PL248086B1 - Sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo, zwłaszcza roślin naczyniowych, przed patogenami bakteryjnymi - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo, zwłaszcza roślin naczyniowych, który charakteryzuje się tym, że eradykację bakterii fitopatogennych z powierzchni roślinnego materiału siewnego lub sadzeniakowego prowadzi się poprzez bezpośrednie traktowanie nasion, bulw, cebul lub kłączy przy użyciu zimnej plazmy atmosferycznej CAP, generowanej w wyniku inicjowania wyładowań barierowych DBD w atmosferze helu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo, zwłaszcza roślin naczyniowych, przed patogenami bakteryjnymi poprzez bezpośrednie traktowanie nasion tych roślin za pomocą zimnej plazmy atmosferycznej (ang. cold atmospheric plasma, CAP). Plazma ta jest generowana w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania wyładowań barierowych (ang. dielectric barrier discharge, DBD).

W pracy autorstwa Uta Schnabel, Rijana Niquet, Udo Krohmann, Jorn Winter Oliver Schluter, Klaus Dieter Weltmann i Jorg Ehlbeck pt.: „Decontamination of Microbiologically Contaminated Specimen by Direct and Indirect Plasma Treatment” (Plasma Process. Polym. 2012, 9, 569) opisano zastosowanie: a) bezpośredniego działania CAP, generowanej w systemie plazmowym z DBD, generowanymi w atmosferze argonu oraz b) pośredniego działania CAP, generowanej w systemie plazmowym z wyładowaniem mikrofalowym, inicjowanym w atmosferze powietrza, do dekontaminacji nasion roślin z gatunku Brassica napus oraz sferycznych i helikalnych struktur szklanych opłaszczonych przetrwalnikami Bacillus atrophaeus (mikroorganizmu modelowego wcześniej klasyfikowanego jako Bacillus subtilis var. niger). W pierwszym etapie nasiona lub szklane modele przestrzenne inkubowano w zawiesinie spor B. atrophaeus (o stężeniu 108 jednostek tworzących kolonie na mililitr; jtk/ml) przez 30 minut, następnie osuszano i poddawano działaniu CAP.

W przypadku bezpośredniego działania CAP, nasiona lub szklane modele (kulki lub helisy), opłaszczone powierzchniowo sporami bakteryjnymi, eksponowano przez 10 min na działanie CAP, generowanej w systemie plazmowym z DBD, inicjowanymi w atmosferze argonu. Logarytm redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie B. atrophaeus na mililitr próby w przypadku takiego traktowania sferycznych i helikalnych struktur szklanych wynosił odpowiednio 2,4 log oraz 2,1 log. Uzyskany logarytm redukcji okazał się być jednak znacząco niższy (wynosił jedynie 0,7 log), gdy bezpośredniemu działaniu CAP poddano nasiona B. napus. Niższa efektywność eradykacji spor B. atrophaeus z powierzchni nasion może być związana z porowatym charakterem ich powierzchni, sprzyjającym adhezji bakterii i utrudniającym penetrację strugi plazmowej. Warto podkreślić, że przedstawione wyniki nie wykazały możliwości zastosowania opracowanego systemu plazmowego do dekontaminacji nasion, gdyż uzyskany logarytm redukcji, wynoszący 0.7 log, odpowiada eliminacji <90% komórek bakteryjnych.

Oczywistym jest, że w odniesieniu do dekontaminacji nasion dążenie do osiągnięcia 5-6 logarytmów redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie bakteryjne (co jest standardem w przypadku poszukiwania nowych substancji o działaniu antyseptycznym czy opracowywania metod sterylizacyjnych) nie jest konieczne, jednakże tak niski procent dezaktywacji komórek bakteryjnych (około 10% komórek pozostaje żywotna) umożliwiłby późniejszą odbudowę populacji mikroorganizmów i, w odniesieniu do drobnoustrojów fitopatogennych, aplikacja zaproponowanej procedury nie zapobiegłaby w efekcie rozwojowi infekcji i wystąpieniu objawów chorobowych na roślinach. Nie należy zapominać, iż w przypadku zastosowania opisanej procedury, konieczny jest zakup stosunkowo drogiego gazu wyładowczego, tj. argonu, który jest stosowany do generowania CAP w piórze plazmowym. Dodatkowo, 10-minutowy czas ekspozycji nasion na wytworzoną plazmę prawdopodobnie jest zbyt długi do wdrożenia przedstawionej metody do procesu technologicznego w przemyśle rolno-spożywczym.

Kolejna testowana przez badaczy metoda, w której wykorzystywane było pośrednie działanie CAP, okazała się być skuteczniejsza od opracowanego przez nich bezpośredniego podejścia. Gdy powierzchnie szklanych modeli sferycznych i helikalnych oraz nasion B. napus, opłaszczone wcześniej sporami B. Atrophaeus, poddano działaniu plazmy, generowanej w systemie plazmowym z wyładowaniami mikrofalowymi, inicjowanymi w atmosferze powietrza przez 5 min, osiągnięto odpowiednio 5,2; 3,4 oraz 2,4 logarytmy redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie bakteryjne. Uzyskano zatem zdecydowanie wyższą skuteczność niż przy testowaniu poprzedniej metody, jednakże autorzy nie są w stanie jednoznacznie określić przyczyny obserwowanej w tym przypadku antybakteryjnej aktywności zastosowanej plazmy. Należy podkreślić, że stosowany przez badaczy gaz wyładowczy, tj. powietrze, zmienia swoją temperaturę z 4 000°C do 150°C, w trakcie przemieszczania się przez komorę reakcyjnowyładowczą. Niestety, nie określono temperatury gazu w momencie jego kontaktu z kontaminownymi powierzchniowo próbami, czyli opłaszczonymi sporami B. atrophaeus szklanymi strukturami sferycznymi lub helikalnymi oraz nasionami B. napus. Stąd, nie można wykluczyć, że antybakteryjne właściwości opisanej metody wynikają raczej z poddania spor B. atrophaeus działaniu wysokiej temperatury niż z efektów interakcji wspomnianych przetrwalników z analizowaną CAP.

