PL249473B1 - Liposom kationowy wiążący i stabilizujący RNA, jego zastosowanie jako nośnika leku oraz w terapii genowej i sposób ładowania liposomu emetyną - Google Patents

Liposom kationowy wiążący i stabilizujący RNA, jego zastosowanie jako nośnika leku oraz w terapii genowej i sposób ładowania liposomu emetyną

Info

Publication number
PL249473B1
PL249473B1 PL438742A PL43874221A PL249473B1 PL 249473 B1 PL249473 B1 PL 249473B1 PL 438742 A PL438742 A PL 438742A PL 43874221 A PL43874221 A PL 43874221A PL 249473 B1 PL249473 B1 PL 249473B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
emetine
liposome
rna
liposomes
weight
Prior art date
Application number
PL438742A
Other languages
English (en)
Other versions
PL438742A1 (pl
Inventor
Olga Święch
Original Assignee
Bs Biotechna Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bs Biotechna Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością filed Critical Bs Biotechna Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością
Priority to PL438742A priority Critical patent/PL249473B1/pl
Priority to PCT/PL2022/000046 priority patent/WO2023022615A1/en
Priority to JP2024533925A priority patent/JP2024531829A/ja
Priority to IL310853A priority patent/IL310853A/en
Priority to US18/683,763 priority patent/US20240382425A1/en
Priority to EP22797521.6A priority patent/EP4398883A1/en
Priority to CN202280069568.1A priority patent/CN118139613A/zh
Priority to CA3229288A priority patent/CA3229288A1/en
Publication of PL438742A1 publication Critical patent/PL438742A1/pl
Publication of PL249473B1 publication Critical patent/PL249473B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/472—Non-condensed isoquinolines, e.g. papaverine
    • A61K31/4725—Non-condensed isoquinolines, e.g. papaverine containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1277—Preparation processes; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/51—Physical structure in polymeric form, e.g. multimers, concatemers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest liposom kationowy wiążący i stabilizujący RNA, charakteryzujący się tym, że składa się z lipidów obojętnych w ilości od 12,4 do 49% wagowych, lipidów kationowych w ilości od 16,2 do 55% wagowych, lipidów modyfikowanych glikolem polietylenowym w ilości 12,9 do 15,1% wagowych i cholesterolu w ilości od 15,4 do 18,1% wagowych i charakteryzuje się wielkością od 80 nm do 190 nm, współczynnikiem polidyspersji od 0,06 do 0,23 oraz potencjałem zeta + 19 mV do + 55 mV, przy czym jest załadowny RNA. Przedmiotem zgłoszenia jest także zastosowanie ww. liposomu i sposób ładowania liposomu emetyną.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest liposom kationowy wiążący i stabilizujący RNA, jego zastosowanie jako nośnika leku oraz w terapii genowej i sposób ładowania liposomu emetyną.
Terapię genową definiuje się jako zastosowanie różnego rodzaju kwasów nukleinowych do ekspresji, edycji lub wyciszania określonych genów w komórkach w celu uzyskania konkretnych efektów terapeutycznych. Pierwsze sekwencje kwasu nukleinowego zastosowane w terapii genowej miały postać plazmidowego DNA, podczas gdy ostatnio wprowadzone leki oparte na RNA, takie jak mały interferujący RNA (siRNA) czy mRNA, charakteryzują się dużo większą skutecznością terapii. Pomimo obiecujących wyników terapii RNA, jako narzędzia do leczenia obecnie nieuleczalnych chorób genetycznych i nabytych, jej stosowanie napotyka na szereg trudności, takich jak toksyczność wektorów wirusowych wykorzystywanych do dostarczania RNA oraz nieskuteczność nośników niewirusowych lub syntetycznych, które mają zastąpić nośniki wirusowe. (Lukashev A.N., Zamyatnin A.A. Jr.: Viral vectors for gene therapy: current state and clinical perspectives. Biochemistry (Mosc.), 81,700-708, 2016). Nieefektywność systemów niewirusowych można tłumaczyć brakiem wydajnych systemów dostarczania, które dostatecznie chronią kwasy nukleinowe i dostarczają je w wystarczających dawkach do miejsc docelowych, zwykle do wnętrza specyficznych komórek. (Yin H., Kanasty R.L., Eltoukhy A.A., Vegas A.J., Dorkin J.R., Anderson D.G.: Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat. Rev. Genet., 15, 541-555, 2014). W ciągu ostatnich kilku lat nastąpił ogromny postęp w rozwoju niewirusowych systemów do ukierunkowanego dostarczania genów in vivo do różnych narządów. Postęp ten przełożył się na zatwierdzenie pierwszego leku opartego na interferencji RNA (RNAi), Patisiran (Onpattro), do leczenia dziedzicznej amyloidozy, w której pośredniczy transtyretyna. (Kristen AV, Ajroud-Driss S, Conceicao I, Gorevic P, Kyriakides T, Obici L. Patisiran, an RNAi therapeutic for the treatment of hereditary transthyretinmediated amyloidosis. Neurodegenerative Disease Management, 9, 5-23, 2019). Patisiran to preparat na bazie lipidów, który zawiera siRNA w kapsułkach i skutecznie działa na hepatocyty wątroby po podaniu dożylnym, aby spowodować efektywne i trwałe wyciszenie nieprawidłowej postaci genu transtyretyny. Ten przełom w dziedzinie dostarczania genów niewirusowych spotkał się z dużym zainteresowaniem na całym świecie i wyraźnie pokazał znaczenie układów opartych na lipidach w opracowywaniu bardziej wydajnych leków w przyszłości.
Dostępnych jest kilka nośników syntetycznych do dostarczania genów. Jedna strategia polega na zastosowaniu koniugatów różnych kwasów nukleinowych z różnymi urządzeniami funkcjonalnymi, takimi jak peptydy, polimery, cukry, białka, przeciwciała lub aptamery. (Glebova KV, Marakhonov AV, Baranova AV, Skoblov M. Types of non-viral delivery systems of small interfering RNA. Molekuliarnaia Biologiia, 46, 387-401, 2012). Inna strategia polega na enkapsulacji kwasów nukleinowych w nanocząstkach (NP) o odpowiedniej wielkości. Systemy koniugatów są małych rozmiarów i można je łatwo usunąć z organizmu przez filtrację kłębuszkową w nerkach. (Khalil IA, Yamada Y, Harashima H. Optimization of siRNA delivery to target sites: issues and future directions. Expert Opin. Drug Deliv., 15, 1053-1065, 2018). Ponadto kwasy nukleinowe w koniugatach nie są chronione i muszą być chemicznie zmodyfikowane, aby były odporne na degradację przez nukleazy w krążeniu. Z drugiej strony systemy NP są wystarczająco duże, aby uniknąć eliminacji przez nerki i mogą zapewnić większą ochronę kwasów nukleinowych w krążeniu. Nanocząstki stosowane do dostarczania genów można ogólnie podzielić na nanocząsteczki polimerowe i lipidowe. Nanocząstki lipidowe zapewniają kilka korzyści, w tym wyższą stabilność, niską toksyczność i większą wydajność. (Cullis PR, Hope MJ. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Mol. Ther., 25, 1467-1475, 2017; Zhao Y, Huang L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Adv. Genet., 88, 13-36, 2014). Ponadto systemy oparte na lipidach można modyfikować innymi ligandami nakierowującymi na określone komórki. Aby zwiększyć wydajność i zmniejszyć skutki uboczne nośników genowych opartych na lipidach, systemy muszą unikać inaktywacji w surowicy oraz muszą mieć zdolność wiązania i stabilizowania nukleotydów oraz celowania w określone komórki organizmu. (Khalil IA, Sato Y, Harashima H. Recent advances in the targeting of systemically administered non-viral gene delivery systems. Expert Opin. Drug Deliv., 16, 1037-1050, 2019; Nakamura T, Yamada Y, Sato Y, Khalil IA, Harashima H. Innovative nanotechnologies for enhancing nucleic acids/gene therapy: controlling intracellular trafficking to targeted biodistribution. Biomaterials, 218, 119329, 2019). Skład lipidowy w nanocząstkach warunkuje ich parametry fizykochemiczne, trwałość, siłę wiązania kwasów nukleinowych oraz czas życia w krwioobiegu. Najczęściej stosowanymi lipidami do konstrukcji nośników lipidowych w terapii genowej są: DOTMA, DOTAP oraz ich pochodne, a także lipidy jonizowalne, ich połączenia z lipidami obojętnymi oraz lipidami modyfikowanymi glikolem polietylenowym.
Emetyna jest lekiem niskocząsteczkowym wykazującym działanie zarówno przeciwnowotworowe jak i przeciwpasożytnicze, oraz silne działanie hamujące o szerokim spektrum przeciwko różnym wirusom DNA i RNA. Może zapobiegać przedostawaniu się wirusów do komórek, hamując w ten sposób aktywność enzymu replikacji wirusa i transport wewnątrzkomórkowy, a także może hamować translację białek wirusowych. (Mukhopadhyay R, Roy S, Venkatadri R, et al. Efficacy and mechanism of action of low dose emetine against human cytomegalovirus. PLoS Pathog 2016;12:e1005717). Potwierdzono, że hamowanie translacji białek przez emetynę może być skuteczne w zapobieganiu replikacji koronawirusa typu 2 ostrej niewydolności oddechowej (SARS-CoV-2) (Bojkova D, Klann K, Widera M, et al. Proteomics of SARS-CoV-2-infected host cells reveals therapy targets. Nature 2020;583:469-472.) Ponadto spośród ponad 290 leków, które zostały przebadane pod kątem koronawirusów MERS i SARS, emetyną ma najniższe EC50 (poniżej 0,02 μΜ) blokując inwazję wirusa i hamując jego replikację. (Bleasel MD, Peterson GM. Emetine, Ipecac, Ipecac Alkaloids and Analogues as Potential Antiviral Agents for Coronaviruses. Pharmaceuticals (Basel) 2020; 13:51). Dodatkowo może być akumulowana w tkance płucnej przez ponad 12 godzin i nadal utrzymywać skuteczne stężenie. Dlatego też emetyna może być stosowana jako potencjalny lek na COVID-19. (doi: 10.1097/JBR.0000000000000076).
Z drugiej strony przeciwnowotworowe działanie emetyny było znane od początku XX wieku. W latach 70. emetyną była testowana w badaniach klinicznych fazy l i II jako środek przeciwnowotworowy samodzielnie lub w połączeniu z innymi chemioterapiami. Badania te przeprowadzono u pacjentów z zaawansowaną chorobą oporną na leczenie, a w badaniach u pacjentów wstępnie leczonych odnotowano częściową i sporadyczną całkowitą odpowiedź. Stwierdzono jednak, że indeks terapeutyczny emetyny jest bardzo wąski, a zwiększenie dawki było ograniczone przez wystąpienie toksyczności sercowej i nieprawidłowości EKG. W przeciwieństwie do doustnej emetyny, pozajelitowa emetyna nie wywoływała znaczących nudności. Ponadto lek nie miał wpływu na czynność nerek lub wątroby i nie był mielosupresyjny. Wydaje się jednak, że toksyczność sercowa i mięśniowa ograniczająca dawkę hamowała dalszy rozwój emetyny jako terapii przeciwnowotworowej. Badania te sugerują, że emetyn a może być użytecznym środkiem przeciwnowotworowym, jeśli poprawi się jej indeks terapeutyczny (EXCLI Journal 2016;15:323-328 - ISSN 1611-2156, published: May 10, 2016, Recent developments on potential new applications of emetine as anticancer agent November 2019, Volume 42 Issue 5, Emetine exhibits anticancer activity in breast cancer cells as an antagonist of Wnt/ β-catenin signaling The Open Natural Products Journal, 2011, 4, 8-15, Biological Activities of Emetine).
Powyższe badania nad emetyną wykazują, że może znaleźć potencjalne zastosowanie jako czynnik wspomagający w terapiach genowych skierowanych zarówno przeciwko chorobom wirusowym jak i przeciwnowotworowym. Istnieje zatem duża potrzeba w poszukiwaniu nośników leków zapewniających bezpieczny transport emetyny do komórek patologicznie zmienionych, w szczególności nośników kationowych, zapewniających jednocześnie wiązanie i stabilizację kwasów rybonukleinowych. Dotychczasowe badania wykazały, że emetyna ma niskie powinowactwo do nośników lipidowych ze współczynnikiem enkapsulacji %EE na poziomie 50% dla lipidów obojętnych, a jej ładowanie do nośników lipidowych realizowano z wykorzystaniem gradientu stężeń w oddzielnym kroku syntetycznym po procesie formowania liposomów (DOI: 10.1016/j.ejpb.2014.04.002).
Istota rozwiązania według pierwszego wynalazku polega na tym, że liposom składa się z lipidów obojętnych w ilości od 12,4 do 49% wagowych, lipidów kationowych w ilości od 16,2 do 55% wagowych, lipidów modyfikowanych glikolem polietylenowym w ilości 12,9 do 15,1% wagowych i cholesterolu w ilości od 15,4 do 18,1% wagowych i charakteryzuje się wielkością od 80 nm do 190 nm, współczynnikiem polidyspersji od 0.06 do 0.23 oraz potencjałem zeta od +19 mV do +55 mV, przy czym jest załadowany RNA.
Korzystnie RNA ma postać dupleksu siRNA anty-EGFR.
Korzystnie lipidem obojętnym jest dipalmitoilofosfatydylocholina (DPPC).
Korzystnie lipidem obojętnym jest 1,2-dimirystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC).
Korzystnie lipidem kationowym jest 1,2-dimirystoilo-sn-glicero-3-etylofosfocholina (14:0 EPC). Korzystnie lipidem kationowym jest 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-etylofosfocholina (16:0 EPC). W korzystnym wykonaniu lipidem modyfikowanym glikolem polietylenowym jest 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG-NH2).
Korzystnie RNA połączone jest z liposomami w proporcji 1 : 30, czyli na 1 mg liposomu przypada nie więcej niż 1,34 μg RNA.
Korzystnie liposom ma wbudowany lek niskocząsteczkowy.
Najkorzystniej lekiem niskocząsteczkowym jest emetyna w ilości od 0,5% wagowych i nie więcej niż 8,5% wagowych.
Korzystnie liposom modyfikowany jest czynnikiem naprowadzającym.
Korzystnie czynnikiem naprowadzającym jest kwas foliowy w ilości nie mniej niż 1,3% wagowych i nie więcej niż 1,55% wagowych.
Istotą rozwiązania według drugiego wynalazku jest zastosowanie liposomu opisanego powyżej jako nośnika leków.
Istotą rozwiązania według trzeciego wynalazku jest zastosowanie liposomu opisanego powyżej w terapii genowej.
