PL248110B1

PL248110B1 - Szczep bakterii mlekowych Lacticaseibacillus rhamnosus

Info

Publication number: PL248110B1
Application number: PL447283A
Authority: PL
Inventors: Katarzyna Śliżewska
Original assignee: Politechnika Lodzka
Priority date: 2023-12-27
Filing date: 2023-12-27
Publication date: 2025-10-20
Also published as: PL447283A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest nowy szczep bakterii mlekowych Lacticasei bacillus rhamnosus ŁOCK 1151 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu pod numerem B/00501, wykazujący jednocześnie właściwości funkcjonalne, probiotyczne i przemysłowe.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest szczep bakterii mlekowych Lacticaseibacillus rhamnosus, o właściwościach probiotycznych.

Dotychczas znane są szczepy bakterii z gatunku Lactobacillus rhamnosus, jak Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103, Lactobacillus rhamnosus GG, Lactobacillus rhamnosus Lc705, Lactobacillus rhamnosus ATCC 8530, Lactobacillus rhamnosus CASL, z opisu patentowego PL 226294 szczep Lactobacillus rhamnosus BioPL1, z opisu patentowego PL 233582 szczep bakterii mlekowych Lactobacillus rhamnosus ŁOCK 1087 o właściwościach probiotycznych oraz z opisu patentowego PL 238589 szczep bakterii mlekowych Lactobacillus rhamnosus ŁOCK 1146. Obecna nazwa tego gatunku bakterii to Lacticaseibacillus rhamnosus.

Wiadomo jest, iż probiotyki wykazują korzystny wpływ na zdrowie ludzi. Głównym ich zadaniem jest utrzymanie równowagi mikrobiologicznej przewodu pokarmowego. Drobnoustroje probiotyczne powinny charakteryzować się dobrą adhezją do komórek nabłonka jelita grubego i konkurować z patogenami o niezbędne składniki pokarmowe. Wpływ probiotyków na skład flory jelitowej wiąże się również z ich metabolizmem, głównie z procesem fermentacji sacharydów, wytwarzaniem gazów i związków organicznych, głównie kwasu mlekowego oraz krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych - masłowego, propionowego i octowego, które obniżają pH treści jelitowej. Badania ostatnich lat wskazują ponadto na właściwości przeciwnowotworowe probiotyków, które polegają na ograniczaniu rozwoju bakterii wytwarzających fekalne enzymy prokancerogenne, takie jak glukuronidaza czy nitroreduktaza, biorące udział w procesie wzrostu komórek nowotworowych. Probiotyki cechuje również zdolność wytwarzania supresyjnych substancji antykancerogennych, a także zdolność do rozkładu prokancerogennych azobarwników, aflatoksyn, nitrozoamin czy azotanów.

Produkcja żywności probiotycznej, dodatków do żywności oraz produktów farmaceutycznych wymaga pozyskiwania nowych szczepów oraz doboru szczepów o odpowiednich właściwościach. Zgodnie z propozycjami Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), Organizacji Narodów Zjednoczonych ds. Wyżywienia i Rolnictwa (FAO) oraz Europejskiego Urzędu ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) szczepy probiotyczne w procesie selekcji muszą spełniać zarówno kryteria bezpieczeństwa, funkcjonalności, jak i przydatności technologicznej. Bezpieczeństwo szczepu jest zdefiniowane poprzez jego pochodzenie oraz profil oporności na antybiotyki. Aspekty funkcjonalne określają ich zdolność przeżycia w przewodzie pokarmowym (m.in. odporność na niskie pH i sole żółci). Właściwości technologiczne obejmują natomiast zdolność przeżycia probiotyków i zachowania swoich uzdolnień podczas przechowywania i dystrybucji.

Celem wynalazku było znalezienie nowego szczepu bakterii z gatunku Lacticaseibacillus rhamnosus, który będzie wykazywał jednocześnie właściwości funkcjonalne, probiotyczne i przemysłowe, tj. zdolność do przetrwania i utrzymania aktywności metabolicznej oraz do wzrostu w miejscu docelowym, odporność na sole żółciowe, enzymy i niskie pH, aktywność antagonistyczną wobec patogenów, adhezję i zdolność do kolonizacji nabłonka jelitowego, detoksyfikację mykotoksyn, możliwość łatwej produkcji dużych ilości biomasy i wysoką produktywność kultur, stabilność pożądanych właściwości podczas procesu utrwalania, wysoki wskaźnik przeżycia przy przechowywaniu w produktach gotowych oraz gwarancję pożądanych właściwości sensorycznych gotowych produktów.