Dodatkowo badacze analizowali wpływ bezpośredniego oraz pośredniego działania CAP na efektywność kiełkowania nasion B. napus. 10 min bezpośrednia ekspozycja nasion B. napus na wyładowania DBD, przyczyniła się do zwiększenia procentu wykiełkowanych nasion o 3% po 24 h oraz o 13% po 48 h w porównaniu do nasion stanowiących próbę kontrolną, czyli nietraktowanych CAP. Natomiast, gdy wspomniane nasiona poddano 10-minutowemu pośredniemu działaniu plazmy, po 24 godzinach zaobserwowano kiełkowanie 40% nasion potraktowanych plazmą, w porównaniu do 20% nasion z grupy kontrolnej. Warto podkreślić, że po 72 godzinach inkubacji nie zaobserwowano różnic między zdolnością do kiełkowania nasion po bezpośrednim i pośrednim traktowaniu plazmą w porównaniu do grup kontrolnych, nietraktowanych wyładowaniem. Niestety, autorzy nie przedstawili wyników analizy statystycznej i nie wiemy czy uzyskane różnice w efektywności kiełkowania nasion po inkubacjach trwających 24 h bądź 48 h, pomiędzy próbami traktowanymi a kontrolnymi, były statystycznie istotne.

Z kolei w pracy autorstwa Anindita Mitra, Yang-Fang Li, Tobias G. Klampfl, Tetsuji Shimizu, Jin Jeon, Gregor E. Morfill oraz Julia L. Zimmermann pt.: “Inactivation of Surface-Borne Microorganisms and Increased Germination of Seed Specimen by Cold Atmospheric Plasma” (Food Bioprocess. Technol. 2014, 7, 645) opisano wpływ CAP, generowanej pod ciśnieniem atmosferycznym w urządzeniu FlatPlaSter 2.0, zawierającym elektrodę opartą na technologii powierzchniowego mikro-wyładowania (ang. surface micro-discharge, SMD), na naturalną mikroflorę obecną na powierzchni nasion Cicer arietinum. Autorzy szukali również odpowiedzi na pytanie czy ekspozycja nasion C. arietinum na mikrowyładowanie SMD zmienia efektowność ich późniejszego kiełkowania. Badacze zaobserwowali, że wraz ze wzrostem długości czasu ekspozycji nasion na analizowaną plazmę (testowano następujące czasy traktowania: 0,5, 1, 2, 3, 4 i 5 min), liczba jednostek tworzących kolonie mikroflory, naturalnie występującej na powierzchni nasion C. arietinum, zmniejszyła się z poziomu 4,5 ± 0,02 log CFU/ml/cm2, do najniższej przedstawionej wartości tj. około 2,5 CFU/ml/cm², po 5 minutach działania SMD. Uzyskany logarytm redukcji (»2 log) jest wyższy niż w przypadku bezpośredniego działania CAP w układzie opisanym przez Schnabel i współ. (2012), chociaż ze względu na przeprowadzenie badań na nasionach innego gatunku roślin oraz eradykacji przetrwalników zamiast składników naturalnej mikroflory, nie jest możliwe jednoznaczne stwierdzenie wyższej skuteczności przytoczonego w tym przykładzie rozwiązania. Ponadto, Autorzy nie przedstawili składu gatunkowego inaktywowanej naturalnej mikroflory nasion C. arietinum, stąd nie byli w stanie określić czy unieczynnione komórki bakteryjne należały do mikroorganizmów saprofitycznych, drobnoustrojów wspomagających wzrost i rozwój roślin czy też bakterii fitopatogennych. Dodatkowo, zastosowanie opisanego systemu plazmowego do sterylizacji nasion wymaga stałego wytrząsania materiału roślinnego w celu równomiernej ekspozycji chropowatej powierzchni nasion na analizowaną CAP.

W tej samej pracy opisano również wpływ CAP na efektywność kiełkowania nasion C. arietinum. Badacze obserwowali stymulację kiełkowania nasion C. arietinum po ich traktowaniu CAP typu SMD. Po 24 h procent nasion traktowanych plazmą przez 30 s, 1 min, 2 min, 3 min oraz 4 min wynosił odpowiednio około 31%, 48%, 33%, 28% oraz 20% i wzrósł w porównaniu do nietraktowanych CAP nasion z próby kontrolnej (wykiełkowało około 13% nasion). Należy podkreślić, że po inkubacji nasion trwającej 72 czy 96 h, znacząco wyższy procent kiełkujących nasion można było zaobserwować jedynie w przypadku traktowania nasion CAP przez 1 oraz 2 min. Najkorzystniejszy efekt, wspomagający kiełkowanie nasion (oprócz procentu wykiełkowanych nasion zdefiniowany również na bazie prędkości kiełkowania, pozyskanych długości pędu i korzeni, suchej masy sadzonki i indeksu wigoru), badacze przypisali ekspozycji na CAP trwającej 1 min, a warto podkreślić, że taki czas działania CAP typu SMD skutkował redukcją w liczbie jednostek tworzących kolonie naturalnej mikroflory nieprzekraczającej 1 logarytmu. Za zaletę przytoczonego rozwiązania można przyjąć stosunkowo krótki czas ekspozycji nasion na działanie badanej plazmy oraz uzyskany po tym czasie efekt stymulacji kiełkowania nasion C. arietinum Aczkolwiek, przed wdrożeniem tej metody do przemysłu rolno-spożywczego, należałoby uzyskać wyższą efektywność eradykacji mikroorganizmów niż wspominany <1 log.

