PL249275B1 - Polimer kationowy o właściwościach przeciwgrzybicznych - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są polimery kationowe otrzymane na bazie monomeru chlorku [2(metakryloksy)etylo]trimetyloamoniowego charakteryzujące się selektywnym działaniem przeciwgrzybiczym i niską toksycznością wobec komórek ssaczych, zwłaszcza ludzkich, które dzięki temu nadają się szczególnie do wytwarzania leków przeciwgrzybiczych.

Description

Przedmiotem wynalazku są polimery kationowe otrzymane na bazie monomeru chlorku [2-(metakryloksy)etylo]trimetyloamoniowego (dalej też PMAPTAC) charakteryzujące się selektywnym działaniem przeciwgrzybiczym i niską toksycznością wobec komórek ssaczych, zwłaszcza ludzkich. Dzięki temu nadają się one do wytwarzania leków przeciwgrzybiczych.

W zgłoszeniu patentowym P.402516 ujawniono kationowe monomery, takie jak chlorek [2-(metakryloksy)etylo]trimetyloamoniowy (dalej również MAPTAC) otrzymywane w wyniku czwartorzędowania 2-dimetyloaminoetylometakrylanu przy pomocy chlorku metylu. Ponadto ujawniono, że taki kationowy monomer wykazuje właściwości fungistatyczne względem wszystkich szczepów Candida albicans, Candida krusei oraz Candida parapsilosis. Nie ujawniono jednak możliwości stosowania polimerów oraz nie zasugerowano możliwości otrzymania szczególnych polimerów charakteryzujących się selektywnym działaniem przeciwgrzybiczym.

W publikacji Colloids and Surfaces A 549 (2018) 122-129 ujawniono przeciwbakteryjne działanie MAPTAC.

W publikacji Progress in Polymer Science 39 (2014) 1096-1143 ujawniono przeciwbakteryjne działanie MAPTAC i jego kopolimerów.

W publikacji Int J Artif Organs 2012; 35 (10): 854-863 ujawniono przeciwbakteryjne działanie MAPTAC w formie wbudowanej w żywice akrylowe.

Polimer kationowy otrzymany na bazie monomeru chlorku [2-(metakryloksy)etylo]trimetyloamoniowego (PMAPTAC) jest znanym związkiem o przypisanym numerze CAS 68039-13-4, który dostępny jest na rynku pod nazwą handlową Polycare®133 (patrz: https://qlenncorp.com/wp-content/uploads/2015/10/Polvcare-133.-PDS.-02.01.14.pdf).

Chińskie zgłoszenie patentowe opublikowane jako CN109912739 ujawnia sposób wytwarzania PMAPTAC o lepkościach z zakresu 2,0-8,2 dl/g, z zastosowaniem monomeru MAPTAC.

Polskie zgłoszenie patentowe P.431691 ujawnia homopolimery kationowe PMAPTACy, w którym y oznacza stopień polimeryzacji w zakresie od 15 do 150.

Brytyjskie zgłoszenie patentowe GB2114616 ujawnia polimer kationowy PMAPTAC zastosowany w wodnej kompozycji do falowania bądź prostowania włosów. Polichlorek metakryloamidopropylotrimetyloamoniowy) jest wytwarzany przez polimeryzację odpowiedniego monomeru sprzedawanego przez Texaco Chemicals pod nazwą MAPTAC. Masa cząsteczkowa wynosi korzystnie od 5000 do 500000.

Celem wynalazku jest dostarczenie substancji charakteryzującej się selektywnym działaniem przeciwgrzybiczym i niską toksycznością wobec komórek ssaczych, zwłaszcza ludzkich.

Nieoczekiwanie taki cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest polimer kationowy o masie cząsteczkowej od 30 kDa do 34 kDa otrzymany na bazie monomeru chlorku [2-(metakryloksy)etylo]trimetyloamoniowego o wzorze:

do stosowania w zapobieganiu lub leczeniu zakażeń wywoływanych przez grzyby u pacjenta będącego ssakiem, zwłaszcza człowiekiem, przy czym grzyb należy do gatunku wybranego korzystnie spośród: dermatofitówz rodzaju Trichophyton, zwłaszcza Trichophyton interdigitale, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans lub Trichophyton rubrum, Scopulariopsis brevicaulis, gatunków z rodzaju Fusarium, zwłaszcza Fusarium oxysporum lub Fusarium solani, Cryptococcus neoformans.