Istota rozwiązania według wynalazku w zakresie sposobu polega na tym, że odważa się od 12,4 do 49% wagowych lipidów obojętnych, od 16,2 do 55% wagowych lipidów kationowych, od 12,9 do 15,1% wagowych lipidów modyfikowanych glikolem polietylenowym, cholesterol w ilości od 15,4 do 18,1% wagowych i nie mniej niż 0,5% wagowych emetyny, po czym rozpuszcza się odważkę w mieszaninie chloroformu i metanolu o stosunku objętościowym 2:1, dodając od 0,26 do 1,4 mg mieszaniny lipidowej na każdy 1 ml mieszaniny rozpuszczalnika. Następnie całość odparowuje się usuwając rozpuszczalnik w temperaturze od 25 do 40°C, przy ciśnieniu od 100 do 300 mbar w czasie od 2 do 5 h do uzyskania cienkiego filmu dwuwarstwy lipidowej na ścianach naczynia, po czym dosusza film w temperaturze od 25° do 40°C przy ciśnieniu od 100 do 300 mbar. Po całkowitym odparowaniu rozpuszczalników organicznych dodaje się sterylną filtrowaną sól fizjologiczną, bufor PBS lub płyn Ringera w ilości 1 ml na 0,34 do 0,36 mg lipidów, szczelnie zamyka a następnie hydratuje w temperaturze od 45 do 60°C, przy ciśnieniu od 100 do 300 mbar w czasie od 5 do 10 h. Zhydratowane warstwy lipidowe pozostawia się do ostygnięcia, po czym poddaje się procesowi rozbicia lipidów na cząstki o wielkości nie przekraczającej 200 nm w temperaturze od 45 do 65°C kontrolując rozmiar cząstek i ilość związanej emetyny. Roztwór pozostawia się do ostygnięcia, na koniec otrzymane liposomy oczyszcza się z niezwiązanej emetyny i nieprzereagowanych lipidów, mierzy się potencjał Zeta i wykonuje charakterystykę składu.
Korzystnie lipidem obojętnym jest dipalmitoilofosfatydylocholina (DPPC).
Korzystnie lipidem obojętnym jest 1,2-dimirystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC).
Korzystnie lipidem kationowym jest 1,2-dimirystoilo-sn-glicero-3-etylofosfocholina (14:0 EPC).
Korzystnie lipidem kationowym jest 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-etylofosfocholina (16:0 EPC).
Korzystnie lipidem modyfikowanym glikolem polietylenowym jest 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG-NH2).
Korzystnie emetynę otrzymuje się w następujący sposób: przygotowuje się roztwór chlorowodorku emetyny w wodzie zdejonizowanej o stężeniu 30 mg/ml, następnie wytrąca się osad miareczkując 0.2M roztworem NaOH, w ilości 1 ml 0.2 M NaOH na każde 20 mg emetyny, po czym odwirowuje się osad z prędkością od 4000 do 6000 RPM w czasie od 10 do 30 minut i oddziela go od roztworu. Do roztworu znad osadu dodaje się 0,1 ml 0.2M NaOH w celu kontroli całkowitego wytrącenia formy emetyny, po czym mierzy się ilość niewytrąconej emetyny, a osad przemywa się nie mniej niż pięciokrotnie wodą destylowaną, za każdym razem dyspergując za pomocą ultradźwięków, odwirowując i mierząc ilość niewytrąconej emetyny w roztworze znad osadu, przy czym całkowita strata emetyny podczas procesu wynosi nie więcej niż 20%. Następnie osad dosusza się w temperaturze od 25 do 30°C, pod ciśnieniem 100 mbar w czasie od 3 do 5 h.
Korzystnie ilość niewytrąconej emetyny mierzy się za pomocą spektroskopii UV-Vis względem krzywej kalibracyjnej.
Korzystnie mieszaninę lipidów odparowuje się w suszarce próżniowej w temperaturze od 25 do 40°C, przy ciśnieniu od 100 do 300 mbar w czasie od 2 do 4,5 h.
Korzystnie mieszaninę lipidów odparowuje się wyparce próżniowej w temperaturze od 30° do 40°C, przy ciśnieniu od 150 do 300 mbar w czasie od 2 do 5 h.
Korzystnie hydratację przeprowadza się w suszarce próżniowej.
Korzystnie hydratację przeprowadza się w wyparce próżniowej.
Korzystnie dosuszanie prowadzi się w suszarce próżniowej.
Korzystnie sterylną sól fizjologiczną, bufor PBS lub płyn Ringera filtruje się przez filtry strzykawkowe bpPVDF, 0.2 pm.
Korzystnie rozbicie lipidów prowadzi się metodą sonifikacji w czasie od 30 do 60 min przy częstotliwości 50 Hz do uzyskania zmiany zabarwienia roztworu z mlecznej na bezbarwną.
Korzystnie ilość związanej emetyny kontroluje się za pomocą metody UV-Vis przy długości fali 280 nm.
PL 249473 Β1
Korzystnie liposomy oczyszcza się za pomocą dializy w membranach 10 kD za pomocą ultraczystej wody przez od 30 do 60 minut podając 1 I wody na 4,5 ml próbki i zmieniając - wodę trzykrotnie w równych odstępach czasu.
Korzystnie czystość otrzymanych liposomów mierzy się za pomocą spektroskopii UV-Vis.
Korzystnie wielkość uzyskanych liposomów określa się za pomocą metody DLS.
Korzystnie charakterystykę składu liposomów przeprowadza się za pomocą metody ATR IR.
Główną zaletą rozwiązań według wynalazków jest to, że zastosowana w liposomach kombinacja lipidów pozwala na kontrolę dodatniego ładunku powierzchniowego a tym samym kontrolę siły wiązania cząsteczek RNA i stabilizację naturalnych, nietrwałych nici RNA oraz ich przechowywanie w temperaturze +4°C do 5 dni, podczas gdy dostępne na rynku nośniki RNA wymagają utrzymywania temperatury przechowywania na poziomie -80°C. Uzyskane liposomy wiążą RNA nawet w stosunku wagowym 1:30 (RNA: liposom), 1 mg liposomów może wiązać aż 34 pg kwasów nukleinowych. Opracowane liposomy charakteryzują się niewielką średnicą i niskim współczynnikiem polidyspersji PDI.
Kolejną zaletą jest synteza liposomów kationowych ładowanych niskocząsteczkowym lekiem emetyną o działaniu przeciwnowotworowym i przeciwwirusowym do wiązania i stabilizowania RNA dekorowaną cząsteczką naprowadzającą - kwasem foliowym. Dodatek emetyny i kwasu foliowego w strukturze liposomu kationowego wspomaga wiązanie i stabilizację RNA. Uzyskane liposomy kationowe zawierające emetynę i kwas foliowy wykazują wyraźną selektywność w działaniu jako nośniki w terapii przeciwnowotworowej, silnie wnikają i transportują kwasy nukleinowe do komórek nowotworowych Caco-2, które posiadają nadekspresję receptora kwasu foliowego podczas gdy działanie na prawidłowe komórki MEF-WT jest znikome.
Uzyskane liposomy kationowe bez czynnika naprowadzającego (kwasu foliowego) również efektywnie przenoszą RNA do wnętrza komórek nowotworowych Caco-2, jednak ich działanie jest słabsze niż w przypadku liposomów kationowych zawierających cząsteczkę naprowadzającą - kwas foliowy. Jednak mogą bycz powodzeniem stosowane do genowej terapii przeciwnowotworowej.
Procedura przygotowania liposomów ładowanych emetyną pozwala na uzyskanie nanocząstek kationowych z emetyną o współczynnikach kapsułkowania %EE nawet powyżej 90% co nie było do tej osiągnięte nawet dla liposomów obojętnych. Pozwala również na redukcję kroków syntetycznych i ładowanie emetyny podczas tworzenia się dwuwarstwy lipidowej.
W procesie tworzenia liposomów według wynalazku wykorzystano nowatorską kombinację lipidów kationowych 16:0 EPC i 14:0 EPC z lipidami obojętnymi, a także po raz pierwszy uzyskano syntezę liposomów kationowych ładowanych niskocząsteczkowym lekiem - emetyną o działaniu przeciwnowotworowym i przeciwwirusowym do wiązania i stabilizowania RNA.
Rozwiązania według wynalazków przedstawiono w poniższych przykładach wykonania i zilustrowane na rysunku FIG. 1 - FIG. 16.
W badaniach wykorzystano RNA, którego charakterystyka została podana w poniższej tabeli:
Symbol oligonukleotydu Sekwencja 5'->3' Czas retencji HPLC Rt [min] m/z ..... m/z Wydajność syntezy w jednostkach optycznych [OD] Ilość pg/l OD
RNAs 5'-UCGG GCU CUG GAG GAA AAG ATT-3' 22-nt 1236 (BI) 7117.4 7117.0 2 32.6
RNAas 5'-UCUU UUC CUC CAG AGC CCG ATT-3' 22-nt 12.04 (BI) 6848.1 6847.9 2 34.5
DNA4L FL-5'-TTT CTTTTC CTC CAG AGC CCGA-3' 22-nt 14.26 (B2) 7149.3 7149.2 10 34.2
RNA22S 5'-UCGG GCU CUG GAG GAA AAG AAA-3' 22-nt 12.5S (BI) 7167.4 7167.0 19 31.6
RNA-ml 5'-AUG CCCCUCAACGUU UUU CUU UUCCUC-3' 27-nt 11,82 (BI) 8341.9 8341,0 20 34.3
RNA-m2 5'-GAGG AGA CAU GGU GAA UUU CUU UUC CUC-3' 28-nt 11.76 (BI) 8917.4 8916.1 15 31.9
RNA 2'OMe (13bKBAC) 5'-2'OMe(AUG AAG GUU CAA UCUNGAU UUUJ-3' 21-nt 14.49 (BI) 6954.6 6954.2 5 32.2
PL 249473 Β1
W odrębnym badaniu wykorzystano również dupleks siRNA anty-EGFR. Nadekspresja EGFR w komórkach została powiązana ze złośliwością nowotworu, w tym jego inwazyjnością nowotworu, angiogenezą i występowaniem przerzutów (Nicholson Rl, Gee JM, Harper ME. EGFR and cancer prognosis. Eur J Cancer. 2001 ;374(suppl 4):9-15). Podwyższone poziomy EGFR stwierdza się w różnych typach guzów a nadekspresja EGFR została uznana za marker prognostyczny progresji nowotworu i lekooporności w chemioterapii. Dlatego EGFR został uznany za cel terapeutyczny w leczeniu raka.
Przykład I (seria I, liposom S10_5 z RNA-m2).
Odważono odpowiednie dla serii masy lipidów według tabeli 1 (liposom 4, kod układu S10_5) w ilości 10-cio krotnej tj. 0,95 mg DMPC, 3,42 mg DPPC, 4,15 mg 14:0 EPC, 1,88 mg DSPE-PEG-NH2 oraz 2,25 mg Cholesterolu. Następnie rozpuszczono w 5 ml mieszaniny chloroformu z metanolem o stosunku objętościowym 2:1. Mieszaninę lipidów pozostawiono do odparowania rozpuszczalników na wyparce próżniowej przyjmując następujące parametry: T = 40°C, p = 200 mbar, t = 3 h. Podczas procesu odparowania następował proces tworzenia się cienkiego filmu dwuwarstwy lipidowej. Warstwę dosuszono w suszarce próżniowej przyjmując następujące parametry: T = 40°C, p = 200 mbar, t = 1 h. Po całkowitym odparowaniu rozpuszczalników organicznych dodano 45 ml sterylnej soli fizjologicznej filtrowanej przez filtry strzykawkowe bpPVDF, 0.2 μΠΊ. Całość hydratowano na wyparce próżniowej w następujących warunkach: T = 60°C, p = 300 mbar, t = 5 h. Zhydratowane warstwy lipidowe pozostawiono do ostygnięcia, a następnie poddano procesowi sonifikacji zgodnie z parametrami: T = 60°C, t = 40 min, 50 Hz. Po tym czasie zaobserwowano zmianę zabarwienia roztworu z mlecznej na bezbarwną co świadczyło o utworzeniu się liposomów o małych rozmiarach (SUV - ang. smali unilameller vesicles). Następnie roztwór liposomów pozostawiono do ostygnięcia a ich rozmiar badano za pomocą metody dynamicznego rozproszenia światła DLS. Otrzymane liposomy podzielono i oczyszczono za pomocą dializy w membranach 10 kD za pomocą ultraczystej wody (system Milli-Q, filtr Biopak CDUFBI001 : RNase free, DNase-free, Pyrogen-free) przez 50 minut (4,5 ml próbki na 1 L wody) zmieniając wodę trzykrotnie po 20 min, 30 min oraz 40 min. Czystość otrzymanych liposomów mierzono za pomocą spektroskopii UV-Vis. Następnie mierzono potencjał Zeta i rozmiar za pomocą metody DLS oraz wykonywano charakterystykę składu za pomocą metody ATR IR. Wyniki pomiarów dla liposomów S10_5 oraz pozostałych liposomów z serii I przedstawiono w tabeli 2.
Tabela 1. Skład liposomów serii I wyrażony w stosunku molowym, masowym i stężeniu procentowym
Liposomy % wagowy fosfolipidów kationowych KOD '> układu — X DMPC DPPC 16:0 EPC 14:0 . ®EPC ' ; > ·, DSPE-PEG-NH2 Cholesterol .½ dspe-peg-fa: Emetyna
1 23,74 S9_5 Stosunek molowy
1,2 0,16 0,64 0 0,116 1 0 0
Stosunek masowy [mg]
0,473 0,068 0,297 0 0,188 0,225 0 0
Procent wagowy [%]
37,81 5,44 23,74 0,00 15,03 17,99 0,00 0,00
2 29,57 S9_6 ™ Stosunek molowy
o' 0,8. 0 1,2: 0,116 0 0
Stosunek masowy [mg] '
p 0,342 0 0,518 0,188 0,225 : 0 „ 0
Procent wagowy [%] ,
0,00 26,87 0,00 40,69 14,77 17,67 0,00 0,00
3 24,78 S10_4 Stosunek molowy
0,48 0,8 0 0,72 0,116 1 0 0
Stosunek masowy [mg]
0,189 0,342 0 0,311 0,188 0,225 0 0
Procent wagowy [%]
15,06 27,25 0,00 24,78 14,98 17,93 0,00 0,00
PL 249473 Β1
. 47 A i. u 32,81 519-5 , / : Stosunek molowy .