W publikacji autorstwa Pradeep Puligundla, Je-Wook Kim i Chulkyoon Mok pt.: „Effect of corona discharge plasma jet treatment on decontamination and sprouting of rapeseed (Brassica napus L.) seeds” (Food Control. 2017, 71, 376) badano skuteczność zastosowania wyładowań koronowych, generowanych pod ciśnieniem atmosferycznym (ang. corona discharge plasma jet; CDPJ) do sterylizacji nasion rzepaku oraz szacowano wpływ obróbki nasion tym wyładowaniem na ich zdolność do kiełkowania oraz szeroko rozumiane właściwości fizykochemiczne i organoleptyczne. Posiewy wykonane z nasion rzepaku na podłoża selekcyjno-różnicujące ujawniły, według badaczy, że na powierzchni te stowanych nasion B. napus występują bakterie tlenowe (w ilości 8,46 log CFU/g), a także mikroorganizmy oznaczone jako pleśnie i drożdże (6,19 log CFU/g) oraz drobnoustroje sklasyfikowane do gatunków Bacillus cereus (7,06 log CFU/g), Salmonella spp. (6,10 CFU/g) czy też Escherichia coli (5,36 CFU/g). W trakcie trwającej 3 min ekspozycji nasion rzepaku na działanie plazmy CDPJ, stwierdzono redukcję w liczbie mikroorganizmów występujących na powierzchni nasion, gdyż odpowiednio wykryte miana bakterii tlenowych, E. coli, B. cereus, Salmonella sp., oraz grzybów spadły o 2,2; 2,0;1,2; 1,8 bądź 2,0 log CFU/g w wyniku interakcji z analizowaną plazmą. Autorzy raportują, że uzyskane różnice w liczbie mikroorganizmów pomiędzy próbą kontrolną oraz próbami poddanymi działaniu plazmy CDJP przez 1, 2 i 3 min, utrzymują się co najmniej do 4 dni po skiełkowaniu nasion. W kwestii eksperymentów mających na celu oszacowanie efektywności kiełkowania nasion B. napus poddanych działaniu CDPJ, badacze przedstawili dane wskazujące, że 1 oraz 2 min ekspozycja na CAP nie wpływa w znaczący sposób na procent wykiełkowanych nasion. Obserwowano natomiast zwiększenie świeżej masy kiełków oraz ich całkowitej długości Jednakże nasiona B. napus traktowane analizowaną plazmą przez 3 min charakteryzowały się nie tylko niższą efektywnością kiełkowania, obniżoną wartością świeżej masą oraz krótszą całkowitą długością kiełków, ale również negatywną oceną w wykonanej analizie organoleptycznej. Stąd należy wziąć pod uwagę, że raportowane logarytmy redukcji w liczbie mikroorganizmów powinny być raczej analizowane w kontekście 2-minutowej ekspozycji nasion na plazmę typu CDPJ, a bazując na danych przedstawionych przez badaczy na Rycinie 4 w omawianej publikacji, wspomniane logarytmy redukcji nie zbliżają się do 2, oscylując w okolicach 1 log CFU/g. Oprócz powyższych, niezbyt satysfakcjonujących właściwości antybakteryjnych, należy zwrócić uwagę na fakt, że autorzy identyfikowali drobnoustroje do gatunków na podstawie ich zdolności do wzrostu na podłożach selekcyjnoróżnicujących. W świetle współczesnej mikrobiologicznej wiedzy nie jest to wystarczająco czuła metoda do klasyfikacji bakterii do poszczególnych gatunków, dlatego też przedstawione przez badaczy właściwości antybakteryjne analizowanej plazmy typu CDJP względem drobnoustrojów z danych grup taksonomicznych powinno się traktować z dużą dozą rezerwy.

Do zanieczyszczenia mikrobiologicznego nasion może dojść podczas cyklu życiowego rośliny bądź w trakcie późniejszego zbioru, transportu, kondycjonowania, kwalifikowania, magazynowania czy też pakowania tego produktu. The National Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods z siedzibą w USA, przypisała ostatnio obserwowane ogniska chorobowe, związane z infekcją kiełków brakowi konsekwentnie stosowanych metod sterylizacji nasion. Wśród drobnoustrojów chorobotwórczych względem ludzi i zwierząt odpowiedzialnych za te ogniska, a izolowanych z kiełków roślin należy zwrócić uwagę na bakterie z gatunków Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, B. cereus, Aeromonas hydrophila oraz E. coli. Powyższy fakt był przyczyną zainteresowania badaczy eradykacją drobnoustrojów chorobotwórczych względem ludzi i zwierząt z powierzchni nasion. Jak dotąd naukowcy podjęli liczne próby dekontaminacji nasion z użyciem metod chemicznych, fizycznych czy też biologicznych, aczkolwiek temat dekontaminacji nasion z drobnoustrojów powodujących choroby roślin nie był często podejmowany przez środowisko naukowe.

W naszym rozwiązaniu podjęliśmy się wykazania skuteczności zastosowania CAP, generowanej w wyniku inicjowania DBD w atmosferze helu w piórze plazmowym, do eradykacji ekonomicznie istotnych bakteryjnych fitopatogenów. W efekcie skutecznej inaktywacji komórek bakterii chorobotwórczych względem roślin, można by uzyskać obniżenie strat w produkcji roślinnej i przez to zapewnić dostęp do wysokiej jakości żywności rosnącej populacji ludzkiej. W tym kontekście istotnym jest by wybrana metoda była skuteczna, ekologiczna i niedroga, dlatego też przedmiotem zgłaszanego wynalazku jest sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo przed patogenami bakteryjnymi poprzez bezpośrednie traktowanie nasion CAP.

Warto zauważyć, co wykazano na powyższych przykładach, że podejmowano jak dotąd próby eradykacji bakterii (były to jednakże w większości drobnoustroje chorobotwórcze względem człowieka, modelowe mikroorganizmy czy też składniki naturalnej mikroflory) z powierzchni nasion przy użyciu CAP, jak również analizowano późniejszą zdolność traktowanych plazmą nasion do wykiełkowania i wzrostu. Jednak zastosowanie większości z opisanych w literaturze systemów plazmowych do eradykacji mikroorganizmów nie gwarantuje zadowalającej wartości logarytmu redukcji liczby drobnoustrojów w odpowiednio krótkim czasie przy jednoczesnym wykazaniu braku negatywnego wpływu na efektywność kiełkowania nasion.

Problemem technicznym, który postanowiono rozwiązać było dostosowanie parametrów pracy pióra plazmowego z DBD do jego późniejszego zastosowania do skutecznej inaktywacji bakteryjnych fitopatogenów z powierzchni nasion roślin naczyniowych. Z tego względu, celem wynalazku było opracowanie efektywnej metody eradykacji komórek bakterii fitopatogennych z powierzchni nasion. Zaproponowane rozwiązanie, skutkujące uzyskaniem odpowiedniego logarytmu redukcji w liczbie komórek bakteryjnych oraz brakiem negatywnego efektu na kiełkowanie nasion, odpowiedziałoby na niezaspokojoną dotąd potrzebę rynkową.

Istotą wynalazku jest sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo, zwłaszcza roślin naczyniowych, który polega na tym, że eradykację bakterii fitopatogennych z powierzchni materiału siewnego bądź sadzeniakowego prowadzi się poprzez bezpośrednie traktowanie nasion, bulw, cebul lub kłączy przy użyciu zimnej plazmy atmosferycznej CAP, generowanej w piórze plazmowym w wyniku inicjowania wyładowań barierowych DBD w atmosferze helu, przy czym do generowania wyładowań DBD stosuje się częstotliwość wyładowania prądu w zakresie od 10 do 30 kHz, amplitudę prądu wynoszącą 40000 V, wypełnienie prądu w zakresie od 25 do 75%, w odległości końcówki pióra plazmowego od traktowanego materiału roślinnego w zakresie od 0,5 do 10 cm, a roślinny materiał siewny lub sadzeniakowy traktuje się wyładowaniem barierowym DBD w czasie od 10 sekund do 5 minut.

Korzystnie sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo prowadzi się stosując hel o szybkości przepływu 5 dm³/min.

Korzystnie sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo prowadzi się stosując częstotliwość wyładowania prądu najkorzystniej 22,17 kHz.

Korzystnie, sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo prowadzi się stosując wypełnienie prądu 68,07%.

Korzystnie sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo prowadzi się poprzez bezpośrednie traktowanie materiału siewnego lub sadzeniakowego wyładowaniem barierowym DBD w czasie 2 min.

