrzeby, jednak nie później niż na tydzień przed zbiorem materiału do izolacji niedojrzałych zarodków.

Przygotowanie niedojrzałych zarodków

Niedojrzałe ziarniaki zbiera się dwa tygodnie po kwitnieniu (od pojawienia się pylników na zewnątrz kłosów) i sterylizuje wg powyższej procedury (uprawa roślin). Niedojrzałe zarodki izoluje się skalpelem i wykłada na pożywkę zawierającą 9% sacharozę oraz auksynę 2,4D. Następnie materiał roślinny inkubuje się w ciemności w temperaturze 23°C przez jeden dzień.

Przygotowanie pocisków ze złota oraz mikrowstrzeliwanie

Nanocząsteczki złota (20 mg) o wielkości 0.6 μm traktuje się kilkukrotnie alkoholem etylowym, a następnie zawiesza w sterylnej wodzie. Do 20 mg nanocząsteczek dodaje się 50 μg DNA wektorów w obecności 0.1M spermidyny i 2.5M CaCl2. Na jeden strzał używa się 400 μg złota i 1 μg DNA. Po inkubacji przez 2 minuty w pokojowej temperaturze, nanocząsteczki pokryte DNA wiruje się 8000 g przez 15 s. Po odwirowaniu, roztwór złoto-DNA zawiesza się w alkoholu etylowym. 20 μl zawiesiny nanocząsteczek pokrytych DNA nanosi się na wysterylizowane makronośniki.

Na jeden strzał przypada ok. 80 niedojrzałych zarodków ułożonych na środku szalki Petriego o średnicy 50 mm. Szalka Petriego znajduje się w odległości 10 cm od makronośników. Mikrowstrzeliwanie następuje po wcześniejszym wytworzeniu próżni 27-28 mm Hg.

Następnie niedojrzałe zarodki pozostawia się w ciemności na płytkach Peteriego na tej samej pożywce przez 1-2 dni w temperaturze 23°C. Po tym okresie, eksplantaty przenosi się na pożywkę indukcyjną o niższym stężeniu osmotycznym zawierającą auksynę 2,4 d oraz czynnik selekcyjny, 3 mg/l fosfinotricynę. Po 4 tygodniach embriogeniczne kalusy przenosi się na pożywkę regeneracyjną zawierającą cytokininę BAP. Szalki Petriego z regenerującymi roślinkami inkubuje się w temperaturze 23°C przy fotoperiodzie 16 h/8 h (dzień/noc). Po 3 tygodniach, wyrosłe regeneranty ukorzenia się na pożywce zawierającej sacharozę. Ukorzenione roślinki przenosi się do doniczek z ziemią przygotowaną tak jak opisano w sekcji uprawa roślin. Rośliny uprawia się w tych samych warunkach jak rośliny rosnące z nasion.

Identyfikacja roślin zawierających syntetyczny regulator według wynalazku

Rośliny pszenicy zawierające syntetyczny aktywator identyfikuje się poprzez analizę genomowego DNA na zawartość fragmentów genu syntetycznego aktywatora Ubi_tadCas9::VP128. W tym celu należy wyizolować genomowe DNA z komórek liści wyselekcjonowanych roślin zgodnie z protokołem DNeasy Plant Mini Kit, Qiagen. Do amplifikacji genu Ubi_tadCas9::VP128 należy użyć 20-50 ng genomowego DNA oraz pary starterów specyficznych do amplifikowanego fragmentu, na przykład startera Cas9endfw1 (CATCGAGCAGATCAGCGAGT (Sekw. Nr 29)) i U6promrw1 (GCTCTCCCCAATCGTGAACA (Sekw. Nr 30)). Obecność syntetycznego regulatora jest potwierdzana poprzez amplifikacje fragmentu genomowego DNA o długości 1186 par zasad (Fig. 13 - rośliny M2-01, M2-03, M1-04, M1-05). W roślinach M1-06, BobWhite, DST nie stwierdzono obecności genu syntetycznego aktywatora (fragment 784 par zasad to domena wiążąca DNA bez aktywatora). Reakcje PCR i analizy DNA na żelach agarozowych przeprowadza się zgodnie z protokołami znanymi biologom molekularnym.

