PL249389B1 - Biosensor do identyfikacji i pomiaru endotoksyny bakteryjnej LPS oraz sposób otrzymywania biosensora do identyfikacji i pomiaru endotoksyny bakteryjnej - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy biosensora do identyfikacji i pomiaru lipopolisachardu bakteryjnego LPS będący modyfikowaną elektrodą wykonaną co najmniej w części ze złota, na której powierzchni wytworzona jest warstwa z koniugatu peptydowego o sekwencji Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-O2Oc-Ile-Lys-Lys-Ile-Leu-Ser-lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-O2Oc-OH poprzez chemiczne jego osadzenie na powierzchni przez jego inkubację w elektrodzie w roztworze zawierającym od 0,5 mM do 10 mM koniugatu. Wynalazek dotyczy też sposobu otrzymywania tego biosensora.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest złota elektroda modyfikowana koniugatem peptydowym jako biosensor umożliwiający identyfikację - wykrywanie bakteryjnej endotoksyny (LPS, lipopolisacharyd), jak i pomiar, w badanych próbkach z wykorzystaniem technik elektroanalitycznych: woltamperometrii cyklicznej (CV) oraz elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS) w bardzo niskich stężeniach od 5-10’¹⁰ do 5-10’²¹ g/mL oraz sposób modyfikacji elektrody - otrzymywania biosensora. Biosensor pozwala na pomiar endotoksyny LPS jakościowo i ilościowo. Biosensor znajduje zastosowanie do wykrywania i pomiaru LPS w próbkach środowiskowych, spożywczych czy farmaceutycznych.

Lipopolisacharyd, endotoksyna (LPS) jest heteropolimerem składającym się z części polisacharydowej i hydrofobowej części lipidowej (tzw. Lipid A). Stanowi on kluczowy element budulcowy ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych. Endotoksyna zapewnia integralność strukturalną komórki bakterii oraz chroni mikroorganizmy przed negatywnym wpływem zewnętrznych czynników chemicznych, w tym antybiotyków lub cytotoksyn produkowanych przez układ odpornościowy zainfekowanego organizmu. W przebiegu infekcji LPS jest uwalniany w trakcie namnażania się komórek bakterii lub wskutek ich lizy. Jako cząsteczka silnie immunogenna, LPS obecny w organizmie może wywoływać stany zapalne o różnym stopniu nasilenia - od lekkiego podwyższenia temperatury z towarzyszącymi objawami grypopodobnymi po rozległą leukocytozę, nekrozę komórek i tkanek i szok septyczny, mogący mieć skutek letalny. Charakter objawów wywołanych intoksykacją LPS jest zależny od szczepu bakteryjnego będącego „dawcą” endotoksyny oraz indywidualnych cech zakażonego organizmu.

Oprócz zagrożeń wynikających z obecności endotoksyny we krwi, LPS obecny w środowisku naturalnym, na przykład, w kurzu domowym lub powietrzu hal przemysłowych może być przyczyną schorzeń układu oddechowego typu przewlekłe zapalenie oskrzeli, astma, przewlekły katar (Pascoe CD, Jha A, Basu S, Mahood T, Lee A, Hinshaw S, Falsafi R, Hancock REW, Mookherjee N, Halayko AJ. The importance of reporting house dust mite endotoxin abundance: impact on the lung transcriptome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2020 Jun 1;318(6):L1229-L1236).

Osobnym zagadnieniem jest obecność LPS w preparatach biofarmaceutycznych, suplementach diety, wodzie lub produktach spożywczych. Na przykład, w przemyśle fermentacyjnym stężenie endotoksyn występujących w pohodowlanych supernatantach bakteryjnych waha się w szerokim przedziale od 1,0 x 10-9 M do ponad 1,0 x 10-5 M [DOI 10.1007/s00216-007-1443-4]. Dlatego też, ilościowe określenie poziomu LPS w roztworach jest niezwykle ważne. Uznaje się jednak, że doustne spożycie preparatów skażonych endotoksyną nie powoduje zagrożenia dla życia i zdrowia, stanowi natomiast kryterium w ocenie jakości produktu, które również powinno podlegać ścisłej kontroli (Wassenaar TM, Zimmermann K. Lipopolysaccharides in Food, Food Supplements, and Probiotics: Should We be Worried? Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2018 Aug 21 ;8(3):63-69).

Komercyjne testy diagnostyczne wykrywające LPS w płynnych próbkach bazują przede wszystkim na metodach biochemicznych (Stromberg, L.R.; Mendez, H.M.; Mukundan, H. Detection methods for lipopolysaccharides: Past and present.

In Escherichia Coli-Recent Advances on Physiology, Pathogenesis and Biotechnological Applications; Sarnie, A., Ed.; IntechOpen Ltd: London, UK, 2017; pp. 141-166:).

Znany jest „LAL” test (LAL ang. Limulus amebocyte lysate test, test z lizatem amebocytów Limilus). Jest to test kolorymetryczny, czynnikiem aktywnym jest wodny wyciąg z komórek krwi skrzypłocza morskiego Limulus polyphemus. Obecność LPS w badanej próbce uruchamia kaskadową reakcję krzepnięcia krwi prowadzącą do jej żelowania lub w przypadku stosowania znakowanych fluorescencyjnie substratów reakcji proteolitycznej do wzrostu fluorescencji w wybranym zakresie fal. Ilościową ocenę stężenia LPS w próbce wykonuje się poprzez pomiar spektrofotometryczny. Dostępny komercyjnie jako Pierce TM Chromogenic Endotoxin Quant Kit (producent Thermo Scientific), czułość 0,01 EU/ml (1 EU odpowiada około 0,1-0,2 ng endotoksyny w 1 ml).

Znane są też immunoenzymatyczne testy, które można podzielić na wykrywające bezpośrednio cząsteczki LPS oraz wykrywające przeciwciała względem LPS. Główną wadą tej metody jest niska czułość i powtarzalność wynikająca z niespecyficznego wiązania się LPS do powierzchni płytek lub reagentów. Udoskonaleniem klasycznego testu ELISA jest tzw. test kanapkowy ENDOLisa ® (czułość 0,5-500 EU/mL), będący połączeniem testu ELISA z detekcją czynnika C (składnika testu LAL). Dostępny komercyjnie jako ESP™ - Endotoxin Sample Preparation Kit, BioDtech, Inc., wykorzystywany do oznaczania LPS w ludzkim osoczu.

Znane jest również wykorzystanie modyfikowanych genetycznie linii komórkowych zdolnych do wzmożonej ekspresji receptorów TLR4, MD-2 oraz CD-14 uwrażliwionych w ten sposób na obecność LPS. Przykładem jest - HEK-Blue™ LPS Detection Kit 2. Kolorymetryczny test InvivoGen, wykorzystujący modyfikowane genetycznie komórki linii HEK o zwiększonej zdolności do wykrywania aktywnej formy LPS na drodze kaskady sygnałowej po aktywacji receptorów TLR 4 (Toll-like receptor). Komórki posiadają dodatkowo gen reporterowy kodujący alkaliczną fosfatazę komórek zarodkowych (SEAP), która ulega ekspresji po indukcji przez NF-kB wydzielany na skutek aktywacji receptorów TLR-4 w odpowiedzi na obecność LPS. Odpowiednio dobrane medium QUANTI-Blue wykrywa obecność SEAP i w ten sposób możliwa jest pośrednia ocena stężenia LPS w badanej próbce. Czułość 0,01EU/ml (1x10'¹²g/ml).