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii mlekowych z gatunku Lacticaseibacillus rhamnosus , który oznaczono symbolem ŁOCK 1151 i który został zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu pod numerem B/00501.

Szczep bakterii ŁOCK 1151 wyizolowano z kału noworodka.

Szczep ŁOCK 1151 jest Gram-dodatnią pałeczką, nie przetrwalnikującą, nieruchliwą. Szczep wykazuje właściwości probiotyczne. Stanowi homolog bakterii z gatunku Lacticaseibacillus rhamnosus (dawna nomenklatura Lactobacillus rhamnosus) o sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNA przedstawionej na końcu opisu.

W celu określenia przynależności gatunkowej nowego szczepu ŁOCK 1151 zsekwencjonowano region DNA kodujący gen 16S rRNA o długości 1440. Otrzymaną sekwencję nukleotydową genu 16S rRNA porównano za pomocą programu BLASTN + 2.15.0 z sekwencjami dostępnymi w bazie National Center of Biotechnology In formation (NCBI). Na podstawie porównania sekwencji nukleotydowych genów 16S rRNA bakterii z gatunku Lactobacillus rhamnosus Y1 (GenBank JX556102.1) stwierdzono podobieństwo nowego szczepu bakterii z prawdopodobieństwem 99,38%.

Szczep ŁOCK 1151 hoduje się na podłożu MRS agar przeznaczonym do hodowli bakterii z rodzaju Lactobacillus sp., przejrzystym, o barwie żółto-brązowej, o składzie w g/l: pepton kazeinowy 10,0, ekstrakt mięsny - 10,0, ekstrakt drożdżowy - 4,0, D(+)glukoza - 20,0, wodorofosforan di-potasu 2,0, Tween 80 - 1,0, cytrynian di-amonu - 2,0, octan sodu - 5,0, siarczan magnezu - 0,2, siarczan manganu - 0,04, agar - 15,0, o pH 5,7 ± 0,2, w temperaturze 15-45°C, korzystnie 37°C w czasie 48 godzin. Na podłożu MRS rośnie w postaci dużych (średnica około 2-3 mm), lekko wypukłych kolonii o kolorze jasnokremowym. Brzeg i powierzchnia kolonii są gładkie.

Szczep ŁOCK 1151 hoduje się także w podłożu płynnym MRS, stanowiącym modyfikację podłoża Rogosa, zawierającym jako źródło glukozę, o składzie w g/l: ekstrakt drożdżowy - 4,0, ekstrakt mięsny 10,0, pepton z kazeiny - 10,0, D(+)glukoza - 20,0, Tween 80 - 1,0, wodorocytrynian amonu - 2,0, fosforan dwupotasowy - 2,0, octan sodu - 5,0, siarczan magnezu 7-wodny - 0,20, siarczan magnezu 4-wodny - 0,05, o pH 5-6, w temperaturze 15-45°C, korzystnie 37°C w czasie 48 godzin. W podłożu tym szczep rośnie tworząc jednorodne zmętnienie pożywki i białokremowy osad na dnie probówki.

Do wzrostu szczep preferuje atmosferę wzbogaconą w CO2 wprowadzony w ilości 5% (v/v). Rośnie zarówno w warunkach tlenowych, jak i względnie beztlenowych.

Cechy morfologiczne szczepu ŁOCK 1151

W obrazie mikroskopowym bakterie mają kształt krótkiej długości pałeczek, prostych, o długości 4-5 μm i do 1 μm szerokości. Pałeczki nie wytwarzają przetrwalników. W barwieniu Gamma barwią się na kolor fioletowy, są zatem Gram-dodatnie. Nie wykazują zdolności ruchu.

Cechy fizjologiczne i biochemiczne szczepu ŁOCK 1151

Szczep nie wytwarza oksydazy cytochromowej oraz katalazy.

