PL249308B1 - Peptydowe pochodne 1-(3-hydroksypropylo)-1H-pirolo-2,5-dionu, zastosowanie medyczne tych związków oraz sposób ich otrzymywania - Google Patents

Peptydowe pochodne 1-(3-hydroksypropylo)-1H-pirolo-2,5-dionu, zastosowanie medyczne tych związków oraz sposób ich otrzymywania

Info

Publication number
PL249308B1
PL249308B1 PL445129A PL44512923A PL249308B1 PL 249308 B1 PL249308 B1 PL 249308B1 PL 445129 A PL445129 A PL 445129A PL 44512923 A PL44512923 A PL 44512923A PL 249308 B1 PL249308 B1 PL 249308B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
derivative
pyrrol
dioxo
dihydro
compounds
Prior art date
Application number
PL445129A
Other languages
English (en)
Other versions
PL445129A1 (pl
Inventor
Janusz RACHOŃ
Janusz Rachoń
Mateusz Daśko
Karol Biernacki
Olga Ciupak
Sebastian DEMKOWICZ
Sebastian Demkowicz
Original Assignee
Politechnika Gdanska
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Politechnika Gdanska filed Critical Politechnika Gdanska
Priority to PL445129A priority Critical patent/PL249308B1/pl
Publication of PL445129A1 publication Critical patent/PL445129A1/pl
Publication of PL249308B1 publication Critical patent/PL249308B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/44—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/444—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having two doubly-bound oxygen atoms directly attached in positions 2 and 5
    • C07D207/448—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having two doubly-bound oxygen atoms directly attached in positions 2 and 5 with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms directly attached to other ring carbon atoms, e.g. maleimide
    • C07D207/452—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members having two doubly-bound oxygen atoms directly attached in positions 2 and 5 with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms directly attached to other ring carbon atoms, e.g. maleimide with hydrocarbon radicals, substituted by hetero atoms, directly attached to the ring nitrogen atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/4015—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. piracetam, ethosuximide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/425—Thiazoles
    • A61K31/427—Thiazoles not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings
    • C07D417/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Przedmiotem wynalazku są związki chemiczne, będące akceptorami Michaela, charakteryzujące się strukturą chemiczną umożliwiającą ich wysoką reaktywność w reakcjach addycji Michaela, czyli addycji nukleofilowej do α,β-nienasyconych związków karbonylowych czy acylowych. Przedmiotem wynalazku jest pierwsze zastosowanie medyczne peptydowych pochodnych 1-(3-hydroksypropylo)-1H-pirolo-2,5-dionu. Przedmiotem wynalazku jest medyczne zastosowanie peptydowych pochodnych 1-(3-hydroksypropylo)-1H-pirolo-2,5-dionu jako leków, w tym zwłaszcza jako leków przeciwwirusowych o właściwościach inhibitora proteaz cysteinowych, w tym proteazy SARS CoV-2 Mpro oraz innych inhibitorów proteaz cysteinowych. Wynalazek dotyczy również zastosowania tych związków do wykorzystania in vitro np. w diagnostyce jako inhibitorów proteazy cysteinowej, w tym proteazy SARS CoV2 Mpro oraz innych inhibitorów proteaz cysteinowych. W szczególności przedmiotowe związki - peptydowe pochodne 1-(3-hydroksypropylo)-1H-pirolo-2,5-dionu znajdują zastosowanie medyczne jako leki w terapii przeciwwirusowej, a w szczególności w leczeniu infekcji wirusowych wywołanych koronawirusem SARS CoV-2, w tym COVID19 oraz innych koronawirusów odpowiedzialnych za ciężki ostry zespół oddechowy (SARS), zwłaszcza ssaków, w tym ludzi. Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób otrzymywania tych nowych związków na bazie peptydowych pochodnych 1-(3-hydroksypropylo)-1H-pirolo-2,5-dionu.