Ze względu na wysoki koszt wymienionych powyżej testów biochemicznych istnieje udokumentowana potrzeba opracowania nowych metod wykrywających endotoksynę LPS w bardzo krótkim czasie, bez konieczności czasochłonnego przygotowywania próbek.

Alternatywą dla istniejących metod biochemicznych mogą być metody elektrochemiczne. Według dostępnych danych literaturowych, technikę elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS) z powodzeniem wykorzystano do produkcji biosensorów umożliwiających detekcję LPS. W tym celu różnorodne strukturalnie ligandy były chemicznie immobilizowane na powierzchni złotej elektrody. Kilka przykładowych rozwiązań technicznych opisano poniżej.

Znana jest modyfikowana enzymatycznie (enzymem diaforazą) złota elektroda (o średnicy 1,6 mm) umożliwiająca monitorowanie zmiany przewodnictwa kwasu ferrocenoboronowego na skutek jego oddziaływań z grupami glikozylowymi w strukturze LPS obecnego w badanej próbce (reakcja kompleksowania z powstawaniem cyklicznych estrów boronowych w warunkach zasadowych). Limit detekcji dla LPS E. coli serotyp 0127:B8 ustalono na poziomie 50 ng/mL. Wyniki uzyskano badając próbki LPS o znanym stężeniu w 10 mM buforze fosforanowym, pH 8,5. [Kato D, Iijima S, Kurita R, et al. Electrochemically amplified detection for lipopolysaccharide using ferrocenylboronic acid. Biosensors & Bioelectronics. 2007 Feb;22(7):1527-1531. DOI: 10.1016/j.bios.2006.05.020]. Znana jest też złota elektroda, do której przy użyciu linkera w postaci kwasu 3-merkaptopropionowego został kowalencyjnie przyłączony fragment jednołańcuchowego DNA specyficznie wiążącego cząsteczki LPS. Czułość metody potwierdzono w zakresie 0,001-1 ng/mL względem LPS E. coli 055:B5. Biosensor wykorzystano do oznaczania LPS w roztworach soli fizjologicznej. Dodatkowo sprawdzono czułość sensora względem LPS w obecności pDNA, RNA, BSA, glukozy, sacharozy oraz cholesterolu. Nie stwierdzono istotnego spadku czułości biosensora w obecności wybranych substancji [Su W, Lin M, Lee H, Cho M, Choe WS, Lee Y. Determination of endotoxin through an aptamer-based impedance biosensor. Biosens Bioelectron. 2012 Feb 15;32(l):32-6. doi: 10.1016/j.bios.2011.11.009. Epub 2011 Dec 1. PMID: 22182428].

Złote elektrody z immobilizowaną glikoproteiną lektyną w roli liganda rozpoznającego cząsteczki LPS to wymienione niżej.

Znana jest lektyna Cramol kowalencyjnie połączona z nanocząsteczkami złota funkcjonalizowanymi L-cysteiną oraz osadzonymi na powierzchni warstwy polimerowej PVM (poli (chlorku winylu-octanu kwasu maleinowego)) złotej elektrody. Czułość elektrody wahała się od 25 μg/mL wzwyż dla LPS pochodzącego ze szczepów E. coli, Serratia marcescens, Salmonella enetrica, Klebsiella pneumoniae [Oliveira MD, Andrade CA, Correia MT, Coelho LC, Singh PR, Zeng X. Impedimetric biosensor based on self-assembled hybrid cystein-gold nanoparticles and CramoLL lectin for bacterial lipopolysaccharide recognition. J Colloid Interface Sci. 2011 Oct 1;362(1):194-201. doi: 10.1016/j.jcis.2011.06.042. Epub 2011 Jun 24. PMID: 21752390].

Znana jest elektroda wykrywająca jednocześnie endotoksyny LPS E. coli oraz LTA S. aureus. W roli liganda wykorzystano lektynę konkawalinę A, którą immobilizowano przy użyciu aldehydu glutarowego na powierzchni stalowej elektrody zmodyfikowanej warstwą polianiliny. Najniższe wykrywalne stężenie dla LPS E. coli oraz LTA S. aureus w próbce wody dejonizowanej było na poziomie 50 μg/mL. [da Silva, J. S. L.; Oliveira, M. D. L.; de Melo, C. P.; Andrade, C. A. S., Impedimetric sensor of bacterial toxins based on mixed (Concanavalin A)/polyaniline films. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2014,117, 549-554].

Znana jest złota elektroda modyfikowana lektyną (o nieznanym źródle pochodzenia) w roli liganda rozpoznającego LPS E. coli, która została przyłączona kowalencyjnie do powierzchni elektrody za pomocą EDC (chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N’-etylokarbodiimidu) po jej uprzedniej modyfikacji z użyciem 2% kwasu liponowego w etanolu. Tak otrzymany biosensor umożliwił oznaczenie poziomu LPS w 10 mM buforze fosforanowym, pH 7,2 w zakresie stężeń od 1,0 x 10'¹³ do 1,0 x 10'¹⁰ M. Przedstawione pomiary przeprowadzono stosując technikę przepływową.

Znane są też elektrody modyfikowane peptydami.

Znana jest złota elektroda, której powierzchnię zmodyfikowano syntetycznym peptydem złożonym z 7 hydrofobowych aminokwasów, 4 aminokwasów polarnych i 7 aminokwasów naładowanych dodatnio [WO 2009/124721 A1,2009, 50, DOI: 10.1039/c4an01324g] w celu detekcji LPS ekstrahowanego z komórek szczepu E. coli ATCC 35218. Wykorzystując pomiary elektrochemiczne uzyskano detekcji LPS na poziomie 21,8 pg/mL. Główną wadą zastosowanej przez twórców elektrody jest konieczność użycia specjalnie stworzonego przez autorów naczynia pomiarowego pozwalającego na przeprowadzenie testu.

Znane jest też wykorzystanie cyklicznego antybiotyku polipeptydowego Polimyksyny B przyłączonego do powierzchni elektrody uprzednio zmodyfikowanej przy użyciu kwasu 4,4’-ditio-dibutanowego. Zastosowanie przez autorów elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS) umożliwiło detekcję LPS w zakresie stężeń od 0,2 do 0,8 ng/mL w buforze MES o pH 5.0. [Ding, S.-J.; Chang, B.-W.; Wu, C.-C.; Chen, C.-J.; Chang, H.-C., A new method for detection of endotoxin on polymyxin B-immobilized gold electrodes. Electrochemistry Communications 2007, 9 (5), 1206-1211].

Innym przykładem biosensora jest złota elektroda modyfikowana kwasem nitrylotrioctowym zawierająca na swojej powierzchni jony miedzi [http://dx.doi.org/10.1016/j.snb.2012.09.017] Detekcję LPS dokonano w zakresie stężeń od 0,0001 do 0,1 ng/mL.

Główną wadą biosensorów wykorzystujących lektyny jest obniżenie lub całkowita utrata zdolności do wykrywania LPS w roztworach w obecności innych związków np. cukrów (glukoza, sacharoza itp.), jak i długi czas pomiaru, konieczność stosowania dodatkowego sprzętu z biosensorem.