Dla lepszego zrozumienia istoty wynalazku niniejszy opis został zilustrowany załączonymi figurami.

Na Fig. 1 przedstawiono widma FT-IR ujawnionych polimerów.

Na Fig. 2 przedstawiono wpływ badanych polikationów na przeżycie komórek fibroblastów 3T3-L1 w doświadczeniach przeprowadzonych z użyciem podłoża bez surowicy (Fig. 2a) oraz z dodatkiem surowicy (Fig. 2b).

Na Fig. 3 przedstawiona została ocena toksyczności terbinafiny.

Na Fig. 4 przedstawiona została ocena toksyczności cyklopiroksu.

PL 249275 Β1

Na Fig. 5 przedstawiono rozkład wielkości cząstek w mieszaninach roztworów polimeru z surowicą oraz samej surowicy.

Na Fig. 6 przedstawiono chromatogramy odwirowanych mieszanin surowicy i roztworów polimeru. Z lewej detektor refrakcji, z prawej detektor rozpraszana światła.

Ponadto istota wynalazku została wyjaśniona w poniższych przykładach.

W przykładach 1, 2 i 4 ujawniono kolejne etapy przykładowej realizacji sposobu według wynalazku, natomiast w przykładach 3 i 5 właściwości uzyskiwanych zgodnie z wynalazkiem materiałów

Synteza polimerów

W celu skutecznego porównania wpływu masy cząsteczkowej kationowych makromolekuł na aktywność biologiczną wykonano cztery syntezy różniące się czasem prowadzenia reakcji lub ilością inicjatora w dwóch wariantach. Pierwszy zakładał wykorzystanie infertera (polimeryzacja kontrolowana RAFT), natomiast drugi był klasyczną (bez kontroli) polimeryzacją rodnikową. Polimeryzacja kontrolowana RAFT w obecności infertera posłużyła do syntezy makromolekuł o mniejszej masie niż możliwe jest uzyskanie w klasycznych układach bez kontroli. Syntezę wykonano w sposób opisany poniżej.

Przykład 1. Polimeryzacja polikationów o mniejszej masie

Najpierw z roztworu monomeru MAPTAC (50% w wodzie) usunięto inhibitor polimeryzacji przepuszczając tę mieszaninę przez zobojętniony tlenek glinu. Następnie zmieszano 6 ml roztworu monomeru MAPTAC, 15 mg inicjatora polimeryzacji V-501 (kwas 4,4'-Azobis(4-cyjanowalerianowy)) oraz 5 ml wody. Mieszaninę podgrzano do 40°C i odgazowano przepuszczając przez nią argon około 0,5 h. Następnie do tak otrzymanego roztworu dodano 34,66 mg CPD (kwas 4-cyjano-4-(fenylokarbotioilotio)pentanowy) rozpuszczonego w 1 ml metanolu. Naczynie reakcyjne umieszczono na mieszadle magnetycznym i mieszano. Polimeryzacja prowadzona była przez 7 h (PMAPTAC62) i 24 h (PMAPTAC90) w temperaturze 70°C. Roztwór zawierający produkt syntezy ochłodzono. Kolejnym etapem była dializa do wody destylowanej w tubie do dializy (graniczna przepustowość masy poniżej 3,5KDa), która trwała 5 dni ze zmianą wody co 24 h. Polimer po dializie wyizolowano z roztworu przez liofilizację.

Przykład 2. Polimeryzacja polimerów o większej masie

Najpierw z roztworu monomeru MAPTAC (50% w wodzie) usunięto inhibitor polimeryzacji przepuszczając tę mieszaninę przez zobojętniony tlenek glinu. Następnie zmieszano 6 ml roztworu monomeru MAPTAC oraz 15 mg (PMAPTAC133) lub 30 mg (PMAPTAC160) inicjatora polimeryzacji V-501 oraz 5 ml wody. Mieszaninę podgrzano do 40°C i odgazowano przepuszczając przez nią argon około 0,5 h. Naczynie reakcyjne umieszczono na mieszadle magnetycznym i mieszano. Polimeryzacja prowadzona była w obydwóch przypadkach przez 4 h w temperaturze 70°C. Roztwór zawierający produkt syntezy ochłodzono. Kolejnym etapem była dializa do wody destylowanej w tubie do dializy, która trwała 5 dni, ze zmianą wody co 24 h. Polimer po dializie wyizolowano z roztworu przez liofilizację.