Description

Przedmiotem wynalazku są związki chemiczne, będące akceptorami Michaela, charakteryzujące się strukturą chemiczną umożliwiającą ich wysoką reaktywność w reakcjach addycji Michaela, czyli addycji nukleofilowej do α,β-nienasyconych związków karbonylowych czy acylowych. Przedmiotem wynalazku jest pierwsze zastosowanie medyczne peptydowych pochodnych 1-(3-hydroksypropylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionu. Przedmiotem wynalazku jest medyczne zastosowanie peptydowych pochodnych 1-(3-hydroksypropylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionu jako leków, w tym zwłaszcza jako leków przeciwwi rasowych o właściwościach inhibitora proteaz cysteinowych, w tym proteazy SARS CoV-2 Mpro oraz innych inhibitorów proteaz cysteinowych (zwanych również jako proteazy tiolowe). Wynalazek dotyczy również zastosowania tych związków do wykorzystania in vitro np. w diagnostyce jako inhibitorów proteazy cysteinowej, w tym proteazy SARS CoV-2 Mpro (ang. main protease- główna proteaza) oraz innych inhibitorów proteaz cysteinowych. W szczególności przedmiotowe związki - peptydowe pochodne 1-(3-hydroksypropylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionu znajdują zastosowanie medyczne jako leki w terapii przeciwwirusowej, a w szczególności w leczeniu infekcji wirusowych wywołanych koronawirusem SARS CoV-2, w tym COVID19 oraz innych koronawirusów odpowiedzialnych za ciężki ostry zespół oddechowy (SARS), zwłaszcza ssaków, w tym ludzi. Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób otrzymywania tych nowych związków na bazie peptydowych pochodnych 1-(3-hydroksypropylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionu. Wynalazek znajduje praktyczne zastosowanie w medycynie, jako odczynnik in vitro, zwłaszcza w diagnostyce.
Z publikacji Discovery of Ketone-Based Covalent Inhibitora of Coronavirus 3CL Proteases for the Potential Therapeutic Treatment of COVID-19. J. Med. Chem. (2020) 63 (21), 12725-12747 znana jest struktura związku przeciwwirusowego pod nazwą PF-07321332.
Wzór 1. Struktura chemiczna związku PF-07321332.
Do chwili obecnej związek PF-07321332 jest jednym z dwóch kandydatów na lek przeciwwirusowy stosowany w potencjalnej terapii COVID-19 (obokMolnupiraviru). Pralek PF-07321332 został specjalnie opracowany do podawania doustnego w celu zablokowania aktywności SARS-CoV-2 Mpro. Jest pochodną związku o nazwie PF-00835231, kandydata klinicznego I fazy (pralek PF-07304814) pierwotnie opracowanego przez firmę Pfizer w latach 2002-2003 przeciwko wirusowi SARS-CoV-1. Związek PF-07321332 wykazuje znaczące różnice w budowie oraz w mechanizmie działania w porównaniu ze związkami chemicznymi będącymi przedmiotem wynalazku o wzorze ogólnym 11.
W publikacji Inhibition Mechanism of SARS-CoV-2 Main Protease by Ebselen andits Derivatives. Nat. Commun. (2021), 12 (1), 3061 raportowana jest struktura związku o nazwie Ebselen identyfikowanego jako silny inhibitor proteazy SARS CoV-2 Mpro.
Wzór 2. Struktura chemiczna Ebselenu.
Pierwotnie Ebselen był wykorzystywany jako syntetyczna organoselenowa pochodna o właściwościach przeciwzapalnych, przeciwutleniających i cytoprotekcyjnych. Działa jako naśladowca peroksydazy glutationowej i może również reagować z peroksyazotynem. Związek ten oraz jego pochodne
PL 249308 Β1 okazały się również bardzo silnymi inhibitorami proteazy SARS CoV-2 Mpro charakteryzując się wartością ICso na poziomie od 0,67 do 2,1 pmol. Niedogodnością tego związku jest możliwość występowania właściwości cytotoksycznych w przypadku stosowania w wyższych dawkach.
W publikacji Boceprevir, GC-376, and Calpain Inhibitora II, XII Inhibit SARS-CoV-2 Viral Replication by Targeting the Viral Main Protease. Celi Res (2020) 30 (8), 678-692 opisywana jest struktura związku o działaniu przeciwwirusowym o nazwie Boceprevir
Wzór 3. Struktura chemiczna Bocepreviru.
Boceprevir jest zatwierdzonym przez FDA inhibitorem proteazy serynowej do leczenia infekcji HCV. Podobnie jak w przypadku proteaz Mpro koronawirusa, rozszczepienie poliproteiny HCV przez wirusową proteazę NS3 uwalnia funkcjonalne białka wirusowe niezbędne do replikacji wirusa. Lek ten był badany wraz z innymi wirusowymi inhibitorami proteaz i wykazano, że hamuje aktywność enzymatyczną Mpro z wartością IC50 równą 4,13 pmol i wykazywał wartość EC50 na poziomie 1,90 pmol wobec wirusa SARS-CoV-2. Niedogodnością tego związku jest potencjalna niska skuteczność wobec pojawiających się nowych mutacji wirusów dróg oddechowych zwłaszcza SARS, w tym SARS-CoV-2, jak również brak działania uniwersalnego wobec szeregu enzymów zaliczanych do grupy proteaz cysteinowych.
Z publikacji Feline Coronavirus Drug Inhibits the Main Protease ofSARS-CoV-2 and Blocks Virus Replication. Nat. Commun. (2020) 11 (1), 4282, znane są struktury związków wykazujących działanie przeciwwirusowe o nazwie GC376 oraz GC373.
GC376
Wzór 4. Struktury chemiczne wodorosiarczynowej pochodnej GC376 oraz aldehydu
GC373.
GC376jest wodorosiarczynowym prolekiem aldehydu GC373, i związki te silnie hamują działanie proteazy Mpro kilku koronawirusów, w tym SARS-CoV-2 (wartość IC50 = 0,40 ± 0,05 pmol dla GC373 oraz IC50 = 0,19 ± 0,04 pmol dla GC376).
Niedogodnością tych związków jest ograniczone spektrum działania wobec grupy enzymów tj. proteaz cysteinowych.
Z publikacji Structure of Mpro from SARS-CoV-2 and Discovery of its Inhibitors. Naturę (2020) 582 (7811) znana jest struktura związku przeciwwirusowego o nazwie N3.
PL 249308 Β1
Wzór 5. Struktura chemiczna związku o nazwie N3.
Związek N3 został zidentyfikowany w toku badań poświęconych projektowaniu nowych struktur związków o potencjalnym działaniu jako inhibitorów proteaz SARS i jest zdolny do specyficznego hamowania proteaz Mpro pochodzących z wielu koronawirusów, w tym SARS-CoV-1 i MERS-CoV. Pochodna N3 jest nieodwracalnym inhibitorem, która tworzy addukt z katalityczną resztą cysteiny w wyniku reakcji addycji Michaela zachodzącej na atomie Οβ ugrupowania winylowego. Związek N3 charakteryzował się inhibicją wobec SARS-CoV-2 z wartością ECso na poziomie 16,77 pmol. Pochodna N3, której mechanizm działania zakłada reakcję addycji Michaela w miejscu aktywnym enzymu, angażuje funkcję nienasyconego estru fenylowego, czyli innego ugrupowania będącego akceptorem Michaela aniżeli w przypadku związków będących przedmiotem wynalazku. Niedogodnością tego związku jest jego wysoka podatność na reakcję hydrolizy, która to reakcja jest charakterystyczna w przypadku struktur związków zawierających wysoce reaktywne estry fenylowe oraz inne ugrupowania zaliczane do tzw. estrów aktywnych.
Z publikacji Structural Basis forthe Inhibition of SARS-CoV-2 Main Protease by Antineoplastic Drug Carmofur. Nat. Struci Mol. Biol. (2020) 27 (6), 529-532 znana jest struktura związku o nazwie Karmofur.
Wzór 6. Struktura chemiczna związku o nazwie Karmofur.
Jest to substancja o właściwościach przeciwnowotworowych, zaliczana do pochodnych 5-fluorouracylu (5-FU) i była stosowana w leczeniu raka jelita grubego poprzez hamowanie ludzkiej kwaśnej ceramidazy. Karmofur hamuje aktywność enzymu SARS-CoV-2 Mpro in vitro z wartością ICso 1,82 μίτιοΙ oraz replikację wirusa na poziomie parametru ECso 24,30 μίτιοΙ. Struktura krystaliczna SARS-CoV-2 Mpro w kompleksie z karmofurem potwierdza, że związek w centrum aktywnym enzymu bezpośrednio modyfikuje katalityczną resztę cysteiny z uwolnieniem fragment 5-FU. Związek o nazwie Karmofur wykazuje znaczące różnice w budowie chemicznej oraz wykazuje inny mechanizm inhibicji enzymu SARS-CoV-2 Mpro w porównaniu ze związkami będącymi przedmiotem wynalazku. Niedogodnością tego związku jest występowanie właściwości cytotoksycznych (szczególnie w wysokich dawkach), charakterystycznych dla szerokiej grupy związków o właściwościach przeciwnowotworowych, co negatywnie wpływa na profil bezpieczeństwa stosowania leku.
W publikacji X-ray Screening Identifies Active Site and Allosteric Inhibitors of SARS-CoV-2 Main Protease. Science (2021) 372 (6542), 642-646 opisywana jest struktura związku o nazwie Kalpeptyna.
Wzór 7. Struktura chemiczna Kalpeptyny.
PL 249308 Β1
Kalpeptyna jest jednym z najsilniejszych inhibitorów enzymu Mpro charakteryzującym się wartością parametru ECso = 72 nmol. Struktura Kalpeptyny wiąże się kowalencyjnie poprzez swoją grupę aldehydową z resztą cysteiny C145, prowadząc do otrzymania pochodnej tiohemiacetalowej i wykazując odmienny mechanizm działania wobec enzymu SARS-CoV-2 Mpro w porównaniu z wynalazkiem. Niedogodnością tego związku jest jego podatność na procesy utleniania, wynikająca z obecności funkcji aldehydowej jak również brak możliwości tworzenia stabilnego wiązania kowalencyjnego w miejscu aktywnym enzymu, co może skutkować odwracalnością reakcji enzymatycznej i ograniczeniami w badaniach klinicznych.
W tej samej publikacji tj. X-ray Screening Identifies Active Site and Allosteric Inhibitors od SASS-CoV-2 Main Protease. Science (2021) 372 (6542), 642-646 opisywana jest struktura innego związku przeciwwirusowego o nazwie Pelitynib.
Wzór 8. Struktura chemiczna Pelitynibu.
Pelitynib został opracowany jako środek przeciwnowotworowy wiążący się z resztą cysteiny w miejscu aktywnym inhibitora receptora naskórkowego czynnika wzrostu kinazy tyrozynowej. Z uwagi na fakt, iż Pelitynib jest katalizowanym aminą akceptorem Michaela, przewidywano, że będzie on również ukierunkowany na katalityczną cysteinę; jednak mapa gęstości elektronowej struktury kokryształu Mpro z Pelitynibem pokazuje, że wiąże się on między dwoma protomerami Mpro. Fragment struktury Pelitynibu zawierający funkcję eteru etylowego styka się z T26, N119, N142 i G143 jednego protomeru, co zaburza dziurę oksyanionową niezbędną do aktywności Mpro. Przeprowadzone badania nad mechanizmem inhibicji Pelitynibu dowodzą, iż znacząco różni się on od mechanizmu hamowania enzymu SARS-CoV-2 Mpro. Niedogodnością tego związku jest występowanie typowych efektów ubocznych charakterystycznych dla związków o działaniu przeciwnowotworowym (w tym cytotoksyczności), co może znacznie ograniczać jego zastosowanie w praktyce klinicznej.
