PL247951B1

PL247951B1 - Sposób wytwarzania ryboflawiny w podłożach z hydrolizatami lignocelulozy przy użyciu flawinogennych drożdży Candida famata

Info

Publication number: PL247951B1
Application number: PL442422A
Authority: PL
Inventors: Andriy Sybirnyy; Justyna Ruchała; Alicja Najdecka; Dariya Fedorovych
Original assignee: Podkarpackie Centrum Innowacji Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia; Univ Rzeszowski
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2025-09-22
Also published as: PL442422A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania ryboflawiny, charakteryzujący się tym, że szczepy flawinogennych drożdży Candida famata hoduje się w podłożu z hydrolizatem lignocelulozy, który zawiera glukozę, ksylozę i sacharozę, z dodatkiem ekstraktu drożdżowego, stosując wytrząsanie, w temperaturze od 27 do 30°C, do wyczerpania wszystkich cukrów w podłożu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ryboflawiny (witamina B2) w podłożu z hydrolizatem lignocelulozy przy pomocy flawinogennych drożdży Candida famata.

Ryboflawina (witamina B2) jest rozpuszczalną w wodzie witaminą, biosyntetycznym prekursorem koenzymów flawinowych mononukleotydu flawinowego (FMN) i dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD), które uczestniczą w wielu reakcjach enzymatycznych. Ryboflawina jest wysokowartościową substancją z roczną sprzedażą ponad 9 miliardów USD (https://www.mordorintelligence.com/industryre- ports/riboflavinmarket). Ryboflawina wykorzystywana jest przede wszystkim jako dodatek do pasz, a ponadto znajduje zastosowanie w przemyśle spożywczym oraz w medycynie. Ryboflawinę uzyskuje się za pomocą nadprodukujących szczepów bakterii Bacillus subtilis oraz grzyba nitkowatego Ashbya (Eremothecium) gossypii z wykorzystaniem podłoży z glukozą oraz/lub tłuszczem jako źródłem węgla. Koszty produkcji ryboflawiny w znacznym stopniu zależą od kosztów i obecności substratów węglowych.

Niniejszy wynalazek ujawnia sposób uzyskania ryboflawiny przy pomocy flawinogennych drożdży C. famata wykazujących obfity wzrost i nadprodukcję ryboflawiny w podłożach z hydrolizatem lignocelulozy oraz głównymi źródłami węgla występującymi w hydrolizatach, czyli glukozą oraz ksylozą. Maksymalnie w podłożu z hydrolizatami lignocelulozy uzyskano około 900 mg ryboflawiny w litrze podczas hodowli w kolbach.

Drożdże C. famata należą do tak zwanych flawinogennych drożdży zdolnych do nadprodukcji ryboflawiny w warunkach deficytu żelaza w podłożu. Wykorzystując odpowiednie szczepy tego gatunku, skonstruowano bardzo wydajnych producentów ryboflawiny już w podłożu standardowym z dodatkiem żelaza, które charakteryzują się wydajnością syntezy na poziomie przemysłowych producentów tj. B. subtilis i A. gossypii, jednak producenci C. famata okazali się genetycznie niestabilni więc przemysłowa produkcja ryboflawiny z udziałem tych drożdży została zawieszona (Abbas and Sibirny, 2011). Dzięki późniejszym badaniom zostały skonstruowane przez Twórców niniejszego wynalazku genetycznie stabilne (nierewertujące) szczepy produkujące ryboflawinę, na przykład, szczep BRP, dzięki nadekspresji genów SEF1 (kodujący aktywator transkrypcji) oraz RIB1 i RIB7 (kodujące, odpowiednio, pierwszy i ostatni enzymy biosyntezy ryboflawiny, czyli cyklohydrolazę GTP oraz syntazę ryboflawiny) (Dmytruk et al., 2011, 2014). Dodatkowo produkcję ryboflawiny u C. famata udało się zwiększyć w wyniku klonowania i nadekspresji genu RFE1 kodującego białko pozwalające na sekrecję ryboflawiny z komórki na zewnątrz do podłoża, (szczep BRP/RFE) (Tsyrulnyk et al., 2020), aktywując produkcję purynowego prekursora ryboflawiny, GTP przy pomocy nadekspresji genów PRS3 oraz ADE4 (Dmytruk et al., 2020) lub dodatkowo poprzez nadekspresję w szczepie z nadprodukcją GTP genu RIB6 kodującego syntazę 3,4-dihydroksybutanonofosforanu (Petrovska et al., 2022).