Własności fizykochemiczne badanych polimerów

Przykład 3. Ogólna charakterystyka fizyczna polimerów

Zebrane tu dane miały na celu potwierdzić, że udało się otrzymać polikationy oraz wyznaczyć ich masę cząsteczkową. Jak wskazuje zestawienie poniżej, otrzymaliśmy cztery polikationy (świadczy o tym dodatnia wartość potencjału zeta) różniące się masą molową (wyznaczoną na podstawie pomiarów GPC).

Tabela 1. Ogólna charakterystyka badanych polimerów

Nazwa polimeru	Masa molowa Mp [kDa]	Metoda polimeryzacji	Potencjał zeta w wodzie* [mV]
PMAPTAC62	13,76	RAFT	31,83±5,35
PMAPTAC90	19,93	RAFT	41,20±5,17
PMAPTAC133	29,54	Rodnikowa	23,03±4,25
PMAPTAC160	34,01	Rodnikowa	24,01 ±4,51

‘stężenie roztworu polimeru 2 g/l

PL 249275 Β1

Przykład 4. Charakterystyka chemiczna

Dane poniżej potwierdzają otrzymanie w wyniku syntez przewidywanych struktur chemicznych polimerów. Podobieństwo w kształcie widm FT-IR (patrz Fig. 1) i składzie pierwiastkowym potwierdza ten fakt.

Tabela 2. Skład pierwiastkowy otrzymanych polimerów

Nazwa polimeru	N	C	H	S	N/C
PMAPTAC62	10,24	44,30	9,72	0	0,2311
PMAPTAC90	10,58	45,61	9,99	0	0,2319
PMAPTAC133	10,45	47,07	9,94	0	0,2219
PMAPTAC160	10,46	47,51	9,95	0	0,2201

Widma IR wskazują na obecność zgodnie z przewidywaniami wszystkich grup funkcyjnych, które wystąpią w produkcie polimeryzacji monomeru MAPTAC. Szczególnie ważny tutaj jest pik pochodzący od drgań grup metylowych aminy IV rzędowej odpowiedzialnej za dodatni ładunek makromolekuły występujących przy 1485 cm'¹.

Przykład 5. Wstępna ocena toksyczności na liniach komórkowych

Linia fibroblastów tkankowych

Wstępne badania przeprowadzono na linii komórkowej mysich fibroblastów embrionalnych 3T3-L1 (ATCC, CL-173™), linii unieśmiertelnionej (komórki o wysokiej tolerancji). Stosowano medium DMEM. Do komórek po 24 h od wysiania i skutecznej adhezji dodawano polimery rozpuszczone w medium (w przypadku eksperymentów bez surowicy najpierw zmieniano medium na bezsurowicze), a po kolejnej dobie oceniano ilość żywych komórek (wychwyt czerwieni obojętnej - neutral red uptake assay [1]. Wyniki przedstawiono na Fig. 2.

Badania wykazały, że im większa masa polimeru tym większy ujemny wpływ na komórki. W obecności surowicy tylko w przypadku polimeru o największej masie - PMAPTAC160 o stężeniach 50 pg/ml i większych, liczba żywych komórek zmniejszyła się do poniżej 50%. W układach bez dodatku surowicy toksyczność była większa. Zmniejszenie liczby żywych komórek powyżej 50% występowało dla dwóch polimerów - PMAPTAC133 i PMAPTAC160, i dotyczyło to odpowiednio stężeń równych i większych 25 pg/ml i 10 pg/ml. W przypadku polimeru PMAPTAC133 w zakresie stężeń 25-100 pg/ml liczba żywych komórek nie spadała poniżej 40%, co wskazuje, że polimer ten wykazuje umiarkowaną toksyczność na badane komórki. Polimer o większej masie tj. PMAPTAC160 w tym samym zakresie stężeń powodował redukcję liczby żywych komórek do 25% w stosunku do kontroli.

Z uzyskanych wyników można wnioskować, że polimer o największej masie cząsteczkowej PMAPTAC160, jest zbyt toksyczny do dalszych badań, nawet przy założeniu pozaustrojowego zastosowania, natomiast polimery o niższej masie wykazują umiarkowaną, możliwą do zaakceptowania toksyczność, zwłaszcza w przypadku aplikacji pozaustrojowej.