Badanie metabolizmu glukozy w warunkach tlenowych i beztlenowych na pożywce Hugh-Leifsona w wysokich stupach wykazało, że szczep ŁOCK 1151 jest zdolny do rozkładu glukozy zarówno w obecności tlenu, jak i w warunkach beztlenowych, czyli na drodze fermentacji.

Test API 50 CHL wykazał, że szczep ŁOCK 1151 jest zdolny do fermentacji następujących sacharydów i ich pochodnych: acetyloglukozaminy, amygdaliny, arbutyny, celobiozy, D-turanozy esculiny, fruktozy, galaktozy, gencjobiozy, glukonianu, glukozy, inozytolu, laktozy, maltozy, mannozy, mannitolu, melecytozy, N-Metylo-a,D-glukopiranozydu, ramnozy, rybozy, sacharozy, salicyny, sorbitolu, sorbozy, tagatozy, trehalozy.

Szczep ŁOCK 1151 charakteryzuje się metabolizmem względnie heterofermentatywnym. Laktozę fermentuje z wytworzeniem kwasu mlekowego w ilości 4,1 g/l, przy czym udział kwasu L(+)mlekowego wynosu 98%, kwasu octowego (1,6 g/l), aldehydu octowego (1,2 mg/l) i etanolu (4,9 mg/l).

Test API ZYM wykazał, że szczep ŁOCK 1151 wykazuje aktywność następujących enzymów: arylamidazy cysteiny, arylamidazy leucyny, arylamidazy waliny, fusfohydrolazy naftylo-AS-BI.

Szczep ŁOCK 1151 nie wytwarza siarkowodoru, ani amoniaku z argininy, nie wykazuje zdolności rozkładu H2O2.

Cechy probiotyczne szczepu ŁOCK 1151

Szczep ŁOCK 1151 spełnia kryteria stawiane bakteriom probiotycznym, co stwierdzono w wyniku badań in vitro wykonanych według procedur zalecanych przez FAO/WHO.

Szczep wykazuje odporność na niskie pH (kwasowość soku żołądkowego) w zakresie pH od 2,0 do 3,0 oraz na sole żółci w stężeniach 1% i 2% w czasie do 4 godzin.

Szczep ŁOCK 1151 wykazuje oporność w stosunku do antybiotyków i chemioterapeutyków o działaniu przeciwbakteryjnym, jak amikacyna, amoksycylina, aztreonam, cefalotyna, ceftazydym, doksycyklina, erytromycyna, kanamycyna, klotrimazol, penicylina, streptomycyna, tetracyklina, wankomycyn.

Wykazuje aktywność antagonistyczną w stosunku do patogenów przenoszonych drogą pokarmową, jak Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Choleraesuis, Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Staphylococcus aureus.

Posiada niską aktywność fekalną. Spośród trzech enzymów: β-glukozydazy, β-glukuronidazy i ureazy aktywna jest tylko β-glukozydaza.

Szczep ŁOCK 1151 charakteryzuję się dobrym przyleganiem do komórek nabłonka jelitowego Caco-2, a więc wykazuje właściwości adhezyjne.

Wykazuje zdolności detoksyfikacyjne mykotoksyn, jak aflatoksyna Bi, deoksyniwalenol, fumonizyna, ochratoksyna A, toksyny T-2, zearalenon, które najczęściej mogą stanowić zanieczyszczenie żywności i pasz.

Cechy biotechnologiczne szczepu ŁOCK 1151

Właściwości biotechnologiczne szczepu ŁOCK 1151, ze względu na możliwość zastosowania w żywności i w paszach określono zarówno w mleku, jak i w mieszance paszowej.

W mleku o 3,2% zawartości tłuszczu szczep ŁOCK 1151 osiągnął fazę stacjonarną po 18 godzinach hodowli, zaś plon komórek wynosił 1,5 χ 10¹⁰ jtk/ml. Czas trwania fazy adaptacyjnej bakterii wyniósł 2 godziny. Właściwa szybkość wzrostu szczepu wynosiła 0,45 h^-1, a produktywność hodowli była równa 0,6 χ 109.

W początkowym etapie fazy stacjonarnej szczep osiągnął kwasowość wynoszącą 42°SH, dający kwaśny smak mleka. Specyficzna aktywność kwasząca w fazie stacjonarnej wzrostu szczepu wynosiła 4,7°SH/10⁸ jtk. Po 24 godzinach inkubacji szczep wykorzystał laktozę mleka w 25,4%.

