PL247927B1 - 2-(4-Hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-ylo)metylo] hydrazynokarbotioamid, sposób jego wytwarzania i jego pierwsze zastosowanie medyczne - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest nowa pochodna hydrazynokarbotioamidu, o wzorze ogólnym 1 przedstawionym na rysunku, będąca jednoczesnym inhibitorem ludzkiej topoizomerazy II oraz tyrozynazy do zastosowania w leczeniu czerniaka. Zgłoszenie obejmuje także sposób wytwarzania nowej pochodnej hydrazynokarbotioamidu o wzorze ogólnym 1, charakteryzujący się tym, że hydrazyd kwasu 4-hydroksy-3-nitrobenzoesowego poddaje się reakcji z izotiocyjanianem 1-naftylometylu, prowadząc reakcję w rozpuszczalnikach organicznych, gdzie postęp reakcji kontroluje się przy użyciu technik chromatograficznych, a po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną ochładza się, powstały osad odsącza, suszy, a następnie krystalizuje z rozpuszczalników polarnych. Reakcję w rozpuszczalnikach organicznych prowadzi się we wrzącym etanolu, korzystnie w czasie przez 5 — 30 minut, zaś otrzymany produkt reakcji krystalizuje się z etanolu.

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowa pochodna hydrazynokarbotioamidu o wzorze ogólnym 1, przedstawionym na rysunku, charakteryzująca się jednoczesnym działaniem hamującym aktywność ludzkiej topoizomerazy II i tyrozynazy, wykazująca aktywność cytotoksyczną wobec linii komórek nowotworowych czerniaka, sposób jej wytwarzania oraz jej pierwsze zastosowanie medyczne.

Znane są z literatury naukowej pochodne hydrazynokarbotioamidu inne niż wskazana w wynalazku, wykazujące aktywność przeciwnowotworową (Biomolecules 2022, 12, 151; Molecules 2019, 24, 2065; Molecules 2020, 25, 2980; Anticancer Agents Med Chem 2018, 18, 529-540). W przypadku pojedynczych pochodnych hydrazynokarbotioamidu stwierdzono, że ich działanie przeciwnowotworowe jest efektem hamowania topoizomerazy II (Anticancer Agents Med Chem 2018, 18, 529-540). Istnieją też pojedyncze doniesienia naukowe wskazujące, że niektóre pochodne hydrazynokarbotioamidu, lecz podstawione tylko w pozycji 2 i nieposiadające podstawionego atomu azotu w grupie karbotioamidowej, są zdolne do inhibitowania enzymu tyrozynazy (Bioorg Chem 2008, 16, 1096-1102; Sci Rep 2023, 13, 2578). Dla pochodnych hydrazynokarbotioamidu opisanych w przytoczonych tekstach źródłowych albo nie przeprowadzono oznaczenia aktywności przeciwnowotworowej, albo, jak w przypadku jednej przetestowanej pochodnej opisanej w Sci Rep 2023, 13, 2578, nie stwierdzono istotnego hamowania wzrostu komórek nowotworowych A375 do stężenia 32 μM. Co istotne, dotychczas brak jest w literaturze naukowej jakichkolwiek doniesień, w tym również opisów patentowych, dotyczących istnienia pochodnych hydrazynokarbotioamidu wykazujących zdolność do jednoczesnej inhibicji obu wspomnianych enzymów - ludzkiej topoizomerazy II oraz tyrozynazy. Tym bardziej brak jest doniesień naukowych na temat aktywności cytotoksycznej takich pochodnych wobec komórek czerniaka lub jakichkolwiek innych komórek nowotworowych.

Inhibicja obu wspomnianych enzymów jest korzystna w leczeniu czerniaka, gdyż zahamowanie aktywności topoizomerazy II skutkuje ograniczeniem proliferacji komórek rakowych a inhibicja tyrozynazy, której nadekspresja obserwowana jest w komórkach czerniaka, zwiększa wrażliwość tych komórek na cytostatyki oraz zwiększa aktywność limfocytów wobec komórek rakowych, przez co podnosi skuteczność leczenia (Int J Cancer 2009, 124, 1470-1477).