W analogicznych warunkach (ta sama linia komórkowa, składy medium oraz czas ekspozycji) wykonano ocenę toksyczność dwóch komercyjnie stosowanych leków przeciwgrzybiczych - cyklopiroksu i terbinafiny.

Uzyskane wyniki badań toksyczności terbinafiny i cyklopiroksu zobrazowano odpowiednio na Fig. 3 i Fig. 4. Porównując te wyniki z uzyskanymi dla polimerów można zaobserwować, że wszystkie badane makromolekuły są znacząco mniej toksyczne niż leki niskocząsteczkowe. W przypadku terbinafiny i eksperymentów w medium surowiczym, które wydają się tu najbardziej wiarygodne, stężenie 25 pg/ml powoduje spadek ilości komórek poniżej 50%. Spadek ten jest znaczący, gdyż dla stężeń 50, 75 i 100 pg/ml ilość komórek żywych nie przekracza 10%, natomiast dla polimerów uzyskaliśmy wartości powyżej 40%. Cyklopiroks już w stężeniach 5 pg/ml powodował śmierć ponad połowy komórek. W związku z silnym odziaływaniem tego leku z surowicą eksperyment w medium bezsurowiczym byłby niewiarygodny i nie został wykonany [2].

Wstępna ocena toksyczności polimerów po aplikacji dożylnej - interakcja z białkami surowicy

Ponieważ najbardziej obiecujące wyniki jeżeli chodzi o własności przeciwmykotyczne uzyskano dla polimeru PMAPTAC133, dla tego polikationu zbadano odziaływanie z białkami surowicy.

Przykład 6. Powstawanie cząstek o wielkości submikro na skutek reakcji polikation PMAPTAC 133-białka surowicy, które mogą blokować naczynia krwionośne

Największym niebezpieczeństwem w przypadku polimerów oddziałujących z białkami surowicy (co często zachodzi w przypadku polikationów) jest powstawanie w wyniku tych reakcji cząstek o rozmiarach mikro i submikrometrycznych, które mogłyby zablokować światło włosowatych naczyń krwionośnych. W przypadku badanego polimeru oceniono wielkość tych produktów stosując dynamiczne rozpraszanie światła. Eksperyment polegał na wymieszaniu równych objętości roztworu polimeru 5 g/l w 0,1 M NaCI i surowicy bydlęcej (surowice oraz roztwór polimeru wirowano 10 000 obrotów/min przez 5 minut bezpośrednio przed zmieszaniem). Jako kontrola posłużyła analogiczna mieszanina sporządzona z surowicy oraz roztworu 1M NaCI bez polimeru. Wyniki przedstawiono na Fig. 6.

Wniosek z otrzymanych wyników jest taki, że mamy w przypadku polimeru odziaływanie z białkami surowicy i w tym przypadku powstają submikrometryczne cząstki, ale ich wielkość nie przekracza 1 μm, co sprawia, że niebezpieczeństwo powstawania zatorów naczyń włosowatych po podaniu dożylnym należy uznać za niewielkie. Optymalne byłoby gdyby w ogóle nie obserwowano tego odziaływania, ale nie jest to sytuacja, która wyklucza zastosowania nowego związku jako lek, ponieważ komercyjnie stosowane leki przeciwgrzybicze tj. cyklopiroks i terbinafina również wykazują silne, opisane w literaturze, odziaływanie z białkami surowicy. Stanowi to jednak przesłankę do użycia tego polimeru głównie pozaustrojowo.

Przykład 7. Zmiany w składzie białkowym surowicy na skutek interakcji z polikationem

Jak wspomniano powyżej, procesy towarzyszące wiązaniu białek surowicy przez polimery mogą wpływać na skład tej mieszaniny białek (po oddzieleniu produktów tej reakcji). W związku z tym podjęto próbę oceny, z jakimi dokładnie komponentami surowicy reaguje badany polimer PMAPTAC133 na podstawie zmian w składzie surowicy po oddzieleniu produktów tej reakcji poprzez odwirowanie z prędkością 10 000 obrotów/min przez 5 min. Do oceny zmian składu mieszaniny białek posłużono się chromatografią GPC, która pozwala na ocenę mas cząsteczkowych makromolekuł obecnych w mieszaninie przy jednoczesnym określeniu ich ilości. Eluent stanowił roztwór 0,1 M NaCI, a surowicę przed pomiarem mieszano z eluentem w proporcjach 0,05 ml i 0,95 eluentu bądź eluentu z polimerem o stężeniu 5 g/l. Objętość nastrzyku wynosiła 100 μl, szybkość przepływu 0,8 ml/min.