Szczep ŁOCK 1151 wykazuje zdolność do wzrostu i namnażania się przy produkcji mlecznych napojów fermentowanych (jogurt, kefir, maślanka) oraz serów twarogowych (kwasowych i kwasowo-podpuszczkowych) i nie wykazywał właściwości antagonistycznych w stosunku do szczepionek mleczarskich.

W mieszance paszowej (zmielone ziarna: jęczmienia 50%, pszenicy 40%, kukurydzy 5%) szczep ŁOCK 1151 osiągnął fazę stacjonarną po 19 godzinach hodowli, zaś plon komórek wynosił 6,5 χ 109 jtk/ml. Czas trwania fazy adaptacyjnej bakterii wyniósł 2 godziny. Właściwa szybkość wzrostu szczepu wynosiła 0,25 h^-1, a produktywność hodowli była równa 0,40 χ 109.

Jest zdolny do jednoczesnego wykorzystania glukozy i galaktozy. Ponadto fermentuje inulinę, która wykazuje właściwości prebiotyczne.

Szczep ŁOCK 1151 nie syntetyzuje bakteriocyn i związków bakteriocynopodobnych. Jest zdolny do syntezy biosurfaktantów, związków niewrażliwych na działanie enzymów proteolitycznych - pepsyn i trypsyn.

Szczep ŁOCK 1151 znajduje zastosowanie jako dodatek do żywności i pasz.

Przedmiot wynalazku ilustrują poniższe przykłady.

Przykład I.

Szczep ŁOCK 1151 hodowano w podłożu płynnym MRS (firmy Merck), o składzie w g/l: ekstrakt drożdżowy - 4,0, ekstrakt mięsny - 10,0, pepton z kazeiny - 10,0, D(+)glukoza - 20,0, Tween 80 1,0, wodorocytrynian amonu - 2,0, fosforan dwupotasowy - 2,0, octan sodu - 5,0, siarczan magnezu 7-wodny - 0,20, siarczan magnezu 4-wodny - 0,05, o pH 5-6, w obecności CO2 wprowadzonego w ilości 5% (v/v), w temperaturze 37°C w czasie.

Po 48 godzinach hodowli wyhodowane komórki oddzielono od podłoża na wstrząsarce uzyskując gęstość 1,1 χ 10¹⁰ komórek/ml.

Przykład II.

Szczep ŁOCK 1151 hodowano w podłożu płynnym Rogosa (firmy Difco) o składzie w g/l: pepton kazeinowy - 10,0, ekstrakt drożdżowy - 5,0, D(+)glukoza - 20,0, fosforan potasu - 6,0, cytrynian amonu - 2,0, Tween 80 - 1,0, octan sodu - 15,0, siarczan magnezu - 0,575, siarczan żelaza II - 0,034, siarczan manganu - 0,12, agar - 15,0, o pH 5-6, w obecności CO2 wprowadzonego w ilości 5% (v/v), w temperaturze 37°C.

Po 48 godzinach hodowli wyhodowane komórki oddzielono od podłoża na wstrząsarce uzyskując gęstość 9,8 χ 109 komórek/ml.

Przykład III.

Bakterie otrzymane jak w przykładzie I umieszczono w środowisku o pH 2,0 i 3,0. W środowisku o pH 2,0 po 180 minutach przeżyło 4,2 χ 108 jtk/ml przy wyjściowej ich ilości 6,0 χ 108 jtk/ml. W środowisku o pH 3,0 po 180 minutach przeżyło 4,8 χ 108 jtk/ml przy wyjściowej ich ilości 6,0 χ 108 jtk/ml.

P r z y k ł a d IV.

Bakterie otrzymane jak w przykładzie I poddano działaniu żółci o stężeniach 1% i 2% w czasie do 4 godzin. Po 4 godzinach inkubacji przy stężeniu żółci 2% przeżywalność komórek wynosiła 90%, a przy stężeniu żółci 1% przeżyło 94% komórek bakterii.

P r z y k ł a d V.

Liofilizat bakterii otrzymanych jak w przykładzie I przechowywano w temperaturze 4-5°C oraz w temperaturze pokojowej 25°C w ciągu 6 miesięcy. Po tym czasie nastąpiło obniżenie liczby żywych komórek o 6% dla temperatury chłodniczej i o 11% dla temperatury pokojowej. Temperatura chłodnicza zapewniła większą stabilność i trwałość.