Przykład 9. Weryfikacja skuteczności syntetycznego regulatora zawierającego domenę aktywatora w aktywacji ekspresji genu męskiej sterylności MS2.

Do funkcjonalnej weryfikacji przykładowej realizacji wynalazku użyto wektorów syntetycznych regulatorów, które zostały wprowadzone do komórek pszenicy poprzez metody opisane w poprzednich przykładach. Jak przedstawiono na Fig. 14, wprowadzenie syntetycznego aktywatora do komórek pszenicy powoduje aktywacje ekspresji genu męskiej sterylności MS2, co manifestuje się poprzez obecność transkryptów mRNA tego genu (Fig. 31, Sekw. Nr 22). Transkrypty genu MS2 o wielkości 230 par zasad pojawiają się w komórkach pszenicy po wprowadzeniu aktywatora tadCas9::VP128-M1. Sekwencja transkryptu jest przedstawiona na Fig. 14 (Sekw. Nr 25). Transkrypt mRNA genu MS2 nie zawiera pierwszego intronu tego genu, który jest usuwany w procesie dojrzewania cząsteczek mRNA (pierwszy intron obecny w genie MS2 jest zaznaczony na żółto). Jest to bezpośredni dowód na to, że pojawiające się transkrypty są faktycznie produktami zaktywowanej ekspresji genu MS2.

Przykład 1 0. Sposób otrzymywania mieszańców pszenicy z wykorzystaniem syntetycznego regulatora według wynalazku.

Produkcja mieszańców roślin obupłciowych, a w szczególności roślin klejstogamicznych, wymaga krzyżowania dwóch genetycznie zróżnicowanych odmian (linii wsobnych) z których jedna jest linią męsko-sterylną (roślina mateczna). Dawcą pyłku jest płodna roślina ojcowska.

Przedmiotem wynalazku jest system produkcji mieszańców roślin przedstawiony na Fig. 10. Istotnym elementem tego systemu jest namnażanie roślin męsko-sterylnych.

W przedstawianej realizacji wynalazku, rośliny te są namnażane poprzez krzyżowanie z roślinami ojcowskimi (dawcami pyłku), którymi są rośliny tej samej odmiany (A) (linii wsobnej) (Fig. 10).

Pierwsza roślina w parze to płodna roślina odmiany wybranej do krzyżowania przez hodowców. Roślina ta nie zawiera żadnych dodatkowych elementów genetycznych wprowadzonych poprzez genetyczne transformacje lub edytowanie genomu. Ta roślina jest źródłem pyłków do zapylania roślin sterylnych przez co rośliny sterylne ulegają namnażaniu.

Drugą rośliną w parze jest roślina tej samej odmiany mająca zintegrowaną w swoim genomie sekwencję kwasu nukleinowego kodującą syntetyczny regulator, którego ekspresja powoduje aktywację genu sterylności (aktywator) lub inaktywację (represor) endogennych genów płodności. Gen syntetycznego regulatora jest funkcjonalnie połączony z genetycznym markerem umożliwiającym identyfikację lub selekcje roślin/nasion zawierających ten gen.