Polimer oddziałuje z białkami surowicy i powoduje spadek stężenia białek najliczniej występujących w tej mieszaninie i o największej masie cząsteczkowej czyli albumin. Pokazuje to spadek sygnałów dla obydwóch detektorów przy najniższych czasach retencji, co odpowiada największym masom cząsteczkowym. Obserwacje z dwóch ostatnich punktów wskazują, że użycie dożylne PMAPTAC133 mogłoby okazać się niebezpieczne. Nie stanowi to jednak problemu praktycznego, ponieważ docelowo związki te mają być stosowane pozaustrojowo do leczenia grzybic skóry, paznokci i włosów.

Przykład 8. Badanie aktywności przeciwgrzybiczej polimerów

Wykonaliśmy badania aktywności przeciwgrzybiczej polimerów w warunkach in vitro w stosunku do wybranych gatunków grzybów pochodzących z międzynarodowych kolekcji kultur oraz z kolekcji mikroorganizmów Zakładu Kontroli Zakażeń i Mykologii, Katedry Mikrobiologii, Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum. Badanie wykonywano metodą mikrorozcieńczeniową w płynnym podłożu, w płaskodennych, polipropylenowych, 96-dołkowych płytkach titracyjnych. Zastosowana metodologia opierała się na procedurach badania lekowrażliwości grzybów opracowanych przez Europejski Komitet ds. Badania Wrażliwości Drobnoustrojów (EUCAST - European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) [3, 4] oraz procedurze Hancock Lab dla przeciwdrobnoustrojowych peptydów kationowych [5].

Badane związki rozpuszczano w jałowej wodzie destylowanej uzyskując wyjściowe stężenia 5 g/l, z których przygotowywano szereg dwukrotnych rozcieńczeń w wodzie. Poszczególne rozcieńczenia polimerów przenoszono w objętości 20 μl na płytki titracyjne (dołki 1-10). Do dołków 11 i 12 przenoszono po 20 μl jałowej wody destylowanej. Dołki 1-11 zaszczepiano grzybami w objętości 180 μl zawiesin komórek grzybowych w płynnej pożywce, do dołka 12 przenoszono 180 μl jałowego podłoża. Zawiesiny grzybów sporządzano ze świeżych hodowli prowadzonych na podłożach agarowych przez zebranie zarodników jałową wymazówką do jałowej wody destylowanej lub jałowej wody destylowanej z dodatkiem Tween-20. Zawiesiny niektórych szczepów filtrowano w celu usunięcia elementów strzępkowych (sto

PL 249275 Β1 sowano filtry o średnicy porów 20 pm i 10 pm). Zawiesiny doprowadzano do gęstości 0,5 w skali MacFarlanda, a następnie rozcieńczano 1:20 w płynnym podłożu RPMI-1640 z L-glutaminą, bez wodorowęglanu sodu, suplementowanym glukoza (2%) i zbuforowanym kwasem morfolinopropanosulfonowym (MOPS) (0,165 mol/l).

Końcowe stężenia polimerów na płytce, po dodaniu zawiesin grzybów w płynnym podłożu wynosiły 0,49-500 mg/l.

Inkubację prowadzono w cieplarkach w temperaturze 27°C lub 37°C przed 24-72 h, w zależności od gatunku grzyba. Wyniki odczytywano przy widocznym gołym okiem wzroście grzybów w kontroli (dołek 11). Wizualnie określano najniższe stężenia polimerów hamujące wzrost grzybów (wartość MIC - minimal inhibitory concentration). Uzyskane wyniki przedstawiono w Tabelach 3-5.

Wstępne badania wykazały, że aktywność antymykotyczna ma związek z masą cząsteczkową polimerów. Wykazaliśmy, że polimery o większych masach cząsteczkowych (PMAPTAC133, PMAPTAC160) wykazują lepszą aktywność przeciwgrzybiczą in vitro (niższe wartości MIC) od pozostałych (Tabela 3). W związku z wykazanymi właściwościami przeciwgrzybiczymi PMAPTAC133 i jego stosunkowo niską toksycznością komórkową (wyniki opisane powyżej), związek ten poddaliśmy szerszym badaniom z użyciem większej liczby szczepów grzybów.