0,24 0,8 o 0,96 .·. 0,116 ::,7,/0/7)
Stosunek masowy [mg] y
0,095 0,342 7 (J 0.415 0,188 ; 0,225 ///7:· .0/7//): /770:7)/7
Procent wagowy [%]
27,04 .0,00 32,81 14,86 . y; )17)79.,- :.j 0,60 /): 0,00
5 40,69 S10_6 Stosunek molowy
0 0,8 0 1,2 0,116 1 0 0
Stosunek masowy [mg]
0 0,342 0 0,518 0,188 0,225 0 0
Procent wagowy [%]
0,00 26,87 0,00 40,69 14,77 17,67 0,00 0,00
6 > Ί 28,30 Sll_4 '· : . . ' ..Λ·,. .. . · · W - t stosunek wolowy · · ·. >
.0.72 0,48 ' 0,32 0,48 .·. 0,116 : )/)./)0 /)):' // 0 ./://
Stosunek masowy [mg] . · ·, ·' '·. .7=
0,284 0,205 0,149 0,207 0,188 0,225 u7:.Ó;i'))): y/ ))0//)/
. Procent wagowy [%] u
22,58 16,30 11,84 16,45 14,94 17,89 j; /)0,00/: )) 0,00
7 41,95 Sll_5 Stosunek molowy
0,48 0,32 0,48 0,72 0,116 1 0 0
Stosunek masowy [mg]
0,189 0,137 0,223 0,311 0,188 0,225 0 0
Procent wagowy [%]
14,85 10,76 17,52 24,43 14,77 17,67 0,00 0,00
8 55,28 Sll_6 , Stosunek molowy 1
0,24 0,16 0,64 0,96 : 0,116 1 0 0
11 Stosunek masowy [mg]
0,095 0,068 0,297 0,415 0,188 0,225 0 0
Procent wagowy [%]
7,38 5,28 23,06 32,22 14,60 17,47 0,00 0,00 . it '
Tabela 2. Parametry fizyczne liposomówz serii I wraz z odchyleniami standardowymi (SD)
Liposom KOD Układu Parametry Fizyczne
promień hydrodynamiczny [nm] SD {+/-) współczynnik polidyspersji (POI) SD{+/-) potencjał Zeta [mV] SD(+/)
1 S9 5 78,53 3,5 0,131 0,01 19,5 1,35
2 S9 6 81,1 2,08 0,13 0,007 41,93 1,58
3 S10_4 75,61 3,24 0,156 0,007 43,4 3,03
4 SIO. 5 98,48 1,71 0,087 0,015 42,1 2,86
5 S10_6 84,46 0,92 0,099 0,019 51,9 2,26
6 Sll_4 127,63 1,72 0,096 0,004 47,43 1,12
7 Sll_5 81,53 0,44 0,096 0,007 48,87 1,76
8 Sll_6 98,48 1,71 0,087 0,015 49,63 0,67
PL 249473 Β1
Do 0.75 ml liposomów S10_5 dodano 0,250 μΙ roztworu RNA-m2 (20 pig/ml) rozpuszczonego w ultraczystej wodzie (system Milli-Q, filtr Biopak CDUFBI001: RNase free, DNase-free, Pyrogen-free) dodatkowo sterylizowanej dwukrotnie w sterylizatorze medycznym. Całość szczelnie zamknięto, osłonięto od źródeł światła i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po okresie inkubacji mierzono rozmiar i potencjał zeta w celu wykluczenia agregacji liposomów oraz potwierdzenia wiązania RNA-m2 (potencjał zeta). Następnie dodano kolejny dodatek 0,250 pL roztworu RNA-m2, całość inkubowano kolejną godzinę i mierzono potencjał Zeta w celu ustalenia pojemności załadunku RNA-m2 przez liposomy.
Wyniki przedstawiono w tabelach 3 i 4. Tożsame eksperymenty wykonano dla pozostałych liposomów z serii I (tabela 1) a wyniki zamieszczono w tabelach 3 i 4. Dodatkowo wykonano pomiary rozmiaru układów po 5 dniach w celu zbadania stabilności liposomów. Wyniki zamieszczono w tabeli 5.
Tabela 3. Rozmiar (promień hydrodynamiczny, HR) i współczynnik polidyspersji (PDI) liposomów przed i po dodatku 5 pg RNA-m2 na 1 mg liposomów, po godzinie i po pięciu dniach wraz z odchyleniami standardowymi (SD)
l-P· KOD , Układu Przed dodatkiem RNA Po dodatku RNA 5 ug na 1 mg liposomów Po 5 dniach od dodatku RNA 5 ug na 1 mg liposomów
HR , [nm] SD (+/-) PDI SD (+/ ) HR (nm] SD (+ZB PDI SD 1+/·) HR [nm] SD [+/-) PDI SD (+/-)
1 S9_5 78,5 3,5 0,131 0,01 78 1,2 0,141 0,011 80,8 1,7 0,144 0,008
2 S9_6 81,1 2,1 0,13 0,007 82,4 0,8 0,116 0,007 80,8 1 0,126 0,012
3 S10_4 75,6 3,2 0,156 0,007 82,6 1,7 0,135 0,012 83,6 1,2 0,124 0,017
4 S10_5 98,5 1,7 0,087 0,015 106,1 1,7 0,128 0,006 136 1 0,11 0,008
5 S10 6 84,5 0,9 0,099 0,019 90 0,9 0,099 0,014 90,8 0,6 0,092 0,007
6 Sll_4 127,6 1,7 0,096 0,004 137 2,6 0,108 0,026 138,1 1,5 0,12 0,01
7 Sll_5 81,5 0,4 0,096 0,007 90,8 0,8 0,085 0,007 92,6 0,8 0,092 0,001
8 Sll_6 98,5 1,7 0,087 0,015 100,9 0,5 0,068 0,017 101,4 1,2 0,07 0,013
Brak istotnych zmian zarówno w rozmiarze jak i współczynniku polidyspersji świadczą o braku agregacji liposomów, czyli ich stabilności w obecności RNA-m2.
Tabela 4. Zmiany potencjału Zeta liposomów serii I po dodatku 5 pg i 10 pg RNA-m2 na 1 mg liposomów wraz z odchyleniami standardowymi (SD)
l.p. KOD Układ >> u . ?rzed;a»S dodatkiem RNA-m2 Po dodatku 5pg RNA-m2 na 1 mg liposomów 1 Po dodatku 10pg RN A-m 2 i 1“
Ą. n3 1 mg liposomow *
Zeta [mV] SD (+/) Zeta [mV] SD (+/-) ; Zmiana potencjału Zeta fmV] £ Zeta , [rrV] SD (+/-) Zmiana potencjału Zeta [mV]
1 S9_5 19,5 1,35 13,57 0,61 -5,93 20,5 0,62 +6,93
2 S9_6 41,93 1,58 25,9 1,56 -16,03 24,37 1,12 -1,53
3 S10_4 43,4 3,03 28,83 5,52 -14,57 20,6 0,96 -8,23
4 S10_5 42,1 2,86 38,27 0,67 -3,83 34,57 5,42 -3,7
5 S10_6 51,9 2,26 32,9 1,08 -19 25,93 1,12 -6,97
6 Sll_4 47,43 1,12 36,4 1,82 -11,03 30,87 1,76 -5,53
7 Sll_5 48,87 1,76 35,63 1,27 -13,23 29,43 0,9 -6,2
8 Sll_6 49,63 0,67 32,33 1,56 -17,3 29,57 1,67 -2,77
Spadek wartości potencjału Zeta liposomów świadczy o wiązaniu RNA-m2.
Przykład I zilustrowany został na rysunku Fig. 1 A-F.
Przykład II (seria II, liposom S10_3 z emetyną i RNA-m2).
mg chlorowodorku emetyny rozpuszczono w 1 ml zdejonizowanej wody, a następnie wytrącono miareczkując 0.2M roztworem NaOH. Całkowita objętość zużytego titranta wynosiła 1.5 ml. Osad odwirowano z prędkością 6000 RPM przez 20 minut i oddzielono od roztworu. Do roztworu znad osadu dodano 0,1 ml 0.2M NaOH w celu kontroli całkowitego wytrącenia formy emetyny. Ilość niewytrąconej emetyny zmierzono za pomocą spektroskopii UV-Vis względem krzywej kalibracyjnej w pH 12.4. Osad przemyto 5 krotnie wodą destylowaną, za każdy razem dyspergując za pomocą ultradźwięków, odwirowując i mierząc ilość niewytrąconej emetyny w roztworze znad osadu. Całkowita strata emetyny podczas procesu wynosiła 3 mg (10%). Osad dosuszono w suszarce próżniowej w temperaturze 30°C, pod ciśnieniem 100 mbar, przez 5 h i stosowano w dalszych krokach syntetycznych. Rozpuszczalność formy zdeprotonowanej w wodzie została wyznaczona na 1.79 mg/ml.
W celu przygotowania liposomów kationowych S10_3 odważono pięciokrotność odpowiednich dla serii II masy lipidów i emetyny (według tabeli 5) tj. 0,475 mg DMPC 0,34 mg DPPC, 1,49 mg 16:0 EPC, 2,08 mg 14:0 EPC, 0,94 mg DSPE-PEG-NH2, 1,13 mg cholesterolu oraz 0,03 mg emetyny, a następnie rozpuszczono w 2,5 ml mieszaniny chloroformu i metanolu o stosunku objętościowym 2:1. Mieszaninę lipidów pozostawiono do odparowania rozpuszczalników na wyparce próżniowej przyjmując następujące parametry: T = 35°C, p = 200 mbar, t = 4 h. Podczas procesu odparowania następował proces tworzenia się cienkiego filmu dwuwarstwy lipidowej. Warstwę dosuszono w suszarce próżniowej przyjmując następujące parametry: T = 35°C, p = 200 mbar, t = 1 h. Po całkowitym odparowaniu rozpuszczalników organicznych dodano 22,5 ml sterylnej soli fizjologicznej filtrowanej przez filtry strzykawkowe bpPVDF, 0.2 μm. Całość hydratowano na wyparce próżniowej w następujących warunkach: T = 50°C, p = 300 mbar, t = 6 h. Zhydratowane warstwy lipidowe pozostawiono do ostygnięcia a następnie poddano procesowi sonifikacji w temperaturze T = 60°C, w czasie t = 40 min i częstotliwości 50 Hz. Po tym czasie zaobserwowano zmianę zabarwienia roztworu z mlecznej na bezbarwną co świadczyło o utworzeniu się liposomów o małych rozmiarach (SUV - ang. small unilameller vesicles). Następnie roztwory pozostawiono do ostygnięcia a rozmiar liposomów zbadano za pomocą metody dynamicznego rozproszenia światła DLS. Ilość związanej emetyny kontrolowano za pomocą metody UV-Vis przy długości fali 280 nm. Otrzymane liposomy oczyszczono za pomocą dializy w membranach 10 kD za pomocą ultraczystej wody (system Milli-Q, filtr Biopak CDUFBI001: RNase free, DNase-free, Pyrogen-free) przez 50 minut (4,5 ml próbki, 1 I, zmieniając wodę trzykrotnie po 20 min, 30 min oraz 40 min. Czystość otrzymanych liposomów mierzono za pomocą spektroskopii UV-Vis. Następnie zmierzono potencjał Zeta i rozmiar za pomocą metody DLS oraz wykonywano charakterystykę składu za pomocą metody ATR IR. Stężenie otrzymanych liposomów wynosiło 0.29 mg/ml. W yniki pomiarów dla liposomów S10_3 oraz pozostałych liposomów z serii II przedstawiono w tabeli 6.
Do 0.75 ml liposomów S11_3 z serii II otrzymanych według powyższej procedury dodawano 0,250 μl roztworu RNA-m2 (20 μg/ml) rozpuszczonego w ultra czystej wodzie (system Milli-Q, filtr Biopak CDUFBI001: RNase free, DNase-free, Pyrogen-free) dodatkowo sterylizowanej dwukrotnie w sterylizatorze medycznym. Następnie całość szczelnie zamknięto, osłonięto od źródeł światła i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po okresie inkubacji mierzono rozmiar i potencjał zeta każdego z układów w celu wykluczenia agregacji liposomów oraz potwierdzenia wiązania RNA-m2 (potencjał Zeta). Następnie dodano kolejny dodatek 0,250 μl roztworu RNA-m2 (20 μg/ml), całość inkubowano kolejną godzinę i mierzono potencjał zeta w celu ustalenia pojemności załadunku RNA-m2 przez liposomy. Dodatkowo wykonano pomiary rozmiaru układów po 5 dniach w celu zbadania stabilności liposomów. Wyniki pomiarów dla układu S10_3 zamieszczono w tabelach 7 i 8. W tabelach zawarto również wyniki dla wszystkich liposomów z serii II.
PL 249473 Β1
Tabela 5. Skład liposomów serii II wyrażony w stosunku molowym, masowym i stężeniu procentowym
Lp % wagowy fosfolipidów kationowych KOD układu DMPC □PPC 16:0 EPC 14:0 : EPC ‘ DSPE-PEG-NH2 Cholesterol DSPE-PEG-FA Emetyna
1 23,63 S9_2 Stosunek molowy
1,2 0,16 0,64 0 0,116 1 0 0,0225
Stosunek masowy [mg]
0,473 0,068 0,297 0 0,188 0,225 0 0,006
Procent wagowy [%]
37,63 5,41 23,63 0,00 14,96 17,90 0,00 0,48
2 29,43 S9_3 Stosunek molowy
1,2 0 0,8 0 0,116 1 0 0,0225
Stosunek masowy [mg]
0,473 0 0,372 0 0,188 0,225 0 0,006
Procent wagowy [%]
37,42 0,00 29,43 0,00 14,87 17,80 : 0,00 0,47
3 24,66 S10_l Stosunek molowy
0,48 0,8 0 0,72 0,116 1 0 0,0225
Stosunek masowy [mg]
0,189 0,342 C 0,311 0,188 0,225 0 0,006
Procent wagowy [%]
14,99 27,12 0,00 24,66 14,91 17,84 0,00 0,48
4 32,65’ ii : li S1O_2 Stosunek molowy
DMPC DPPC 16:0 EPC 14:0 EPC DSPE-PĘG-NH2 Cholesterol DSPE-PEG-FA Emetyna :
0,24 0,8 0 0,96 0,116 . 1 0 0,0225
: Stosunek masowy [mg]
0,095 0,342 0 0,415 0,188 0,225 0 . 0,006
Procent wagowy [%] .
7,47 26,91 0,00 32,65 14,79 17,70 0,00 0,47
5 40,50 S103 Stosunek molowy
0 0,8 0 1,2 0,116 1 0 0,0225
Stosunek masowy [mg]
0 0,342 0 0,518 0,188 0,225 0 0,006
Procent wagowy [%]
0,00 26,74 0,00 40,50 14,70 17,59 0,00 0,47
& 28,16 ϋ $U_1 Stosunek molowy .;
0,72 0,48 0,32 0,48 : 0,116 : 1 .1 0 0,0225
Stosunek masowy [mg]
0,284 , .0,205 0,149 0,207 0,188 0,225 : 0 i 0,006
Procent wagowy [%]
22,47 16,22 11,79 16,38 14,87 17,80 0,00 : 0,47
PL 249473 Β1
7 41,75 Sll_2 Stosunek molowy
0,48 0,32 0,48 0,72 0,116 1 0 0,0225
Stosunek masowy [mg]
0,189 0,137 0,223 0,311 0,188 0,225 0 0,006
Procent wagowy [%]
14,78 10,71 17,44 24,32 14,70 17,59 0,00 0,47
8 i ' II a 55,02 • S1O -i· ,i । , : Stosunek molowy 1 ®'
0,24 ' 0,16 0,64 , 0,96 ·’ 0,116 ' 1 0 1. : 0,0225
Stosunek masowy [mg] ' ,A,t ' .s
0,095 0,068 0,297 0,415 : 0,188 0,225 ( , 0 0,006
Procent wagowy [%]·: :
7,34 ; 5,26 22,95 32,07 14,53 I 17,39 0,00 0,45
Tabela 6. Parametry fizyczne liposomów serii II wraz z odchyleniami standardowymi (SD)
Lp SF KOD Układu 0 i .,Parametry Fizyczne ’’ jg
ł [ promień hydrodynamiczny HR[nm] SD(+/-) a współczynnik polidyspersji SD (+Λ) Zeta[mV] SD (+/·)
1 S9_2 81,32 1,79 0,151 0,025 25,9 3,7
2 S9_3 80,5 2,9 0,164 0,019 23,07 0,31
3 S10_l 67,74 2,27 0,152 0,003 34,3 11,75
4 SIO 2 101,97 0,29 0,112 0,012 49,45 0,07
5 S10_3 96,04 0,74 0,063 0,005 40,73 1,42
6 Sll_l 81,54 1,11 0,108 0,013 49,57 2,17
7 Sll_2 110,63 0,55 0,09 0,014 45,57 2
8 Sll_3 125,6 3,32 0,073 0,02 50,1 2,09
Tabela 7. Rozmiar (promień hydrodynamiczny, HR) i współczynnik polidyspersji (PDI) liposomów przed i po dodatku 5 pg RNA-m2 na 1 mg liposomów, po godzinie i po pięciu dniach wraz z odchyleniami standardowymi (SD)
Lp. > KOD Układu Przed dodatkiem RNA-m2 Po dodatku RMA-m2 5 ug na 1 mg liposomów Po 5 dn m2 5 u ach od dodatku RNAg na 1 mg liposomów
1 HR [nm] SD (+/·) PDI SD (+/-) HR [nm] SD . . (+/-) PDI1 SD [+/-) HR [nm] SD (+/-) PDI SD (+/-)
1 S9_2 81,3 1,8 0,151 0,025 85,9 1 0,119 0,008 85,7 1,8 0,098 0,004
2 S9_3 80,5 2,9 0,164 0,019 77,8 2,6 0,17 0,006 78 0,8 0,163 0,006
3 S10_l 67,7 2,3 0,152 0,003 76 0,8 0,125 0,01 77,3 0,4 0,126 0,007
4 SIO 2 102 0,3 0,112 0,012 102,6 2,3 0,091 0,012 101,2 1 0,083 0,003
5 S10 3 96 0,7 0,063 0,005 105,5 1,4 0,08 0,016 107,1 0,5 0,076 0,004
6 Sll_l 81,5 1,1 0,108 0,013 91 0,8 0,104 0,015 90,7 1 0,074 0,013
7 Sll_2 110,6 0,6 0,09 0,014 129,6 0,9 0,107 0,005 126,3 0,8 0,086 0,003
8 SI 13 125,6 3,3 0,073 0,02 144,1 0,8 0,071 0,007 143,2 2,8 0,075 0,027
PL 249473 Β1
Brak istotnych zmian zarówno w rozmiarze jak i współczynniku polidyspersji świadczą o braku agregacji liposomów, czyli ich stabilności w obecności RNA-m2.