Polskie zgłoszenie patentowe PL435341 A1 dotyczy nowego szczepu drożdży Candida famata BCRP zdolnego do nadprodukcji ryboflawiny, zastosowania szczepu drożdży Candida famata BCRP do wytwarzania ryboflawiny oraz sposobu wytwarzania ryboflawiny.

Ukraińskie zgłoszenie wzoru użytkowego UA133594 U dotyczy sposobu otrzymywania rekombinowanych szczepów gatunku drożdży Candida famata o wysokim poziomie syntezy witaminy B2 (ryboflawiny).

Ukraińskie zgłoszenie patentowe UA90741 C2 dotyczy szczepu drożdży Candida famata IMB Y-5033 - stabilnego producenta ryboflawiny (witamina B2).

Ukraińskie zgłoszenie patentowe UA90754 C2 dotyczy szczepu drożdży Candida famata IMB Y-5034 - producenta ryboflawiny (witamina B2).

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO0206448 A2 dotyczy systemu do transformacji drożdży flawinogennych.

Ukraińskie zgłoszenie wzoru użytkowego UA36164 U dotyczy szczepu drożdży Candida famata IMB Y-5034 - producenta ryboflawiny (witamina B2).

Ukraińskie zgłoszenie wzoru użytkowego UA34554 U dotyczy szczepu drożdży Candida famata IMB Y-5033 - stabilnego producenta ryboflawiny (witamina B2).

Ukraińskie zgłoszenie wzoru użytkowego UA22568 U dotyczy sposobu przygotowania mononukleotydu flawiny (5'-FMN).

Europejskie zgłoszenie patentowe EP0967287 A2 dotyczy wytwarzania ryboflawiny przy użyciu transformowanego szczepu drożdży zawierającego sekwencję DNA połączoną transkrypcyjnie z promotorem funkcjonalnym w komórkach drożdży, który po ekspresji w odpowiedniej komórce gospodarza, koduje co najmniej jeden polipeptyd wykazujący aktywność biosyntezy ryboflawiny.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO03074721 A2 dotyczy sposobu wytwarzania ryboflawiny.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO8809822 A1 dotyczy szczepów mikroorganizmów z gatunku Candida famata wytwarzających ryboflawinę.

W dziedzinie istnieje zatem wciąż zapotrzebowanie na opracowanie nowych, prostszych, bardziej ekonomicznych sposobów wytwarzania ryboflawiny.

Celem niniejszego wynalazku było opracowanie nowego sposobu wytwarzania ryboflawiny (witaminy B2) z hydrolizatów lignocelulozy przy pomocy szczepów flawinogennych drożdży C. famata.

A zatem, przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób otrzymywania ryboflawiny, charakteryzujący się tym, że szczepy flawinogennych drożdży Candida famata hoduje się w podłożu z hydrolizatem lignocelulozy, który zawiera glukozę, ksylozę i sacharozę, z dodatkiem ekstraktu drożdżowego, stosując wytrząsanie, w temperaturze od 27 do 30°C, do wyczerpania wszystkich cukrów w podłożu.

Korzystnie, hydrolizatem lignocelulozy jest hydrolizat bagassy.

Korzystnie, hydrolizat lignocelulozy zawiera 11 g/l glukozy, 8 g/l ksylozy i 2 g/l sacharozy.

Korzystnie, dodatek ekstraktu drożdżowego wynosi 0,2% wagowego.

Korzystnie, wytrząsanie prowadzi się w kolbach na wytrząsarce z częstotliwością 200 obrotów/minutę.

Korzystnie, hodowlę prowadzi się przez 4 dni.

Korzystnie, hodowlę prowadzi się w temperaturze 28°C.