Celem wynalazku było opracowanie biosensora do identyfikacji - wykrywania LPS umożliwiającego zarówno detekcję endotoksyny jak i jej pomiar ilościowy bez konieczności pracochłonnego przygotowania badanej próbki i pozbawionego wielu innych w/w niedogodności. Nieoczekiwanie cel ten uzyskano poprzez modyfikację elektrody wykonanej chociaż w części ze złota peptydem DAL-PEG-DK5-PEG-OH tj. Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-O20c-Ile-Lys-Lys-Ile-Leu-Ser-lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-O20c-OH podany we wzorze 1. Wynalazek dotyczy zatem elektrody zmodyfikowanej tj. pokrytej warstwą w/w peptydem- biosensora LPS. Jako elektroda stosuje się elektrodę wykonaną ze złota lub w części ze złota tj. z innego materiału pokrytego złotem np. krzemu, szkła. Stosuje się np. złote elektrody dyskowe, opisane szczegółowe w przykładzie ale i drukowane.

Oprócz tego, opracowano sposób otrzymywania biosensora tj. modyfikacji elektrody złotej tj. wykonanej co najmniej w części ze złota, jak opisano wyżej, polegający na efektywnej metodzie przyłączania koniugatu do powierzchni elektrody, uwzględniającej możliwość usuwania grup ochronnych przyłączanego koniugatu peptydowego na powierzchni elektrody. Takie podejście dotychczas nie było opisane w literaturze naukowej.

Wynalazek polega na modyfikacji elektrody wykonanej chociaż w części ze złota poprzez kowalencyjne przyłączenie do jej powierzchni znanego wybranego koniugatu peptydowego DAL-PEG-DK5-PEG-OH tj. Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-O20c-lle-Lys-Lys-lle-Leu-Ser-lys-lle-Lys-Lys-Leu-Leu-O20c-OH, dalej opisywany jako DAL-PEG-DK5-PEG-OH. Warstwa z koniugatu peptydowego DAL-PEG-DK5-PEG-OH utworzona jest poprzez jego chemiczne osadzenie na powierzchni uprzednio zmodyfikowanej elektrody. Używa się w tym celu roztworu koniugatu o stężeniu od 0,5 mM do 10 mM. Koniugat chemicznie immobilizowany na powierzchni elektrody ostatecznie nie posiada w swojej strukturze reszt aminokwasowych z osłonami bocznymi oraz osłony Fmoc N-końcowej grupy aminowej - 9H-fluoren-9-ylometoksykarbonylowej, które są obecne na etapie jego otrzymywania drogą syntezy na nośniku stałym z wykorzystaniem strategii Fmoc. Według proponowanej metody proces usuwania osłon zachodzi na powierzchni elektrody. Elektrody przeznaczone do modyfikacji mogą być komercyjnie dostępnymi elektrodami wykonanymi ze złota o średnicy minimum 1,6 mm, maksimum 3 mm, dodatkowo mogą to być każde inne elektrody wykonane ze złota, np.: elektrody drukowane o powierzchni roboczej o średnicy minimum 1,6 mm, maksimum 4 mm, lub szkło lub krzem pokryte złotem o wym iarach co najmniej 10 x 10 mm, zaś warstwa koniugatu wykazującego powinowactwo względem LPS stanowi warstwę wytworzoną w sposób chemiczny na powierzchni elektrody.

Wynalazek stanowi zatem również sposób otrzymywania biosensora. Do otrzymania biosensora użyto dyskowej elektrody wykonanej ze złota lub w części ze szkła, korzystnie złotej o średnicy minimum 1,6 mm, maksimum 3 mm. Jednakże może to być każda inna elektroda wykonana ze złota lub w części ze złota, korzystnie elektroda drukowana o powierzchni roboczej o średnicy minimum 1,6 mm, maksimum 4 mm, lub szkło lub krzem i innym materiał pokryty złotem, korzystnie o wymiarach co najmniej x 10 mm. W celu uzyskania biosensora oddziałującego z LPS elektrodę modyfikuje się w kilku etapach koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH. W korzystnym wariancie jest to modyfikowana elektroda dyskowa o średnicy minimum 1,6 mm a maksimum 3 mm lub drukowana elektroda wykonana co najmniej w części ze złota o średnicy 1,6 mm lub 4 mm.

W pierwszym etapie elektrodę wykonaną co najmniej w części ze złota oczyszcza się np. za pomocą tlenku glinu lub metodą elektrochemiczną. Po dokładnym umyciu elektrody wodą i alkoholem (metylowym, etylowym lub izopropylowym) lub wodą i wysuszeniu, elektrodę poddaje się modyfikacji (pierwszy etap) przy użyciu roztworu składającego się z: minimum 20 mM cystaminy do 100 mM cystaminy rozpuszczonej w alkoholu np. etanolu lub wodzie. Inkubuje się minimum od 2 do 24 godzin w roztworze aż do wytworzenia na powierzchni elektrody warstwy samoorganizującej zawierającej wyeksponowane wolne grupy aminowe co sprawdza się za pomocą zmian rejestrowanych w pomiarach woltamperometrii cyklicznej (CV) oraz elektrochemiczną spektroskopią impedancyjną (EIS).

W drugim etapie modyfikacji elektrodę umieszcza się w roztworze koniugatu peptydowego DAL-PEG-DK5-PEG-OH rozpuszczonym w DMSO (dimetylosulfotlenku) lub DMF dimetyloformamidzie w stężeniu co najmniej 0,5 mM i maksymalnie 10 mM posiadającym w swojej strukturze wszystkie osłony bocznych grup aminokwasowych oraz osłonę Fmoc grupy α-aminowej na N-końcu peptydu. Reakcję przyłączenia koniugatu peptydowego przeprowadza się w kilku etapach.

Do roztworu DMSO lub DMF zawierającego od 0.1 M do 1 M EDC tj. 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu i od 0,05 M do 1 M NHS (N-hydroksysukcynoimidu) oraz od 0,1 M do 1 M trietyloaminy dodaje się roztwór koniugatu peptydowego DAL-PEG-DK5-PEG-OH zawierającego grupy ochronne: 9H-fluoren-9-ylometoksykarbonylową Fmoc oraz grupy ochronne w łańcuchu bocznym tak, aby uzyskać stężenie DAL-PEG-DK5-PEG-OH od 0,5 mM do 10 mM związku. Grupy te powstają w trakcie syntezy tego koniugatu znaną metodą na nośniku stałym. Tak przygotowaną mieszaninę pozostawia się na czas od od 1 do 12 godzin w temperaturze pokojowej. Grupy ochronne w łańcuchu bocznym oraz grupa Fmoc na N-końcu peptydu są naturalną konsekwencją syntezy peptydów na nośniku stałym z wykorzystaniem strategii Fmoc. Koniugat przyłączany do zmodyfikowanej powierzchni elektrody posiada te wszystkie grupy i nie są one zakładane na etapie otrzymywania biosensora ale jego otrzymywania z wykorzystaniem blokowania Fmoc.

W kolejnym etapie usuwa się grupę 9H-fluoren-9-ylometoksykarbonylową (Fmoc) z N-końca koniugatu peptydowego. W tym celu po dokładnym opłukaniu elektrody alkoholem (metylowym, etylowym, izopropylowym) i wysuszeniu elektrodę umieszcza się w roztworze od 10% do 25% (v:v) piperydyny w roztworze DMF (dimetyloforamid) na czas minimum od 30 minut do 60 minut. Po tym czasie elektrodę dokładnie obmywa się wodą, po czym umieszcza ją w mieszaninie składającej się z od 95 do 100% (v:v) TFA (kwas trifluorooctowy) : od 1% do 2,5% H2O (woda) : od 1% do 2,5% TIS (triisopropylosilan) na czas minimum od 30 minut do 120 minut, w celu pozbycia się wszystkich grup ochronnych łańcucha bocznego peptydu.