W potomstwie krzyżówki pierwszej i drugiej rośliny wśród nasion zebranych z roślin matecznych (męsko-sterylnych), 50% nasion zawiera syntetyczny regulator. Są to namnożone sterylne rośliny pierwszej odmiany, które następnie są używane do produkcji mieszańców heterozygotycznych. W pierwszym wariancie przykładowej realizacji wynalazku, nasiona niezawierające syntetycznego regulatora można rozdzielić, poprzez sortowanie nasion w świetle UV. Nasiona z syntetycznym regulatorem zawierają gen markerowy barwnika fluorescencyjnego (Fig. 12). Ekspresja genu markerowego żółtej fluorescencji (mcitrine) umożliwia segregację nasion pszenicy zawierających syntetyczne regulatory ekspresji genów męskiej sterylności. Sortowanie nasion roślin matecznych jest stosowane w innych systemach produkcji mieszańców (5, 28). W drugim wariancie przykładowej realizacji wynalazku, po wysadzeniu nasion, można usuwać rośliny płodne poprzez spryskanie herbicydem - gen markerowy odporności na herbicyd podłączony do syntetycznego regulatora. W trzecim wariancie przykładowej realizacji wynalazku, pryskanie herbicydem można wykonywać po kilku cyklach produkcyjnych w których wysadza się wszystkie nasiona zebrane z pola bez potrzeby dosadzania roślin ojcowskich (dawcami pyłku są rośliny niezawierające syntetycznego regulatora). Syntetyczny regulator nie jest przenoszony przez pyłek do następnego pokolenia, gdyż mateczne rośliny zawierające syntetyczny regulator są roślinami męsko-sterylnymi. W wyniku tego procesu nie pojawiają się homozygotyczne rośliny zawierające syntetyczny regulator, namnożeniu ulegają tylko rośliny heterozygotyczne.

Po namnożeniu, heterozygotyczne rośliny męsko-sterylne krzyżuje się z roślinami ojcowskimi innej odmiany (B) (linii wsobnej) co prowadzi do powstania mieszańca AB. Wszystkie rośliny mateczne produkują nasiona mieszańca AB, połowa tych nasion będzie produkowała rośliny płodne zdolne do zapylenia nasion na polach produkcyjnych. Jeżeli zaistnieją ograniczenia uprawy roślin z syntetycznymi regulatorami, nasiona te można odsortować od nasion roślin hybrydowych bez obcych elementów genetycznych.

Literatura

1. W. Akel, M. Rapp, P. Thorwarth, T. Wurschum, C. F. H. Longin, Hybrid durum wheat:

heterosis of grain yield and quality traits and genetic architecture of anther extrusion. Theor. Appl. Genet. 132, 921-932 (2019).

2. X. Wan, S. Wu, X. Li, Breeding with dominant genic male-sterility genes to boost crop grain yield in the post-heterosis utilization era. Mol Plant 10.1016/j.molp.2021.02.004 (2021).

3. M. J. Milner et al., Identification of genes involved in male sterility in wheat (Triticum aestivum L.) which could be used in a genic hybrid breeding system. Plant Direct 4, e00201 (2020).

4. J. Li, Z. Wang, G. He, L. Ma, X. W. Deng, CRISPR/Cas9-mediated disruption of TaNP1 genes results in complete male sterility in bread wheat. J Genet Genomics 47, 263272 (2020).

5. Y. Wu et al., Development of a novel recessive genetic male sterility system for hybrid seed production in maize and other cross-pollinating crops. Plant Biotechnol J 14, 1046-1054 (2016).

6. W. Cao, D. J. Somers, G. Fedak, A molecular marker closely linked to the region of

Rht-D1c and Ms2 genes in common wheat (Triticum aestivum). Genome 52, 95-99 (2009).

7. F. Ni et al., Wheat Ms2 encodes for an orphan protein that confers male sterility in grass species. Nat Commun 8, 15121 (2017).

8. A. Papikian, W. Liu, J. Gallego-Bartolome, S. E. Jacobsen, Site-specific manipulation of Arabidopsis loci using CRISPR-Cas9 SunTag systems. Nat Commun 10, 729 (2019).

9. Z. Li et al., A potent Cas9-derived gene activator for plant and mammalian cells. Nat

Plants 3, 930-936 (2017).

10. P. I. Thakore et al., RNA-guided transcriptional silencing in vivo with S. aureus CRI-

SPR-Cas9 repressors. Nat Commun 9, 1674 (2018).

11. A. Piatek et al., RNA-guided transcriptional regulation in planta via synthetic dCas9- based transcription factors. Plant Biotechnol J 13, 578-589 (2015).