PL 248110 Β1

Przykład VI.

Trwałość przechowalniczą szczepu LOCK 1151 określono w mleku UHT o zawartości tłuszczu 3,2%.

Do mleka dodano 10% inokulum bakterii LOCK 1151 i inkubowano do momentu ukwaszenia mleka, po czym ukwaszone mleko przechowywano w temperaturze 4°C w ciągu 21 dni.

Przeżywalność szczepu LOCK 1151 przechowywanego przez 21 dni w temperaturze 4°C wynosiła 95%, a liczba komórek bakterii kształtowała się na poziomie 10⁹ jtk/ml. Kwasowość całkowitą kształtowała się na poziomie 40,5°SH.

Wykaz sekwencji nukleotydowej regionu DNA kodującego gen 16S rRNA szczepu bakterii Lacticaseibacillus rhamnosus LOCK 1151, która określa jego przynależność gatunkową:

CGAGTTCTGA TTATTGAAAG GTGCTTGCAT GATTTAGATT TTGAACGAGT GGCGGACGGG TGAGTAACAC GTGGGTAACC TGCCCTTAAG TGGGGGATAA CATTTGGAAA CAGATGCTAA TACCGCATAA ATCCAAGAAC CGCATGGTTC TTGGCTGAAA GATGGCGTAA GCTATCGCTT TTGGATGGAC CCGCGGCGTATTAGCTAGTT GGTGAGGTAA CGGCTCACCA AGGCAATGAT ACGTAGCCGA ACTGAGAGGT TGATCGGCCA CATTGGGACT GAGACACGGC CCAAACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTAGGGA ATCTTCCACA ATGGACGCAA GTCTGATGGA GCAACGCCGC GTGAGTGAAG AAGGCTTTCG GGTCGTAAAA CTCTGTTGTT GGAGAAGAATGGTCGGCAGA GTAACTGTTG TCGGCGTGAC GGTATCCAAC CAGAAAGCCA CGGCTAACTA CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGTAGGTG GCAAGCGTTATCCGGATTTA TTGGGCGTAA AGCGAGCGCA GGCGGTTTTTTAAGTCTGAT GTGAAAGCCC TCGGCTTAAC CGAGGAAGTG CATCGGAAAC TGGGAAACTT GAGTGCAGAA GAGGACAGTG GAACTCCATG TGTAGCGGTG AAATGCGTAG ATATATGGAA GAACACCAGT GGCGAAGGCG GCTGTCTGGT CTGTAACTGA CGCTGAGGCT CGAAAGCATG GGTAGCGAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCATGCCGT AAACGATGAA TGCTAGGTGTTTGGAAGGGTTTCCGCCCTT CAGTGCCGCA GCTAACGCAT TAAGCATTCC GCCTGGGGGA GTACGACCGC AAGGTTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGAACA TGTGGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG TCTTGACATC TTTTGATCAC CTGAGAGATC AGGTTTCCCC TTCGGGGGCA AAATGACAGG TGGTGCATGG TTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTTAT GACTAGTTGC CAGCATTTAG TTGGGCACTC TAGTAAGACT GCCGGTGACA AACCGGAGGA AGGTGGGGAT GACGTCAAAT CATCATGCCC CTTATGACCT GGGCTACACA CGTGCTACAA TGGATGGTAC AACGAGTTGC GAGACCGCGA GGTCAAGCTA ATCTCTTAAA GCCATTCTCA TTCGGACTGT AGGCTGCAAC TCGCCTACAC GAAGTCGGAA TCGCTAGTAA TCGCGGATCA GCACGCCGCG GTGAATACGT TCCCGGGCCTTGTACACACC GCCCGTCACA CCATGAGAGT TTGTAACACC CGAAGCCGGT GGCGTAACCC TTTTAGGGAG CGAGCCGGTC CTTAAAGTTG w której: A - oznacza adeninę, G - guaninę, C - cytozynę, T - tyminę.

Claims

1. Szczep bakterii mlekowych Lacticaseibacillus rhamnosus LOCK 1151 zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu pod numerem B/00501, o właściwościach probiotycznych.