Pomiary elektrochemiczne wykonano celem potwierdzenia skuteczności każdego z etapów modyfikacji elektrody. Pomiary elektrody po każdym z etapów modyfikacji wskazują na zmiany prądowe na jej powierzchni, które są konsekwencją zmian strukturalnych po każdym z etapów modyfikacji. Zatem, po przeprowadzeniu pomiarów elektrochemicznych (CV lub EIS) potwierdzających proces modyfikacji powierzchni elektrody, elektrodę umieszcza się na minimum od 10 do 60 minut w roztworze od 0,5% do 3% BSA (albumina wołowa) w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiążących na elektrodzie (wolnych grup aminowych po 1 etapie modyfikacji).

W następnym etapie po opłukaniu elektrody roztworem wody dejonizowanej lub PBS (buforowany roztwór soli fizjologicznej) w stężeniu od 0,01 1 M do 1 M wykonano pomiary elektrochemiczne techniką CV lub/oraz EIS w celu detekcji wybranego typu lipopolisacharydu LPS np. LPS Escherichia coliserotyp O26:B6. Badania zdolności detekcji i czułości elektrody względem LPS prowadzi się po naniesieniu roztworu zawierającego LPS na powierzchnię elektrody (dopuszczalny zakres objętości próbki od 2 do 20 μl) i inkubacji przez okres od 30 minut do 60 minut. Pomiary techniką CV oraz EIS przeprowadza się używając potencjostatu/galwanostatu firmy Metrohm Autolab, Holandia (może to być każdy inny potencjostat z możliwością wykonania pomiarów CV i EIS). Wszystkie pomiary opisane szczegółowo w przykładach wykonuje się natomiast w elektrochemicznej celce pomiarowej zawierającej biosensor, czyli:

a. modyfikowaną elektrodę złotą dyskową opisaną w przykładzie, będącą przedmiotem zgłoszenia, używaną jako elektrodę pracującą;

oraz:

b. elektrodę odniesienia Ag/AgCl (0,1 M NaCl) oraz

c. elektrodę platynową w postaci drutu platynowego, lub płytki platynowej stosowaną jako elektrodę pomocniczą, w roztworze buforu fosforanowego (PBS) w stężeniu od 0,01M do 0,1 M o pH od 7.0 do 7,5 w temperaturze pokojowej zawierającym mieszaninę [K3Fe(CN)s] i [K4Fe(CN)s] w stężeniu od 1 mM do 10 mM.

W przypadku techniki CV za każdym razem stosowano prędkość skanowania, która może wynosić od 10 mV/s do 100 mV/s. W przypadku metody EIS eksperymenty prowadzono przy potencjale obwodu otwartego w zakresie częstotliwości od 0,1 Hz do 10 000 Hz i amplitudzie 10 mV. Wykorzystuje się w tym celu roztwory LPS w buforze PBS o zdefiniowanym stężeniu endotoksyny (np. LPS Escherichia coli 026:B6) oraz roztworach LPS w PBS z dodatkiem płynów ustrojowych (typu 50% mocz myszy laboratoryjnej lub 50% komercyjnie dostępny preparat surowicy krwi ludzkiej). Główną zaletą zmodyfikowanych w opisany sposób elektrod jest skrócenie czasu pomiarowego w porównaniu do komercyjnych testów biochemicznych, niski koszt otrzymywania oraz możliwość ich wykorzystania do wykonywania pomiarów w czasie rzeczywistym. W przypadku proponowanego sensora nie ma konieczności stosowania skomplikowanego naczynia pomiarowego (np.: cela przepływowa). Proponowany jest tylko standardowy zestaw elektrod, w skład którego wchodzi również ta modyfikowana peptydem. W standardowych warunkach pomiarowych stosowanych w ocenie skuteczności wymienionych powyżej przykładowych biosensorów znanych, tzn. roztwory buforów lub buforowana sól fizjologiczna, elektroda modyfikowana wybranym peptydem DAL-PEG-DK5-PEG-OH zanurzona w roztworze PBS posiada znacząco wyższą czułość, rzędu 5 10^-21 do 5 10^-10 g/mL, względem LPS Escherichia coli serotyp O26:B6 obecnego w roztworze. Ponadto, biosensor zbadano wobec złożonych pod względem składu biologicznego próbek, mianowicie: roztworów soli fizjologicznej z dodatkiem 50% v/v ludzkiej surowicy lub mysiego moczu, do których dodawano LPS E. coli serotyp O26:B6. W takich warunkach eksperymentalnych najmniejsze wykrywalne stężenie LPS w badanej próbie zarówno techniką EIS, jak i CV, wynosiło 2,5 10^-15 (w roztworze 50% mysiego moczu w PBS) i 2,5 10^-9 g/mL (w roztworze 50% ludzkiej surowicy krwi w PBS).

Możliwości praktycznego zastosowania sensora endotoksyny - oznaczania jak i pomiaru - są bardzo szerokie. Przede wszystkim biosensor wykrywający LPS może mieć zastosowanie w diagnostyce medycznej, w analizie jakości produktów farmaceutycznych, spożywczych, przemysłowych, gdzie obecność endotoksyny jest istotnym kryterium oceny jakości preparatów. Biosensor, będący przedmiotem wynalazku wykrywa endotoksynę LPS w buforowanym roztworze wodnym, jednak może również pracować w każdym innym roztworze wodnym. Wynalazek ma zastosowanie do wykrywania LPS w próbkach medycznych, środowiskowych, spożywczych czy farmaceutycznych.

Wynalazek opisano bliżej w przykładach oraz na fig. 1 gdzie pokazano schemat modyfikacji elektrody złotej w celu detekcji liposacharydu LPS; na fig. 2 gdzie pokazano woltamperogramy cykliczne potwierdzające kolejne po sobie procesy modyfikacji elektrody złotej zarejestrowane dla: a) czystej elektrody złotej, b) elektrody złotej po modyfikacji cystaminą, c) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym PEG-DK5-PEG-OH d) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz peptydem DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA e) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA, po inkubacji w roztworze LPS o stężeniu 5 10^-13 g/mL oraz odpowiednio po nałożeniu wyższych stężeń f) 5 10^-12 g/mL g) 5 10^-10 g/mL h) 5 10-8 g/mL i) 5 10^-6 g/mL j) 5 10-⁴² g/mL, zarejestrowane w 0,1 M roztworze PBS o pH 7,0 zawierającym 1 mM Fe[(CN)6]³’^/4’, prędkość skanowania 100 mV/s. Fig. 3: woltamperogramy cykliczne potwierdzające kolejne po sobie procesy modyfikacji elektrody złotej zarejestrowane dla: a) czystej elektrody złotej, b) elektrody złotej po modyfikacji cystaminą, c) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym PEG-DK5-PEG-OH d) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz peptydem DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA e) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA, po inkubacji w roztworze LPS o stężeniu 5 10^-15 g/mL A) w mysim moczu, B) w ludzkim osoczu, zarejestrowane w 0,1 M roztworze PBS o pH 7,0 zawierającym 1 mM Fe[(CN)6]³’^/4’, prędkość skanowania 100 mV/s. Fig. 4: wykresy Niquista zarejestrowane dla: czystej elektrody złotej, b) elektrody złotej po modyfikacji cystaminą, c) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH d) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz peptydem DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA e) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz peptydem DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA po inkubacji w roztworze LPS o stężeniu 5 10^-21 g/mL, zarejestrowane w 0,1 M roztworze PBS o pH 7, zawierającym 1 mM Fe[(CN)6]^3-/4-. Punkty oznaczają wartości punktowe otrzymane doświadczalnie, natomiast linia ciągła przedstawia dane dopasowania uzyskane z dopasowania odpowiedniego elektrycznego obwodu zastępczego.