Korzystnie sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo prowadzi się w odległości 2 cm od końcówki pióra plazmowego do traktowanych próbek.

Korzystnie w wyniku bezpośredniego działania wyładowań barierowych DBD na powierzchnię materiału siewnego lub sadzeniakowego prowadzi się eradykację bakterii fitopatogennych z rodzajów Dickeya i Pectobacterium.

Korzystnie sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo prowadzi się poprzez traktowanie wyładowaniem wyładowań barierowych DBD materiału siewnego lub sadzeniakowego roślin naczyniowych, najkorzystniej nasion fasoli mung (Vigna radiata L.).

W trakcie działania analizowanej CAP nie dochodzi do mechanicznego uszkodzenia powierzchni nasion ani zakłócenia metabolizmu komórkowego, w efekcie nie obserwuje się zahamowania kiełkowania nasion poddanych generowanemu wyładowaniu DBD.

W trakcie badań zoptymalizowano również dodatkowe parametry przyczyniające się do podnoszenia efektywności zaproponowanego sposobu ochrony roślin istotnych gospodarczo. Stwierdzono, że skuteczność eradykacji komórek bakteryjnych oraz późniejszy brak zahamowania kiełkowania nasion jest zależny od warunków generowania tego rodzaju wyładowania, tj. rodzaju zastosowanego gazu wyładowczego, szybkości przepływu gazu wyładowczego, częstotliwości wyładowania prądu, wypełnienia prądu, długości czasu ekspozycji, odległości nasion od stożka plazmowego, a także zależy od rodzaju traktowanych plazmą nasion oraz ich efektywnego wytrząsania celem ekspozycji całej powierzchni nasiona na stosowaną CAP.

Wynalazek umożliwia inaktywację komórek bakterii fitopatogennych z powierzchni nasion przy jednoczesnym braku negatywnego oddziaływania DBD na efektywność kiełkowania traktowanych nasion.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest w przykładach realizacji, jednocześnie nie ograniczając jego zakresu, obrazujących sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo poprzez bezpośrednie traktowanie nasion CAP, generowaną w piórze plazmowym w wyniku inicjowania wyładowań barierowych DBD, oraz na rysunku na którym:

- na Fig. 1 przedstawiono eradykację bakterii fitopatogennych z gatunów Dickeya solani, szczep IFB0099, Pectobacterium carotovorum, szczep IFB5118 oraz Pectobacterium atrosepticum szczep IFB5103 ze sferycznych struktur szklanych, wynikającą z traktowania powierzchni tych modeli przez 1 min CAP generowaną w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD. Przed zastosowaniem wyładowania kulki szklane inkubowano w zawiesinach bakteryjnych o gęstościach optycznych 0,5; 0,05 oraz 0,005 McF. Na wykresie przedstawiono średnie ± odchylenie standardowe dla procenta redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie bakterii D. solani IFB0099, P. carotovorum IFB5118 oraz P. atrosepticum IFB5103 na mililitr buforu Ringera, wynikające z zastosowywania CAP, według wynalazku, w odniesieniu do nietraktowanych tym wyładowaniem prób kontrolnych. Eksperyment wykonano w trzech powtórzeniach biologicznych, każde z nich obejmowało trzy powtórzenia techniczne.

- na Fig. 2 przedstawiono różnice w morfologii komórek bakterii fitopatogennych D. solani IFB0099 traktowanych CAP, według wynalazku (A - próba badawcza), w porównaniu do próby kontrolnej (B - próba kontrolna). W przypadku bakterii poddanych działaniu wyładowania przez 5 min można zaobserwować zwiększenie gęstości elektronowej w obrębie protoplastu bakteryjnego, obniżenie gęstości elektronowej przy brzegach komórki oraz powiększenie się przestrzeni pomiędzy ścianą komórkową oraz błoną cytoplazmatyczną komórek fitopatogennych.

- na Fig. 3 przedstawiono eradykację bakterii fitopatogennych z gatunków Dickeya solani, szczep IFB0099, Pectobacterium carotovorum, szczep IFB5118 oraz Pectobacterium atrosepticum szczep IFB5103 z nasion fasoli mung, wynikającą z traktowania ich powierzchni przez 2 min CAP, generowaną w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD. Przed zastosowaniem wyładowania wyjałowione wcześniej nasiona inkubowano w zawiesinach bakteryjnych Dickeya solani IFB0099, Pectobacterium carotovorum IFB5118 bądź Pectobacterium atrosepticum IFB5103 o gęstościach optycznych 0,5; 0,05 bądź 0,005 McF. Na wykresie przedstawiono średnie ± odchylenie standardowe dla procenta redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie bakterii D. solani IFB0099, P. carotovorum IFB5118 oraz P. atrosepticum IFB5103 na mililitr buforu Ringera, wynikające z zastosowywania CAP, według wynalazku, w odniesieniu do nietraktowanych tym wyładowaniem prób kontrolnych. Eksperyment wykonano w trzech powtórzeniach biologicznych, każde z nich obejmowało trzy powtórzenia techniczne.

- na Fig. 4A przedstawiono średni procent wykiełkowanych nasion fasoli mung, wynikający z traktowania ich powierzchni przez 2 min bądź 4 min CAP, generowaną w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD po 24 h, 48 h oraz 96 h inkubacji w warunkach optymalnych w fitotronie. Przedstawiono średnią ± błąd standardowy z procentu wykiełkowanych nasion. Z kolei na Fig. 4B przedstawiono średnią długość kiełków fasoli mung po 48 h i 96 h od traktowania ich nasion przez 2 min bądź 4 min DBD. Zobrazowano średnią ± błąd standardowy z długości kiełków fasoli mung. Eksperymenty przedstawione na Fig. 4 wykonano w trzech powtórzeniach biologicznych, każde z nich obejmowało trzy powtórzenia techniczne.

Przykład 1

Sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo, wykazany poprzez eradykację bakterii fitopatogennych Dickeya solani IFB0099, Pectobacterium atrosepticum IFB5103 oraz Pectobacterium carotovorum IFB5118, z użyciem CAP generowanej w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD.

Właściwości antybakteryjne CAP, generowanej w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD, wykazuje się względem zdolności tego wyładowania do unieczynnienia komórek bakterii fitopatogennych D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 oraz Pectobacterium carotovorum IFB5118 z powierzchni kulek szklanych.