Niniejszy wynalazek przedstawiono na figurach rysunku, gdzie:

na Fig. 1 pokazano wzrost i produkcję ryboflawiny przez szczep C. famata BRP RFE1 hodowanego w YNB na pożywce bez ekstraktu drożdżowego (0,2%) uzupełnionej różnymi źródłami węgla: 1 - glukoza, 2 - ksyloza, 3 - bagasse;

na Fig. 2 pokazano profile czasowe wzrostu (A) i produkcji ryboflawiny (B) przez szczep C. famata BRP RFE1 na YNB z pożywką bez ekstraktu drożdżowego (0,2%) uzupełnioną różnymi źródłami węgla: 1 - glukoza, 2 - ksyloza, 3 - bagassa;

na Fig. 3 pokazano profile czasowe stężenia glukozy (kwadraty) i ksylozy (kółka) C. famata BRP (A) i BRP RFE (B) na YNB z dodatkiem ekstraktu drożdżowego (0,2%); natomiast na Fig. 4 pokazano profile czasowe stężenia glukozy (kwadraty), ksylozy (kółka) i sacharozy (trójkąt) C. famata BRP (A) i BRP RFE (B) na bagassie.

Przedmiotem wynalazku jest sposób produkcji ryboflawiny z wykorzystaniem drożdży Candida famata, zwłaszcza szczepu BRP/RFE1 oraz innych, zdolnych do nadprodukcji ryboflawiny (witamina B2) w podłożu z hydrolizatem lignocelulozy. Szczep ten charakteryzuje się nadekspresją genów kodujących czynnik transkrypcji SEF1, genów strukturalnych syntezy ryboflawiny RIB1 i RIB7 oraz transportera ryboflawiny RFE1 zabezpieczającego ekskrecję ryboflawiny na zewnątrz z komórki do podłoża. Te zmiany genetyczne osiągnięte z wykorzystaniem metod inżynierii metabolicznej zostały uzyskane na nadproducencie ryboflawiny, szczepie AF-4, który selekcjonowany był przy pomocy klasycznej selekcji z użyciem antymetabolitów.

Opłacalność biotechnologicznej produkcji jakiegokolwiek produktu zależy od cen surowców. Najbardziej wydajne procesy można realizować w przypadku wykorzystania jako surowców odpadów. Lignoceluloza (sucha biomasa roślinna) jest tanim surowcem będącym odpadem rolnictwa (słoma, kolba kukurydziana) lub przemysłu drzewnego (trociny, gałęzie, liście). Odpady komunalne również składają się z lignocelulozy, a jej udział może sięgać do 50%. Lignoceluloza zawiera trzy główne polimery, ligninę, celulozę oraz hemicelulozę, z których ostatnie dwa to polimery cukrów. Główne cukry wchodzące do składu lignocelulozy to glukoza (40% ogólnej zawartości cukrów) oraz pięciowęglowy cukier ksyloza (30%). Wszystkie znane drożdże bardzo dobrze rosną na glukozie, natomiast zdolność wzrostu na ksylozie u drożdży spotyka się bardzo rzadko. Na przykład, drożdże piekarskie Saccharomyces cerevisiae nie są zdolne do wytwarzania biomasy na ksylozie. Zatem poszukiwanie szczepów drożdży zdolnych do utylizacji ksylozy jest ważnym problemem biotechnologii. Jeszcze istotniejsze jest znalezienie szczepów drożdży, które nie tylko rosną, ale także syntetyzują cenne wysokowartościowe substancje na podłożach z ksylozą, a w najbardziej korzystnym rozwiązaniu także na hydrolizatach lignocelulozy, które oprócz glukozy i ksylozy, zawierają wiele innych cukrów, w szczególności inną pentozę, L-arabinozę, a także inhibitory wzrostu, takie jak furfural, 5-hydroksymetylofurfural oraz kwas octowy.