Tabela 8. Zmiany potencjału Zeta liposomów po dodatku 5 pg i 10 pg RNA-m2
Liposom KOD Układ u Przed dodatkiem RNA-m2 Po dodatku 5pgRNA-m2 na 1 mg liposomów „ Po dodatku lOpg RNA-m2 na 1 mg liposomów
Zeta ' lmVj SD (+M Zeta [mV] SD (+/-) Zmianaji potencjału Zeta [mV] Zeta lmV] fii· SD (+/-) । Zmiana .. potencjału Zeta [mV]’4
1 S9_2 25,9 3,7 12,83 1,04 -13,07 24,57 1,7 +11,73
2 S9_3 23,07 0,31 11,4 1,08 -11,67 20,47 0,9 -9,07
3 S10_ 1 34,3 11,75 22,55 2,05 -11,75 22,35 0,78 -0,2
4 S10_ 2 49,45 0,07 38,53 0,9 -10,92 27,23 14 -11,3
5 S10_ 3 40,73 1,42 37,43 2,27 -3,3 36,17 0,35 -1,27
6 Sll_ 1 49,57 2,17 30,63 3,91 -18,93 30,53 2,05 -0,1
7 Sll_ 2 45,57 2 34,97 2,53 -10,6 26,9 1,49 -8,07
8 Sll_ 3 50,1 2,09 36,1 2 -14 31,03 1,16 -5,07
9 Sll_ 6 49,63 0,67 32,33 1,56 -17,3 29,57 1,67 -2,77
Przykład II zilustrowany został na rysunku Fig. 2 A-F
Przykład III (Seria III, liposomy S18_2 z RNA-m2, Emetyną i czynnikiem naprowadzającym kwasem foliowym - FA).
mg chlorowodorku emetyny rozpuszczono w 1 ml zdejonizowanej wody, a następnie wytrącono miareczkując 0.2M roztworem NaOH. Całkowita objętość zużytego titranta wynosiła 1.5 ml. Osad odwirowano z prędkością 6000 RPM przez 20 minut i oddzielono od roztworu. Do roztworu znad osadu dodano 0,1 ml 0.2M NaOH w celu kontroli całkowitego wytrącenia formy emetyny. Ilość niewytrąconej emetyny zmierzono za pomocą spektroskopii UV-Vis względem krzywej kalibracyjnej w pH 12.4. Osad przemyto 5 krotnie wodą destylowaną, za każdy razem dyspergując za pomocą ultradźwięków, odwirowując i mierząc ilość niewytrąconej emetyny w roztworze znad osadu. Całkowita strata emetyny podczas procesu wynosiła 3 mg (10%). Osad dosuszono w suszarce próżniowej w temperaturze 30°C, pod ciśnieniem 100 mbar, przez 5 h i stosowano w dalszych krokach syntetycznych. Rozpuszczalność formy zdeprotonowanej w wodzie została wyznaczona na 1.79 mg/ml.
W celu przygotowania liposomów kationowych S18_2 odważono pięciokrotność odpowiednich dla serii III masy lipidów i emetyny (według tabeli 11) tj. 0,48 mg DMPC, 2,38 mg DPPC, 2,08 14:0 EPC, 0,94 mg DSPE-PEG-NH2,1,13 mg cholesterolu, 0,095 mg DSPE-PEG-FA oraz 0,03 mg emetyny, a następnie rozpuszczono w 2,5 ml mieszaniny chloroformu i metanolu o stosunku objętościowym 2:1. Mieszaninę lipidów pozostawiono do odparowania rozpuszczalników na wyparce próżniowej przyjmując następujące parametry: T = 35°C, p = 200 mbar, t = 4 h. Podczas procesu odparowania następował proces tworzenia się cienkiego filmu dwuwarstwy lipidowej. Warstwę dosuszono w suszarce próżniowej przyjmując następujące parametry: T = 40°C, p = 200 mbar, t = 1 h. Po całkowitym odparowaniu rozpuszczalników organicznych dodano 22,5 ml sterylnej soli fizjologicznej filtrowanej przez filtry strzykawkowe bpPVDF, 0.2 μπι. Całość hydratowano na wyparce próżniowej w następujących warunkach: T = 50°C, p = 300 mbar, t = 6 h. Zhydratowane warstwy lipidowe pozostawiono do ostygnięcia a następnie poddano procesowi sonifikacji w temperaturze T = 60°C, w czasie t = 40 min i częstotliwości
PL 249473 Β1
Hz. Po tym czasie zaobserwowano zmianę zabarwienia roztworu z mlecznej na bezbarwną co świadczyło o utworzeniu się liposomów o małych rozmiarach (SUV - ang. smali unilamellervesicles). Następnie roztwory pozostawiono do ostygnięcia a rozmiar liposomów zbadano za pomocą metody dynamicznego rozproszenia światła DLS. Ilość związanej emetyny kontrolowano za pomocą metody UV-Vis przy długości fali 280 nm. Otrzymane liposomy oczyszczono za pomocą dializy w membranach 10 kD za pomocą ultraczystej wody (system Milli-Q, filtr Biopak CDUFBI001: RNase free, DNase-free, Pyrogen-free) przez 50 minut (4,5 ml próbki, 1 I), zmieniając wodę trzykrotnie po 20 min, 30 min oraz 40 min. Czystość otrzymanych liposomów mierzono za pomocą spektroskopii UV-Vis. Następnie zmierzono potencjał Zeta i rozmiar za pomocą metody DLS oraz wykonywano charakterystykę składu za pomocą metody ATR IR. Stężenie otrzymanych liposomów wynosiło 0.28 mg/ml. Wyniki pomiarów dla liposomów S18_2 oraz pozostałych liposomów z serii III przedstawiono w tabeli 10.
Tabela 9. Skład liposomów serii III wyrażony w stosunku molowym, masowym i stężeniu procentowym
Liposomy % wagowy fosfolipidów kationowych KOD układu DIMPC DPPC 16:0 EPC · 14:0 EPC DSPE-PEG-NH2 Cholesterol· 4 DSPE-PEG-FA : W / Emetyna j
1 23,28 S17_2 Stosunek molowy
1,2 0,16 0,64 0 0,116 1 0,01 0,0225
Stosunek masowy [mg]
0,473 0,068 0,297 0 0,188 0,225 0,019 0,006
Procent wagowy [%]
37,63 5,41 23,63 0,00 14,96 17,90 1,51 0,48
Ϊ i1 '! 2 28,99 S17„3 • Stosunek molowy , , :
1,2 0 0,8 0 * 0,116 ίί 1 ο,οι . '0,0225
^Stosunek masowy [mg]—
0,473 id’ 0„ 0,372 ' 0 0,188 ’ 0,225 0,019 J· 0,006
i·'. Procent wagowy [%l
37,42 0,00 29,43 0,00 :14,87 • 17,80 1,50 : 0,47
3 24,30 S18_l Stosunek molowy
0,48 0,8 0 0,72 0,116 1 0,01 0,0225
Stosunek masowy [mg]
0,189 0,342 0 0,311 0,188 0,225 0,019 0,006
Procent wagowy [%]
14,99 27,12 0,00 24,66 14,91 17,84 1,51 0,48
4 32,17 ai , S18_2 Stosunek molowy
0,24 0,8 0 0,96 0,116 1 0,01 0,0225
» r . : stosunek masowy [mg] > [
0,095 0,342 0 0,415 0,188 : -W· ' 0,019 i 0;006
0,225
Procent wagowy [%] 1 i
. 7,47 26,91 0,00 32,65 14,79 - 17,70 1,49 0,47
5 39,91 S18_3 Stosunek molowy
0 0,8 0 1,2 0,116 1 0,01 0,0225
Stosunek masowy [mg]
0 0,342 0 0,518 0,188 0,225 0,019 0,006
Procent wagowy [%]
0,00 26,74 0,00 40,50 14,70 17,59 1,49 0,47
PL 249473 Β1
6 27,75 S19_l Stosunek molowy
0,72 0,48 0,32' 0,48 0,116 1 :. · o,oi i 0,0225
Stosunek masowy [mg]
0,284 0,205 0,149 0,207 0,188 0,225 0,019 0,006
Procent wagowy [%]
22/17 16,22 ' 11,79 16,38 14,87 17,80 1,50 0,47
7 41,14 S19_2 Stosunek molowy
0,48 0,32 0,48 0,72 0,116 1 0,01 0,0225
Stosunek masowy [mg]
0,189 0,137 0,223 0,311 0,188 0,225 0,019 0,006
Procent wagowy [%]
14,78 10,71 17,44 24,32 14,70 17,59 1,49 0,47
8 . 54,23 'S19_3 « Stosunek molowy
, 0,24 0,16 0,64 0,96 ‘ . o,H6 1 i 0,01 0,0225
Stosunek masowy [mg] 1
0,095 0,068 0,297 0,415 0,188 0,225 0,019 1 0,006
Procent wagowy {%]
7,34 5,26 22,95 32,07 14,53 17,39 1,47 0,46
Tabela 10. Parametry fizyczne liposomów serii III wraz z odchyleniami standardowymi (SD)
L.p. KOD Układu Parametr)) Fizyczne
n promień di hydrodynamiczny [nm] SD (+/-) ’ współczynnik polidyspersji PDI 4 SD {+/-) Potencjał Zeta [mV] SD (+/-)
1 S17_2 154,83 0,91 0,158 0,013 28,13 1,8
2 S17_3 93,69 1,48 0,107 0,009 34,9 0,62
3 S18_l 83,31 1,2 0,134 0,01 37 0,75
4 S18 2 97,55 0,85 0,08 0,019 44,1 1,68
5 S18 3 84,57 1,36 0,093 0,02 54,93 2,11
6 S19_l 86,19 5,38 0,16 0,019 39,4 0,85
7 S19_2 88,34 5,13 0,157 0,006 39,9 3,63
8 S193 103,03 0,98 0,118 0,025 50,3 4,54
Do 0.75 ml liposomów S18_2 z serii III otrzymanych według powyższej procedury dodawano 0,250 μΙ roztworu RNA-m2 (20 μg/ml) rozpuszczonego w ultraczystej wodzie (system Milli-Q, filtr Biopak CDUFBI001: RNase free, DNase-free, Pyrogen-free) dodatkowo sterylizowanej dwukrotnie w sterylizatorze medycznym. Następnie całość szczelnie zamknięto, osłonięto od źródeł światła i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po okresie inkubacji zmierzono rozmiar i potencjał zeta każdego z układów w celu wykluczenia agregacji liposomów oraz potwierdzenia wiązania RNA-m2 (potencjał Zeta). Następnie dodano kolejny dodatek 0,250 μΙ roztworu RNA-m2 (20 μg/ml), całość inkubowano kolejną godzinę i mierzono potencjał zeta w celu ustalenia pojemności załadunku RNA-m2 przez liposomy. Dodatkowo wykonano pomiary rozmiaru układów po 5 dniach w celu zbadania stabilności liposomów. Wyniki pomiarów dla układu S18_2 zamieszczono w tabelach 11 i 12. W tabelach zawarto również wyniki dla wszystkich liposomów z serii III.
PL 249473 Β1
Tabela 11. Rozmiar (promień hydrodynamiczny, HR) i współczynnik polidyspersji (PDI) liposomów serii III przed i po dodatku 5 pg RNA-m2 na 1 mg liposomów, po godzinie i po pięciu dniach wraz z odchyleniami standardowymi (SD)
Lipósóm KOW Układu Iii Ϊ r: I [lii 1 [ 1' j i 3 Przed dodatkiem RNA a 1 II 11 L ..... * 1 l L t ' Po dodatku RNA-m2 S ug na 1 mg liposomów Po 5 dniach od dodatku RNA- ' '· ' _ . ..' Mi·· ' m2 5 ug na 1 mg hposomow
1 t HR [nm] SD '· (+/-) PDI SD “ (+/-) HR [nm] SD (+/’) PDI SD (+/-) HR [nm] SD (+/-) PDI SD W
1 S17_2 154,8 0,9 0,158 0,013 148,6 1,4 0,205 0,012 191,8 4 0,205 0,008
2 S17_3 93,7 1,5 0,107 0,009 94,5 0,1 0,082 0,017 102,5 1,4 0,089 0,014
3 S18_l 83,3 1,2 0,134 0,01 90,6 0,5 0,126 0,004 101,2 1 0,115 0,007
4 S18_2 97,6 0,8 0,08 0,019 87,8 0,5 0,13 0,011 97,7 2,3 0,121 0,005
5 S18.3 84,6 1,4 0,093 0,02 91 0,9 0,095 0,006 96 3,1 0,104 0,02
6 S19JL 86,2 5,4 0,16 0,019 94 0,7 0,099 0,011 102,8 1,1 0,08 0,011
7 S19_2 88,3 5,1 0,157 0,006 90 0,3 0,086 0,007 100,8 0,4 0,088 0,016
8 S19_3 103 1 0,118 0,025 106,9 0,3 0,079 0,027 116,6 0,8 0,066 0,01
Brak istotnych zmian zarówno w rozmiarze jak i współczynniku polidyspersji świadczą o braku agregacji liposomów, czyli ich stabilności w obecności RNA-m2.