Badane szczepy bakterii, tj. D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 oraz Pectobacterium carotovorum IFB5118, przechowuje się w jałowym 40% (v/v) roztworze glicerolu w temperaturze -80°C. W celu uzyskania pojedynczej kolonii bakteryjnej wymienione powyżej szczepy fitopatogenów wysiewa się metodą posiewu redukcyjnego na podłoże Trypticase Soy Agar (TSA) i inkubuje następnie w temperaturze 28°C przez 24 h. Pojedynczą kolonię bakteryjną pobiera się jałową ezą i zaszczepia nią pożywkę płynną Trypticase Soy Broth (TSB). Następnie, inokulowaną pożywkę TSB inkubuje się w 28°C przez 24 h z wytrząsaniem 140 rpm. Otrzymaną w ten sposób hodowlę nocną poddaje się wirowaniu przy 6500 rpm przez 10 min, usuwa supernatant, a osad zawiesza się w 1,5 ml jałowej soli fizjologicznej (0,85% NaCl). Następnie, zawiesinę bakteryjną w soli fizjologicznej poddaje się ponownemu wirowaniu przy 6500 rpm przez 10 min, uzyskany supernatant usuwa, a powstały osad komórek bakteryjnych ponownie zawiesza w 1,5 ml jałowej soli fizjologicznej. Po przeprowadzeniu kolejnego, wykonanego w opisany powyżej sposób, płukania osadu bakteryjnego jałową solą fizjologiczną, komórki bakteryjne z uzyskanego osadu zawiesza się w 200 μl jałowej soli fizjologicznej. Taką zawiesinę komórek bakteryjnych dodaje się do 5 ml jałowej soli fizjologicznej, znajdującej się w 15 ml szklanej probówce, w takiej ilości by na podstawie pomiarów densytometrycznych (densytometr DEN-1B (BioSan, Łotwa)) doprowadzić końcową gęstość optyczną zawiesiny do 0,5 McF. Później, stosując metodę seryjnych rozcieńczeń, uzyskuje się zawiesiny bakteryjne o gęstości optycznej 0,05 McF oraz 0,005 McF. Powyższą procedurę wykonuje się dla każdego testowanego szczepu bakteryjnego tj. D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 oraz Pectobacterium carotovorum IFB5118.

Szklane kulki o średnicy 3,5 mm jałowi się poprzez umieszczenie ich w 200 ml zlewce, zanurzenie w 50 ml 70 % etanolu i pozostawienie na 1 min. Następnie, 70% alkohol zlewa się, a zlewkę przykrywa się folią aluminiową i poddaje jałowieniu w autoklawie przez 45 min w 121°C, przy ciśnieniu 1 atmosfery. Tak wyjałowione szklane kulki umieszcza się na 12-dołkowej sterylnej płytce, w taki sposób by 5 kulek szklanych przypadało na jeden dołek. Do każdego dołka, w którym znajdują się szklane kulki, dodaje się wcześniej przygotowaną zawiesinę bakterii D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 bądź Pectobacterium carotovorum IFB5118, o gęstości optycznej 0,5 lub 0,05 lub 0,005 McF. Następnie szklane kulki poddane 30 s inkubacji w zawiesinach bakteryjnych przenosi się z użyciem jałowej pincety do innej 12-dołkowej jałowej płytki, umieszczając, jak poprzednio, po 5 kulek stanowiących jedną próbę badawczą bądź kontrolną w danym dołku. Każdy dołek zawierający 5 szklanych kulek inkubowanych w zawiesinie bakterii D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 bądź Pectobacterium carotovorum IFB5118 o gęstości optycznej 0,5 lub 0,05 lub 0,005 McF, które stanowią próby badawcze eksperymentu eksponuje się na 1 min wyładowanie DBD w odległości 2 cm od źródła CAP. Ponadto, w wyniku zastosowania w piórze plazmowym prądu o wartości częstotliwości 22.17 kHz, amplitudy tego prądu wynoszącej 40000 V oraz wypełnienia prądu o wartości 68,07%, a także wprowadzając do pióra plazmowego hel z szybkością przepływu 5,0 dm³/min, inicjuje się i utrzymuje stabilne wyładowania DBD. W trakcie traktowania kulek szklanych plazmą, 12-dołkową płytkę poddaje się delikatnemu wstrząsaniu, tak aby powierzchnia każdej kulki szklanej została poddana działaniu DBD. W eksperymencie uwzględniona jest próba kontrolna, którą stanowią kulki szklane inkubowane w zawiesinie bakterii D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 bądź Pectobacterium carotovorum IFB5118 o gęstości optycznej 0,5 lub 0,05 lub 0,005 McF, niepoddane jednakże działaniu wyładowania DBD. Następnie, 5 szklanych kulek (zarówno traktowanych plazmą jak i tych niepoddanych ekspozycji na wyładowanie) z danego dołka płytki 12-dołkowej przenosi się jałową pęsetą do innej 12-dołkowej płytki, zalewa 1 ml buforu Ringera i wytrząsa przez 10 minut przy 600 rpm. Po 10-minutowej inkubacji kulek w buforze Rignera, pobiera się 100 μ! buforu zawierającego komórki bakteryjne, seryjnie rozcieńcza do 10^-6 i wysiewa każde z przygotowanych rozcieńczeń metodą posiewu na murawę na pożywkę TSA. Inokulowane płytki TSA inkubuje się w cieplarce w 28°C przez 48 h i po tym czasie dokonuje zliczenia obserwowanych kolonii bakteryjnych. Przedstawione powyżej doświadczenie wykonuje się w trzech powtórzeniach biologicznych, każde z nich obejmuje po trzy powtórzenia techniczne. Efektywność przedstawionego sposobu ochrony roślin poprzez eradykację bakterii fitopatogennych z powierzchni szklanych kulek z użyciem CAP, generowanej w piórze plazmowym z DBD ocenia się poprzez obliczenie procentu oraz logarytmu redukcji w ilości jednostek tworzących kolonie D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 bądź Pectobacterium carotovorum IFB5118, wynikającą z działania pióra plazmowego w porównaniu do nietraktowanych DBD prób kontrolnych.

Efektywność przedstawionego sposobu ochrony roślin poprzez eradykację bakterii fitopatogennych z użyciem CAP, generowanej w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD, wykazano na Fig. 1:

- Antybakteryjne właściwości CAP, generowanej w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD, względem bakterii fitopatogennych (Fig. 1). W wyniku przeprowadzonych doświadczeń wykazano, że 1 min ekspozycja na wyładowanie DBD kulek szklanych opłaszczonych wcześniej bakteriami D. solani, IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 oraz Pectobacterium carotovorum IFB5118 spowodowała redukcję w ilości jednostek tworzących kolonie bakteryjne w zakresie 99,93% - 100%. W kwestii logarytmu redukcji, zastosowane wyładowanie, według wynalazku, skutkowało zmniejszeniem w liczbie żywych komórek bakteryjnych w zakresie od 3,16 log do eradykacji wszystkich komórek bakteryjnych z powierzchni szklanych kulek. Na wykresie przedstawiono (średnia ± błąd standardowy) procent redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie bakteryjne D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 bądź P. carotovorum IFB5118, które wcześniej aplikowano na powierzchnię szklanych kulek w postaci zawiesin o gęstości 0,5; 0,05 oraz 0,005 McF, przy czym procent redukcji w ilości żywych komórek bakteryjnych wynikał z porównania liczby jednostek tworzących kolonie wyrastających na podłożu odżywczym TSA po ekspozycji szklanych kulek na wyładowanie DBD w porównaniu do próby kontrolnej, czyli inokulowanych bakteriami kulek, ale niepoddanych działaniu wyładowania. Przeprowadzona analiza statystyczna (test Kruskala-Wallisa oraz test najmniejszych istotnych różnic Fishera z poprawką Bonferroniego; p < 0.05) wykazała, że wszystkie ujęte w eksperymencie gatunki bakterii fitopatogennych są jednakowo wrażliwe na wyładowanie DBD.