Liczba stwierdzanych rocznie przypadków raka zwiększyła się globalnie w ostatnich latach do ponad 23 milionów, podczas gdy liczba zgonów związanych z przebiegiem chorób nowotworowych przekroczyła 10 mln (JAMA Oncol 2022, 8, 420-444). Zgodnie z danymi WHO (Globocan 2020) dotyczącymi zachorowalności na czerniaka, w roku 2020 odnotowano ponad 320 tyś. nowych przypadków zachorowań na ten typ nowotworu, a śmiertelność przekraczała 60 tyś. osób. Co więcej, dane statystyczne pokazują, że co dekadę podwaja się liczba nowodiagnozowanych przypadków czerniaka. Dane te pokazują, że ważne jest poszukiwanie i wprowadzanie do praktyki klinicznej nowych leków przeciwnowotworowych wykazujących skuteczność wobec komórek czerniaka.

Zgłaszający prowadzili badania mające na celu uzyskanie pochodnych hydrazynokarbotioamidu wykazujących zdolność jednoczesnego hamowania ludzkiej topoizomerazy II oraz tyrozynazy, będącymi enzymami istotnymi z punktu widzenia skutecznego działania przeciwnowotworowego skierowanego przeciwko komórkom czerniaka. Otrzymane wyniki dowodzą silnej aktywności przeciwczerniakowej pochodnej hydrazynokarbotioamidu, będącej przedmiotem wynalazku. Działanie to jest efektem jednoczesnego zahamowania w komórkach czerniaka aktywności topoizomerazy II oraz tyrozynazy. Co ważne, pochodna hydrazynokarbotioamidu, będąca przedmiotem wynalazku, charakteryzowała się działaniem przeciwnowotworowym wobec komórek czerniaka silniejszym aniżeli stosowany klinicznie lek przeciwnowotworowy - etopozyd. Przedstawione dane pozwalają oczekiwać, że pochodna będąca przedmiotem wynalazku może być atrakcyjnym kandydatem na lek przeciwnowotworowy.

Istotą wynalazku jest 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-ylo)metylo]hydrazynokarbotioamid, o wzorze ogólnym 1 przedstawionym na rysunku.

Pochodna o wzorze ogólnym 1 wykazuje aktywność hamującą wobec ludzkiej topoizomerazy II oraz tyrozynazy, co prowadzi do zahamowania wzrostu komórek nowotworowych czerniaka oraz zwiększa wrażliwość tych komórek na cytostatyki oraz zwiększa aktywność limfocytów wobec komórek czerniaka. Wykazana dualna aktywność pochodnej według wynalazku względem dwóch wspomnianych enzymów wpływa na jej istotną aktywność przeciwnowotworową wobec komórek czerniaka.

Istotą sposobu wytwarzania nowej pochodnej hydrazynokarbotioamidu o wzorze ogólnym 1, według wynalazku, jest to, że hydrazyd kwasu 4-hydroksy-3-nitrobenzoesowego (o wzorze ogólnym 2) poddaje się reakcji z izotiocyjanianem 1-naftylometylu (o wzorze ogólnym 3), przy czym reakcję prowadzi się w rozpuszczalnikach organicznych, eterze dietylowym, metanolu, korzystnie we wrzącym etanolu, przez 5-30 minut. Postęp reakcji kontroluje się technikami chromatograficznymi. Po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną schładza się, a wytrącony osad odsącza się, suszy, a następnie krystalizuje z rozpuszczalników polarnych, korzystnie z etanolu.

Istotą wynalazku jest również 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-ylo)metylo]-hydrazynokarbotioamid do zastosowania w leczeniu czerniaka.

Związek według wynalazku wykazuje silne działanie przeciwnowotworowe skierowane przeciwko komórkom czerniaka, w związku z czym może znaleźć zastosowanie do wytwarzania nowych leków mających zastosowanie w terapii tej choroby nowotworowej.

Przykład 1:

0,01 Mola hydrazydu kwasu 4-hydroksy-3-nitrobenzoesowego rozpuszczono w 25 ml bezwodnego etanolu, po czym do otrzymanego roztworu dodano równomolową ilość izotiocyjanianu 1-naftylometylu. Całość ogrzewano w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika w kolbie okrągłodennej pod chłodnicą zwrotną wodną przez 25 minut, po czym mieszaninę reakcyjną schłodzono a wytrącony osad odsączono, wysuszono i krystalizowano z etanolu.