Tabela 12. Zmiany potencjału Zeta liposomów serii III po dodatku 5 pg i 10 pg RNA-m2 wraz z odchyleniami standardowymi (SD)
J-P ! , KOD Układu Priecl dodatkiem RNA-m2 J U OB.. Lito....... Po dodatku Spg RNA-m2 na 1 mg liposomów ......Tl: M Po dodatku 10pg RNA-m2 na -1* i* i mg liposomów
Potencjał Zeta [mV] SD (+/-) Potencjał Zeta [mV] SD (+/-) Zmiana potencjału Zeta,[mVj- A a Zeta [mV] Śi-···’- SD (+/-) Zmiana potencjału Zeta [rrV]
1 S17_2 28,13 1,8 24,07 0,47 -4,07 21,37 2,25 -2,7
2 S17_3 34,9 0,62 21,77 0,91 -13,13 20,37 2,97 -1,4
3 S18_l 37 0,75 28,77 1,12 -8,23 24,07 0,61 -4,7
4 S18_2 44,1 1,68 37,83 0,55 -6,27 30,83 2,17 -7
5 S18_3 54,93 2,11 42,7 0,82 -12,23 30,1 1,54 -12,6
6 S19_l 39,4 0,85 35,73 1,27 -3,67 25,3 2,97 -10,43
7 S19_2 39,9 3,63 35,6 0,8 -4,3 27,97 2,06 -7,63
8 S19_3 50,3 4,54 47,57 0,49 -2,73 35 0,62 -12,57
Przykład III zilustrowany został na rysunku Fig. 3 A-L
Przykład IV (seria IV, liposom S17_4 z RNA i czynnikiem naprowadzającym kwasem foliowym FA, bez emetyny).
W celu przygotowania liposomów kationowych S17_2 odważono odpowiednie masy lipidów według tabeli 15, tj. 0,473 mg DMPC, 0,137 mg DPPC, 0,233 mg 16:0 EPC, 0,188 mg DSPE-PEG-NH2, 0,225 mg cholesterolu oraz 0,019 mg DSPE-PEG-NH2, a następnie rozpuszczono w 0.5 ml mieszaniny chloroformu z metanolem o stosunku objętościowym 2:1. Mieszaninę lipidów pozostawiono do odparowania rozpuszczalników w czasie t = 3 h w suszarce próżniowej w temperaturze T = 25°C, przy ciśnieniu p = 100 mbar. Podczas procesu odparowania następował proces tworzenia się cienkiego filmu dwuwarstwy lipidowej. Po całkowitym odparowaniu rozpuszczalników organicznych dodano 4.5 ml sterylnej soli fizjologicznej filtrowanej przez filtry strzykawkowe bpPVDF, 0.2 μΠΊ. Całość szczelnie zamknięto i zabezpieczono parafilmem, a następnie hydratowano w suszarce próżniowej: T = 50°C, p = 200 mbar,
PL 249473 Β1 t = 10 h. Zhydratowane warstwy lipidowe pozostawiono do ostygnięcia a następnie poddano procesowi sonifikacji zgodnie z parametrami: T = 65°C, t = 30 min, 50 Hz. Po tym czasie zaobserwowano zmianę zabarwienia roztworu z mlecznej na bezbarwną co świadczyło o utworzeniu się liposomów o małych rozmiarach (SUV - ang. smali unilameller vesicles). Następnie roztwory pozostawiono do ostygnięcia, a rozmiar liposomów zbadano za pomocą metody dynamicznego rozproszenia światła DLS. Otrzymane liposomy oczyszczono za pomocą dializy w membranach 10 kD za pomocą ultraczystej wody (system Milli-Q, filtr Biopak CDUFBI001: RNase free, DNase-free, Pyrogen-free) przez 40 minut (4,5 ml próbki na 1 I wody), zmieniając wodę trzykrotnie zmieniana po 10 min, 20 min i 30 minutach. Czystość otrzymanych liposomów mierzono za pomocą spektroskopii UV-Vis. Następnie mierzono potencjał Zeta i rozmiar za pomocą metody DLS oraz wykonywano charakterystykę składu za pomocą metody ATR IR. Wyniki pomiarów przedstawiono w tabeli 14.
Tabela 13. Skład liposomów serii IV wyrażony w stosunku molowym, masowym i stężeniu procentowym
Lp. % wagowy fosfolipidów kationowych KOD układu DMPC DPPC 16:0 EPC 14:0 EPC h DSPE-PEGNH2 Cholesterol DSPE-PEG-FA Emetyna
1 17,63 S17_4 Stosunek molowy
1,2 0,32 0,48 0 0,116 1 0,01 0
Stosunek masowy [mg]
0,473 0,137 0,223 0 0,188 0,225 0,019 0
Procent wagowy [%]
37,96 11,00 17,90 0,00 15,09 18,06 1,52 0,00
i 2: 23,39 ' $17 5 Stosunek molowy
1,2 0,16 0,64 0 0,116 1 0,01 0
Stosunek masowy [mg]
. 0,473 0,068 0,297 0 0,188 0,225 : 0,019 0
Procent wagowy [%]
37,81 5,44 23,74 0,00 15,03 17,99 1,52 0,00
3 29,13 S17_6 Stosunek molowy
1,2 0 0,8 0 0,116 1 0,01 0
Stosunek masowy [mg]
0,473 0 0,372 0 0,188 0,225 0,019 0
Procent wagowy [%]
37,60 0,00 29,57 0,00 14,94 17,89 1,51 0,00
4 24,41 S18_4 Stosunek molowy
0,48 0,8 0 0,72 . 0,116 1 0,01 0
Stosunek masowy [mg]
. 0,189 . 0,342 ..0 0,311 0,188 0,225 0,019 0
Procent wagowy [%
15,06 27,25 0,00 24,78 14,98 17,93 ‘ 1,51 0,00
5 32,32 518_5 Stosunek molowy
0,24 0,8 0 0,96 0,116 1 0,01 G
Stosunek masowy [mg|
0,095 0,342 0 0,415 0,188 0,225 0,019 0
Procent wagowy [%]
7,51 27,04 0,00 32,81 14,86 17,79 1,50 0,00
6 :40,09 S18_5 Stosunek molowy
0 0,8 0 1,2 0,116 1 0,01
Stosunek masowy [mg|
0 0,342 0 0,518 0,188 0,225 0,019 0
Procent wagowy [%]
: 0,00 26,87 0*00 40,69 14,77 17,67 : 1,49 0,00
PL 249473 Β1
7 27,88 S19_4 S19_5 Stosunek molowy
0,72 0,48 0,32 0,48 0,116 1 | 0,01 0
Stosunek masowy [mg]
0,284 0,205 0,149 0,207 0,188 0,225 | 0,019 0
Procent wagowy [%]
22,58 16,30 11,84 16,45 14,94 17,89 | 1,51 0,00
8 .41,33 Stosunek molowy
0,48 0,32 0,48 0,72 0,116 1 1 0,01 0
Stosunek masowy [mg] t _
0,189 0,137 0,223 0,311 0,188 . 0,225 j 0,019 0
Procent wagowy [%] .
14,85 10,76 17,52 24,43 14,77 17;67 1' ' 1,49 0,00
9 54,48 S19_6 Stosunek molowy
0,24 0,16 0,64 0,96 0,116 1 | 0,01 0
Stosunek masowy [mg|
0,095 0,068 0,297 0,415 0,188 0,225 | 0,019 0
Procent wagowy [%]
7,38 5,28 23,06 32,22 14,60 17,47 | 1,48 0,00
Tabela 14. Parametry fizyczne liposomów serii IV wraz z odchyleniami standardowymi (SD)
Lp KOD Układu Parametry Fizyczne s
Promień hydrodynamiczny [nm] iSfjr s 0(+/-) współczynnik poiidyspersji PDI SD (+/-) Potencjał Zeta [mV] SD (+/-)
1 S17_4 82,8 2,34 0,173 0,008 36,67 1,24
2 S17_5 86,14 0,21 0,14 0,009 36,93 4,89
3 S17_6 105,64 8,03 0,212 0,026 47,97 0,58
4 S184 157,27 4,41 0,159 0,027 47,67 1,31
5 S18 5 99,73 0,77 0,107 0,01 49,27 1,45
6 S18_6 79,54 5,22 0,17 0,017 50,9 1,86
7 S19_4 103,03 0,98 0,118 0,025 46,4 2,23
8 S19_5 97,8 4,17 0,163 0,013 50,73 3,63
9 S19_6 124,33 2,93 0,137 0,008 56,07 2,16
Do 0.75 ml liposomów S17_4 z serii IV otrzymanych według powyższej procedury dodawano 0,250 μΙ roztworu RNA-m2 (20 μg/ml) rozpuszczonego w ultra czystej wodzie (system Milli-Q, filtr Biopak CDUFBI001: RNase free, DNase-free, Pyrogen-free) dodatkowo sterylizowanej dwukrotnie w sterylizatorze medycznym. Następnie całość szczelnie zamknięto, osłonięto od źródeł światła i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po okresie inkubacji mierzono rozmiar i potencjał zeta każdego z układów w celu wykluczenia agregacji liposomów oraz potwierdzenia wiązania RNA-m2 (potencjał Zeta). Następnie dodano kolejny dodatek 0,250 μΙ roztworu RNA-m2 (20 μg/ml), całość inkubowano kolejną godzinę i mierzono potencjał zeta w celu ustalenia pojemności załadunku RNA-m2 przez liposomy. Dodatkowo wykonano pomiary rozmiaru układów po 5 dniach w celu zbadania stabilności liposomów. Wyniki pomiarów dla układu S17_4 zamieszczono w tabelach 15 i 16. W tabelach zawarto również wyniki dla wszystkich liposomów z serii IV.
PL 249473 Β1
Tabela 15. Rozmiar (promień hydrodynamiczny, HR) i współczynnik polidyspersji (PDI) liposomów serii IV przed i po dodatku 5 pg RNA-m2 na 1 mg liposomów, po godzinie i po pięciu dniach wraz z odchyleniami standardowymi (SD)
l.p. KOD Układu Przed dodatkiem RNA-m2 1 Po dodatku RNA-m2 5 ug na 1 mg liposomów Po 5 dniach od dodatku RNAm2 5 ug na 1 mg liposomów
ΐ HR (nm] SD’ (+/-) PDI £ SD (+/-) HR: [nm]* SD (+/-) . PDI i SD : (+/) : HR [nm] SD <+/-) PDI SD:··.. ¢+/-)
1 S17_4 82,8 2,3 0,173 0,008 77,7 0,7 0,159 0,007 90,1 2,7 0,151 0,01
2 S17_5 86,1 0,2 0,14 0,009 88,5 0,8 0,109 0,015 98,4 1,9 0,099 0,013
3 S17 6 105,6 8 0,212 0,026 110 1 0,124 0,007 127,5 1,7 0,13 0,006
4 S18_4 157,3 4,4 0,159 0,027 172,6 1 0,223 0,016 227,4 6,2 0,234 0,004
5 S185 99,7 0,8 0,107 0,01 104,6 0,9 0,091 0,019 116,5 1,9 0,089 0,012
6 S18_6 79,5 5,2 0,17 0,017 94,2 0,5 0,095 0,011 103,8 1 0,074 0,01
7 S19_4 103 1 0,118 0,025 104,3 0,2 0,125 0,006 117,7 1,4 0,128 0,012
8 S195 97,8 4,2 0,163 0,013 105,3 0,3 0,085 0,007 117,7 2,9 0,096 0,017
9 S19_6 124,3 2,9 0,137 0,008 141,5 0,8 0,085 0,029 152,4 1 0,077 0,023
Brak istotnych zmian zarówno w rozmiarze jak i współczynniku polidyspersji świadczą o braku agregacji liposomów, czyli ich stabilności w obecności RNA-m2.
Tabela 16. Zmiany potencjału Zeta liposomów serii IV po dodatku 5 pg i 10 pg RNA-m2 wraz z odchyleniami standardowymi
L P· KOD Układu Przed ·!«, dodatkiem · ' RNA-m2 Po dodatku 5pg RNA-ri2 na 1 i mg liposomów 1 Po dodatku 10pg RNA-m2 na 1 1mg łiposomow
7eta [mV] SD (+/^ Zeta [mV] SD (+/-) Zmiana t . < .. potencjału Zeta [mV] ~ Zeta [mV] SD (+Λ) Zmiana potencjału Zeta [mV|
1 S17 4 36,67 1,24 27 0,42 -9,67 27,37 1,75 +0,37
2 S17_5 36,93 4,89 29,13 0,32 -7,8 26,17 3,04 -2,97
3 S176 47,97 0,58 37,53 1,19 -10,43 31,03 2,35 -6,5
4 S18_4 47,67 1,31 42,2 1,92 -5,47 33,23 0,86 -8,97
5 S18_5 49,27 1,45 44,27 2,47 -5 31,1 1,78 -13,17
6 S18_6 50,9 1,86 48,9 1,51 -2 33 3,86 -15,9
7 S19_4 46,4 2,23 40,6 0,66 -5,8 33,37 1,43 -7,23
8 S19_5 50,73 3,63 44,37 2,6 -6,37 38,67 3,15 -5,7
9 S19_6 56,07 2,16 44,3 0,26 -11,77 32,8 1,82 -11,5
Przykład IV zilustrowany został na rysunku Fig. 4A-F
Przykład V Wyznaczanie maksymalnego współczynnika kapsułkowania (%EE) dla liposomów z serii II (przykład 2) oraz III (przykład 3).
Współczynnik kapsułkowania %EE, definiowany jako ilość leku związanego w liposomie do całkowitej ilości leku, wyrażony w procentach został wyznaczony dla liposomów z Tabeli 1 oraz Tabeli 5 ładowanych emetyną za pomocą spektroskopii UV-Vis. Wartości współczynników %EE dla wszystkich układów przekraczają 90%.
Dodatkowo dla dokładniejszego wyznaczenia współczynnika kapsułkowania wykonano liposomy ze wzrastającą ilością emetyny w zakresie stężeń początkowych emetyny od 6,5 μΜ do 51,7 μΜ dla
PL 249473 Β1 układów niemodyfikowanych czynnikiem naprowadzającym (tabela 17) oraz modyfikowanych czynnikiem naprowadzającym (tabela 18). Parametry fizykochemiczne wraz ze współczynnikami kapsułkowania przedstawiono w tabeli 19. Zależność współczynnika kapsułkowania od wyjściowego stężenia emetyny dla układów z tabeli 17 i 18 przedstawiono na wykresie Fig. 5B.