Celem niniejszego wynalazku było opracowanie sposobu produkcji ryboflawiny (witaminy B2) z hydrolizatów lignocelulozy przy pomocy szczepów flawinogennych drożdży C. famata. Ten cel osiągnięty został poprzez hodowlę wyżej wymienionych drożdży w odpowiednich podłożach zawierających następujące źródła węgla: glukozę, ksylozę, hydrolizaty lignocelulozy (konkretnie słomę trzciny cukrowej, znaną też jako bagassa). Istota rozwiązania polega na tym, że szczepy C. famata najpierw hoduje się przez 8-12 godz. w płynnym podłożu bogatym YPD (ekstrakt drożdżowy 1%, pepton 1%, glukoza 1%), po czym zaszczepia się je w podłoża syntetyczne YNB zawierające yeast nitrogen base (0,17%), siarczan amonu (0,5%), ekstrakt drożdżowy (0,2%) lub bez niego z glukozą (20 g/l) lub z ksylozą (20 g/l) oraz na hydrolizacie bagassy też z ekstraktem drożdżowym, który zawierał następujące główne cukry: glukozę (11 g/l), ksylozę (8 g/l) oraz sacharozę (2 g/l). Hodowla prowadzona jest w kolbach na wytrząsarce z częstotliwością obrotów 200 obrotów/minutę. Wyniki takich eksperymentów pokazują, że drożdże C. famata wykazują umiarkowany wzrost na podłożu syntetycznym YNB bez ekstraktu drożdżowego na glukozie oraz ksylozie i taki wzrost był znacznie bardziej obfity po dodawaniu ekstraktu drożdżowego. Wzrost na hydrolizacie bagassy był dość obfity (Fig. 1). Drożdże C. famata syntetyzują ryboflawinę na wszystkich sprawdzanych podłożach; ekstrakt drożdżowy powiększał produkcję ryboflawiny, której produkcja w podłożu z glukozą była wyższa (950 mg/l) niż w podłożu z ksylozą (210 mg/l). Produkcja ryboflawiny w podłożu z hydrolizatem bagassy była dość wysoka i prawie dorównywała produkcji na glukozie, gdyż wynosiła 900 mg/l 15 (Fig. 1). Kinetyka wzrostu i produkcji ryboflawiny na podłożach z glukozą, ksylozą oraz hydrolizatem bagassy podane są na Fig. 2.

Następnie przeanalizowana została utylizacja głównych cukrów w podłożu z hydrolizatem lignocelulozy (bagassy). W podłożach z indywidualnymi cukrami (glukozą i ksylozą) były one aktywnie metabolizowane przez komórki drożdży, jednak glukoza utylizowana była szybciej niż ksyloza (Fig. 3). W podłożu z hydrolizatem bagassy jeden z dwóch sprawdzonych szczepów BRP na początku utylizował glukozę a ksyloza wykorzystywana była po wyczerpaniu glukozy. Natomiast szczep BRP/RFE utylizował oba cukry praktycznie jednocześnie (Fig. 4). Trzeba zaznaczyć, że wzrost i produkcja ryboflawiny w podłożu z hydrolizatem bagassy były bardzo podobne do tych w podłożu z glukozą i znacznie wyższe niż w podłożach z ksylozą. Wyniki te wskazują na wysoką oporność szczepów C. famata do inhibitorów znajdujących się w hydrolizacie lignocelulozy co ma duże znaczenie biotechnologiczne.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania ryboflawiny, znamienny tym, że szczepy flawinogennych drożdży Candida famata hoduje się w podłożu z hydrolizatem lignocelulozy, który zawiera glukozę, ksylozę i sacharozę, z dodatkiem ekstraktu drożdżowego, stosując wytrząsanie, w temperaturze od 27 do 30°C, do wyczerpania wszystkich cukrów w podłożu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hydrolizatem lignocelulozy jest hydrolizat bagassy.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że hydrolizat lignocelulozy zawiera 11 g/l glukozy, 8 g/l ksylozy i 2 g/l sacharozy.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że dodatek ekstraktu drożdżowego wynosi 0,2% wagowego.
5. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-4, znamienny tym, że wytrząsanie prowadzi się w kolbach na wytrząsarce z częstotliwością 200 obrotów/minutę.
6. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-5, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się przez 4 dni.
7. Sposób według któregokolwiek z zastrz. 1-6, znamienny tym, że hodowlę prowadzi się w temperaturze 28°C.