Fig. 5: wykresy Niquista zarejestrowane dla: elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA po inkubacji w roztworach LPS o stężeniach od 5 10^-21 g/mL do 5 10^-10 g/mL, zarejestrowane w 0,1 M roztworze PBS o pH 7,0 zawierającym 1 mM Fe[(CN)6]³’^/4·. Punkty oznaczają wartości punktowe otrzymane doświadczalnie, natomiast linia ciągła przedstawia dane dopasowania uzyskane z dopasowania odpowiedniego elektrycznego obwodu zastępczego. Fig. 6: zależność rezystancji przeniesienia ładunku (Rct) i logarytmu inkubowanego stężenia LPS. Fig 7: wykresy Niquista zarejestrowane dla: a) czystej elektrody złotej, b) elektrody złotej po modyfikacji cystaminą, c) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym PEG-DK5-PEG-OH d) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz peptydem DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA e) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA, po inkubacji w roztworze LPS o stężeniu 5 10^-15 g/mL A) w mysim moczu, B) w ludzkim osoczu, zarejestrowane w 0,1 M roztworze PBS o pH 7,0 zawierającymi mM Fe[(CN)6]^{3 /4}. Punkty oznaczają wartości punktowe otrzymane doświadczalnie, natomiast linia ciągła przedstawia dane dopasowania uzyskane z dopasowania odpowiedniego elektrycznego obwodu zastępczego.

Koniugat pokazano na wzorze 1.

Przykład 1 - opis budowy i otrzymania przykładowego biosensora

Do otrzymania biosensora może być wykorzystana elektroda dyskowa o kształcie okrągłym w przekroju wykonana ze złota o średnicy 1,6 mm. W celu uzyskania biosensora oddziałującego z LPS, elektrodę zmodyfikowano w kilku etapach koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH.

Poniżej przedstawiono przykładowy opis wykonania biosensora na przykładzie modyfikacji elektrody dyskowej o długości 70 mm i średnicy 6 mm o średnicy powierzchni złotej wynoszącej 1,6 mm użytej jako elektrody pracującej. Może to również być szkło, lub inny materiał (np. krzem) pokryty złotem o wymiarach 10 x 10 mm.

Opis otrzymywania elektrody

W pierwszym etapie elektroda złota została dokładnie wyczyszczona za pomocą tlenku glinu o wielkości ziaren 0,05 μm na padach wykonanych z mikrowłókien(firmy Buehler, USA). Po dokładnym umyciu elektrody wodą i metanolem oraz wysuszeniu, elektrodę poddano modyfikacji (pierwszy etap) przy użyciu roztworu składającego się z: 20 mM cystaminy w etanolu (Sigma-Aldrich). Po 12 godzinach inkubacji w roztworze na powierzchni elektrody wytworzyła się samoorganizująca się warstwa typu Self -Assembly-Monolayers (SAM) zawierająca wyeksponowane wolne grupy aminowe.

W drugim etapie modyfikacji elektrodę umieszczono w roztworze koniugatu peptydowego DAL-PEG-DK5-PEG-OH rozpuszczonego w DMSO (stężenie 0,5 mM) posiadającego w swojej strukturze wszystkie osłony bocznych grup aminokwasowych oraz osłonę Fmoc grupy α-aminowej na N-końcu cząsteczki. Procedura przyłączania koniugatu peptydowego do elektrody odbywała się w następujących etapach:

Do roztworu DMSO (dimetylosulfotlenku) zawierającego 0,1 M EDC (1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu) i 0,05 M of NHS (N-hydroksysukcynoimidu) oraz 0,1 M trietyloaminy dodano roztwór koniugatu peptydowego DAL-PEG-DK5-PEG-OH w DMSO tak, aby uzyskać stężenie 1,5 mM związku w mieszaninie reakcyjnej. Tak przygotowaną mieszaninę i elektrodę pozostawiono na 12 godzin w temperaturze pokojowej.

W kolejnym etapie usunięto grupę 9H-fluoren-9-ylometoksykarbonylową (Fmoc) z N-końca koniugatu peptydowego. W tym celu po dokładnym opłukaniu elektrody metanolem, następnie wodą i wysuszeniu, elektrodę umieszczono w 20% roztworze piperydyny w DMF (dimetyloforamid) na czas 30 minut. Po tym czasie elektrodę dokładnie obmyto wodą, po czym umieszczono ją w mieszaninie składającej się z 95% TFA (kwas trifluorooctowy) : 2,5% H2O (woda) : 2,5% TIS (triisopropylosilan) na czas 1,5 godziny, w celu pozbycia się wszystkich grup ochronnych łańcucha bocznego.

Po przeprowadzeniu pomiarów elektrochemicznych (EIS, lub CV) potwierdzających proces modyfikacji powierzchni elektrody, elektrodę umieszczono na 30 minut w roztworze 1% BSA (albumina wołowa) w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiążących na elektrodzie (wolnych grup aminowych po 1 etapie modyfikacji). Wszystkie pomiary przeprowadzono w celce pomiarowej zawierającej modyfikowaną elektrodę złotą jako elektrodę pracującą, elektrodę odniesienia Ag/AgCl (0,1 M NaCl) oraz elektrodę platynową zastosowaną jako elektrodę pomocniczą, w roztworze zawierającym mieszaninę 1 mM [K3Fe(CN)6] i [K4Fe(CN)6] rozpuszczoną w 0,1 M roztworze (PBS) o pH 7,0 w temperaturze pokojowej. W przypadku techniki CV za każdym razem stosowano prędkość skanowania wynoszącą 100 mV/s. W przypadku metody EIS eksperymenty prowadzono przy potencjale obwodu otwartego w zakresie częstotliwości od 0,1 Hz do 10 000 Hz i amplitudzie 10 mV.

Poszczególne etapy modyfikacji elektrody zostały przedstawione na Fig. 1 tj. etapy modyfikacji powierzchni złotej elektrody umożliwiającej uzyskanie biosensora wykrywającego LPS E. coli.

W następnym etapie po opłukaniu elektrody 0,01 M roztworem PBS (roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami), o pH 7,4 wykonano pomiary elektrochemiczne techniką EIS oraz CV w celu detekcji wybranego typu lipopolisacharydu (LPS E. coli serotyp O26:B6). Na podstawie wcześniej uzyskanych wyników badań biologicznych potwierdzających wysokie powinowactwo koniugatu peptydowego DAL-PEG-DK5-PEG-OH do LPS Escherichia coli serotyp O26:B6, ten typ lipopolisacharydu został użyty we wszystkich badaniach elektrochemicznych. Wszystkie analizowane roztwory liposacharydu LPS były odpowiednio rozcieńczane w 0,01 M PBS o pH 7,4 do uzyskania stężeń w zakresie od 5 10^-10 do 5 10^-21 g/mL. Elektrody po każdym etapie modyfikacji charakteryzowano techniką CV lub techniką EIS. Badania zdolności detekcji i czułości elektrody względem LPS prowadzono po naniesieniu 10 μL przygotowanych roztworów LPS na powierzchnię elektrody i inkubacji próbki przez 30 minut.

Badanie działania biosensora otrzymanego według opisu powyżej, zastosowanego do pomiarów elektrochemicznych w układzie trójelektrodowym.