Tabela 17. Stosunek molowy i masowy liposomów niemodyfikowanych czynnikiem naprowadzającym kwasem foliowym (FA) z różną wyjściową zawartością emetyny
KOD układu Stosunek molowy DPPC DPPC [mg] Stosunek molowy DSPEPEG-NH2 DSPEPEGJMH2 [mg] Stosunek molowy Cholesterol Cholesterol [mg] Stosunek molowy DMPC DMPC [mg] Stosunek molowy 14:0 EPC 14:0 EPC [mg] Stosunek molowy Emetyna Emetyna [mg]
1520 0,8 0,342 0,116 0,188 1 0,225 0,24 0,020 0,96 0,415 0,05 0,014
2520 0,8 0,342 0,116 0,188 1 0,225 0,24 0,039 0,96 0,415 0,1 0,028
3520 0,8 0,342 0,116 0,188 1 0,225 0,24 0,079 0,96 0,415 0,2 0,056
4520 0,8 0,342 0,116 0,188 1 0,225 0,24 0,118 0,96 0,415 0,3 0,084
5520 0,8 0,342 0,116 0,188 1 0,225 0,24 0,158 0,96 0,415 0,4 0,112
Tabela 18. Stosunek molowy i masowy liposomów modyfikowanych czynnikiem naprowadzającym kwasem foliowym (FA) z różną wyjściową zawartością emetyny
KOD układu Stosunek molowy DPPC DPPC [mg] Stosunek molowy DSPEPEG-NH2 DSPL· PEGJS1H 2 [mg] Stosunek molowy Cholesterol Cholesterol [mg] Stosunek molowy DMPC DMPC [mg] Stosunek molowy 14:0 EPC 14:0 EPC [mg] Stosunek molowy Emetyna Emetyna [mg] Stosunek molowy DSPE-PEGFA DSPE -PEGFA [mg]
1521 0,8 0,342 0,116 0,188 1 0,225 0,24 0,020 0,96 0,415 0,05 0,014 0,01 0,019
2521 0,8 0,342 0,116 0,188 1 0,225 0,24 0,039 0,96 0,415 0,1 0,028 0,01 0,019
3521 0,8 0,342 0,116 0,188 1 0,225 0,24 0,079 0,96 0,415 0,2 0,056 0,01 0,019
4521 0,8 0,342 0,116 0,188 1 0,225 0,24 0,118 0,96 0,415 0,3 0,084 0,01 0,019
5521 0,8 0,342 0,116 0,188 1 0,225 0,24 0,158 0,96 0,415 0,4 0,112 0,01 0,019
Tabela 19. Parametry fizykochemiczne liposomów z różną masą wyjściową emetyny wraz z odchyleniami standardowymi (SD)
KOD układu k}“UlrN - .....-uq..ąirJ4iS4iA->··-· Rozmiar 5 T 1 . WMIIr.4tlkj> .· r o ........ JA. .3 ,,f%. ΙΓΜ Λ···.· v·*r..<·r.*r.mn SD łśrBii ·. ............... ·. ......... ' 11 ... '< .........i 1,1· ·.. PDI . SD • 1 «>· %EE ? ............frWfóJi#! : ..ΐΐΜΐη'- . '· . - · IK'1 »i» ’ ’ μ. ** .'Γ , «Α γ.··» . ft* SD f - ' AJĄ 1. , _ , 1“ ffl ' . Γ τ.»
1S20 114,93 1,1 0,23 0,003 75,87 2,57
2S20 140,43 0,4 0,16 0,008 77,7 6,52
3S20 143,4 3,7 0,14 0,009 69,08 7,14
4S20 95,95 0,62 0,07 0,007 77,75 5,47
PL 249473 Β1
5S20 143,83 1,59 0,18 0,011 23,27 7,04
1S21 113,3 2,04 0,07 0,021 97 5,16
2S21 111 4,9 0,22 0,005 86,37 3,22
3S21 89,67 0,2 0,11 0,014 95,72 8,87
4S21 84,75 1,13 0,1 0,012 82,32 7,74
5521 102,3 1,64 0,09 0,008 54,05 4,83
Przykład V zilustrowany został na rysunku Fig. 5A-B
Przykład VI (profil uwalniania emetyny z liposomów S21_4 bez oraz w obecności RNA-m2).
Membranę dializacyjną 25 kD kondycjonowano kolejno w: ultraczystej wodzie (system Milli-Q, filtr Biopak CDUFBI001: RNase free, DNase-free, Pyrogen-free) przez 20 minut i buforze Brittona Robinsona o odpowiednim pH kolejne 20 minut. Następnie w membranie umieszczano 1 ml roztworu liposomów zawierających emetynę oraz 1 ml buforu o odpowiednim pH. Membranę szczelnie zamknięto i umieszczono w butelce szklanej z korkiem o pojemności 100 ml zawierającej bufor o pH identycznym z pH wewnątrz membrany dializacyjnej oraz element mieszający. Butelkę umieszczano na mieszadle magnetycznym i okryto szczelnie folią aluminiową. Ilość uwolnionego leku na zewnątrz membrany dializacyjnej badano za pomocą spektroskopii UV-Vis po: 10 min, 30 min i dalej co godzinę. Ilość uwolnionej emetyny wyznaczano z maksimum piku absorbancji przy długości fali 280 nm. Pomiar prowadzono do 24 h.
Profile uwalniania emetyny bez i w obecności RNA-m2 5 μg/mg liposomów zostały przedstawione na wykresie Fig. 6.
Przykład VII (profil uwalniania RNA-m2 z liposomów S18_5).
Membranę dializacyjną 25 kD kondycjonowano kolejno w: ultraczystej wodzie (system Milli-Q, filtr Biopak CDUFBI001: RNase free, DNase-free, Pyrogen-free) przez 20 minut i buforze Brittona Robinsona o odpowiednim pH kolejne 20 minut. Następnie w membranie umieszczano 1 ml roztworu liposomów S18_5 zawierających RNA-m2 10 μg/mg liposomów oraz 1 ml buforu o odpowiednim pH. Membranę szczelnie zamknięto i umieszczono w butelce szklanej z korkiem o pojemności 100 ml zawierającej bufor o pH identycznym z pH wewnątrz membrany dializacyjnej oraz element mieszający. Butelkę umieszczano na mieszadle magnetycznym i okryto szczelnie folią aluminiową. Ilość uwolnionego leku na zewnątrz membrany dializacyjnej badano za pomocą spektroskopii UV-Vis po: 10 min, 30 min i dalej co godzinę. Ilość uwolnionego RNA-m2 wyznaczano z maksimum piku absorbancji przy długości fali 250 nm. Pomiar prowadzono do 8 h. Wyniki przedstawiono na wykresie Fig. 7.
Przykład VIII (analiza składania oligonukleotydów RNA-m2 z liposomami S10_5 bez kwasu foliowego i emetyny, na wodzie za pomocą elektroforezy PAGE).
Do roztworu oligonukleotydu RNA-m2 (0,10 OD) w wodzie Milli-Q (mQ, 15 μί) dodano [32Ρ-γ] ATP (37,0 MBq, 1,00 mCi) w roztworze zawierającym kinazę polinukleotydową T4 (1 μί, 10 000 jednostek/mL), 2 μί buforu do reakcji fosforylacji, dostarczonego przez producenta, uzupełnionym wodą mQ do objętości 20 μί. Roztwór reakcyjny inkubowano w temp. 37°C przez 1 godz. Następnie zdeaktywowano enzym, poprzez inkubację mieszaniny przez 3 min w temp. 80°C. Radioaktywnie wyznakowany jednoniciowy oligonukleotyd RNA (0,5 μί z otrzymanego roztworu) inkubowano z liposomami S10_5 użytymi w określonym stosunku, przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Składanie przeprowadzono w wodzie mQ lub w buforze o następującym składzie: 20 mM Tris-HCI (pH 8), 50 mM NaCI and 10 mM MgCb. Wydajność tworzenia kompleksów badano za pomocą elektroforezy w 15% żelu poliakrylamidowym (PAGE) w warunkach niedenaturujących (bez dodatku mocznika). Elektroforezę przeprowadzono w temperaturze pokojowej przy stałym napięciu 300 V/cm i prądzie 20 mA przez 30 min i określonym kierunku przepływu prądu, a następnie żele wywoływano autoradiograficznie. Związki dodawane bezpośrednio do liposomów (S10_5 rozpuszczone w wodzie), inkubacja 1 h, RT. Wyniki przedstawiono na rysunku Fig. 8 A-C.
Wnioski:
1. Liposomy S10_5 wiążą kwasy nukleinowe (pojedyncza nić RNA)
2. Związki S10_5 nie degradują nici RNA.
3. Żel nr 1 (- do +) Na ścieżce nr 3 widzimy prążek migrujący wolniej (ułożony wyżej) niż prążek na ścieżce nr 2 (ułożony niżej) co wynika z różnicy ilości liposomów dodatnio naładowanego migrującego wolniej w żelu.
4. Żel nr 2 (+ do 1) liposomy opłaszczone RNA przez swoją wielkość i/lub obojętny ładunek słabo wnikają do 15% niedenaturującego żelu.
Przykład IX (analiza składania oligonukleotydów siRNA z liposomami S10_5 (w roztworze wodnym bez kwasu foliowego i emetyny, bez NaCI,) za pomocą elektroforezy PAGE).
Do roztworu oligonukleotydu RNA (0,10 OD) w wodzie Milli-Q (mQ, 15 μL) dodano [32Ρ-γ] ATP (37,0 MBq, 1,00 mCi) w roztworze zawierającym kinazę polinukleotydową T4 (1 μΐ, 10 000 jednostek/mL), 2 μL buforu do reakcji fosforylacji, dostarczonego przez producenta, uzupełnionym wodą mQ do objętości 20 μL. Roztwór reakcyjny inkubowano w temp. 37°C przez 1 godz. Następnie zdeaktywowano enzym, poprzez inkubację mieszaniny przez 3 min w temp. 80°C. Tak przygotowany roztwór znakowanych radioizotopowo RNA bez dalszego oczyszczania zastosowano w następnych eksperymentach.
Składanie dupleksów nici kwasów nukleinowych przeprowadzono poprzez dodanie roztworu znakowanej nici RNA (nić sens) (0,10 OD) do roztworu drugiej nici (nić antysensowa RNAas lub DNA-FL) (0,10 OD) w stosunku molowym 1:1 w sterylnej wodzie milliQ do objętości końcowej 40 μL. Mieszaninę ogrzano przez 5 min w temp. 75°C, powoli schłodzono (1 h) do temperatury pokojowej.
Roztwór radioaktywnie znakowanego dupleksu (0,5 μΐ) dodano do roztworu liposomów S10_5 w określonym stosunku wagowym, inkubowano przez 1 h w temp. pokojowej. Próbki poddano analizie za pomocą elektroforezy w 15% żelu poliakryloamidowym (PAGE) w warunkach niedenaturujących (bez dodatku mocznika). Elektroforezę przeprowadzono w temperaturze pokojowej przy stałym napięciu 300 V/cm i prądzie 20 mA przez 30 min. w ustalonym kierunku przepływu prądu a następnie żele wywoływano autoradiograficznie na kliszach diagnostycznych. Związki dodawane bezpośrednio do liposomów (S10_5, bez NaCI, w wodzie), inkubacja 1 h, RT.
Wyniki przedstawiono na rysunku FIG. 9A-C.
Wnioski:
1. Liposomy S10_5 bez soli fizjologicznej wiążą kwasy nukleinowe (dupleks siRNA) lepiej niż liposomy zawierające NaCI.
2. Dodatkowo zaobserwowano, że dupleks siRNA silniej wiąże się do liposomów (w stosunku 1:50) niż jednoniciowe RNA (w stosunku 1:100).
3. Związki S10_5 nie degradują siRNA.
Przykład X (analiza składania oligonukleotydów RNA m2 z liposomami S18_2 z kwasem foliowym i emetyną bez NaCI, w wodzie za pomocą elektroforezy PAGE).
Do roztworu oligonukleotydu RNA (0,10 OD) w wodzie Milli-Q (mQ, 15 μΐ) dodano [32Ρ-γ] ATP (37,0 MBq, 1,00 mCi) w roztworze zawierającym kinazę polinukleotydową T4 (1 μΐ, 10 000 jednostek/mL), 2 μL buforu do reakcji fosforylacji, dostarczonego przez producenta, uzupełnionym wodą mQ do objętości 20 μL. Roztwór reakcyjny inkubowano w temp. 37°C przez 1 godz. Następnie zdeaktywowano enzym, poprzez inkubację mieszaniny przez 3 min w temp. 80°C. Radioaktywnie wyznakowany jednoniciowy oligonukleotyd RNA (0,5 μΐ z otrzymanego roztworu) inkubowano z liposomami S18_2 użytymi w określonym stosunku, przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Składanie przeprowadzono w wodzie mQ lub w buforze o następującym składzie: 20 mM Tris-HCI (pH 8), 50 mM NaCI i 10 mM MgCl2. Wydajność tworzenia kompleksów badano za pomocą elektroforezy w 15% żelu poliakrylamidowym (PAGE) w warunkach niedenaturujących (bez dodatku mocznika). Elektroforezę przeprowadzono w temperaturze pokojowej przy stałym napięciu 300 V/cm i prądzie 20 mA przez 30 min. i określonym kierunku przepływu prądu, a następnie żele wywoływano autoradiograficznie. Związki (RNA m2) dodawane bezpośrednio do liposomów z emetyną i kwasem foliowym (S18_2, usunięte NaCI, w wodzie), inkubacja 1 h, RT Wyniki przedstawiono na rysunku FIG. 10 A-C
Wnioski:
1. RNA m2 silnie wiąże się do S18_2, co świadczy o tym, że dodatek emetyny i kwasu foliowego do liposomu nie utrudnia wiązania, a jest silniejsze w porównaniu do samego liposomu S10_5.
2. Liposom nie degraduje RNA.
Przykład XI (analiza składania oligonukleotydów siRNA z liposomami S18_2 z kwasem foliowym i emetyną bez NaCI, w wodzie za pomocą elektroforezy PAGE.
Do roztworu oligonukleotydu RNA (0,10 OD) w wodzie Milli-Q (mQ, 15 μL) dodano [32Ρ-γ] ATP (37,0 MBq, 1,00 mCi) w roztworze zawierającym kinazę polinukleotydową T4 (1 μΐ, 10 000 jednostek/mL), 2 μΐ buforu do reakcji fosforylacji, dostarczonego przez producenta, uzupełnionym wodą mQ do objętości 20 μL. Roztwór reakcyjny inkubowano w temp. 37°C przez 1 godz. Następnie zdeaktywowano enzym, poprzez inkubację mieszaniny przez 3 min w temp. 80°C. Tak przygotowany roztwór znakowanych radioizotopowo RNA bez dalszego oczyszczania zastosowano w następnych eksperymentach.
Składanie dupleksów nici kwasów nukleinowych przeprowadzono poprzez dodanie roztworu znakowanej nici RNA (nić sens) (0,10 OD) do roztworu drugiej nici (nić antysensowna RNAas lub DNA-FL) (0,10 OD) w stosunku molowym 1:1 w sterylnej wodzie milliQ do objętości końcowej 40 μL. Mieszaninę ogrzano przez 5 min w temp. 75°C, powoli schłodzono (1 h) do temperatury pokojowej.
Roztwór radioaktywnie znakowanego dupleksu (0,5 μΐ) dodano do roztworu liposomów S18_2 w określonym stosunku wagowym, inkubowano przez 1 h w temp. pokojowej. Próbki poddano analizie za pomocą elektroforezy w 15% żelu poliakryloamidowym (PAGE) w warunkach niedenaturujących (bez dodatku mocznika). Elektroforezę przeprowadzono w temperaturze pokojowej przy stałym napięciu 300 V/cm i prądzie 20 mA przez 30 min. w ustalonym kierunku przepływu prądu a następnie żele wywoływano autoradiograficznie na kliszach diagnostycznych. Związki (siRNA) dodawane bezpośrednio do liposomów z emetyną i kwasem foliowym (S18_2, usunięte NaCI, w wodzie), inkubacja 1 h, RT. Wyniki przedstawiono na rysunku FIG. 11 A-C.