Wykaz przebadanych gatunków wraz z liczbą badanych szczepów i otrzymanymi wartościami MIC dla polimeru PMAPTAC133 ujęto w Tabeli 4. Najniższe wartości MIC uzyskano dla dermatofitów z rodzaju Trichophyton (Trichophyton interdigitale, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Trichophyton rubrum), które powodują zakażenia tkanek zkeratynizowanych, a także w stosunku do Scopulariopsis brevicaulis, wywołującego głównie onychomykozę, oraz gatunków Fusarium (Fusarium oxysporum, Fusarium solani) będących przyczyną zakażeń paznokci, rogówki, wnętrza gałki ocznej oraz uogólnionych. Aktywność antymykotyczna w stosunku do tych szczepów potwierdzono w kilku niezależnych doświadczeniach. Wykazaliśmy także aktywność antymykotyczna na drożdże Cryptococcus neoformans, co wymaga jednak potwierdzenia w badaniach na większej liczbie szczepów tego gatunku (Tabela 5).

Nie stwierdziliśmy działania przeciwgrzybiczego polimeru PMAPTAC133 na drożdże z rodzaju Candida (gatunki Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata), natomiast aktywność w stosunku do szczepów z rodzaju Aspergillus wydaje się być zmienna, co najmniej w zależności od gatunku, przy czym w dotychczasowych badaniach nie wykazaliśmy wpływu przeciwgrzybiczego na najczęstsze patogeny człowieka z tego rodzaju tj. Aspergillus flavus i Aspergillus fumigatus (Tabele 4 i 5).

Dobrą aktywność nowego polimeru PMAPTAC133 na Scopulariopsis brevicaulis potwierdziliśmy dla kilkudziesięciu szczepów, w tym zarówno szczepów pochodzących z międzynarodowych kolekcji kultur, jak i szczepów klinicznych, izolowanych z paznokci i skóry, zdeponowanych w Zakładzie Kontroli Zakażeń i Mykologii UJCM (Tabele 4 i 5). Także z dużą pewnością można stwierdzić, że nowy polimer ma działanie przeciwgrzybicze w stosunku do gatunku Scopulariopsis brevicaulis.

Tabela 3. Wartości najniższych stężeń PMAP7AC62, PMAP7AC90, PMAP7AC133, PMAP7AC160 hamujących wzrost wybranych gatunków grzybów (MIC).

Gatunek	Wartości MIC polimerów [mg/l]
PMAPTAC62	PMAPTAC90	PMAPTAC133	PMAPTAC160
Candida albicans ATCC 90028	>500	>500	>500	>250
Candida krusei ATCC 6259	>500	>500	>500	>250
Aspergillus flavus ATCC 204304	>500	>500	>500	>250

PL 249275 Β1

Aspergillus brasiliensis ATCC 16404	>500	>500	>500 (3,90 wyraźne osłabienie wzrostu)	>250 (3,90 wyraźne osłabienie wzrostu)
Penicillium funiculosum DM 10640	>500	>500	>500 (7,81 mg/l wyraźne osłabienie wzrostu)
Trichophyon mentagrophytes ATCC 18484	>500	>500	1,95 (0,98 wyraźne osłabienie wzrostu)	0,98
Fusarium solani szczep 155	>500	>500	1,95	1,95
Scopulańopsis brevicaulis szczep 26	0,98	0,98	0,98	*

Uzyskano wyniki dla innych szczepów tego gatunku i mieściły się w zakresie 0,98-1,95 mg/l.

Tabela 4. Wartości minimalnych stężeń polimeru PMAP7AC133 hamujących wzrost badanych gatunków grzybów (MIC) uzyskane w kilku niezależnych badaniach.