Charakterystykę oraz właściwości otrzymanego biosensora wykrywającego obecność lipopolisacharydu Escherichia coli serotyp O26:B6 badano dwiema technikami: woltamperometrią cykliczną (CV) oraz elektrochemiczną spektroskopią impedancyjną (EIS). Pomiary techniką CV oraz EIS przeprowadzono używając potencjostatu/ galwanostatu firmy Metrohm Autolab, Holandia, model M204. Wszystkie pomiary wykonano w celce pomiarowej zawierającej modyfikowaną elektrodę złotą jako elektrodę pracującą, elektrodę odniesienia Ag/AgCl (0,1 M NaCl) oraz elektrodę platynową zastosowaną jako elektroda pomocnicza, w roztworze zawierającym mieszaninę 1 mM [K3Fe(CN)6] i [K4Fe(CN)6] rozpuszczoną w 0,1 M roztworze (PBS) o pH 7,0 w temperaturze pokojowej. W przypadku techniki CV za każdym razem stosowano prędkość skanowania wynoszącą 100 mV/s. W przypadku metody EIS eksperymenty prowadzono przy potencjale obwodu otwartego w zakresie częstotliwości od 0,1 Hz do 10 000 Hz i amplitudzie 10 mV. Eksperymenty charakteryzujące modyfikację elektrody oraz jej czułość względem obecności LPS Escherichia coli serotyp O26:B6 badano techniką woltamperometrii cyklicznej (CV) wykonując pomiary w zakresie potencjałów od -0.3 do 0.65 V w roztworze 0,1 M PBS zawierającym 1 mM Fe(CN)6³·/⁴’ użytego jako próbnik redoks. Czułość modyfikowanych elektrod badano względem roztworów zawierających od 5 10^-13 do 5 10^-4 g/mL endotoksyny rozpuszczonej w roztworze PBS. W przypadku eksperymentów wykonanych z użyciem złożonych pod względem składu próbek biologicznych (LPS dodany do próbek mysiego moczu lub surowicy ludzkiej krwi w stosunku objętościowym 1:1 (v:v), tzn. końcowe stężenie v/v mysiego moczu lub surowicy ludzkiej krwi w badanej próbie wynosiło 50%) wykonywano pomiary w zakresie stężeń 2,5 10^-15 i 2,5 10^-9 g/mL stosując technikę CV oraz EIS.

Za każdym razem nanoszono na elektrodę 10 μL analizowanego roztworu LPS i wykonywano pomiar po czasie 30 minut. Uzyskane wyniki jednoznacznie potwierdzają zmiany prądowe obserwowalne po każdym etapie modyfikacji elektrody co pokazano na fig. 2. Dla czystej elektrody złotej zaobserwowano dwa odwracalne piki katodowy i anodowy dla których separacja pików AEp wynosi 70 mV, po modyfikacji elektrody cystaminą obserwowane są również piki o podobnym charakterze, z separacją pików wynoszącą 71 mV, jednakże woltamperogram przesunięty jest w zakres potencjałów ujemnych. Modyfikacja koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH powoduje otrzymanie podobnego woltamperogramu, który uzyskano dla czystej elektrody złotej. W niektórych przypadkach modyfikacji elektrody obserwuje się również obniżenie wysokości prądów otrzymanych woltamperogramów. Natomiast inkubacja w 1% roztworze BSA powoduje obniżenie zarówno prądów katodowych, jak i anodowych oraz wzrost separacji pików do wartości wynoszącej 129 mV.

Pomiary wykonane dla tak zmodyfikowanej elektrody po następujących po sobie procesach 30-minutowych inkubacji w roztworach LPS o ściśle określonym stężeniu endotoksyny wskazują na obniżenie kolejno po sobie zarówno pików katodowych, jaki i anodowych, w zakresach stężeń od 5 10^-13 do 5 10^-4 g/mL LPS rozpuszczonego roztworze PBS.

Na Fig. 2 przedstawiono uzyskane woltamperogramy cykliczne w zakresach stężeń od 5 10^-4 do 5 10^-13 g/mL LPS na powierzchni zmodyfikowanej elektrody w odniesieniu do wyników otrzymanych na poszczególnych etapach modyfikacji elektrody złotej. Pomiary wykonywano po inkubacji, zaczynając od roztworów o mniejszym stężeniu 5 10^-13 g/mL. LPS Escherichia coli serotyp O26:B6 rozpuszczonego w roztworze PBS.

Fig. 2 przedstawia wybrane woltamperogramy uzyskane dla najniższych stężeń LPS oraz kolejno co drugie badane stężenie LPS. Otrzymane woltamperogramy jednoznacznie wskazują, że za każdym razem po inkubacji w roztworze o wyższym stężeniu uzyskiwane woltamperogramy posiadają mniejszą wysokość piku katodowego oraz piku anodowego, a także wraz ze wzrostem stężenia LPS rośnie separacja pików AEp. Zmiany obserwowane w wysokościach prądów uzyskanych woltamperogramów są następstwem oddziaływania koniugatu peptydowego DAL-PEG-DK5-PEG-OH z obecnym w badanej próbce LPS Escherichia coli serotyp O26:B6.

Na fig. 2: pokazano woltamperogramy cykliczne dla pomiaru elektrody na każdym etapie otrzymywania: a) czystej elektrody złotej b) elektrody złotej po modyfikacji cystaminą, c) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym PEG-DK5-PEG-OH d) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz peptydem DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA e) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA, po inkubacji w roztworze LPS o stężeniu 5 10^-13 g/mL oraz odpowiednio po nałożeniu wyższych stężeń f) 5 10^-12 g/mL g) 5 10’¹⁰ g/mL h) 5 10’8 g/mL i) 5 10’⁶ g/mL j) 5 10’4 g/mL, zarejestrowane w 0,1 M roztworze PBS o pH 7,0 zawierającymi mM Fe[(CN)6]³·/⁴’, prędkość skanowania 100 mV/s.

W celu detekcji LPS rozpuszczonego w PBS z dodatkiem mysiego moczu lub surowicy w stosunku (1:1, v:v), obserwowano znaczące zmiany kształtu woltamperogramów po każdym procesie modyfikacji powierzchni elektrody złotej (Au) co zostało przedstawione na Fig. 3 oraz kolejno: cystaminą (Au/Cyst), koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH (Au/Cyst/kon.pept) oraz koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA (Au/Cyst/kon.pept/BSA). Elektrochemiczną detekcję LPS w tym przypadku prowadzono w zakresie stężeń 2,5 10’¹⁵ i 2,5 10^-9. Uzyskane rezultaty jednoznacznie wskazują na bardzo wysoką czułość mierzonych elektrod względem LPS.

Na reprezentatywnej Fig. 3 będącej graficzną interpretacją przeprowadzonych pomiarów umieszczono woltamperogramy cykliczne zarejestrowane po inkubacji 10 μL roztworów LPS otrzymanych przez rozpuszczenie LPS w PBS a następnie a) 50% mysim moczu w PBS oraz b) 50% ludzkim osoczu w PBS na powierzchni elektrody w czasie 30 min. Po inkubacji elektrody modyfikowanej koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH w roztworze LPS o stężeniu 2,5 10’¹⁵ (LPS 2,5E-15) rozpuszczonym w 0,1 M PBS o pH 7,0 z 50% dodatkiem mysiego moczu lub 50% dodatkiem ludzkiego osocza w obu przypadkach następuje wyraźne obniżenie prądów odpowiedzi elektrodowej w obecności 1 mM Fe[(CN)6]³’/⁴ użytego jako znacznika redoks oraz przy prędkości skanowania 100 mV/s, co świadczy o oddziaływaniu badanego biosensora z LPS zawieszonym w badanych roztworach. Na fig. 3 pokazano woltamperogramy cykliczne potwierdzające kolejne po sobie procesy modyfikacji elektrody złotej zarejestrowane dla: a] czystej elektrody złotej, b] elektrody złotej po modyfikacji cystaminą, c) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym PEG-DK5-PEG-OH d) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz peptydem DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA e) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA, po inkubacji w roztworze LPS o stężeniu 5 10’¹⁵ g/mL A) w mysim moczu, B) w ludzkim osoczu, zarejestrowane w 0,1 M roztworze PBS o pH 7,0 zawierającymi mM Fe[(CN)6]³'^/4', prędkość skanowania 100 mV/s.