Wnioski:
1. Zaobserwowano silne wiązanie dupleksu siRNA do S18_2, pomimo dodatku emetyny i kwasu foliowego jako cząsteczki kierunkującej. Wynika do z podwójnej ilości ładunków ujemnych jakie niesie siRNA, w porównaniu do jednoniciowego RNA oraz właściwości związku S18_2. Brak widocznego substratu (siRNA) przy stosunku 1:50 (tor nr 3).
2. Jednakowa intensywność prążków utworzonych nanostruktur (+ do -) jest dodatkowym potwierdzeniem całkowitego wysycenia S18_2 już przy niższych stosunkach nadmiaru liposomu.
3. siRNA silniej się wiąże do S18_2 w stosunku 1:50 niż RNA m2.
Potwierdzenie obserwacji silnego wiązania RNA/Liposomu S18_2. Należy przeprowadzić ten sam eksperyment w niższym stosunku S18_2 do siRNA, aby potwierdzić, że siRNA wysyca liposom S18_2 w niższych stosunkach.
Przykład XII (analiza składania oligonukleotydów siRNA z liposomami S18_2 z kwasem foliowym i emetyny bez NaCI, w wodzie za pomocą elektroforezy PAGE.
Do roztworu oligonukleotydu RNA (0,10 OD) w wodzie Milli-Q (mQ, 15 μΐ) dodano [32Ρ-γ] ATP (37,0 MBq, 1,00 mCi) w roztworze zawierającym kinazę polinukleotydową T4 (1 μΐ, 10 000 jednostek/mL), 2 μΐ buforu do reakcji fosforylacji, dostarczonego przez producenta, uzupełnionym wodą mQ do objętości 20 μL. Roztwór reakcyjny inkubowano w temp. 37°C przez 1 godz. Następnie zdeaktywowano enzym, poprzez inkubację mieszaniny przez 3 min w temp. 80°C. Tak przygotowany roztwór znakowanych radioizotopowo RNA bez dalszego oczyszczania zastosowano w następnych eksperymentach.
Składanie dupleksów nici kwasów nukleinowych przeprowadzono poprzez dodanie roztworu znakowanej nici RNA (nić sens) (0,10 OD) do roztworu drugiej nici (nić antysensowna RNAas lub DNA-FL) (0,10 OD) w stosunku molowym 1:1 w sterylnej wodzie milliQ do objętości końcowej 40 μΐ.
Mieszaninę ogrzano przez 5 min w temp. 75°C, powoli schłodzono (1 h) do temperatury pokojowej.
Roztwór radioaktywnie znakowanego dupleksu (0,5 μΐ) dodano do roztworu liposomów S18_2 w określonym stosunku wagowym, inkubowano przez 1 h w temp. pokojowej. Próbki poddano analizie za pomocą elektroforezy w 15% żelu poliakryloamidowym (PAGE) w warunkach niedenaturujących (bez dodatku mocznika). Elektroforezę przeprowadzono w temperaturze pokojowej przy stałym napięciu 300 V/cm i prądzie 20 mA przez 30 min w ustalonym kierunku przepływu prądu a następnie żele wywoływano autoradiograficznie na kliszach diagnostycznych. Związki (siRNA) dodawane bezpośrednio do liposomów z emetyną i kwasem foliowym (S18_2, usunięte NaCI, w wodzie), inkubacja 1 h, RT.
Wyniki przedstawiono na rysunku FIG. 12A-C.
Wniosek:
1. Zaobserwowano silne wiązanie dupleksu siRNA do S18_2, pomimo dodatku emetyny i kwasu foliowego jako cząsteczki kierunkującej w niższym stężeniu liposomów S18_2. W stosunku 1:40 substrat (siRNA) w pełni związał się z liposomem S18_2 (tor nr 6).
Przykład XIII (składanie nanostruktur kwasów nukleinowych DNA-FL/RNAs (wyznakowane RNA) z liposomami zawierającymi kwas foliowy i emetynę (S18_2), bez NaCI, analiza za pomocą elektroforezy PAGE).
Składanie dupleksów nici kwasów nukleinowych przeprowadzono poprzez dodanie roztworu znakowanej nici RNA (nić sens) (0,10 OD) do roztworu drugiej nici (nić antysensowna RNAas lub DNA-FL) (0,10 OD) w stosunku molowym 1:1 w sterylnej wodzie milliQ do objętości końcowej 40 μL. Mieszaninę ogrzano przez 5 min w temp. 75°C, powoli schłodzono (1 h) do temperatury pokojowej.
Roztwór radioaktywnie znakowanego dupleksu (0,5 μL) dodano do roztworu liposomów S18_2 w określonym stosunku wagowym, inkubowano przez 1 h w temp. pokojowej. Próbki poddano analizie za pomocą elektroforezy w 15% żelu poliakryloamidowym (PAGE) w warunkach niedenaturujących (bez dodatku mocznika). Elektroforezę przeprowadzono w temperaturze pokojowej przy stałym napięciu 300 V/cm i prądzie 20 mA przez 30 min w ustalonym kierunku przepływu prądu (informacja szczegółowa zawarta jest przy opisach poszczególnych eksperymentów), a następnie żele wywoływano autoradiograficznie na kliszach diagnostycznych. Heterodupleks DNA-FL/RNAs dodano bezpośrednio do liposomów z emetyną i kwasem foliowym (S18_2, bez NaCI, w wodzie). Inkubacja 1 h, RT.
Wyniki przedstawiono na rysunku FIG. 13 A-C.
Wniosek:
Heterodupleks DNA-FL/RNAs silnie wiąże się w stosunku 1:30-1:40. Jest to analogiczny wynik jak do homodupleksu siRNA.
Przykład XIV (analiza stabilności nanostruktur kwasów nukleinowych RNA m2 z liposomami S10_5, bez NaCI po 5 dniach za pomocą elektroforezy PAGE).
Do roztworu oligonukleotydu RNA (0,10 OD) w wodzie Milli-Q (mQ, 15 μL) dodano [32Ρ-γ] ATP (37,0 MBq, 1,00 mCi) w roztworze zawierającym kinazę polinukleotydową T4 (1 μΐ, 10 000 jednostek/mL), 2 μL buforu do reakcji fosforylacji, dostarczonego przez producenta, uzupełnionym wodą mQ do objętości 20 μΐ. Roztwór reakcyjny inkubowano w temp. 37°C przez 1 godz. Następnie zdeaktywowano enzym, poprzez inkubację mieszaniny przez 3 min w temp. 80°C. Tak przygotowany roztwór znakowanych radioizotopowo RNA bez dalszego oczyszczania zastosowano w następnych eksperymentach.
Radioaktywnie wyznakowany jednoniciowy oligonukleotyd RNA (0,5 μΐ z otrzymanego roztworu) inkubowano z liposomami S10_5 użytymi w określonym stosunku, przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT). Składanie przeprowadzono w wodzie mQ lub w buforze o następującym składzie: 20 mM Tris-HCI (pH 8), 50 mM NaCI and 10 mM MgC l2. Wydajność tworzenia kompleksów badano za pomocą elektroforezy w 15% żelu poliakrylamidowym (PAGE) w warunkach niedenaturujących (bez dodatku mocznika). Elektroforezę przeprowadzono w temperaturze pokojowej przy stałym napięciu 300 V/cm i prądzie 20 mA przez 30 min i określonym kierunku przepływu prądu, a następnie żele wywoływano autoradiograficznie. Związki (RNA m2) dodawane bezpośrednio do liposomów bez emetyny i kwasu foliowego (S10_5, bez NaCI, w wodzie), inkubacja 1 h, RT. Następnie związki zostały umieszczone w lodówce 4°C na 5 dni, następnie przeprowadzono elektroforezę PAGE.
Wyniki przedstawiono na rysunku Fig. 14 A-C.
Wnioski:
1. Oligonukleotyd RNA m2 jest stabilny w obecności liposomów S10_5 i nie ulega degradacji po 5 dniach.
2. Również należy wnioskować, że liposom S10_5 nie traci swoich właściwości i silnie wiąże kwas nukleinowy.
Przykład XV (analiza stabilności nanostruktur kwasów nukleinowych siRNA z liposomami (S18_2), bez NaCI po 3 dniach za pomocą elektroforezy PAGE).
Do roztworu oligonukleotydu RNA (0,10 OD) w wodzie Milli-Q (mQ, 15 μΐ) dodano [32Ρ-γ] ATP (37,0 MBq, 1,00 mCi) w roztworze zawierającym kinazę polinukleotydową T4 (1 μΐ, 10 000 jednostek/mL), 2 μL buforu do reakcji fosforylacji, dostarczonego przez producenta, uzupełnionym wodą mQ do objętości 20 pL. Roztwór reakcyjny inkubowano w temp. 37°C przez 1 godz. Następnie zdeaktywowano enzym, poprzez inkubację mieszaniny przez 3 min w temp. 80°C. Tak przygotowany roztwór znakowanych radioizotopowo RNA bez dalszego oczyszczania zastosowano w następnych eksperymentach.
Składanie dupleksów nici kwasów nukleinowych przeprowadzono poprzez dodanie roztworu znakowanej nici RNA (nić sens) (0,10 OD) do roztworu drugiej nici (nić antysensowna RNAas lub DNA-FL) (0,10 OD) w stosunku molowym 1:1 w sterylnej wodzie milliQ do objętości końcowej 40 pL. Mieszaninę ogrzano przez 5 min w temp. 75°C, powoli schłodzono (1 h) do temperatury pokojowej.
Roztwór radioaktywnie znakowanego dupleksu (0,5 pL) dodano do roztworu liposomów S18_2 w określonym stosunku wagowym, inkubowano przez 1 h w temp. pokojowej. Próbki poddano analizie za pomocą elektroforezy w 15% żelu poliakryloamidowym (PAGE) w warunkach niedenaturujących (bez dodatku mocznika). Elektroforezę przeprowadzono w temperaturze pokojowej przy stałym napięciu 300 V/cm i prądzie 20 mA przez 30 min w ustalonym kierunku przepływu prądu a następnie żele wywoływano autoradiograficznie na kliszach diagnostycznych. Związki (siRNA) dodawane bezpośrednio do liposomów z emetyną i kwasem foliowym (S18_2, bez NaCI, w wodzie), inkubacja 1 h, RT, następnie inkubowane w lodówce 4°C przez 3 dni.
Wyniki przedstawiono na rysunku FIG. 15 A-C.
Wniosek:
Analiza elektroforetyczna wykazała, że dwuniciowe kwasy nukleinowe siRNA związane z liposomami S18_2 są stabilne po 3 dniach inkubacji w lodówce 4°C.
Przykład XVI (analiza zdolności wnikania DNA-FL/RNA w kompleksie z liposomami do komórek nowotworowych Caco-2 i prawidłowych MEF-WT przeprowadzona za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Składanie dupleksów nici kwasów nukleinowych przeprowadzono poprzez dodanie roztworu znakowanej nici RNA (nić sens) (0,10 OD) do roztworu drugiej nici (nić antysensowna RNAas lub DNA-FL) (0,10 OD) w stosunku molowym 1:1 w sterylnej wodzie milliQ do objętości końcowej 40 pL. Mieszaninę ogrzano przez 5 min w temp. 75°C, powoli schłodzono (1 h) do temperatury pokojowej.
Hodowla komórek nowotworowych Caco-2 (gruczolakorak jelita grubego) oraz komórek prawidłowych MEF-WT (embrionalne mysie fibroblasty typu dzikiego). Przeprowadzenie badań wnikania opłaszczonych liposomów DNA-FL/RNA do linii komórkowych z wizualizacją mikroskopową.
Komórki CaCo-2 oraz MEF-WT hodowano zgodnie z procedurą ATCC. Wysiano w ilości 15 000 komórek na dołek płytki 96-dołkowej w 200 pL pełnego medium. Po 36 h usunięto pełne medium na medium podstawowe, dodano w różnym stosunku liposom (LIPO) w określonym stosunku wagowym do użytego kwasu nukleinowego, a więc 1:40, gdzie 1 = ilość pg DNA-FL/RNA zawarta w 1 pL roztworu, a 40 = to 40-krotny nadmiar wagowy LIPO S18_2 (liposom z kwasem foliowym i emetyną, w roztworze wodnym pozbawionym soli) lub 1:200, gdzie 200 = 200-krotny nadmiar wagowy LIPO S10_5 (liposom bez kwasu foliowego i emetyny, w roztworze wodnym pozbawionym soli). Zastosowano dwie reakcje kontrolne, z których pierwsza polegała na opłaszczeniu dupleksu DNA-FL/RNA komercyjnym transfektantem, tj. Lipofektaminą 2000 (Invitrogen) w stosunku 1:1 (1 pL Lipofektaminy 2000 na 1 pg kwasu nukleinowego), a druga użyciu nieopłaszczonego heterodupleksu DNA-FL/RNA (1 pL) bez czynnika transfekcyjnego. W każdym eksperymentalnym dołku finalna objętość reakcji w medium podstawowym wynosiła 100 pL. Dupleks DNA-FL/RNA został złożony analogicznie do siRNA z pominięciem procesu znakowania izotopowego. Słaby sygnał zielonej fluorescencji wynika z niskich stężeń dupleksu DNA-FL/RNA (0.1 OD DNA-FL + 0.1 OD RNAs rozpuszczone w 40 pL). Do eksperymentu użyto tylko 1 pL dupleksu. Zdjęcia mikroskopowe - powiększenie x20 - FIG. 16A-B.
Wynik:
- Linia Caco-2 (gruczolakorak jelita grubego, nowotwór)
- Komórki MEF-WT (embrionalne mysie fibroblasty typu dzikiego, prawidłowe)
Wnioski:
1. Dupleks DNA-FL/RNA opłaszczony liposomem S18_2 (zawiera emetynę i kw. foliowy) silnie wynika do komórek Caco-2, które posiadają nadekspresję receptora foliowego na powierzchni błony względem komórek prawidłowych MEF-WT.
2. Ilość pobranego związku DNA-FL/RNA przez komórki widoczne jest w postaci zielonej fluorescencji.
3. Po wybarwieniu siateczki śródplazmatycznej na czerwono i jąder komórkowych na niebiesko obserwujemy (FL+ER+DAPI) zmianę koloru siateczki z czerwonego na pomarańczowo-żółtą, co świadczy o lokalizacji dupleksu DNA-FL/RNA w cytoplazmie, gdzie obecna jest duża ilość struktur błoniastych. Dodatkowo, terapeutyczne kwasy nukleinowe np. (ASO, siRNA) działają w cytoplazmie.
4. Podczas przeprowadzonych eksperymentów zaobserwowano, że komórki Caco-2 po pobraniu dupleksu DNA-FL/RNA opłaszczonego liposomem S18_2 po 4 godzinach zaczynały się odklejać od podłoża, co prawdopodobnie wynika z działania emetyny.
5. Nie obserwowano podobnych zmian komórek w innych zastosowanych układach.
6. DNA-FL/RNA opłaszczony S10_5 (bez emetyny i kw. foliowego) również wykazuje potencjał do wnikania do komórek Caco-2 i MEF-WT, ale znacznie słabszy niż w opłaszczony liposomem S18_2 (z kwasem foliowym i emetyną), ale porównywalnie a nawet lepiej niż komercyjna Lipofektamina 2000. W tym eksperymencie charakterystyczne dla transportu DNA-FL/RNA za pomocą lipofektaminy są zielone kropki (punkty) a liposom S10_2 dostarcza je na całej powierzchni w postaci zielonych cieni „zielone chmury”.