12. X. Wan et al, Maize Genic Male-Sterility Genes and Their Applications in Hybrid Bree- ding: Progress and Perspectives. Mol Plant 12, 321-342 (2019).

13. V. Djukanovic et al., Male-sterile maize plants produced by targeted mutagenesis of the cytochrome P450-like gene (MS26) using a redesigned I-Crel homing endonuclease. Plant J. 76, 888-899 (2013).

14. E. J. Tucker et al., Molecular identification of the wheat male fertility gene Ms1 and its prospects for hybrid breeding. Nat Commun 8, 869 (2017).

15. L. Reynolds et al., Repression of the HIV-1 5' LTR promoter and inhibition of HIV-1 replication by using engineered zinc-finger transcription factors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 100, 1615-1620 (2003).

16. R. Urrutia, KRAB-containing zinc-finger repressor proteins. Genome Biol 4, 231 (2003).

17. J. Boch et al., Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors.

Science 326,1509-1512 (2009).

18. K. S. Makarova et al., Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat

Rev Microbiol 9, 467-477 (2011).

19. X. Zhang et al., MiniCAFE, a CRISPR/Cas9-based compact and potent transcriptional activator, elicits gene expression in vivo. Nucleic Acids Res. 10.1093/nar/gkab174 (2021).

20. E. Deltcheva et al., CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602-607 (2011).

21. M. Jinek et al., A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bac- terial immunity. Science 337, 816-821 (2012).

22. X. Xiong, J. Liang, Z. Li, B. Q. Gong, J. F. Li, Multiplex and optimization of dCas9-TV- mediated gene activation in plants. J Integr Plant Biol 63, 634-645 (2021).

23. Y. Wang et al., Genome-wide characterization of JASMONATE-ZIM DOMAIN trans- cription repressors in wheat (Triticum aestivum L.). BMC Genomics 18, 152 (2017).

24. N. F. Rizvi, J. D. Weaver, E. J. Cram, C. W. Lee-Parsons, Silencing the Transcriptional

Repressor, ZCT1, Illustrates the Tight Regulation of Terpenoid Indole Alkaloid Biosynthesis in Catharanthus roseus Hairy Roots. PLoS One 11, e0159712 (2016).

25. M. M. Mahfouz et al., Targeted transcriptional repression using a chimeric TALE-SRDX repressor protein. Plant Mol Biol 78, 311-321 (2012).

26. N. Alerasool, D. Segal, H. Lee, M. Taipale, An efficient KRAB domain for CRISPRi applications in human cells. Nat Methods 17, 1093-1096 (2020).

27. B. C. Stanton et al., Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic ga- tes. Nature chemical biology 10, 99-105 (2014).

28. X. An et al., Molecular regulation of ZmMs7 required for maize male fertility and deve- lopment of a dominant male-sterility system in multiple species. Proc. Natl Acad. Sci. USA 117, 23499-23509 (2020).

29. L. S. Qi et al., Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell 184, 844 (2021).

30. L. S. Qi et al., Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell 152,1173-1183 (2013).

31. I. Sadowski, J. Ma, S. Triezenberg, M. Ptashne, GAL4-VP16 is an unusually potent transcriptional activator. Nature 335, 563-564 (1988).

32. J. Wang et al., Overexpression of OsMYB1R1-VP64 fusion protein increases grain yield in rice by delaying flowering time. FEBS Lett 590, 3385-3396 (2016).

33. J. P. Guilinger, D. B. Thompson, D. R. Liu, Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 32, 577582 (2014).

34. C. Xia et al., A TRIM insertion in the promoter of Ms2 causes male sterility in wheat.

Nat Commun 8,15407 (2017).

35. S. Gasparis et al., A simple and efficient CRISPR/Cas9 platform for induction of single and multiple, heritable mutations in barley (Hordeum vulgare L.). Plant methods 14, 111 (2018).