Gatunek	Liczba badanych szczepów	Zakres MIC [mg/l]	MIC50 [mg/l]	MIC90 [mg/l]	Moda [mg/l]
Aspergillus brasiliensis	1	>500	-	-	-
Aspergillus calidoustus	1	3,91	-	-	-
Aspergillus flavus	4	>500	>500	>500	>500
Aspergillus fumigatus	7	250->500	>500	>500	>500
Aspergillus nidulans	1	3,91
Aspergillus niger	5	>500	>500	>500	>500
Aspergillus ochraceus	2	>500	>500	>500	>500
Aspergillus terreus	1	>500	-	-	-
Aspergillus ustus	2	1,95-3,91	-	-	•
Aspergillus verrucosum	2	1,95->500	1,95	>500	1,95
Aspergillus versicolor	2	1,95->500	-	-	-
Aspergillus sydowii	2	3,91->500	-	-	-
Candida albicans	1	>500	-	-	-
Candida krusei	1	>500	-	-	-

PL 249275 Β1

Fusarium spp.	16	1,95->500	15,625	>500	>500
Microsporum canis	1	1,95	-	-	-
Penicillium funiculosum	1	>500	-	-	-
Scopulariopsis brevicaulis	49	3,91-7,81	3,91	7,81	3,91
Trichophyon mentagrophytes	2	1,95-3,91	-	-	-
Trichophyton interdigitale	7	1,95-3,91	3,91	3,91	3,91
Trichophyton rubrum	1	500	-	-	-
Trichophyton tonsurans	3	1,95-3,91	1,95	3,91	1,95

MIC - najniższe stężenie hamujące wzrost grzybów (ang. minimal inhibitory concentration),

MIC50 - najniższe stężenie hamujące wzrost 50% badanych szczepów grzybów, MIC90 najniższe stężenie hamujące wzrost 90% badanych szczepów grzybów

Przykład 9. Porównanie aktywności przeciwgrzybiczej polimeru PMAPTAC133 i leków przeciwgrzybiczych (terbinafiny, cyklopiroksu).

W przypadku wybranych szczepów grzybów wykonaliśmy badanie porównujące wartości MIC polimeru PMAPTAC133 z wartościami MIC dwóch znanych leków przeciwgrzybiczych - terbinafiny i cyklopiroksu, mającymi zastosowanie w terapii zakażeń grzybiczych skóry gładkiej, skóry owłosionej i paznokci.

Do badań wykorzystano procedurę opisaną w punkcie powyżej (Przykład 8). Leki rozpuszczano wdimetylosulfotlenku (DMSO) uzyskując wyjściowe stężenia 4 g/l, z których sporządzano szeregi dwukrotnych rozcieńczeń w DMSO. Poszczególne stężenia polimeru rozcieńczano 1:100 wjałowej wodzie, a następnie przenoszono do dołków 1-10 na płytce titracyjnej w objętości 20 μΙ. Dołki 11 i 12 uzupełniano 20 μΙ DMSO rozcieńczonego 1:10 wwodzie. Dołki 1-11 zaszczepiano grzybami w objętości 180 μΙ zawiesin komórek grzybowych w płynnej pożywce, do dołka 12 przenoszono 180 μΙ jałowego podłoża. Końcowe stężenia leków na płytce, po dodaniu zawiesin grzybów w płynnym podłożu wynosiły 0,008-4 mg/l.

Stwierdziliśmy, że dla badanych szczepów z gatunków Scopulariopsis brevicaulis, Fusarium solani, Fusarium oxysporum wartości MIC polimeru są niższe niż dla terbinafiny i cyklopiroksu, a dla dermatofitów Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton interdigitale, Trichophyton tonsurans są niższe dla polimeru niż dla cyklopiroksu (Tabela 5).

Tabela 5. Wartości najniższych stężeń hamujących wzrost grzybów (MIC) [mg/ι] uzyskane dla polimeru PMAP7AC133, cyklopiroksu i terbinafiny w badaniu porównawczym

Czas inkubacji	PMAPTAC133	Cyklopiroks	Terbinafina
24h	48h	72h	24h	48h	72h	24h	48h	72h
Aspergillus brasiliensis ATCC 16404	>250 (3,91 wyraźne osłabienie wzrostu)	>250 (3,91 wyraźne osłabienie wzrostu)		>4	>4		2	>4 (2 osłabienie wzrostu)
Aspergillus flavus ATCC 204304	>250	>250	-	>4	>4	-	4	>4 (2 osłabienie wzrostu)	-
Aspergillus fumigatus DSM81S	>250	>250	-	>4	>4	-	>4(2 osłabienie wzrostu)	>4	-
Aspergillus fumigatus SU 56	>250	>250	-	>4	>4	-	4	>4 (4 osłabienie wzrostu)	-
Aspergillus terreus DSM 1958	>250	>250	-	>4	>4	-	2	>4 (2 osłabienie wzrostu)	-