Właściwości antybakteryjne CAP, generowanej w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD, przejawiają się również zmianami w morfologii komórek bakterii fitopatogennych D. solani IFB0099.

Wizualizację komórek bakterii D. solani IFB0099, poddanych działaniu CAP zgodnie z wynalazkiem, w porównaniu do nietraktowanych wyładowaniem komórek, stanowiących próbę kontrolną, prowadzi się z użyciem transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM Tecnai G² Spirit Bio TWIN (120 kV)). W tym celu przygotowuje się zawiesinę bakterii D. solani IFB0099 o gęstości optycznej 0,5 McF, zgodnie z opisem przedstawionym powyżej, i 0,5 ml tej zawiesiny umieszcza się w 1,5 ml probówce typu Eppendorf. Następnie, probówkę typu Eppendorf z zawiesiną bakteryjną umieszcza w odległości 30 mm od źródła plazmy i poddaje ekspozycji na wyładowanie DBD przez czas 5 min. Uwzględnia się również próbę kontrolną, którą stanowi przygotowana w analogiczny sposób zawiesina bakterii D. solani IFB0099, niepoddana jednakże działaniu wyładowania. Krople zawiesin bakteryjnych D. solani IFB0099, traktowanych oraz nietraktowanych wyładowaniem DBD, według wynalazku, nanosi się na siatkę miedzianą z filmem węglowym i poddaje 1 minutowej inkubacji. Nadmiar zawiesiny bakteryjnej odsącza się z użyciem bibuły filtracyjnej. Następnie na powierzchnię wspomnianej miedzianej siatki zakrapia się 1% roztwór octanu uracylu. Po 1 min nadmiar 1% roztworu octanu uracylu odsącza się z użyciem bibuły filtracyjnej. Po wyschnięciu do sucha, próby badawcze oraz kontrolne poddaje się wizualizacji z użyciem transmisyjnego mikroskopu elektronowego TEM Tecnai G² Spirit Bio TWIN (120 kV). Efektywność przedstawionego sposobu ochrony roślin poprzez eradykację bakterii fitopatogennych z użyciem CAP, generowanej w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD, ocenia się na podstawie różnic w morfologii obserwowanych u bakterii D. solani IFB0099 poddanych działaniu CAP przez 5 min w porównaniu do nietraktowanych wyładowaniem komórek kontrolnych.

Skuteczność opracowanego sposobu ochrony roślin poprzez eradykację bakterii fitopatogennych z użyciem CAP, generowanej w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD, wykazano na Fig. 2:

- Fotomikrog rafie TEM obrazujące różnice w morfologii bakterii D. solani IFB0099 poddanych działaniu CAP, generowanej w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD (Fig. 2A) w porównaniu do nietraktowanych plazmą komórek kontrolnych (Fig. 2B). Ekspozycja komórek D. solani IFB0099 na strugę plazmową spowodowała zwiększenie gęstości elektronowej w obrębie protoplastu komórek fitopatogennych, wskazujące na denaturację i agregację fragmentów DNA, białek oraz rybosomów w wyniku działania powstałych reaktywnych form tlenu, azotu oraz zakwaszenia ośrodka. Ponadto, zaobserwowano rejony o niższej gęstości elektronowej przy brzegach traktowanych plazmą komórek D. solani IFB0099, co sugeruje wypływ cytoplazmy z komórki przez błonę cytoplazmatyczną o zaburzonej ciągłości. Warto również podkreślić powiększenie się przestrzeni pomiędzy ścianą komórkową oraz błoną cytoplazmatyczną u D. solani IFB0099 poddanej bezpośredniemu działaniu DBD.

Przykład 2

Sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo wykazany poprzez eradykację bakterii fitopatogennych Dickeya solani IFB0099, Pectobacterium atrosepticum IFB5103 oraz Pectobacterium carotovorum IFB5118, z powierzchni nasion fasoli mung (Vigna radiata L.) z zastosowaniem CAP, generowanej w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD.

Badane szczepy bakterii, tj. D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 oraz Pectobacterium carotovorum IFB5118, przechowuje się w jałowym 40% (v/v) roztworze glicerolu w temperaturze -80°C. W celu uzyskania pojedynczych kolonii bakteryjnych biomasę D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 oraz Pectobacterium carotovorum IFB5118 wysiewa się metodą posiewu redukcyjnego na podłoże Trypticase Soy Agar (TSA) i inkubuje następnie w temperaturze 28°C przez 24 h. Pojedynczą kolonię bakteryjną pobiera się jałową ezą i zaszczepia nią pożywkę płynną Trypticase Soy Broth (TSB). Następnie inokulowaną pożywkę TSB inkubuje się w 28°C przez 24 h z wytrząsaniem 140 rpm. Otrzymaną w ten sposób hodowlę nocną poddaje się wirowaniu przy 6500 rpm przez 10 min, usuwa supernatant, a osad zawiesza się w 1,5 ml jałowej soli fizjologicznej (0,85% NaCl). Następnie zawiesinę bakteryjną w soli fizjologicznej poddaje się ponownemu wirowaniu przy 6500 rpm przez 10 min, uzyskany supernatant usuwa, a powstały osad komórek bakteryjnych ponownie zawiesza w 1,5 ml jałowej soli fizjologicznej. Po przeprowadzeniu kolejnego, wykonanego w opisany powyżej sposób, płukania osadu bakteryjnego jałową solą fizjologiczną, komórki bakteryjne z uzyskanego osadu zawiesza się w 200 μl jałowej soli fizjologicznej. Taką, mlecznobiałą zawiesinę bakteryjną dodaje się do 5 ml jałowej soli fizjologicznej, znajdującej się w 15 ml szklanej probówce, w takiej ilości by na podstawie pomiarów densytometrycznych (densytometr DEN-1B (BioSan, Łotwa)) doprowadzić końcową gęstość optyczną zawiesiny do 0,5 McF. Następnie, stosując metodę seryjnych rozcieńczeń uzyskuje się zawiesiny bakteryjne

D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 oraz Pectobacterium carotovorum IFB5118 o gęstości optycznej 0,05 McF oraz 0,005 McF.