Z publikacji Bioconjugate Chemistry (2010), 21(10), 1728-1743 znane są struktury l^-Optimization of the N-Lost Drugs Melphalan and Bendamustine: Synthesis and Cytotoxicity of a New Set of Dendrimer-Drug Corjugates as TumorTherapeutic Agents hydroksyetylo)-1H-pirolo-2,5-dionowych pochodnych Melfalanu i Bendamustyny. Niedogodnością tych związków jest ich wysoka cytotoksyczność charakterystyczna dla związków przeciwnowotworowych, znacznie obniżająca możliwość ich powszechnego i uniwersalnego stosowania szczególnie w wysokich dawkach leku.
pochodna Melfalanu
pochodna Bendamustyny
Wzór 9. Struktury chemiczne pochodnych Melfalanu i Bendamustyny.
PL 249308 Β1
Powszechnie wiadomo, iż Bendamustyna i Melfalan są skutecznymi lekami, wykorzystywanymi w leczeniu szeregu chorób nowotworowych, w tym: przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) czy raka piersi. Wykazują również liczne działania niepożądane ograniczające ich wykorzystanie w praktyce klinicznej. Z tego powodu 1-(2-hydroksyetylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionowe pochodne Bendamustyny i Melfalanu wykorzystano do zaprojektowania i otrzymania koniugatów typu lek cytostatyczny-dendrymer w celu akumulacji komórek nowotworowych przez endocytozę. 1-(2-hydroksyetylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionowy fragment struktury koniugatów prowadził do selektywnego uwalniania cytostatyków w komórkach nowotworowych raka sutka MCF-7 i MDA-MB-231. Estryfikacja Bendamustyny za pomocą łącznika 1-(2-hydroksyetylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionowego silnie zwiększyła stabilność hydrolityczną cząsteczki. Opisane pochodne, wykazują częściowe podobieństwo strukturalne (obecność ugrupowania 1-(2-hydroksyetylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionowego) do związków będących przedmiotem zgłoszenia, wykazują jednocześnie istotne różnice w budowie rdzenia cząsteczki oraz charakteryzują się odmiennymi właściwościami determinującymi ich odmienne zastosowanie głównie jako substancji przeciwnowotworowych.
Z dokumentu WO2016207098 A1 2016-12-29 Preparation ofantibody drug corjugates ofkinesin spindle protein (KSP) inhibitora with anti-CD123-antibodies, znany jest związek o wzorze:
Wzór 10. Struktura chemiczna pochodnej wykorzystywanej w syntezie koniugatów przeciwciało lek (ADC).
Związek został wykorzystany do opracowania wynalazku dotyczącego koniugatów przeciwciało lek (ADC), aktywnych metabolitów wspomnianych ADC, sposobów wytwarzania wspomnianych ADC, zastosowania wspomnianych ADC do leczenia i/lub zapobiegania chorobom oraz zastosowania wspomnianych ADC do wytwarzania leków do leczenia i/lub zapobiegania chorobom, w szczególności chorobom hiperproliferacyjnym i angiogennym. Wynalazek można stosować jako lek stosowany w monoterapii lub też w połączeniu z innymi lekami lub dalszymi środkami terapeutycznymi. Podobnie jak w poprzednim przykładzie, opisana pochodna, choć wykazuje częściowe podobieństwo strukturalne (obecność ugrupowania 1-(2-hydroksyetylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionowego) do związków będących przedmiotem wynalazku, wykazuje jednocześnie istotne różnice w budowie rdzenia cząsteczki oraz charakteryzuje się odmiennymi właściwościami oraz zastosowaniem. Nie są znane jednakże jego aktywności wobec enzymów z grupy proteaz cysteinowych w tym proteazy SARS-CoV-2 Mpro. Ponadto obecność w strukturze związku estrów tert-butylowych może negatywnie wpływać na zdolności wiązania się związku w miejscu aktywnym enzymu proteazy SARS-CoV-2 Mpro w wyniku występowania dużej zawady sferycznej.
Wciąż poszukuje się związków o wysokiej selektywności oraz możliwości zahamowania aktywności wielu enzymów z grupy proteaz cysteinowych, mogących znaleźć zastosowanie medyczne, zwłaszcza przeciwwirusowe, jak również jako odczynniki do stosowania in vitro jako inhibitory, w tym w diagnostyce, co stanowiło cel wynalazku. Wynalazek dotyczy zwłaszcza inhibitora SARS-CoV-2 Mpro. Wynalazek charakteryzuje się brakiem efektów ubocznych działań. Wynalazek cechuje się następującymi efektami: wysoką aktywnością hamującą wobec enzymów wirusowych, w tym SARS zwłaszcza SARS-CoV-2 Mpro oraz innych proteaz cysteinowych jak również niską cytotoksycznością wpływającą korzystnie na profil bezpieczeństwa stosowania leku, oraz szeroki profil działania.
Przedmiotem wynalazku są nowe związki chemiczne tj. peptydowe pochodne 1-(3-hydroksypropylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionu o wzorze ogólnym 11:
PL 249308 Β1
wzór 11 w postaci wybranego według wynalazku estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walinoglicyny (6a):
lub wybranego według wynalazku estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propylo-A/2-(acetylo-L-walino)-A/6-(tert-butoksykarbonylo)-L-lizynoglicyny (6f)
lub jej wybranej pochodnej w postaci trifluorooctanu 2-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1H-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walino-L-lizynoglicyny (7f)
nh3cf3coo
Wynalazek dotyczy również związków chemicznych o wzorze ogólnym 11:
wzór 11 w postaci estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walinoglicyny (6a):
PL 249308 Β1 lub pochodnej estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propylo-A/2-(acetylo-L-walino)-/\/6ferf-butoksykarbonylo)-L-lizynoglicyny (6f):
O w postaci trifluorooctanu 2-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walino-L-lizyny
NH3CF3COO (7f) do zastosowanja jako ιθ^
Korzystnie są to leki przeciwwirusowe, korzystnie leki o działaniu inhibitora proteazy SARS CoV-2 Mpro lub innych inhibitorów proteaz cysteinowych.
Wynalazek to też związki chemiczne o wzorze ogólnym 11:
wzór 11
W postaci estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walinoglicyny (6a):
lub pochodnej estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propylo-A/2-(acetylo-L-walino)-/\/6-(ferf-butoksykarbonylo)-L-lizynoglicyny (6f):
PL 249308 Β1 w postaci trifluorooctanu 2-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walino-L-walino-L-lizyny (7f) do zastosowania in vitro jako inhibitory proteaz cysteinowych, zwłaszcza SARS CoV-2 Mpro.
NH3CF3COO
Sposób otrzymywania związków o wzorze ogólnym 11:
wzór 11 w postaci estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-7/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walinoglicyny (6a):
lub estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propylo-A/2-(acetylo-L-walino)-A/6-(tert-butoksykarbonylo)-L-lizynoglicyny (6f):
Charakteryzuje się według wynalazku tym, że sposób przeprowadza się kilkuetapowo według schematów 1,2:
PL 249308 Β1
podczas którego
a) w pierwszym etapie syntezy otrzymuje się pochodną trifluorooctanu estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1 /-/-pirol-1-ilu)propylu glicyny i w tym celu bezwodnik maleinowy poddaje się reakcji cykloaddycji, korzystnie Dielsa-Aldera z furanem prowadzącej do otrzymania bicyklicznej pochodnej (1), zaś związek (1) traktowany jest 3-aminopropan-1-olem w obecności trietyloaminy lub innej zasady organicznej lub nieorganicznej w rozpuszczalniku prowadząc do otrzymania pochodnej (2), a w kolejnym kroku, pochodna (2) poddawana jest odwrotnej reakcji cykloaddycji poprzez ogrzewanie w toluenie lub innym rozpuszczalniku, wyniku której otrzymywana jest maleimidowa pochodna (3), poddawana w następnej kolejności reakcji sprzęgania z tert-butoksykarbonyloglicyną lub z inną chronioną na A/-końcu pochodną glicyny w obecności chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo) karbodiimidu - EDC-HCI oraz 4-(dimetyloamino)pirydyny - DMAP, a ponadto otrzymana w ten sposób pochodna (4) poddawana jest reakcji z kwasem, najkorzystniej z kwasem trifluorooctowym (TFA) prowadząc do otrzymania pochodnej trifluorooctanu estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilu)propylu glicyny (5), zaś
b) w drugim etapie przeprowadza się reakcje sprzęgania otrzymanego trifluorooctanu estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilu)propylu glicyny (5) z A/-chronionymi aminokwasami, dipeptydami lub tripeptydami z wykorzystaniem odczynników sprzęgających, korzystnie hydroksybenzotriazolu - HOBt oraz tetrafluoroboranu O-(benzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego - TBTU w obecności Ν,Ν-diizopropyloetyloaminy - DIPEA lub innych zasad prowadząc do otrzymania peptydowych pochodnych 1-(3-hydroksypropylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionu (6a, 6f).
Wynalazek to też otrzymywanie trifluorooctanu 2-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walino-L-lizynoglicyny (7f)
nh3cf3coo polegający na tym, że otrzymuje się pochodną w postaci trifluorooctanu 2-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propylo-1-ilo)prpyloacetylo-L-walino-L-lizynoglicyny
ŃH„CF„COO । , . . . . . «
3 (7f) przeprowadzając wcześniej wymieniony etap 1 i 2 otrzymując związek (6f) oraz dodatkowo trzeci etap.
PL 249308 Β1
ETAP 3
polegającą na tym, że dla pochodnej zawierającej w swojej budowie ochronną grupę korzystnie ferf-butoksykarbonylową (BOC) w postaci estru (6f) przeprowadza się reakcje deprotekcji w wyniku traktowania kwasem trifluorooctowym (TFA) prowadząc do otrzymania tej soli trifluorooctanowej (7f).
Korzystnie w pierwszym etapie do syntezy pochodnej (1) w wyniku reakcji cykloaddycji Dielsa-Aldera stosuje się dowolny dien, korzystnie furan.
Korzystnie, pierwszy etap syntezy pochodnej (1) w wyniku reakcji cykloaddycji Dielsa-Aldera przeprowadza się w czasie minimum 30 minut, korzystnie w czasie od 30 minut do 24 godzin.
Korzystnie etap syntezy pochodnej (2) przeprowadza się z wykorzystaniem amin lub ich soli, w rozpuszczalniku organicznym, najkorzystniej w etanolu.
Korzystnie etap syntezy pochodnej (2) przeprowadza się początkowo w obniżonej temperaturze, najkorzystniej w 0°C, następnie w temperaturze pokojowej lub wyższej, najkorzystniej w 70°C, w czasie minimum 1 godziny, korzystnie w czasie od 1 godziny do 24 godzin.
Korzystnie etap syntezy pochodnej (3) obejmujący odwrotną reakcję Dielsa-Aldera przeprowadza się w wyniku ogrzewania pochodnej (2) w rozpuszczalniku organicznym w temperaturze wrzenia, najkorzystniej w toluenie, w czasie od 1 do 24 godzin, najkorzystniej przez 5 godzin.