7. Komórki MEF-WT słabiej transfekują się za pomocą Lipofektaminy 2000 niż nowotworowe Caco-2, co jest cechą charakterystyczną dla danej linii komórkowej.
Przykład XVII
Związki siRNA anty-EGFR dodawane były bezpośrednio do lipopleksu i inkubowane przez okres 0,5 h. W stosunku 1:10 substrat (siRNA anty-EGFR) substrat w pełni związał się z lipopleksem. W badaniu weryfikowano uwalnianie się siRNA anty-EGFR z lipoleksu po upływie 30 min w różnych przedziałach pH.

Claims (34)

1. Liposom kationowy wiążący i stabilizujący RNA, znamienny tym, że składa się z lipidów obojętnych w ilości od 12,4 do 49% wagowych, lipidów kationowych w ilości od 16,2 do 55% wagowych, lipidów modyfikowanych glikolem polietylenowym w ilości 12,9 do 15,1% wagowych i cholesterolu w ilości od 15,4 do 18,1% wagowych i charakteryzuje się wielkością od 80 nm do 190 nm, współczynnikiem polidyspersji od 0,06 do 0,23 oraz potencjałem zeta od +19 mV do +55 mV, przy czym jest załadowany RNA.
2. Liposom według zastrz. 1 znamienny tym, że RNA ma postać dupleksu siRNA anty-EGFR.
3. Liposom według zastrz. 1 znamienny tym, że lipidem obojętnym jest dipalmitoilofosfatydylocholina (DPPC).
4. Liposom według zastrz. 1 znamienny tym, że lipidem obojętnym jest 1,2-dimirystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC).
5. Liposom według zastrz. 1 znamienny tym, że lipidem kationowym jest 1,2-dimirystoilo-sn-glicero-3-etylofosfocholina (14:0 EPC).
6. Liposom według zastrz. 1 znamienny tym, że lipidem kationowym jest 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-etylofosfocholina (16:0 EPC).
7. Liposom według zastrz. 1 znamienny tym, że lipidem modyfikowanym glikolem polietylenowym jest 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG-NH2).
8. Liposom według zastrz. 1 znamienny tym, że RNA połączone jest z liposomami w proporcji 1 : 30, czyli na 1 mg liposomu przypada nie więcej niż 1,34 μg RNA.
9. Liposom według zastrz. 1 znamienny tym, że ma wbudowany lek niskocząsteczkowy.
10. Liposom według zastrz. 9 znamienny tym, że lekiem niskocząsteczkowym jest emetyna w ilości nie mniejszej niż 0,5% wagowych i nie więcej niż 8,5% wagowych.
11. Liposom według zastrz. według dowolnego zastrz. 1-10 znamienny tym, że modyfikowany jest czynnikiem naprowadzającym.
12. Liposom według zastrz. 11 znamienny tym, że czynnikiem naprowadzającym jest kwas foliowy w ilości nie mniej niż 1,3% wagowych i nie więcej niż 1,55% wagowych.
13. Liposom kationowy wiążący i stabilizujący RNA jak określono w zastrz. 1 do zastosowania jako nośnik leków.
14. Liposom kationowy wiążący i stabilizujący RNA jak określono w zastrz. 1 do zastosowania w terapii genowej.
15. Sposób ładowania liposomu emetyną znamienny tym, że odważa się od 12,4 do 49% wagowych lipidów obojętnych, od 16,2 do 55% wagowych lipidów kationowych, od 12,9 do 15,1% wagowych lipidów modyfikowanych glikolem polietylenowym i cholesterolu w ilości od 15,4 do 18,1% wagowych i nie mniej niż 0,5% wagowych emetyny, po czym rozpuszcza się odważkę w mieszaninie chloroformu i metanolu o stosunku objętościowym 2:1, dodając od 0,26 do 1,4 mg mieszaniny lipidowej na każdy 1 ml mieszaniny rozpuszczalnika, następnie całość odparowuje się usuwając rozpuszczalniki w temperaturze od 25 do 40°C, przy ciśnieniu od 100 do 300 mbar w czasie od 2 do 5 h do uzyskania cienkiego filmu dwuwarstwy lipidowej na ścianach naczynia, po czym dosusza w temperaturze od 25° do 40°C przy ciśnieniu od 100 do 300 mbar; po całkowitym odparowaniu rozpuszczalników organicznych dodaje się sterylną filtrowaną sól fizjologiczną, bufor PBS lub płyn Ringera w ilości 1 ml na 0,34 do 0,36 mg lipidów, szczelnie zamyka a następnie hydratuje w temperaturze od 45 do 60°C, przy ciśnieniu od 100 do 300 mbar w czasie od 5 do 10h, zhydratowane warstwy lipidowe pozostawia się do ostygnięcia, po czym poddaje się procesowi rozbicia lipidów na cząstki o wielkości nie przekraczającej 200 nm w temperaturze od 45 do 65°C kontrolując rozmiar cząstek i ilość związanej emetyny, roztwór pozostawia się do ostygnięcia, na koniec otrzymane liposomy oczyszcza się z niezwiązanej emetyny i nieprzereagowanych lipidów, mierzy się potencjał Zeta i wykonuje charakterystykę składu.
16. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że lipidem obojętnym jest dipalmitoilofosfatydylocholina (DPPC).
17. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że lipidem obojętnym jest 1,2-dimirystoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DMPC).
18. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że lipidem kationowym jest 1,2-dimirystoilo-sn-glicero-3-etylofosfocholina (14:0 EPC).
19. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że lipidem kationowym jest 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-etylofosfocholina (16:0 EPC).
20. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że lipidem modyfikowanym glikolem polietylenowym jest 1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG-NH2).
21. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że emetynę otrzymuje się w następujący sposób: przygotowuje się roztwór chlorowodorku emetyny w wodzie zdejonizowanej o stężeniu 30 mg/ml, następnie wytrąca się osad miareczkując 0.2 M roztworem NaOH, w ilości 1 ml 0.2 M NaOH na każde 20 mg emetyny, następnie odwirowuje się osad z prędkością od 4000 do 6000 RPM w czasie od 10 do 30 minut i oddziela go od roztworu, po czym do roztworu znad osadu dodaje się 0,1 ml 0,2 M NaOH w celu kontroli całkowitego wytrącenia formy emetyny, po czym mierzy się ilość niewytrąconej emetyny, a osad przemywa się nie mniej niż pięciokrotnie wodą destylowaną, za każdym razem dyspergując za pomocą ultradźwięków, odwirowując i mierząc ilość niewytrąconej emetyny w roztworze znad osadu, przy czym całkowita strata emetyny podczas procesu wynosi nie więcej niż 20%, następnie osad dosusza się w temperaturze od 25 do 30°C, pod ciśnieniem 100 mbar w czasie od 3 do 5 h.
22. Sposób według zastrz. 21 znamienny tym, że ilość niewytrąconej emetyny mierzy się za pomocą spektroskopii UV-Vis względem krzywej kalibracyjnej.
23. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że mieszaninę lipidów odparowuje się w suszarce próżniowej w temperaturze od 25 do 40°C, przy ciśnieniu od 100 do 300 mbar w czasie od 2 do 4,5 h.
24. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że mieszaninę lipidów odparowuje się wyparce próżniowej w temperaturze od 30° do 40°C, przy ciśnieniu od 150 do 300 mbar w czasie od 2 do 5 h.
25. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że hydratację przeprowadza się w suszarce próżniowej.
26. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że hydratację przeprowadza się w wyparce próżniowej.
27. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że dosuszanie prowadzi się w suszarce próżniowej.
28. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że sterylną sól fizjologiczną, bufor PBS lub płynRingera filtruje się przez filtry strzykawkowe bpPVDF, 0,2 μm.
29. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że rozbicie lipidów prowadzi się metodą sonifikacji w czasie od 30 do 60 min przy częstotliwości 50 Hz do uzyskania zmiany zabarwienia roztworu z mlecznej na bezbarwną.
30. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że ilość związanej emetyny kontroluje się za pomocą metody UV-Vis przy długości fali 280 nm.
31. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że liposomy oczyszcza się za pomocą dializy w membranach 10 kD za pomocą ultraczystej wody przez od 30 do 60 minut podając 1 I wody na 4,5 ml próbki i zmieniając - wodę trzykrotnie w równych odstępach czasu.
32. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że czystość otrzymanych liposomów mierzy się za pomocą spektroskopii UV-Vis.
33. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że wielkość uzyskanych liposomów określa się za pomocą metody DLS.
34. Sposób według zastrz. 15 znamienny tym, że charakterystykę składu liposomów przeprowadza się za pomocą metody ATR IR.
PL438742A 2021-08-14 2021-08-14 Liposom kationowy wiążący i stabilizujący RNA, jego zastosowanie jako nośnika leku oraz w terapii genowej i sposób ładowania liposomu emetyną PL249473B1 (pl)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL438742A PL249473B1 (pl) 2021-08-14 2021-08-14 Liposom kationowy wiążący i stabilizujący RNA, jego zastosowanie jako nośnika leku oraz w terapii genowej i sposób ładowania liposomu emetyną
PCT/PL2022/000046 WO2023022615A1 (en) 2021-08-14 2022-08-15 Rna binding and stabilising cationic liposome, its application and method of loading the liposome with emetine
JP2024533925A JP2024531829A (ja) 2021-08-14 2022-08-15 Ｒｎａに結合して安定化させるカチオン性リポソーム、その応用及びリポソームにエメチンを充填する方法
IL310853A IL310853A (en) 2021-08-14 2022-08-15 A cationic liposome binds and stabilizes RNA, its application and method for loading the liposome with EMETINE
US18/683,763 US20240382425A1 (en) 2021-08-14 2022-08-15 RNA binding and stabilising cationic liposome, its application and method of loading the liposome with emetine
EP22797521.6A EP4398883A1 (en) 2021-08-14 2022-08-15 Rna binding and stabilising cationic liposome, its application and method of loading the liposome with emetine
CN202280069568.1A CN118139613A (zh) 2021-08-14 2022-08-15 结合并稳定rna的阳离子脂质体、其应用以及依米丁负载于脂质体的方法
CA3229288A CA3229288A1 (en) 2021-08-14 2022-08-15 Rna binding and stabilising cationic liposome, its application and method of loading the liposome with emetine

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL438742A PL249473B1 (pl) 2021-08-14 2021-08-14 Liposom kationowy wiążący i stabilizujący RNA, jego zastosowanie jako nośnika leku oraz w terapii genowej i sposób ładowania liposomu emetyną

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL438742A1 PL438742A1 (pl) 2023-02-20
PL249473B1 true PL249473B1 (pl) 2026-04-27

Family

ID=84043894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL438742A PL249473B1 (pl) 2021-08-14 2021-08-14 Liposom kationowy wiążący i stabilizujący RNA, jego zastosowanie jako nośnika leku oraz w terapii genowej i sposób ładowania liposomu emetyną

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20240382425A1 (pl)
EP (1) EP4398883A1 (pl)
JP (1) JP2024531829A (pl)
CN (1) CN118139613A (pl)
CA (1) CA3229288A1 (pl)
IL (1) IL310853A (pl)
PL (1) PL249473B1 (pl)
WO (1) WO2023022615A1 (pl)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL247852B1 (pl) * 2023-05-03 2025-09-08 Bs Biotechna Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Kompozycja farmaceutyczna, stosowana w zapobieganiu lub leczeniu chorób nowotworowych i chorób wynikających z nadmiernej proliferacji komórek oraz liposom zawierający tę kompozycję
PL444722A1 (pl) * 2023-05-03 2024-11-04 Bs Biotechna Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Modyfikowany liposom do przenoszenia leków, zastosowanie liposomu do przenoszenia leków, zwłaszcza o działaniu antynowotworowym oraz sposoby ładowania liposomu lekami, zwłaszcza o działaniu antynowotworowym
WO2025258702A1 (ja) * 2024-06-13 2025-12-18 国立大学法人徳島大学 薬物送達ビヒクル

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070293449A1 (en) * 2006-06-20 2007-12-20 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions and methods for delivery of double-stranded rna
US10111871B2 (en) * 2013-08-27 2018-10-30 Northeastern University Nanoparticle drug delivery system and method of treating cancer and neurotrauma
JP2018509387A (ja) * 2015-01-21 2018-04-05 フェーズアールエックス インコーポレイテッド 細胞に治療および診断剤を送達するための方法、組成物、ならびにシステム
US20180200186A1 (en) * 2015-07-09 2018-07-19 Insmed Incorporated Compositions and methods for treating lung diseases and lung injury

Also Published As

Publication number Publication date
IL310853A (en) 2024-04-01
WO2023022615A1 (en) 2023-02-23
CN118139613A (zh) 2024-06-04
EP4398883A1 (en) 2024-07-17
PL438742A1 (pl) 2023-02-20
US20240382425A1 (en) 2024-11-21
CA3229288A1 (en) 2023-02-23
JP2024531829A (ja) 2024-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Endosomolytic and tumor-penetrating mesoporous silica nanoparticles for siRNA/miRNA combination cancer therapy
Haggag et al. Co-delivery of a RanGTP inhibitory peptide and doxorubicin using dual-loaded liposomal carriers to combat chemotherapeutic resistance in breast cancer cells
Yang et al. Nanoparticle delivery of pooled siRNA for effective treatment of non-small cell lung caner
JP6527516B2 (ja) リポソーム粒子、前述のものを作製する方法及びその使用
US20240382425A1 (en) RNA binding and stabilising cationic liposome, its application and method of loading the liposome with emetine
TW202529777A (zh) 組合療法
Silva-Cázares et al. Lipid-based nanoparticles for the therapeutic delivery of non-coding RNAs in breast cancer
Wang et al. RETRACTED ARTICLE: Nanoformulation of Apolipoprotein E3-Tagged Liposomal Nanoparticles for the co-Delivery of KRAS-siRNA and Gemcitabine for Pancreatic Cancer Treatment: Wang and Zhang
PL208054B1 (pl) Kompozycja lipidowa do wytwarzania lipidowego nośnika dla leków genetycznych i jej zastosowanie
Wu et al. Folate-modified liposomes mediate the co-delivery of cisplatin with miR-219a-5p for the targeted treatment of cisplatin-resistant lung cancer
TWI589307B (zh) Novel manufacturing method for local administration of lipid complex and antitumor agent using the lipid complex
AU2013388255B2 (en) Liposome for topical administration and application thereof
Nie et al. CD133 ligand‐enhanced etoposide‐liposome complex for targeted killing of lung cancer cells
US11311629B2 (en) DNA-templated micelle and uses thereof
Nogueira Development of New DODAX: MO: DC-Chol Nanoparticles Containing BRAF-siRNA for Colorectal Cancer Therapy
Muralidharan et al. Lipid Nanocarriers for RNAi-Based Cancer Therapy
Tätz New therapeutic options for the treatment of lung cancer by telomerase inhibition
HK1227705B (en) New production method of lipoplex for local administration and antitumor drug using lipoplex
HK1227705A1 (en) New production method of lipoplex for local administration and antitumor drug using lipoplex