PL 249275 Β1

Candida albicans ATCC 90028	>250	>250	-	>4	>4	-	>4	>4	-
Candida glabrata ATCC 15545	>250	>250	-	>4	>4	-	>4	>4	-
Candida krusei ATCC 6258	>250	>250	-	>4	>4	-	>4	>4	-
Cryptococcus neoformans	1,95	3,91 (1,95 brzeżny wzrost)		>4(4 lekkie osłabienie wzrostu)	>4	-	>4	>4	-
Fusarium oxysporum 109	1,95	3,91 (1,95 brzeżny wzrost)	-	>4	>4	-	>4	>4	-
Fusarium oxysporum DSM 841	1,95	3,91 (1,95 brzeżny wzrost)	-	>4	>4	-	>4	>4	-
Fusarium solani 155	1,95	3,91	-	>4	>4	-	>4	>4	-
Fusarium solani DSM 1164	1,95	1,95	-	>4	>4	-	>4	>4	-
Sccpulariopsis brevicaulis 34	1,95	3,91 (1,95 brzeżny wzrost)	-	>4	>4	-	>4	>4	-
Sccpulariopsis brevicaulis DSM 9122	1,95	1,95	-	>4	>4	-	>4	>4	-
Trichophyton interdigitale 251	1,95	1,95	1,95	>4	>4	>4	slaby wzrost	0,5/0,25	1
T richophyton interdigitale D182	1,95	1,95	1,95	>4	>4	>4	slaby wzrost	0,25	0,5
T richophyton interdigitale DSM4167	bw	1,95	1,95	>4	>4	>4	bw	0,25	0,25
T richophyton mentagrcphyte ATCC 18484	1,95	1,95	3,91 (1,95 brzeżny wzrost)	>4	>4	>4	0,125	0,5(0,25 brzeżny wzrost)	1 (0,25 i 0,5 brzeżny wzrost)
Trichophyton rubrum D197	bw	>250 (slaby wzrost)	>250 (1,95 wyraźne osłabienie wzrostu)	bw	>4	>4	bw	0,125	0,25
T richophyton rubrum D320	>250 (bardzo slaby wzrost)	>250	>250	>4	>4	>4	bw	0,125	2
T richophyton rubrum DSM 16111	3,91 (bardzo slaby wzrost)	7,81/3,91	7,81	>4	>4	>4	0,06 (bardzo slaby wzrost)	0,25	0,25
T richophyton tonsurans 264	bw	1,95	1,95	bw	>4	>4	bw	0,5	0,5
T richophyton tonsurans DSM 12285	bw	1,95	1,95	bw	>4	>4	bw	0,25	0,25

bw - brak wzrostu szczepu w kontroli

PL 249275 Β1

Literatura

[1] Repetto, G., del Peso, A. & Zurita, J. Neutral red uptake assay for the estimation of celi viability/cytotoxicity. Nat Protoc3, 1125-1131 (2008). https://doi.orq/10.1038/nprot.2008.75

[2] Arzneimittelforschung. 1981;31(8A): 1337-53; https://go.drugbank.com/drugs/DB01188

[3] EUCAST DEFINITIVE DOCUMENT E.DEF: 7.3.2. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts.

[4] EUCAST DEFINITIVE DOCUMENT E.DEF: 9.3.2. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for conidia forming moulds.

[5] Modified MIC Method for Cationic Antimicrobial Peptides. Available online: http://cmdr.ubc.ca/bobh/method/modified-micmethod-for-cationic-antimicrobial-peptides (accessed on 5 August 2021

Claims (1)

1. Polimer kationowy o masie cząsteczkowej od 30 kDa do 34 kDa otrzymany na bazie monomeru chlorku [2-(metakryloksy)etylo]trimetyloamoniowego o wzorze:

do stosowania w zapobieganiu lub leczeniu zakażeń wywoływanych przez grzyby u pacjenta będącego ssakiem, zwłaszcza człowiekiem, przy czym grzyb należy do gatunku wybranego korzystnie spośród: dermatofitów z rodzaju Trichophyton, zwłaszcza Trichophyton interdigitale, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans lub Trichophyton rubrum, Scopulariopsis brevicaulis, gatunków z rodzaju Fusarium, zwłaszcza Fusarium oxysporum lub Fusarium solani, Cryptococcus neoformans.