Technika elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS) została użyta do scharakteryzowania czułości zmodyfikowanej elektrody złotej pokrytej koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH względem roztworów o rożnych stężeniach badanego liposacharydu. Czułość modyfikowanych elektrod badano w zakresie od 5 10’²¹ do 5 10’¹⁰ g/mL LPS Escherichia coli serotyp O26:B6 rozpuszczonego w roztworze PBS. Elektrodę złotą zmodyfikowano kolejno: cystaminą, koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH oraz wysycono niespecyficzne miejsca wiążące poprzez inkubację w 1% roztworze BSA. Wszystkie pomiary przeprowadzono przy potencjale obwodu otwartego w zakresie częstotliwości od 0,1 Hz do 10 000 Hz i amplitudzie 10 mV, w roztworze 0,1 M PBS zawierającym 1 mM of Fe(CN)6³'^/4'.

Dane pomiarowe uzyskane metodą impedancyjną zostały opracowane poprzez zastosowanie zmodyfikowanego modelu obwodu zastępczego Randlesa R(Q(RW)) (Schemat umieszczony wewnątrz Fig. 4 składający się z: Rs - rezystancja roztworu, Ret - rezystancja przeniesienia ładunku, W - rezystancja dyfuzyjna Warburga oraz CPE - element stałofazowy). Wszystkie widma impedancyjne przedstawiono w postaci wykresów Niquista. Na Fig. 4 przedstawiono wykresy Niquista obrazujące kolejne etapy modyfikacji elektrody złotej, przedstawiając punktowo dane eksperymentalne, natomiast linią czerwoną przedstawiono dopasowanie liniowe z uwzględnieniem dopasowania obwodu zastępczego. Obliczone wartości rezystancji przeniesienia ładunku wskazują na bardzo duże zmiany po każdym etapie modyfikacji. Wartości te są różne dla czystej niemodyfikowanej elektrody złotej (Au), modyfikowanej cystaminą (Au/Cyst), elektrody modyfikowanej koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH (Au/Cyst/kon.pept) oraz dla elektrody inkubowanej w 1% BSA(Au/Cyst/kon.pept/BSA). Powyższe zmiany jednoznacznie wskazują na efekt modyfikacji elektrody, która w następnym etapie została wy korzystana do detekcji wybranego typu liposacharydu LPS (LPS 5E-21). Powyższe zmiany obserwowalne są dla każdej modyfikowanej elektrody w sposób przedstawiony powyżej. Fig. 4: Wykresy Niquista zarejestrowane dla: czystej elektrody złotej, b) elektrody złotej po modyfikacji cystaminą, c) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH d) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz peptydem DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA e) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz peptydem DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA po inkubacji w roztworze LPS o stężeniu 5 10^-21 g/mL, zarejestrowane w 0,1 M roztworze PBS o pH 7,0 zawierającym 1 mM Fe[(CN)6]³'^/4·. Punkty oznaczają wartości punktowe otrzymane doświadczalnie, natomiast linia ciągła przedstawia dane dopasowania uzyskane z dopasowania odpowiedniego elektrycznego obwodu zastępczego. Z wykresów wynika, że modyfikowana peptydem elektroda wykazuje zmiany rezystancji przeniesienia ładunku w odpowiedzi na obecność w badanej próbce LPS w stężeniu 5 10^-21 g/mL.

Tak zmodyfikowaną elektrodę badano względem roztworów LPS w następujących po sobie zakresach stężeń zaczynając od najmniejszego stężenia, które wyniosło 5 10^-21 aż do stężenia 5 10^-10 g/mL. Analizowane roztwory LPS inkubowano przez 30 minut na powierzchni elektrody po czym wykonywano pomiar rezystancji. Otrzymane wyniki badań pozwalają na jednoznaczne stwierdzenie, że elektroda złota modyfikowana zgodnie z procedurą opisaną powyżej wykazuje zmiany rezystancji przeniesienia ładunku wraz ze wzrostem inkubowanego stężenia badanego liposacharydu LPS co zostało przedstawione na wykresie Niquista Fig. 5.

We wszystkich przypadkach parametr dopasowania (Chi-kwadrat) mieści się w przedziale od 10^-5 do 10'4, co wskazuje na bardzo dobre dopasowanie wybranego modelu zastępczego do danych eksperymentalnych. Na fig. 5 pokazano wykresy Niquista zarejestrowane dla: elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA po inkubacji w roztworach LPS o stężeniach od 5 10^-21 g/mL do 5 10^-10 g/mL, zarejestrowane w 0,1 M roztworze PBS o pH 7,0 zawierającym 1 mM Fe[(CN)6]³‘^/4·. Punkty oznaczają wartości punktowe otrzymane doświadczalne, natomiast linia ciągła przedstawia dane dopasowania uzyskane z dopasowania odpowiedniego elektrycznego obwodu zastępczego. Z wykresów wynika, że wraz ze wzrostem inkubowanego stężenia LPS na elektrodzie wzrasta wartość rezystancji przeniesienia ładunku, co zostało graficznie przedstawione na Fig. 6. Zależność pomiędzy wyznaczoną wartością (Rct) - rezystancja przeniesienia ładunku, a logarytmem stężenia badanego liposacharydu LPS, przedstawiona na rysunku fig. 6 wskazuje na liniową zależność odpowiedzi elektrody wraz ze zmianą stężenia inkubowanego LPS wyrażoną równaniem regresji liniowej wynoszącej Rct = 0,898 log C[LPS] + 21,757 i współczynniku korelacji wynoszącym 0,966 - Fig. 6.

Na fig. 6: pokazano zależność rezystancji przeniesienia ładunku (Rct) i logarytmu inkubowanego stężenia LPS.

W przypadku detekcji LPS w roztworze PBS z dodatkiem 50% (v/v) mysiego moczu lub surowicy pomiary z wykorzystaniem metody EIS wykonywano analogicznie do opisanej wyżej metody CV, tzn., po każdym procesie modyfikacji powierzchni elektrody złotej oraz po inkubacji w odpowiednich roztworach LPS.

Elektrodę złotą zmodyfikowano najpierw cystaminą, następnie koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH oraz po nałożeniu 1 % BSA, zgodnie z procedurą opisaną powyżej. Tak zmodyfikowaną powierzchnię biosensora wykorzystano do pomiarów techniką EIS w zakresie stężeń 2,5 10^-15 i 2,5 10^-9. Uzyskane rezultaty jednoznacznie wskazują na bardzo wysoką czułość elektrod. Na reprezentatywnej fig. 7 będącej graficzną interpretacją przeprowadzonych pomiarów elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej zarejestrowanych po inkubacji 10 μL roztworów LPS otrzymanych poprzez rozpuszczenie LPS w PBS oraz w a) mysim moczu oraz b) ludzkim osoczu na powierzchni elektrody w czasie 30 min.