Nasiona Vigna radiata L., tj. fasoli mung (W. Legutko, Polska), sterylizuje się poprzez umieszczenie 300 tych nasion w 50 ml probówce zawierającej 70% roztwór etanolu w taki sposób by poddany jałowieniu materiał roślinny został w całości pokryty czynnikiem antyseptycznym. Po 30 s inkubacji, 70% roztwór etanolu wylewa się z probówki, a nasiona fasoli mung płucze się w sterylnej destylowanej wodzie przez okres 1 min. Tak przygotowane nasiona umieszcza się na 5 minut w 3% roztworze perhydrolu, a następnie płucze się czterokrotnie w jałowej wodzie destylowanej. Wyjałowione nasiona fasoli mung umieszcza się na 12-dołkowej płytce, po 5 nasion na jeden dołek. Do każdego dołka, w którym znajdują się nasiona fasoli mung dodaje się po 0,5 ml wcześniej przygotowanej zawiesiny bakterii D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 bądź Pectobacterium carotovorum IFB5118 o gęstości optycznej 0,5; 0,05, bądź 0,005 McF. Płytkę 12-dołkową wytrząsa się przez okres 30 s, aby nasiona zostały równomiernie pokryte zawiesiną bakterii. Następnie inokulowane bakteriami nasiona fasoli mung przenosi się przy użyciu jałowej pęsety do innej 12-dołkowej płytki, umieszczając również po 5 nasion w jednym dołku. Kolejnym etapem prac jest poddanie kontaminowanych bakteriami nasion procesowi suszenia przez 10 minut w 35°C. Każdy dołek zawierający 5 nasion fasoli mung inkubowanych w zawiesinie bakterii D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 bądź Pectobacterium carotovorum IFB 5118 o gęstości optycznej 0,5 lub 0,05 lub 0,005 McF, stanowiących próbę badawczą eksperymentu eksponuje się na 2 min wyładowania DBD w odległości 2 cm od źródła CAP. Ponadto, w wyniku zastosowania w piórze plazmowym prądu o wartości częstotliwości 22.17 kHz, amplitudy tego prądu wynoszącej 40000 V oraz wypełnienia prądu o wartości 68,07%, a także wprowadzając do pióra plazmowego hel z szybkością przepływu 5,0 dm³/min, inicjuje się i utrzymuje stabilne DBD. W trakcie traktowania nasion CAP, 12-dołkową płytkę poddaje się delikatnemu wstrząsaniu, tak aby powierzchnia każdego nasiona została poddana działaniu DBD. W eksperymencie uwzględniona jest próba kontrolna, którą stanowią nasiona fasoli mung inkubowane w zawiesinie bakterii D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 bądź Pectobacterium carotovorum IFB5118 o gęstości optycznej 0,5 lub 0,05 lub 0,005 McF, niepoddane jednakże działaniu DBD. Następnie, 5 nasion (zarówno traktowanych plazmą jak i tych niepoddanych ekspozycji na wyładowanie) z danego dołka płytki 12-dołkowej przenosi się jałową pęsetą do innej 12-dołkowej płytki, zalewa 1 ml buforu Ringera i wytrząsa przez 10 minut przy 1000 rpm. Po 10-minutowej inkubacji nasion w buforze Rignera, pobiera się 100 μl buforu zawierającego komórki bakteryjne, seryjnie rozcieńcza do 10^-6 i wysiewa każde z przygotowanych rozcieńczeń metodą posiewu na murawę na pożywkę TSA. Inokulowane płytki TSA inkubuje się w cieplarce w 28°C przez 48 h i po tym czasie dokonuje zliczenia obserwowanych kolonii bakteryjnych.

Efektywność przedstawionego sposobu ochrony roślin poprzez eradykację bakterii fitopatogennych z powierzchni nasion fasoli mung z użyciem CAP, generowanej w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD, ocenia się poprzez determinację procentu oraz logarytmu redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie D. solani IFB0099, P. atrosepticumIFB5103 bądź Pectobacterium carotovorum IFB5118, wynikającą z działania CAP, w odniesieniu do nietraktowanych wyładowaniem prób kontrolnych.

Efektywność przedstawionego sposobu ochrony roślin poprzez eradykację bakterii fitopatogennych z użyciem CAP, generowanej w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD, wykazano na Fig. 3:

- Antybakteryjne właściwości CAP, generowanej w piórze plazmowym, w wyniku inicjowania DBD, względem bakterii fitopatogennych obecnych na powierzchni nasion fasoli mung (Fig. 3). W wyniku przeprowadzonych doświadczeń wykazano, że 2 min ekspozycja na wyładowanie DBD nasion fasoli mung, inokulowanych wcześniej bakteriami D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 bądź Pectobacterium carotovorum IFB5118, spowodowała redukcję w liczbie żywych komórek bakteryjnych w zakresie 99,91% - 100%. Zastosowane wyładowanie, według wynalazku skutkowało logarytmem redukcji w liczbie żywych komórek bakteryjnych przekraczającym 3,07 log. Na wykresie przedstawiono (średnia ± błąd standardowy) procent redukcji w liczbie jednostek tworzących kolonie bakteryjne D. solani IFB0099, P. atrosepticum IFB5103 bądź Pectobacterium carotovorum IFB5118, które wcześniej aplikowano na powierzchnię nasion w postaci zawiesin o gęstości 0,5; 0,05 oraz 0,005 McF, przy czym procent redukcji w ilości żywych komórek bakteryjnych wynikał z porównania liczby jednostek tworzących kolonie wyrastających na podłożu odżywczym TSA po ekspozycji nasion na wyładowanie DBD w porównaniu do próby kontrolnej, czyli inokulowanych bakteriami nasion, ale niepoddanych działaniu wyładowania. Przeprowadzona analiza statystyczna (test Kruskala-Walisa oraz test najmniejszych istotnych różnic Fishera z poprawką Bonferroniego; p < 0.05) wykazała, że wszystkie ujęte w eksperymencie gatunki bakterii fitopatogennych są jednakowo wrażliwe na wyładowanie DBD.

Przykład 3

Sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo poprzez bezpośrednie traktowanie nasion fasoli mung z użyciem CAP generowanej w piórze plazmowym z DBD. Ocena efektywności kiełkowania nasion fasoli mung poddanej działaniu DBD.