Korzystnie w etapie syntezy pochodnej (4) oraz wykorzystuje się A/-chronioną pochodną glicyny, najkorzystniej ferf-butoksykarbonyloglicynę.
Korzystnie w etapie syntezy pochodnej (4) obejmującym sprzęganie pochodnej (3) z A/-chronioną pochodną glicyny, stosuje się dowolne odczynniki sprzęgające, najkorzystniej EDOHCI w obecności DMAP.
Korzystnie w etapie syntezy pochodnej (5) obejmującym reakcje deprotekcji ugrupowania tert-butoksykarbonylowego stosuje się stężony kwas trifluorooctowy (TFA) lubjego roztwory, najkorzystniej roztwór TFA w dichlorometanie.
Korzystnie w etapie syntezy pochodnych (6a, 6f) obejmującym sprzęganie pochodnej (5) z odpowiednimi A/-chronionymi aminokwasami, dipeptydami oraz tripeptydami wykorzystuje się dowolne odczynniki sprzęgające, najkorzystniej HOBt oraz TBTU w obecności DIPEA.
Korzystnie w etapie sprzęgania prowadzący do syntezy pochodnych (6a, 6f) prowadzi się w rozpuszczalniku organicznym, najkorzystniej w A/,A/-dimetyloformamidzie (DMF) w czasie minimum 5 minut.
Korzystnie w etapie syntezy pochodnej (7f) obejmującej reakcje deprotekcji ugrupowania tert-butoksykarbonylowego stosuje się stężony kwas trifluorooctowy (TFA) lubjego roztwory, najkorzystniej roztwór TFA w dichlorometanie.
Wybrane związki o wzorze ogólnym 11 charakteryzują się strukturą chemiczną przypominającą budowę naturalnego substratu enzymu proteazy, zwłaszcza SARS CoV-2 Mpro. Ponadto związki o wzorze ogólnym 11 zawierają w swojej budowie istotne z punktu widzenia aktywności biologicznej ugrupowanie 1-(3-hydroksypropylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionu, będące akceptorem Michaela, biorące bezpośredni udział w reakcji enzymatycznej poprzez addycję (znajdującej się w miejscu katalitycznym) grupy tiolowej reszty cysteiny do wiązania α,β-nienasyconego, lub ulegające oddziaływaniom elektrostatycznym w centrum katalitycznym proteazy SARS CoV-2 Mpro oraz innych enzymów określanych jako proteazy cysteinowe. Związki te posiadają farmakofor, który oddziałuje z grupą SH cysteiny i dlatego są uniwersalne do całej grupy proteaz cysteinowych. Zaprojektowanie struktur nowych związków w oparciu o pochodne aminokwasów i peptydów skutkuje znaczną zmianą właściwości fizykochemicznych związków o wzorze ogólnym 11 jak i efektów działania biologicznego, w tym obniżeniem lub całkowitym wyeliminowaniem właściwości toksycznych związków o strukturze ogólnej 11. Właściwości te są często
PL 249308 Β1 parametrem limitującym wykorzystanie leków, zwłaszcza inhibitorów proteazy wirusowej w tym SARS CoV-2 Mpro, w praktyce klinicznej. Związki o wzorze ogólnym 11 wykazują znaczące różnice w stosunku do znanych związków zaliczanych do inhibitorów proteazy cysteinowej, w tym SARS CoV-2 Mpro oraz innych inhibitorów proteaz cysteinowych (zwanych również jako proteazy tiolowe), wynikające z obecności ugrupowań 1-(3-hydroksypropylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionu oraz podstawników R będących pochodnymi aminokwasów i peptydów. Obecność niniejszych ugrupowań wpływa znacząco na siłę oraz efektywność oddziaływania związków w miejscu katalitycznym proteazy cysteinowej zwłaszcza SARS CoV-2 Mpro w wyniku licznych oddziaływań elektrostatycznych stabilizujących kompleks inhibitor-enzym. Ponadto obecność podstawników R będących pochodnymi aminokwasów i peptydów wchodzących w skład fragmentu struktury związków o wzorze ogólnym 11 wpływa korzystnie na właściwości farmakologiczne związków w tym na brak toksyczności oraz na zwiększenie właściwości hydrofobowych rdzenia inhibitora, co w konsekwencji prowadzi do poprawy transportu przedmiotowych związków do komórek, w wyniku ułatwionej penetracji i przenikania przez błony biologiczne. Wybrane związki mają aktywne działanie medyczne i biologiczne, i mają zastosowanie jako leki, a w szczególności jako leki przeciwwirusowe o działaniu inhibitora proteazy cysteinowej, zwłaszcza SARS CoV-2 Mpro i/lub innych inhibitorów proteaz cysteinowych (zwanych również jako proteazy tiolowe), mające zastosowanie zwłaszcza w przeciwwirusowej terapii, w leczeniu infekcji koronawirusowych (w tym COVID19) zwierząt a zwłaszcza ssaków, w tym ludzi. Związki będące przedmiotem wynalazku mają zastosowanie biologiczne jako inhibitory proteazy cysteinowej, w tym SARS CoV-2 Mpro i/lub innych inhibitorów proteaz cysteinowych, w tym np. w diagnostyce i badaniach in vitro.
Wynalazek dotyczy medycznego zastosowania związków jako leki, zwłaszcza przeciwwirusowe i jako odczynnik in vitro, zwłaszcza w diagnostyce.
Metoda otrzymywania jest 2- etapowy obejmujący następujące etapy:
1. Otrzymywanie farmakofora (ten sam dla wszystkich związków);
2. Sprzęganie farmakofora z aminokwasami - otrzymywane są związki końcowe będące przedmiotem wynalazku.
W przypadku związków z grupą BOC prowadzi się dodatkowo etap trzeci.
3. Usuwanie grupy ochronnej BOC dla związków, które takową posiadały i otrzymanie finalnych związków będących przedmiotem wynalazku.
Czyli dla 2 związków jest po prostu dodatkowy etap. Wynalazek opisano bliżej w przykładach wykonania oraz na wzorach ogólnych, gdzie przedstawiono struktury związków chemicznych będących przedmiotem wynalazku. Wynalazek pokazano również jako wzór 11, a stan techniki zilustrowano jako wzór 1-10. Wynalazek przedstawiono również na schematach przedstawiających sposób otrzymywania związków.
Dokładniej metodę przedstawiono na schematach.
Otrzymywanie wybranych związków należących do grupy związków o wzorze ogólnym 11: prowadzone wg sposobu przedstawionego na poniższych schematach 1, 2, 3:
Schemat 1. Synteza trifluorooctanu estru 2-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilu)propylu glicyny (5) (gdzie AcOET - octan etylu, NEts - trietyloamina, EtOH - etanol, EDC«HCI - chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu, DMAP - 4-dimetyloaminopirydyna, TFA - kwas trifluorooctowy).
PL 249308 Β1
Schemat 2 - Etap 2. Synteza dipeptydowych, tripeptydowych, oraz tetra peptydowych pochodnych 1-(3-hydroksypropylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionu (6a-6i) (gdzie DMF - N,N - dimetyloformamid, DIPEA - Ν,Ν-diizopropyloetyloamina, HOBt - hydroksybenzotriazol, TBTU - tetrafluoroboran O-(benzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy).
ETAP 2
Schemat 3 - Etap 3. Synteza trifluoroocta nowych pochodnych 1-(3-hydroksypropylo)-1H-pirolo-2,5-dionu (7f, 7i) (gdzie TFA -kwas trifluorooctowy) - dodatkowy etap.
Etap 3
Etap 2 i w 3 przedstawiono wcześniej na schematach odpowiednio 2, 3 pokazanych wyżej.
Pierwszy etap syntezy (Etap 1, Schemat 1) obejmuje otrzymywanie pochodnej trifluorooctanu estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilu)propylu glicyny (5). W tym celu bezwodnik maleinowy poddaje się reakcji cykloaddycji Dielsa-Aldera zfuranem prowadzącej do otrzymania bicyklicznej pochodnej (1). Następnie związek (1) traktowany jest 3-aminopropan-1-olem w obecności trietyloaminy w etanolu prowadząc do otrzymania pochodnej (2). W kolejnym kroku, pochodna (2) jest poddawana odwrotnej reakcji Dielsa-Aldera poprzez ogrzewanie w toluenie, w wyniku której otrzymywana jest maleimidowa pochodna (3) poddawana w następnej kolejności reakcji sprzęgania z tert-butoksykarbonyloglicyną w obecności EDOHCI oraz DMAP. Otrzymana w ten sposób pochodna (4) poddawana jest reakcji z kwasem trifluorooctowym (TFA) prowadząc do otrzymania pochodnej trifluorooctanu estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/7-pirol-1-ilu)propylu glicyny (5). Kolejny etap syntezy (Etap 2, Schemat 2) obejmuje szereg reakcji sprzęgania otrzymanego trifluorooctanu estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/7-pirol-1-ilu)propylu glicyny (5) z odpowiednimi A/-chronionymi aminokwasami, dipeptydami oraz tripeptydami z wykorzystaniem odczynników sprzęgających tj. HOBt oraz TBTU w obecności DIPEA prowadząc do otrzymania peptydowych pochodnych 1-(3-hydroksypropylo)-1/7-pirolo-2,5-dionu - według wynalazku wybrano związki (6a, 6f). W końcowym etapie (Etap 3, Schemat 3) pochodne zawierające w swojej budowie ochronną grupę tert-butoksykarbonylową (BOC) (6f) zostają poddane reakcji deprotekcji w wyniku traktowania kwasem trifluorooctowym (TFA) prowadząc do otrzymania odpowiednich soli trifluorooctanowych (7f).
Podstawniki „R” w substratach dobiera się stosownie do otrzymywanych produktów końcowych, co jest znane dla osoby biegłej w tej dziedzinie. Poszczególne etapy syntezy, dla wariantów wynalazku, przedstawiono poniżej. Każdy związek otrzymuje się podobnie dobierając substraty w zależności do danych podstawników.
Wynalazek przedstawiono w przykładach wykonania, na wzorze 11 oraz na schematach 1-3 pokazujących etapy 1, 2, 3. Wzór 1-10 to stan techniki.
Przykład wykonania ogólny
Etap 1:
Otrzymywanie 3a,4,7,7a-tetrahydro-4,7-epoksyizobenzofurano-1,3-dionu (1)
W kolbie okrągłodennej umieszczono 10 ml octanu etylu, bezwodnik maleinowy (1 eq, 5 g, 50,99 mmol) oraz furan (1,3 eq, 4,63 g, 67,94 mmol). Tak przygotowaną mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Po tym czasie odsączono otrzymany biały osad i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano 5,93 g produktu 1 z wydajnością 70%.
Wydajność: 70%. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 6,56 (s, 2H), 5,33 (S, 2H), 3,29 (s, 2H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 172,12, 137,17, 82,07, 49,58.
Otrzymywanie 2-(3-hydroksypropylo)-3a,4,7,7a-tetrahydro-1 H-4,7-epoksyisoindolo-1,3( 2H )-dionu (2) W kolbie okrągłodennej umieszczono 20 ml alkoholu etylowego oraz 1 (1 eq, 2 g, 13,20 mmol). Następnie roztwór ochłodzono do temperatury 0°C, po czym powoli wkroplono roztwór zawierający 5 ml alkoholu etylowego, trietyloaminę (1,1 eq, 1,8 ml, 14,52 mmol), oraz 3-aminopropan-1-ol (1,1 eq, 1,0 ml, 14,52 mmol). Następnie mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury 70°C i mieszano przez noc. Po tym czasie zredukowano ilość rozpuszczalnika o połowę i ochłodzono roztwór do temperatury 0°C. Następnie odsączono otrzymany produkt i wysuszono go pod zmniejszonym ciśnieniem. W ten sposób otrzymano produkt 2 z wydajnością 39%.