Otrzymano 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-ylo)metylo]hydrazynokarbotioamid (o wzorze ogólnym 1) z wydajnością 71%.

Strukturę chemiczną związku określono w oparciu o wyniki analizy widm 1H-NMR oraz IR. Postęp reakcji kontrolowano przy użyciu techniki chromatografii cienkowarstwowej.

Parametry fizykochemiczne i spektralne 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-ylo)metylo]-hydrazynokarbotioamidu o wzorze ogólnym 1:

Wydajność reakcji: 71%; temp. topnienia: 161-162°C; 1H-NMR (600 MHz); 3.73 (s, 2H, CH2), 8.95-8.01 (m, 10H, ArH), 9.22 (s, 1H, NH), 9.52 (s, 1H, OH), 10.24 (s, 1H, NH), 10.87 (s, 1H, NH); IR (γ, cm-1): 3331 (NH), 1675 (C=O), 1332 (C=S).

Określenie właściwości przeciwnowotworowych 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-yIo)metylo]hydrazynokarbotioamidu przeprowadzono za pomocą testu MTT. W badaniach wykorzystano następujące linie komórek nowotworowych czerniaka: A375 oraz G361. Do hodowli komórek stosowano dedykowane do danej linii komórkowej podłoża hodowlane.

Na płytki 96-dołkowe zawierające dany typ komórek o gęstości 1x10⁵ komórek/ml dodawano wzrastające stężenia 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-ylo)metylo]hydrazynokarbotioamidu, po czym prowadzono inkubację przez 24 godziny, po której oznaczano aktywność przeciwnowotworową na podstawie stopnia zahamowania aktywności metabolicznej komórek czerniaka w teście MTT. Jako kontroli dodatniej używano etopozydu, który jest klinicznie stosowanym lekiem przeciwnowotworowym.

Przykład 2:

Linie komórek czerniaka (A375 oraz G361), zakupione z kolekcji American Type Culture Collection (ATCC), hodowano w rekomendowanych do tego celu pożywkach wzbogaconych w 10% FBS oraz antybiotyki - penicylinę (100 U/ml) and streptomycynę (100 μg/ml).

Hodowlę prowadzono w inkubatorze pozwalającym na utrzymanie atmosfery zawierającej 5% CO2 i temperatury 37°C. Zawiesinę komórek czerniaka przenoszono na płytkę 96-dołkową (w objętości 100 μl/dołek), stosując gęstość zawiesiny 1 x 105 komórek/ml. Po czasie 24 godzin wymaganych do całkowitego przyklejenia się komórek do dna dołków, na płytki dodawano roztwory zawierające wzrastające stężenia 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-ylo)metylo]hydrazynokarbotioamidu lub etopozydu (stanowiącego kontrolę dodatnią w teście MTT), całość inkubowano przez kolejne 24 godziny, po czym dodawano roztwór odczynnika MTT. Po 3-godzinnej inkubacji, do dołków dodawano roztwór 10% SDS w celu rozpuszczenia powstałych kryształów formazanu. Po całonocnej inkubacji odczytywano absorbancję roztworów w dołkach przy długości fali 570 nm, stosując czytnik mikropłytek (Epoch, BioTek). Wyniki przedstawiono w postaci wartości IC50. Wyniki przedstawiono w Tabeli 1.

PL 247927 BI

Tabela 1

Aktywność przeciwnowotworowa 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-ylo)metylo]hydra-zynokarbotioamidu wobec linii komórek czerniaka G361 oraz A375

	IC50 ± S	D [pg/ml]
	G361	A375
2-(4-hydroksy-3nitrobenzoilo)-N-[(naft-1 - ylo)metylo]- hydrazynokarbotioamtd	5,72 ±0,21	7,02 ± 0,35
Etopozyd	8,25 ±0,39	14,17 ± 0,42

Zdolność hamowania aktywności ludzkiej topoizomerazy II oraz tyrozynazy przez 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-ylo)metylo]hydrazynokarbotioamid określono przy pomocy zestawów do oznaczania aktywności enzymatycznej: Topoisomerase II Drug Screening Kit (producent: TopoGEN) oraz Tyrosinase Inhibitor Screening Kit (producent: Sigma-Aldrich).