36. X. Liu, Y. Shangguan, J. Zhu, Y. Lu, B. Han, The rice OsLTP6 gene promoter directs anther-specific expression by a combination of positive and negative regulatory elements. Planta 238, 845-857 (2013).

37. K. Hiratsu, K. Matsui, T. Koyama, M. Ohme-Takagi, Dominant repression of target ge- nes by chimeric repressors that include the EAR motif, a repression domain, in Arabidopsis. Plant J. 34, 733-739 (2003).

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Syntetyczny regulator ekspresji genu roślinnego związanego z fenotypową cechą męskiej sterylności zawierający białko posiadające białkową domenę wiążącą się z DNA genu roślinnego związanego z fenotypową cechą męskiej sterylności oraz połączoną z nią białkową domenę aktywatora lub represora procesu transkrypcji tego genu, przy czym białkowa domena wiążącą się z DNA tworzy kompleks z cząsteczką RNA posiadającą sekwencję komplementarną do elementu kontrolującego ekspresję genu sterylności, przy czym:

   - gen roślinny związany z fenotypową cechą męskiej sterylności jest genem rośliny zbożowej, korzystnie genem pszenicy,

   - cząsteczka RNA posiadająca sekwencję komplementarną do elementu kontrolującego ekspresję genu sterylności została wybrana z grupy obejmującej: cząsteczki RNA określane jako tracrRNA i crRNA lub ich syntetyczne wersje określane jako sgRNA będące składnikami systemu CRISPR,

   - białkowa domena aktywatora została wybrana z grupy obejmującej: naturalne domeny czynników transkrypcyjnych takich jak VP-16 i jego syntetyczne pochodne SunTag lub TV,

   - białkowa domena wiążąca się z DNA posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną jako sekw. nr 2, natomiast

   - białkowa domena represora została wybrana z grupy obejmującej: domeny naturalnych represorów takich jak JAZ, ZTC1, SRDX, domeny represorów KRAB lub domeny represorów prokariotycznych na przykład TetR.
2. 2. Regulator ekspresji według zastrz. 1, znamienny tym, że białkowa domena aktywatora posiada sekwencję aminokwasową przedstawioną jako: sekw. nr 2, sekw. nr 4 albo sekw. nr 5.
3. 3. Regulator ekspresji według zastrz. 1, znamienny tym, że cząsteczka RNA posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 3.
4. 4. Kaseta ekspresyjna kodująca regulator ekspresji określony w zastrz. 1-3.
5. 5. Kaseta ekspresyjna według zastrz. 4, znamienna tym, że posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 13.
6. 6. Wektor ekspresyjny zawierający kasetę ekspresyjną określoną w zastrz. 4-5.
7. 7. Wektor ekspresyjny według zastrz. 6, znamienny tym, że posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 14.
8. 8. Sposób otrzymywania męsko-sterylnych roślin, znamienny tym, że do komórek zarodków roślinnych wprowadza się wektor ekspresyjny syntetycznego regulatora genów sterylności lub płodności, identyfikuje się komórki zawierające taki regulator ekspresji, namnaża się zidentyfikowane komórki, a następnie wykorzystuje się je do regeneracji męsko-sterylnych roślin, przy czym korzystnie do komórek zarodków roślinnych wprowadza się wektor ekspresyjny okre

   PL 249598 Β1 ślony w zastrz. 6-7, identyfikuje się komórki zawierające regulator ekspresji określony w zastrz. 1-3, namnaża się zidentyfikowane komórki, a następnie wykorzystuje się je do regeneracji męsko-sterylnych roślin.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że DNA wektora ekspresyjnego wprowadza się do komórek zarodka poprzez mikrowstrzeliwanie.
10. 10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że komórki zawierające regulator ekspresji identyfikuje się poprzez analizę ich genomowego DNA na zawartość fragmentów genu syntetycznego regulatora, zwłaszcza obecność transkryptów mRNA tego genu, korzystnie techniką PCR.