2-(3-Hydroksypropylo)-3a,4,7,7a-tetrahydro-1 H-4,7-epoksyisoindolo-1,3(2 H )-dion (2) Wydajność: 39%. 1H NMR (500 MHz, DMSO-ds) δ 6,53 (s, 2H), 510 (s, 2H), 4,46 (t, J = 5,1 Hz, 1H), 3,40 3,29 (m, 4H), 2,89 (s, 2H), 1,60 - 1,51 (m, 2H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 176,83, 136,89, 81,20, 58,93, 47,83, 36,36, 30,92.
Otrzymywanie 1-(3-hydroksypropylo)-1 H-pirolo-2,5-dionu (3)
W kolbie okrągłodennej umieszczono 2 (1 eq, 0,742 g, 3,32 mmol) oraz 20 ml toluenu. Otrzymany roztwór ogrzewano w temperaturze wrzenia przez 5 godzin. Po tym czasie rozpuszczalnik odparowano, a uzyskany osad przemyto eterem naftowym i odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem. W ten sposób otrzymano produkt 3 z wydajnością 75%.
1-(3-Hydroksypropylo)-1 H-pirolo-2,5-dion (3) Wydajność: 75%. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) 6,97 (s, 2H), 4,47 (s, 1H) 3,46 - 3,36 (m, 4H), 1,67 - 1,52 (m, 2H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-de) δ 171,63, 135,08, 58,71,35,21, 31,58.
Otrzymywanie (tert-butoksykarbonylo)glicynianu 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1 H-pirol-1-ilo)propylu (4)
W kolbie okrągłodennej umieszczono tert-butoksykarbonyloglicynę (1 eq, 0,103 g, 0,54 mmol) oraz 3 ml dichlorometanu. Otrzymany roztwór schłodzono do temperatury 0°C, po czym dodano 3 (1,2 eq, 0,107 g, 0,71 mmol), chlorowodorek 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidu (EDC^HCI) (1,1 eq, 0,124 mg, 0,65 mmol) oraz 4-dimetyloaminopirydyne (DMAP) (0,1 eq, 0,007 g, 0,054 mmol). Całość mieszano w temperaturze 0°C przez 5 minut, po czym mieszaninę reakcyjną ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano przez 15 minut. Następnie mieszaninę reakcyjną odparowano i izolowano produkt z wykorzystaniem preparatywnej chromatografii kolumnowej (eluent 1 : 100 MeOH : DCM). Otrzymano produkt 4 z wydajnością 75%.
(Tert-butoksykarbonylo)glicynian 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1 H-pirol-1-ilo)propylu (4) Wydajność: 91%. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7,20 (t, J = 6,1 Hz, 1H), 7,00 (s, 2H), 3,99 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,65 (d, J = 6,2 Hz, 2H), 3,46 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 1,79 (p, J = 6,5 Hz, 2H), 1,36 (s, 9H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) 171,35, 170,69, 156,22, 134,97, 78,52, 62,59, 52,03, 43,46, 42,00, 34,81,28,57, 28,29.
Otrzymywanie trifluorooctanu estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1 H-pirol-1-ilu)propylu glicyny (5)
W wysuszonej kolbie okrągłodennej przygotowano roztwór substancji 4 (1 eq, 0,0001 mol) w 4 ml bezwodnego dichlorometanu. Następnie do mieszaniny wprowadzono 25% roztwór (v/v) kwasu trifluorooctowego (10 eq, 0,001 mol) w bezwodnym dichlorometanie. Całość mieszano w atmosferze gazu obojętnego przez 24 godziny. Następnie, mieszaninę reakcyjną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt rozpuszczono w niewielkiej ilości bezwodnego metanolu, po czym dodano bezwodny eter dietylowy w celu wytrącenia produktu. Otrzymany osad odsączono, przemyto bezwodnym eterem dietylowym i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydajność reakcji wynosiła 90%.
Trifluorooctan estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1 H-pirol-1-ilu)propylu glicyny (5) Wydajność: 90%. 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 8,34 (brs, 3H), 7,03 (s, 2H), 4,13 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,51 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 1,92 - 1,82 (m, 2H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) 171,70, 168,15, 135,04, 63,73, 34,53, 27,49.
PL 249308 Β1
Etap 2:
Ogólna metoda otrzymywania różnych dipeptydowych, tripeptydowych, oraz tetrapeptydowych pochodnych 1-(3-hydroksypropylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionu - według wynalazku wybrano związki (6a, 6f).
Do wysuszonej kolby okrągłodennej wprowadzono 6 ml bezwodnego A/,A/-dimetyloformamidu, odpowiedni AZ-chroniony aminokwas, AZ-chroniony dipeptyd, lub/(/-chroniony tripeptyd (1 eq, 0,001 mol), związek 5 (1 eq, 0,001 mol) oraz A/,A/-diizopropyloetyloaminę (3 eq, 0,003 mol). Otrzymaną mieszaninę ochłodzono w łaźni lodowej i mieszano przez 30 minut w atmosferze gazu obojętnego. Następnie, do mieszaniny wprowadzono HOBt · H2O (1 eq, 0,001 mol) oraz TBTU (1 eq, 0,001 mol). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wprowadzono 20 ml wody destylowanej, otrzymany roztwór przeniesiono do rozdzielacza, dodano 50 ml octanu etylu i całość przemyto nasyconym, wodnym roztworem kwasu cytrynowego (2x 20 ml), a następnie nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x 20 ml). Warstwę organiczną wysuszono bezwodnym siarczanem magnezu, odsączono i odparowano. Otrzymany surowy produkt oczyszczono za pomocą preparatywnej chromatografii kolumnowej.
Przykład 1, Etap 2:
Otrzymywanie estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walinoglicyny (6a)
Ester 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1H-pirol-1-ilo)propylo acetylo-L-walinoglicyny (6a)
Do wysuszonej kolby okrągłodennej wprowadzono 6 ml bezwodnego Α/,ΑΖ-dimetyloformamidu, Ac-L-Val-OH (1 eq, 0,001 mol, 0,159 g), 5 (1 eq, 0,001 mol, 0,326 g) oraz A/,A/-diizopropyloetyloaminę (3 eq, 0,003 mol, 0,387 g). Otrzymaną mieszaninę ochłodzono w łaźni lodowej i mieszano przez 30 minut w atmosferze gazu obojętnego. Następnie, do mieszaniny wprowadzono HOBt · H2O (1 eq, 0,001 mol, 0,153 g) oraz TBTU (1 eq, 0,001 mol, 0,321 g). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wprowadzono 20 ml wody destylowanej, otrzymany roztwór przeniesiono do rozdzielacza, dodano 50 ml octanu etylu i całość przemyto nasyconym, wodnym roztworem kwasu cytrynowego (2x 20 ml), a następnie nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2x 20 ml). Warstwę organiczną wysuszono bezwodnym siarczanem magnezu, odsączono i odparowano. Otrzymany surowy produkt oczyszczono za pomocą preparatywnej chromatografii kolumnowej w układzie 30:1 CHCl3:MeOH.
Wydajność: 60%. Ή NMR (500 MHz, DMSO-de) δ 8,40 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 7,90 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,03 (s, 2H), 4,17 (dd, J = 8,7, 7,1 Hz, 1H), 4,01 (t, J=6,4 Hz, 2H), 3,85 (dd, J= 17,3, 6,0 Hz, 1H), 3,75 (dd, J = 17,3, 5,7 Hz, 1H), 3,48 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 1,95 (dq, J = 13,6, 6,9 Hz, 1H), 1,86 (s, 3H), 1,85-1,78 (m, 2H), 0,87 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,85 (d, J = 6,8 Hz, 3H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-de) δ 171,78, 171,08, 169,70, 169,32, 134,60, 62,28, 57,52, 40,55, 34,29, 30,42, 27,13, 22,52, 19,21, 18,14. HRMS, m/z: [M + H]+ obliczone C16H24N3O6 354,1660; obserwowane 354,3336.
Przykład 2, Etap 2
Otrzymywanie estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/7-pirol-1-ilo)propylo-A/2-(acetylo-L-walino)-A/6-('ferf-butoksykarbonylo)-L-lizynoglicyny (6f)
Ester 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1 H-pirol-1 -ilo)propylo A/z-(acetylo-L-walino)-A/e-(fertbutoksykarbonylo)-L-lizynoglicyny (6f)
PL 249308 Β1
Do wysuszonej kolby okrągłodennej wprowadzono 6 ml bezwodnego A/,A/-dimetyloformamidu, Ac-L-Val-L-Lys(Boc6N)-OH (1 eq, 0,001 mol, 0,387 g), 5 (1 eq, 0,001 mol, 0,326 g) oraz A/,A/-diizopropyloetyloaminę (3 eq, 0,003 mol, 0,387 g). Otrzymaną mieszaninę ochłodzono w łaźni lodowej i mieszano przez 30 minut w atmosferze gazu obojętnego. Następnie, do mieszaniny wprowadzono HOBt · H2O (1 eq, 0,001 mol, 0,153 g) oraz TBTU (1 eq, 0,001 mol, 0,321 g). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wprowadzono 20 ml wody destylowanej, otrzymany roztwór przeniesiono do rozdzielacza, dodano 50 ml octanu etylu i całość przemyto nasyconym, wodnym roztworem kwasu cytrynowego (2 x 20 ml), a następnie nasyconym wodnym roztworem wodorowęglanu sodu (2 x 20 ml). Warstwę organiczną wysuszono bezwodnym siarczanem magnezu, odsączono i odparowano. Otrzymany surowy produkt oczyszczono za pomocą preparatywnej chromatografii kolumnowej w układzie 25:1 CHCl3:MeOH.
Wydajność: 72%. Ή NMR (500 MHz, DMSO-de) δ 8,30 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 7,89 (t, J = 9,3 Hz, 2H), 7,03 (s, 2H), 6,76 (t, J = 5,2 Hz, 1H), 4,25 (dd, J = 13,2, 8,0 Hz, 1H), 4,18 - 4,13 (m, 1H), 4,04 3,97 (m, 2H), 3,85 (dd, J = 17,4, 6,0 Hz, 1H), 3,75 (dd, J = 17,4, 5,7 Hz, 1H), 3,48 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 287 (dd, J = 12,7, 6,4 Hz, 2H), 1,95 (dq, J= 13,5, 6,8 Hz, 1H), 1,87 (s, 2H), 1,85- 1,78 (m, 2H), 1,691,58 (m, 1H), 1,58- 1,46 (m, 1H), 1,42 - 1,17 (m, 13H), 0,84 (d, J= 6,8 Hz, 3H), 0,81 (d, J= 6,8 Hz, 3H). 13CNMR(126 MHz, DMSO-ds) δ 172,50, 171,48, 171,42, 170,06, 169,81, 168,40, 155,97, 135,01, 77,78, 62,67, 58,14, 52,63, 40,98, 34,66, 32,26, 30,76, 29,66, 28,73, 27,55, 23,04, 22,96, 19,73,18,59. HRMS, m/z: [M + H]+ obliczone C27H44N5O9 582,3134; obserwowane 583,5772.
Etap 3:
Przykład 1, Etap 3
Otrzymywanie trifluorooctanu 2-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walino-L-lizynoglicyny (7f)
nh3cf3coo
Trifluorooctan 2-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1 H-pirol-1 -ilo)propylo acetylo-L-walino-Llizynoglicyny (7f)
W wysuszonej kolbie okrągłodennej przygotowano roztwór substancji 6f (1 eq, 0,0001 mol) w 4 ml bezwodnego dichlorometanu. Następnie do mieszaniny wprowadzono 25% roztwór (v/v) kwasu trifluorooctowego (10 eq, 0,001 mol) w bezwodnym dichlorometanie. Całość mieszano w atmosferze gazu obojętnego przez 24 godziny. Następnie, mieszaninę reakcyjną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy produkt rozpuszczono w niewielkiej ilości bezwodnego metanolu, po czym dodano bezwodny eter dietylowy w celu wytrącenia produktu. Otrzymany osad odsączono, przemyto bezwodnym eterem dietylowym i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.
Wydajność: 79%. Ή NMR (500 MHz, DMSO-de) δ 8,32 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,68 (brs, 3H), 7,03 (s, 2H), 4,33 - 4,24 (m, 1H), 4,17 - 4,10 (m, 1H), 4,01 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 3,82 (ddd, J = 48,3, 17,5, 5,9 Hz, 2H), 3,48 (t, J = 6,7 Hz, 2H), 2,81 - 2,70 (m, 2H), 2,01 - 1,89 (m, 1H), 1,87 (s, 3H), 1,84-1,77 (m, 2H), 1,67 (td, J= 13,5, 7,4 Hz, 1H), 1,59- 1,47 (m, 3H), 1,38-1,27 (m, 2H), 0,84 (dd, J = 8,8, 7,1 Hz, 6H). 13C NMR (126 MHz, DMSO-de) δ 172,43, 171,55, 171,49, 170,08, 169,96, 135,01, 62,70, 58,31, 52,37, 34,66, 31,82, 30,67, 27,55, 27,01, 22,94, 22,56, 19,73, 18,64. HRMS, m/z: [M + H]+ obliczone C22H36N5O7 482,2609; obserwowane 482,4605.