Przykład 3:

Mieszaninę zawierającą DNA, enzym topoizomerazę II, odpowiedni bufor oraz 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-ylo)metylo]hydrazynokarbotioamid wstężeniach 10, 25, 50, 100 pg/ml inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C. Po dodaniu 10% SDS, proteinazy K i buforu obciążającego prowadzono elektroforezę w 1% żelu agarozowym. Po zakończeniu rozdziału elektroforetycznego fragmenty DNA wybarwiano bromkiem etydyny i analizowano densytometrycznie przy użyciu systemu dokumentacji żeli Syngene G:BOX. Wyniki przedstawiono w postaci wartości ICso określającej stężenie, przy którym aktywność enzymu jest hamowana do 50% aktywności początkowej. Poziom zahamowania aktywności topoizomerazy II przez 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-ylo)metylo]hydrazynokarbotioamid przedstawiono w Tabeli 2.

Przykład 4:

Oznaczenie zdolności 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-yfo)metylo]hydrazynokarbotioamidu do hamowania aktywności tyrozynazy przeprowadzono zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta zestawu Tyrosinase Inhibitor Screening Kit. Roztwór o objętości 20 pl, zawierający wzrastające od 10 do 100 pg/ml stężenia 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[naft-1-ylo)metylo]hydrazynokarbotioamidu dodano do 50 pi roztworu tyrozynazy (zawierającego 48 pi buforu MAK257A oraz 2 pl tyrozynazy). Mieszaninę inkubowano przez 10 minut w temperaturze pokojowej a następnie dodano do niej 30 pl roztworu zawierającego substrat dla tyrozynazy i całość staranie wymieszano. Następnie aktywność enzymu oceniano spektrofotometrycznie przy długości fali 510 nm, co 5 minut w zakresie 30-60 minut. Wyniki wyrażono w postaci wartości ICso. Poziom zahamowania aktywności tyrozynazy przez 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-ylo)metylo]hydrazynokarbotioamid przedstawiono w Tabeli 2.

Tabela 2

Zdolność hamowania enzymów: topoizomerazy II oraz tyrozynazy przez 2-(4-hydroksy-3-nitrobenzoilo)-N-[(naft-1-ylo)metylo]hydrazynokarbotioamid

Enzym	IC50 ± SD [pg/ml]
topoizomeraza II	77,03 ±4,31
tyrozynaza	68,14 ±2,97

Claims (5)

1. Nowa pochodna hydrazynokarbotioamidu o wzorze ogólnym 1 przedstawionym na rysunku, będąca jednoczesnym inhibitorem ludzkiej topoizomerazy II oraz tyrozynazy.

PL 247927 BI

2. Sposób wytwarzania nowej pochodnej hydrazynokarbotioamidu o wzorze ogólnym 1, przedstawionym na rysunku, znamienny tym, że hydrazyd kwasu 4-hydroksy-3-nitrobenzoesowego poddaje się reakcji z izotiocyjanianem 1-naftylometylu, prowadząc reakcję w rozpuszczalnikach organicznych, gdzie postęp reakcji kontroluje się przy użyciu technik chromatograficznych, a po zakończeniu reakcji mieszaninę reakcyjną ochładza się, powstały osad odsącza, suszy a następnie krystalizuje z rozpuszczalników polarnych.

3. Sposób, według zastrzeżenia 2, znamienny tym, że reakcję w rozpuszczalnikach organicznych prowadzi się we wrzącym etanolu, korzystnie w czasie przez 5-30 minut.

4. Sposób, według zastrzeżenia 2, znamienny tym, że otrzymany produkt reakcji krystalizuje się z etanolu.

5. Nowa pochodna hydrazynokarbotioamidu o wzorze ogólnym 1 przedstawionym na rysunku, będąca jednoczesnym inhibitorem ludzkiej topoizomerazy II oraz tyrozynazy, o wzorze ogólnym 1, do zastosowania w leczeniu czerniaka.