Wartości punktowe otrzymane doświadczalnie zostały umieszczone na Fig. 7, natomiast linia ciągła przedstawia dane dopasowania uzyskane z dopasowania odpowiedniego elektrycznego obwodu zastępczego. W przypadku badań po inkubacji 10 μL roztworów LPS otrzymanych poprzez rozpuszczenie LPS w PBS a następnie w:

a) mysim moczu w stosunku 1:1, (v/v) oraz b) ludzkim osoczu w stosunku 1:1, (v/v) dane dopasowania przedstawiono linią kropkowaną. Wszystkie eksperymenty EIS prowadzono w 0,1 M roztworze PBS o pH 7,0 zawierającym 1 mM Fe[(CN)6]³‘^/4· przy potencjale obwodu otwartego w zakresie częstotliwości od 0,1 Hz do 10 000 Hz i amplitudzie 10 mV.

Uzyskane wyniki wskazują na wzrost rezystancji przeniesienia ładunku badanej elektrody (Rct) modyfikowanej peptydem DAL-PEG-DK5-PEG-OH w obecności LPS w próbkach zarówno z dodatkiem

50% mysiego moczu, jak i 50% ludzkiego osocza. Obliczone wartości rezystancji przeniesienia ładunku z zastosowaniem zmodyfikowanego modelu obwodu zastępczego Randlesa R(Q(RW)) po inkubacji LPS w 50% mysim moczu wzrastają niemal 3 razy w stosunku do elektrody modyfikowanej koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA. W przypadku inkubacji LPS w 50% ludzkim osoczu wartości rezystancji przeniesienia ładunku wzrastają o wartość około 110 Ω.

Na fig. 7 pokazano wykresy Niquista zarejestrowane dla: a) czystej elektrody złotej, b) elektrody złotej po modyfikacji cystaminą, c) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym PEG-DK5-PEG-OH d) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz peptydem DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA e) elektrody modyfikowanej cystaminą oraz koniugatem peptydowym DAL-PEG-DK5-PEG-OH po nałożeniu 1% BSA, po inkubacji w roztworze LPS o stężeniu 5 10^-15 g/mL A) w mysim moczu, B) w ludzkim osoczu, zarejestrowane w 0,1 M roztworze PBS o pH 7,0 zawierającym 1 mM Fe[(CN)6]^{3 /4}. Punkty oznaczają wartości punktowe otrzymane doświadczalnie, natomiast linia ciągła przedstawia dane dopasowania uzyskane z dopasowania odpowiedniego elektrycznego obwodu zastępczego.

Podsumowując, przeprowadzone badania odpowiedzi elektrodowej z wykorzystaniem techniki CV oraz EIS wskazują, że elektroda modyfikowana w wyżej przedstawiony sposób wykrywa obecność LPS w stężeniach 2,5 10^-15 i 2,5 10^-9 g/mL w 50% mysim moczu oraz w 50% ludzkim osoczu w PBS. Natomiast, w przypadku LPS rozpuszczonego wyłącznie w czystym PBS możliwa jest detekcja endotoksyny LPS już na poziomie 5 10^-21 do 5 10^-10 g/mL.

Claims (10)

1. Biosensor do wykrywania i pomiaru lipopolisacharydu bakteryjnego LPS będący modyfikowaną elektrodą zawierającą złoto, znamienny tym, że stanowi elektrodę wykonaną co najmniej w części ze złota na której powierzchni wytworzona jest warstwa z koniugatu peptydowego o sekwencji Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-O20c-Ile-Lys-Lys-lle-Leu-Ser-lys-lle-Lys-Lys-

-Leu-Leu-O20c-OH poprzez chemiczne jego osadzenie poprzez jego inkubację w elektrodzie w roztworze zawierającym od 0,5 mM do 10 mM koniugatu.

2. Biosensor według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się elektrodę dyskową mającą średnicę minimum 1,6 mm a maksimum 3 mm.

3. Biosensor według zastrz. 1, znamienny tym, że elektroda stanowi drukowaną elektrodę o średnicy minimum 1,6 mm i maksimum 4 mm.

4. Biosensor według zastrz. 1, znamienny tym, że elektroda stanowi materiał pokryty złotem.

5. Biosensor według zastrz. 4, znamienny tym, że materiałem pokrytym złotem jest szkło, krzem.

6. Biosensor według zastrz. 4-5, znamienny tym, że elektroda ma wymiary co najmniej 10 x 10 mm.

7. Sposób otrzymywania biosensora do wykrywania i pomiaru lipopolisacharydu bakteryjnego LPS będący modyfikowaną elektrodą zawierającą złoto, znamienny tym, że elektrodę wykonaną co najmniej w części ze złota poddaje się modyfikacji przy użyciu roztworu składającego się z minimum 20 mM do 100 mM cystaminy rozpuszczonej w alkoholu lub wodzie, w którym inkubuje się elektrodę aż do wytworzenia na powierzchni elektrody warstwy samoorganizującej zawierającej wyeksponowane wolne grupy aminowe a następnie elektrodę umieszcza się w roztworze koniugatu peptydowego o sekwencji Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-O20c-lle-Lys-Lys-lle-Leu-Ser-lys-lle-Lys-Lys-Leu-Leu-O20c-OH rozpuszczonym w dimetylosulfotlenku DMSO lub dimetyloformamidzie DMF w stężeniu co najmniej 0,5 mM i maksymalnie 10 mM, a ponadto reakcję przyłączenia koniugatu peptydowego przeprowadza się w kilku etapach, gdzie w pierwszym etapie do roztworu DMSO lub DMF zawierającego od 0,1 M do 1 M 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu EDC i od 0,05 M do 1 M N-hydroksysukcynoimidu NHS oraz od 0,1 M do 1 M trietyloaminy dodaje się roztwór koniugatu peptydowego o sekwencji Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg-O20c-Ile-Lys-Lys-Ile-Leu-Ser-lys-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-

-O20c-OH zawierającego grupy ochronne 9H-fluoren-9-ylometoksykarbonylową Fmoc oraz grupy ochronne w łańcuchu bocznym tak, aby uzyskać stężenie koniugatu od 0,5 mM do 10 mM związku, zaś w kolejnym etapie usuwa się grupę 9H-fluoren-9-ylometoksykarbonylową Fmoc z N-końca koniugatu peptydowego znanym sposobem w roztworze od 10% do 25% (v:v) piperydyny w roztworze DMF, następnie elektrodę obmywa się i umieszcza w mieszaninie zawierającej od 95 do 100% (v:v) kwasu trifluorooctowego, od 1% do 2,5% H2O i od 1% do 2,5% triisopropylosilanu w celu pozbycia się wszystkich grup ochronnych łańcucha bocznego, a po przeprowadzeniu pomiarów elektrochemicznych potwierdzających proces modyfikacji powierzchni elektrody, elektrodę umieszcza się na minimum od 10 do 60 minut w roztworze od 0,5% do 3% albuminy wołowej w celu zablokowania wolnych grup aminowych wiążących na elektrodzie.

8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stosuje się elektrodę dyskową mającą średnicę minimum 1,6 mm a maksimum 3 mm.

9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że elektroda stanowi drukowaną elektrodę o średnicy minimum 1,6 mm i maksimum 4 mm.

10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że elektroda stanowi materiał pokryty złotem.

11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że materiałem pokrytym złotem jest szkło, krzem. 12. Sposób według zastrz. 10-11, znamienny tym, że elektroda ma wymiary co najmniej

10 x 10 mm.