A) Badania aktywności biologicznej i medycznej otrzymanych pochodnych w teście enzymatycznym z wykorzystaniem proteazy SARS-CoV-2 Mpro oraz oznaczanie ich właściwości cytotoksycznych.
Badania aktywności in vitro otrzymanych wybranych nowych związków o wzorze ogólnym 11:
Aktywność medyczna i biologiczna wybranych związków o wzorze ogólnym 11, mających zastosowanie jako związki aktywne - leki lub środki do wykorzystania in vitro np. w diagnostyce, wykazujące działaniejako inhibitory proteazy SARS-CoV-2 Mpro oraz innych enzymów zaliczanych do klasy proteaz cysteinowych, została oznaczona fluorometrycznie w teście enzymatycznym z wykorzystaniem enzymu proteazy SARS-CoV-2 Mpro według następującej procedury opisanej poniżej.
Hamowanie aktywności enzymu SARS-CoV-2 Mpro
1) Aktywność inhibicyjną otrzymanych związków wobec proteazy SARS-CoV-2 Mpro mierzono w temperaturze 37°C;
2) 0,15 μg proteazy Mpro (proteaza 3CL z koronawirusa SARS-COV-2) (Sigma-Aldrich
SAE0172) inkubowano wraz z analizowanymi związkami w różnych stężeniach (0-100 μmol zawieszonych w DMSO, maksymalne stężenie DMSO - 1%, do 7%, DMSO nie wpłynęło na oznaczenie) w buforze (20 mmol Tris-HCI, 100 mmol NaCI, 1 mmol EDTA i 1 mmol DTT, Ph 7,3);
3) Następnie mieszaninę (100 μΙ końcowej objętości) wytrząsano w temperaturze 37°C przez 10 minut;
4) Po inkubacji dodano 20 μl substratu (Dabcyl-KTSAVLQSGFRKM-Glu(Edans)-NH2, Biosyntan, Niemcy) (stężenie końcowe - 20 μmol);
5) Następnie zmierzono aktywność enzymatyczną testowanych związków przy użyciu czytnika płytek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode (BioTek, USA) przy długościach fali 340/490 nm (wzbudzenie/emisja).
6) Każdy test wykonano w trzech powtórzeniach.
Aktywność biologiczną i medyczną inhibitorów proteazy SARS-CoV-2 Mpro tj. związków według wzoru 11, została oznaczona poprzez analizę przebiegu reakcji enzymatycznej z wykorzystaniem substratu (Dabcyl-KTSAVLQSGFRKM-Glu(Edans)-NH2. Przebieg reakcji badano fluorometrycznie. W końcowym etapie wyznaczono stopień zahamowania aktywności enzymu proteazy SARS-CoV-2 Mpro (IC50) po inkubacji z odpowiednim inhibitorem tj. związkiem o wzorze ogólnym 11. Badania wykonano z wykorzystaniem dedykowanego dla tego typu oznaczeń testu. Dla wybranych związków o wzorze ogólnym 11 - pochodne 1-(3-hydroksypropylo)-1 H-pirolo-2,5-dionu, poprzez analizę danych zarejestrowanych w teście enzymatycznym, obliczono poziom zahamowania aktywności enzymu proteazy SARS-CoV-2 Mpro, wyrażany za pomocą parametru IC50, który kształtował się w przedziale od 8,52 ± 0,44 do 27,28 ± 2,57 μmol. Wykazano, że stopień inhibicji enzymu proteazy SARS-CoV-2 Mpro (wyrażony w wartościach IC50) dla poszczególnych przykładów związków o wzorze ogólnym 11 kształtował się w następujący sposób: dla estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1 H-pirol-1-ilo)propylo acetylo-L-walinoglicyny (6a) IC50 = 16,39 ± 0,34 μmol, dla trifluorooctanu estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1 H-pirol-1-ilo)propylo acetylo-L-walino-L-lizynoglicyny (7f) IC50 = 14,67 ± 0,69 μmol. Potwierdzenie efektywności związki 7f pośrednio wskazuje na działania biologiczne związki 6f. Z tego względu wybrane związki o wzorze ogólnym 11 wykazują działanie biologiczne jak i medyczne, i mają zastosowanie medyczne jako leki. Potwierdzono, że nowe związki według wzoru ogólnego 11, jako jeden z możliwych mechanizmów działania biologicznego, wykazują silne działanie hamujące aktywność enzymu proteazy SARS-CoV-2 Mpro w niskim mikromolowym stężeniu, co jest wystarczające, aby związki działały jako leki zaliczane do inhibitorów proteazy SARS-CoV-2 Mpro lub też jako związki znajdujące zastosowanie jako inhibitory proteazy SARS-CoV-2 Mpro w naukach biologicznych, w tym badaniach diagnostycznych, badaniach klinicznych in vivo. W szczególności wybrane związki o wzorze ogólnym 11 mają zastosowanie jako leki w terapii przeciwwirusowej, a w szczególności w leczeniu infekcji wirusowych wywołanych koronawirusem SARS CoV-2, w tym COVID19 oraz innych koronawirusów odpowiedzialnych za ciężki ostry zespół oddechowy (SARS) zwierząt, zwłaszcza ssaków, w tym ludzi.
Dla otrzymanych związków oznaczono również właściwości cytotoksyczne w teście MTT wobec wybranych linii komórkowych, w celu pozyskania wstępnych informacji określających profil bezpieczeństwa stosowania peptydowych pochodnych 1-(3-hydroksypropylo)-1 H-pirolo-2,5-dionu w potencjalnej terapii przeciwwirusowej. Badania przeprowadzono dla wybranych ludzkich linii komórkowych fibroblastów płuc MRC-5 oraz nabłonka nerki HEK-293 według procedury przedstawionej poniżej.
Hodowla komórek
1) Linie komórkowe pozyskano z American Type Culture Collection (ATCC);
2) Ludzką linię komórkową fibroblastów płuc (MRC-5, ATCC, CCL-171) hodowano w pożywce Eagle's Minimum Essential Medium (nr kat. P04-08058, PanBiotech, Niemcy) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicylina/streptomycyna (P/S);
3) Ludzką linię komórkową nabłonka nerki (HEK-293, ATCC, CRL-1573) hodowano w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (nr kat. P04-03596, PanBiotech, Niemcy) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicylina/streptomycyna (P/S);
4) Wszystkie komórki hodowano w standardowych warunkach (37°C w wilgotnej atmosferze 5% CO2). Komórki utrzymywano w naczyniu do hodowli tkankowej o pojemności 75 cm3, a pożywkę wymieniano co 48 godzin. Konfluentne komórki oddzielono roztworem trypsyny-EDTA i podhodowano w kolejnym naczyniu.
T est żywotności MTT
1) Komórki wysiano na 96 płytkach przy gęstości 2x 104 komórek na studzienkę dla MRC-5 i 4 x 103 komórek na studzienkę dla HEK-293;
2) Po 24 godzinach pożywkę zmieniono na pożywkę nieuzupełnioną FBS, a komórki potraktowano różnymi stężeniami analizowanych związków (0, 31, 25, 62,5, 125, 250, 500 pmol ponownie zawieszonych w DMSO (maksymalne stężenie DMSO -0,1% dla 500 μmol i 0,006% dla 31,25 μmol);
3) Po 72-godzinnej inkubacji pożywki uzupełniono rozpuszczalną w wodzie solą tetrazolową tj. bromkiem 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowym (stężenie końcowe 0,45 mg/ml);
4) Następnie mikropłytki inkubowano w 37°C w 5% CO2 przez 2 godziny;
5) Po inkubacji pożywkę usunięto, a kryształy formazanu rozcieńczono w 100 pl sulfotlenku dimetylu (DMSO);
6) Po 15 minutach, żywotność komórek oznaczano przez pomiar absorbancji przy 540 nm (odniesienie 630 nm) przy użyciu czytnika mikropłytek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode (BioTek, USA);
7) Żywotność określono jako procent kontroli.
Właściwości cytotoksyczne otrzymanych inhibitorów proteazy SARS-CoV-2 Mpro tj. wybranych związków według wzoru 11, określające ich wstępny profil bezpieczeństwa stosowania w potencjalnej terapii przeciwwirusowej, zostały oznaczone poprzez analizę wyników otrzymanych w teście żywotności komórek MTT. Test MTT wykorzystuje zdolność dehydrogenazy mitochondrialnej do enzymatycznej reakcji polegającej na przekształcaniu rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazolowej (bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazoliowego) o pomarańczowym zabarwieniu do nierozpuszczalnego produktu o niebieskiej barwie - formazanu. Żywotność komórek traktowanych otrzymanymi inhibitorami proteazy SARS-CoV-2 Mpro tj. związków według wzoru 11 w różnych stężeniach określono poprzez analizę danych absorbancji przy 540 nm barwnego roztworu formazanu w DMSO przy użyciu czytnika płytek. Ilość barwnego zredukowanego MTT jest proporcjonalna do aktywności oksydacyjnej mitochondriów komórki i liczby aktywnych metabolicznie (żywych) komórek w populacji. W przeprowadzonym teście MTT wyznaczono parametry IC50 dla testowanych związków wobec linii komórkowych fibroblastów płuc MRC-5 oraz nabłonka nerki HEK-293, które kształtowały się w następująco: MRC-5 od 145 ± 21 do >250 pmol, HEK-293 od 55 ± 7 do >250 μmol. Wykazano, że parametry IC50 dla testowanych inhibitorów SARS-CoV-2 Mpro dla poszczególnych przykładów związków o wzorze ogólnym 11 kształtowały się w następujący sposób: dla estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1 H-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walinoglicyny (6a) MRC-5 IC50> 250 pmol, HEK-293 IC50= 126 ± 15 pmol; dla trifluorooctanu estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1 H-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walino-L-lizynoglicyny (7f) MRC-5 IC50 > 250 pmol, HEK-293 IC50 > 200 μmol. Otrzymane wyniki badań dowodzą, iż otrzymane związki nie wpływają znacząco na żywotność komórek fibroblastów płuc MRC-5 oraz nabłonka nerki HEK-293 i charakteryzują się bardzo wysokim profilem bezpieczeństwa. Z tego względu związki o wzorze ogólnym 11 wykazują zastosowanie biologiczne jak i medyczne, i mają zastosowanie medyczne jako leki. Potwierdzono, że nowe związki według wzoru ogólnego 11, nie wykazują właściwości cytotoksycznych wobec testowanych komórek fibroblastów płuc MRC-5 oraz nabłonka nerki HEK-293 w szerokim mikromolowym stężeniu, wykazując wysoki stopień bezpieczeństwa stosowania, co jest wystarczające aby związki były stosowane jako leki zaliczane do inhibitorów proteazy SARS-CoV-2 Mpro lub też jako związki znajdujące zastosowanie jako inhibitory proteazy SARS-CoV-2 Mpro w naukach biologicznych, w tym badaniach diagnostycznych, badaniach klinicznych in vivo oraz jako leki w terapii przeciwwirusowej, a w szczególności w leczeniu infekcji wirusowych wywołanych koronawirusem SARS CoV-2, w tym COVID19 oraz innych koronawirusów odpowiedzialnych za ciężki ostry zespół oddechowy (SARS) zwierząt, zwłaszcza ssaków, w tym ludzi.
Przykład potwierdza również możliwość zastosowanie związków in vitro w diagnostyce ponieważ otrzymane wybrane związki o wzorze ogólnym 11 mogą zostać wykorzystane badaniach mających na celu opracowanie nowych wirusowych testów diagnostycznych jak również związki o wzorze ogólnym 11 znajdują szerokie zastosowanie w różnorodnych badaniach biochemicznych.