Nasiona fasoli mung (Vigna radiata L., W. Legutko, Polska), sterylizuje się poprzez umieszczenie 300 tych nasion w 50 ml probówce zawierającej 70% roztwór etanolu, w taki sposób by poddany jałowieniu materiał roślinny został w całości pokryty czynnikiem antyseptycznym. Po 30 s inkubacji, 70% roztwór etanolu wylewa się z probówki, a nasiona fasoli mung płucze się w sterylnej destylowanej wodzie przez okres 1 min. Tak przygotowane nasiona umieszcza się na 5 minut w 3% roztworze perhydrolu, a następnie płucze się czterokrotnie w jałowej wodzie destylowanej. Wyjałowione nasiona fasoli mung umieszcza się na 12-dołkowej płytce, po 5 nasion na jeden dołek. Każdy dołek zawierający 5 nasion fasoli mung, które stanowią próbę badawczą eksperymentu eksponuje się na 2 min wyładowania DBD w odległości 2 cm od źródła CAP. Ponadto, w wyniku zastosowania w piórze plazmowym prądu o wartości częstotliwości 22.17 kHz, amplitudy tego prądu wynoszącej 40000 V oraz wypełnienia prądu o wartości 68,07%, a także wprowadzając do pióra plazmowego hel z szybkością przepływu 5,0 dm³/min, inicjuje się i utrzymuje stabilne DBD. W trakcie traktowania nasion CAP, 12-dołkową płytkę poddaje się delikatnemu wstrząsaniu tak, aby powierzchnia każdego nasiona fasoli mung została poddana działaniu DBD. W eksperymencie uwzględniona jest próba kontrolna, którą stanowią wyjałowione nasiona fasoli mung, niepoddane jednakże działaniu wyładowania DBD. Następnie, 5 nasion (zarówno traktowanych plazmą jak i tych niepoddanych ekspozycji na wyładowanie) z danego dołka płytki 12-dołkowej przenosi się jałową pęsetą na płytki Petriego o średnicy 96 mm wyłożone pojedynczą warstwą jałowej bibuły filtracyjnej nasączonej 5 ml jałowej wody destylowanej. Tak przygotowane płytki Petriego zawierające nasiona fasoli mung poddaje się inkubacji w fitotronie w warunkach: 16 h światło, 120 μmol m^-2 s^-1 temp. 20°C i 8 h ciemność temp. 18°C. Ilość wykiełkowanych nasion szacuje się po 24 h, 48 h oraz 96 h od traktowania CAP. Długość kiełków mierzy się po 48h oraz 96h od traktowania CAP.

Efektywność przedstawionego sposobu ochrony roślin poprzez traktowanie powierzchni nasion fasoli mung z użyciem CAP, generowanej w piórze plazmowym z DBD, ocenia się poprzez determinację średniej liczby wykiełkowanych nasion oraz średniej długości uzyskanych kiełek po czasie inkubacji w fitotronie.

Efektywność przedstawionego sposobu ochrony roślin poprzez traktowanie powierzchni nasion fasoli mung z użyciem CAP, generowanej w piórze plazmowym z DBD, wykazano na Fig. 4:

- Wpływ traktowania CAP, generowanej w piórze plazmowym z DBD, na kiełkowanie nasion fasoli mung (Fig. 4). Na wykresach przedstawiono (średnia ± błąd standardowy) procent wykiełkowanych nasion (Fig. 4A) oraz uzyskaną długość kiełek (Fig. 4B) po 2 oraz 4 min ekspozycji na DBD nasion fasoli mung w odniesieniu do nietraktowanej CAP próby kontrolnej. Procent wykiełkowanych nasion po 24 h, 48 h i 96 h inkubacji był nieznacznie wyższy w przypadku nasion traktowanych CAP przez 2 min, w porównaniu do nasion kontrolnych, których nie poddawano działaniu plazmy (Fig. 4A). Natomiast aplikacja CAP przez 4 min powodowała po 24 h statystycznie istotną różnicę (test T studenta; p < 0.05) w efektywności kiełkowania nasion poddanych działaniu DBD w odniesieniu do próby kontrolnej. Jednakże obserwowany niekorzystny efekt nie utrzymywał się długo, gdyż nie obserwowano go już po 96 h od aplikacji CAP. Podobne trendy można zaobserwować na Fig. 4B, gdyż w przypadku 2 min ekspozycji na DBD zarówno po 48 h jak i 96 h inkubacji średnia długość kiełków w przypadku nasion traktowanych plazmą była nieznacznie wyższa w porównaniu do kiełków z nasion niepoddanych wyładowaniu generowanemu w piórze plazmowym. Należy nadmienić, że 4 min działanie CAP skutkowało statystycznie istotnym obniżeniem długości powstałych kiełków w porównaniu do próby kontrolnej po 48 h inkubacji. Jednakże obserwowane różnice nie wykazywały istotności statystycznej po 96 h od 4-minutowej ekspozycji nasion na DBD.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo, zwłaszcza roślin naczyniowych, znamienny tym, że eradykację bakterii fitopatogennych z powierzchni materiału siewnego bądź sadzeniakowego prowadzi się poprzez bezpośrednie traktowanie nasion, bulw, cebul lub kłączy przy użyciu zimnej plazmy atmosferycznej CAP, generowanej w piórze plazmowym w wyniku inicjowania wyładowań barierowych DBD w atmosferze helu, przy czym do generowania wyładowań DBD stosuje się częstotliwość wyładowania prądu w zakresie od 10 do 30 kHz, amplitudę prądu wynoszącą 40000 V, wypełnienie prądu w zakresie od 25 do 75%, w odległości końcówki pióra plazmowego od traktowanego materiału roślinnego w zakresie od 0,5 do 10 cm, a roślinny materiał siewny lub sadzeniakowy traktuje się wyładowaniem barierowym DBD w czasie od 10 sekund do 5 minut.
2. 2. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że do generowania wyładowań DBD stosuje się hel o szybkości przepływu 5 dm³/min.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że do generowania wyładowań DBD stosuje się częstotliwość wyładowania prądu 22,17 kHz.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że do generowania wyładowań DBD stosuje się wypełnienie prądu 68,07%.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że roślinny materiał siewny lub sadzeniakowy traktuje się wyładowaniem barierowym DBD w czasie 2 min.
6. 6. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że wyładowanie DBD generuje się w odległości 2 cm od końcówki pióra plazmowego do traktowanych próbek.
7. 7. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że z powierzchni materiału siewnego lub sadzeniakowego prowadzi się eradykację bakterii fitopatogennych z rodzajów Dickeya i Pectobacterium.
8. 8. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że sposób ochrony roślin istotnych gospodarczo prowadzi się poprzez traktowanie wyładowaniem wyładowań barierowych DBD materiału siewnego lub sadzeniakowego fasoli mung (Vigna radiata L.).