Claims (18)

1. Związki chemiczne stanowiące pochodne 1-(3-hydroksypropylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionu o wzorze ogólny 11:
w postaci estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walinoglicyny (6a):
lub estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propylo-A/2-(acetylo-L-walino)-/\/6-(tert-butoksykarbonylo)-L-lizynoglicyny (6f)
O lub jej pochodnej w postaci trifluorooctanu 2-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walino-L-lizynoglicyny (7f)
2. Związki chemiczne o wzorze ogólnym 11:
w postaci estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walinoglicyny (6a):
PL 249308 Β1
lub pochodnej estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-7/-/-pirol-1-ilo)propylo-N2-acetylo-L-walino)-A/6-(tert-butoksykarbonylo)-L-lizynoglicyny w postaci trifluorooctanu 2-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walino-L-lizynoglicyny
NH3CF3COO (7f) do zastosowanja jako ιθ^
3. Związki chemiczne do zastosowania według zastrz. 2 jako leki przeciwwirusowe.
4. Związki chemiczne do zastosowania według zastrz. 2-3 jako leki o działaniu inhibitora proteazy SARS CoV-2 Mpro lub innych inhibitorów proteaz cysteinowych.
5. Związki chemiczne o wzorze ogólnym 11:
w postaci estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walinoglicyny (6a):
lub pochodnej estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propylo-A/2-(acetylo-L-walino)-A/6-(tert-butoksykarbonylo)-L-lizynoglicyny w postaci trifluorooctanu 2-(2,5-diokso-2,5-dihy1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walino-L-lizynoglicyny (7f)
nh3cf3coo do zastosowania in vitro jako inhibitory proteaz cysteinowych, zwłaszcza SARS CoV-2 Mpro.
6. Sposób otrzymywania związków o wzorze ogólnym 11:
PL 249308 Β1
wzór 11 w postaci estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walinoglicyny (6a):
lub estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propylo-A/2-(acetylo-L-walino)-/\/6-(te/'t-butoksykarbonylo)-L-lizynoglicyny (6f):
przy czym sposób przeprowadza się kilkuetapowo według schematów 1, 2:
etapl:
PL 249308 Β1
ETAP 2
podczas którego
a) w pierwszym etapie syntezy otrzymuje się pochodną trifluorooctanu estru 3-(2,5- diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilu)propylu glicyny i w tym celu bezwodnik maleinowy poddaje się reakcji cykloaddycji, korzystnie Dielsa-Aldera zfuranem prowadzącej do otrzymania bicyklicznej pochodnej (1), zaś związek (1) traktowany jest 3-aminopropan-1-olem w obecności trietyloaminy lub innej zasady organicznej lub nieorganicznej w rozpuszczalniku prowadząc do otrzymania pochodnej (2), a w kolejnym kroku, pochodna (2) poddawana jest odwrotnej reakcji cykloaddycji poprzez ogrzewanie w toluenie lub innym rozpuszczalniku, wyniku której otrzymywana jest maleimidowa pochodna (3), poddawana w następnej kolejności reakcji sprzęgania z tert-butoksykarbonyloglicyną lub z inną chronioną na A/-końcu pochodną glicyny w obecności chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo) karbodiimidu (EDOHCI) oraz 4-(dimetyloaminojpirydyny (DMAP), a ponadto otrzymana w ten sposób pochodna (4) poddawana jest reakcji z kwasem, najkorzystniej z kwasem trifluorooctowym (TFA) prowadząc do otrzymania pochodnej trifluorooctanu estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilu)propylu glicyny (5), zaś
b) w drugim etapie przeprowadza się reakcje sprzęgania otrzymanego trifluorooctanu estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilu)propylu glicyny (5) z A/-chronionymi aminokwasami, dipeptydami lub tripeptydami z wykorzystaniem odczynników sprzęgających, korzystnie hydroksybenzotriazolu (HOBt) oraz tetrafluoroboranu O-(benzotriazol-1-ilo)-N,N,N',N,-tetrametylouroniowego (TBTU) w obecności Ν,Ν-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) lub innych zasad prowadząc do otrzymania peptydowych pochodnych 1-(3-hydroksypropylo)-1/-/-pirolo-2,5-dionu (6a, 6f).
7. Sposób otrzymywania trifluorooctanu 2-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walino-L-lizynoglicyny (7f)
nh3cf3coo znamienny tym, że z estru 3-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/-/-pirol-1-ilo)propylo-A/2-(acetylo-L-walinoj-A/^tert-butoksykarbonyloj-L-lizynoglicyny (6f)
O
PL 249308 Β1 otrzymanego w etapie pierwszym i drugim opisanym w zastrzeżeniu 6 otrzymuje się pochodną w postaci trifluorooctanu 2-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1/7-pirol-1-ilo)propyloacetylo-L-walino-L-lizynoglicyny (7f)
przeprowadzając dodatkowo trzeci etap:
polegający na tym, że dla pochodnej zawierającej w swojej budowie ochronną grupę korzystnie tert-butoksykarbonylową (BOC) w postaci estru (6f) przeprowadza się reakcje deprotekcji w wyniku traktowania kwasem trifluorooctowym (TFA) prowadząc do otrzymania tej soli trifluorooctanowej (7f).
8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w pierwszym etapie do syntezy pochodnej (1) w wyniku reakcji cykloaddycji Dielsa-Aldera stosuje się dowolny dien, korzystnie furan.
9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że pierwszy etap syntezy pochodnej (1) w wyniku reakcji cykloaddycji Dielsa-Aldera przeprowadza się w czasie minimum 30 minut, korzystnie w czasie od 30 minut do 24 godzin.
10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że etap syntezy pochodnej (2) przeprowadza się z wykorzystaniem amin lub ich soli, w rozpuszczalniku organicznym, najkorzystniej w etanolu.
11. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że etap syntezy pochodnej (2) przeprowadza się początkowo w obniżonej temperaturze, najkorzystniej w 0°C, następnie w temperaturze pokojowej lub wyższej, najkorzystniej w 70°C, w czasie minimum 1 godziny, korzystnie w czasie od 1 godziny do 24 godzin.
12. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że etap syntezy pochodnej (3) obejmujący odwrotną reakcję Dielsa-Aldera przeprowadza się w wyniku ogrzewania pochodnej (2) w rozpuszczalniku organicznym w temperaturze wrzenia, najkorzystniej w toluenie, w czasie od 1 do 24 godzin, najkorzystniej przez 5 godzin.
13. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w etapie syntezy pochodnej (4) oraz wykorzystuje się A/-chronioną pochodną glicyny, najkorzystniej tert-butoksykarbonyloglicynę.
14. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w etapie syntezy pochodnej (4) obejmującym sprzęganie pochodnej (3) z A/-chronioną pochodną glicyny, stosuje się dowolne odczynniki sprzęgające, najkorzystniej EDOHCI w obecności DMAP.
15. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w etapie syntezy pochodnej (5) obejmującym reakcje deprotekcji ugrupowania tert-butoksykarbonylowego stosuje się stężony kwas trifluorooctowy (TFA) lub jego roztwory, najkorzystniej roztwór TFA w dichlorometanie.
16. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 6, znamienny tym, że w etapie syntezy pochodnych (6a, 6f) obejmującym sprzęganie pochodnej (5) z odpowiednimi A/-chronionymi aminokwasami, dipeptydami oraz tripeptydami wykorzystuje się dowolne odczynniki sprzęgające, najkorzystniej HOBt oraz TBTU w obecności DIPEA.
24 PL 249308 B1
17. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w etap sprzęgania prowadzący do syntezy pochodnych (6a, 6f) prowadzi się w rozpuszczalniku organicznym, najkorzystniej w N,N-dimetyloformamidzie (DMF) w czasie minimum 5 minut.
18. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że w etapie syntezy pochodnej (7f) obejmującej reakcje deprotekcji ugrupowania tert-butoksykarbonylowego stosuje się stężony kwas trifluorooctowy (TFA) lub jego roztwory, najkorzystniej roztwór TFA w dichlorometanie.
PL445129A 2023-06-06 2023-06-06 Peptydowe pochodne 1-(3-hydroksypropylo)-1H-pirolo-2,5-dionu, zastosowanie medyczne tych związków oraz sposób ich otrzymywania PL249308B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL445129A PL249308B1 (pl) 2023-06-06 2023-06-06 Peptydowe pochodne 1-(3-hydroksypropylo)-1H-pirolo-2,5-dionu, zastosowanie medyczne tych związków oraz sposób ich otrzymywania

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL445129A PL249308B1 (pl) 2023-06-06 2023-06-06 Peptydowe pochodne 1-(3-hydroksypropylo)-1H-pirolo-2,5-dionu, zastosowanie medyczne tych związków oraz sposób ich otrzymywania

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL445129A1 PL445129A1 (pl) 2024-12-09
PL249308B1 true PL249308B1 (pl) 2026-03-23

Family

ID=93799861

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL445129A PL249308B1 (pl) 2023-06-06 2023-06-06 Peptydowe pochodne 1-(3-hydroksypropylo)-1H-pirolo-2,5-dionu, zastosowanie medyczne tych związków oraz sposób ich otrzymywania

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL249308B1 (pl)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114432301A (zh) * 2020-11-03 2022-05-06 北京大学 一种共价抑制剂衍生物及其在治疗病毒感染方面的应用
WO2023283256A1 (en) * 2021-07-09 2023-01-12 Aligos Therapeutics, Inc. Anti-viral compounds

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114432301A (zh) * 2020-11-03 2022-05-06 北京大学 一种共价抑制剂衍生物及其在治疗病毒感染方面的应用
WO2023283256A1 (en) * 2021-07-09 2023-01-12 Aligos Therapeutics, Inc. Anti-viral compounds

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IO ANTONOPOULOU, ELEFTHERIA SAPOUNTZAKI, ULRIKA ROVA, PAUL CHRISTAKOPOULOS: "Computational and Structural Biotechnology Journal, 2022, 20, 1306–1344", INHIBITION OF THE MAIN PROTEASE OF SARS-COV-2 (MPRO) BY REPURPOSING/DESIGNING DRUG-LIKE SUBSTANCES AND UTILIZING NATURE’S TOOLBOX OF BIOACTIVE COMPOUNDS *

Also Published As

Publication number Publication date
PL445129A1 (pl) 2024-12-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100384819C (zh) 与细胞凋亡蛋白抑制剂结合的smac蛋白的肽抑制剂
JP6314128B2 (ja) 新たなアルキル化剤
JP2023519752A (ja) 線維芽細胞活性化タンパク質を阻害するための化合物
Zhou et al. Structure–activity studies on a library of potent calix [4] arene-based PDGF antagonists that inhibit PDGF-stimulated PDGFR tyrosine phosphorylation
TW201004647A (en) Novel dual targeting antitumoural conjugates
RU2632199C2 (ru) Функционализированные производные тиеноиндола для лечения ракового заболевания
WO2015179955A1 (en) Uba5 inhibitors
Zhu et al. Design, synthesis and biological evaluation of covalent peptidomimetic 3CL protease inhibitors containing nitrile moiety
Huhtiniemi et al. Nε-Modified lysine containing inhibitors for SIRT1 and SIRT2
JP2021178855A (ja) ヒストンデアセチラーゼの阻害剤としての大環状分子のチオエステルプロドラッグ
CN105131082A (zh) 环肽类化合物及其应用
RU2697519C1 (ru) Средство пептидной природы, включающее псма-связывающий лиганд на основе производного мочевины, способ его получения и применение для получения конъюгата с лекарственным и диагностическим агентом
PL249308B1 (pl) Peptydowe pochodne 1-(3-hydroksypropylo)-1H-pirolo-2,5-dionu, zastosowanie medyczne tych związków oraz sposób ich otrzymywania
PL249318B1 (pl) Peptydowe pochodne 1-(2-hydroksyetylo)-1H-pirolo-2,5-dionu, zastosowanie medyczne tych związków oraz sposób ich otrzymywania
JP6487422B2 (ja) 新しい抗腫瘍剤としてのチエノ［２，３−ｅ］インドール誘導体
Guma et al. Design, synthesis, and biological evaluation of thioamide-linked spiropyrrolidine derivatives as novel 3CLpro inhibitors against SARS-CoV-2
US20250188083A1 (en) Modulators of Histone Acetyltransferase 1 and Methods of Treatment Thereof
CN116925084A (zh) 对肿瘤过表达的细胞周期调节蛋白wee1有双重抑制作用的化合物
HK40031377A (en) Thioester prodrugs of macrocycles as inhibitors of histone deacetylases
HK1235770A1 (en) New alkylating agents
HK1203957B (en) Alkylating agents
HK1235770B (zh) 新的烷化剂
HK1155363A (en) Novel dual targeting antitumoural conjugates