PL247644B1

PL247644B1 - Zastosowanie 8-glukozydu emodyny w leczeniu nowotworów układu nerwowego

Info

Publication number: PL247644B1
Application number: PL445382A
Authority: PL
Inventors: Anna Wawruszak; Wirginia Kukuła-Koch; Estera Okoń; Andrzej Stepulak
Original assignee: Univ Medyczny W Lublinie
Priority date: 2023-06-28
Filing date: 2023-06-28
Publication date: 2025-08-18
Also published as: PL445382A1

Abstract

Celem rozwiązania według wynalazku jest zastosowanie glikozylowanej formy emodyny o działaniu przeciwnowotworowym jako związku z grupy pochodnych antracenu w leczeniu nowotworów układu nerwowego. Istotą rozwiązania według wynalazku jest 8-glukozyd emodyny o wzorze C21H20O10 do zastosowania w leczeniu nowotworów układu nerwowego, a zwłaszcza glejaka, glejaka wielopostaciowego oraz neuroblastomy. Wynalazek daje możliwość wykorzystania przeciwnowotworowej aktywności glukozydu emodyny i stosowania go jako potencjalnego leku lub składnika preparatów farmaceutycznych w przemyśle farmaceutycznym do terapii chorych z nowotworami układu nerwowego.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie 8-glukozydu emodyny w leczeniu nowotworów układu nerwowego zwłaszcza glejaka, glejaka wielopostaciowego oraz neuroblastomy.

Przeprowadzone badania dotyczą bardzo istotnego zagadnienia, jakim jest skuteczna terapia chorób nowotworowych układu nerwowego przy zastosowaniu substancji pochodzenia roślinnego. Zapadalność na nowotwory układu nerwowego wzrosła znacząco w ostatnich latach. W 2019 r. zanotowano ok. 350 tys. przypadków jedynie nowotworów mózgu na świecie. Wskaźniki śmiertelności dla tej choroby opisano na poziomie 72,98% wśród pacjentów średnio i wysokorozwiniętych krajów. Wobec powyższego, jedną z kluczowych potrzeb badawczych jest zwiększenie skuteczności istniejących oraz opracowanie nowych strategii terapeutycznych w chorobach nowotworowych układu nerwowego, a także poszukiwanie skutecznych leków hamujących zmiany w układzie nerwowym.

Substancje pochodzenia roślinnego stanowią źródło licznych i różniących się rusztowaniem chemicznym struktur o wielu aktywnościach biologicznych. Poszukiwania nowych kandydatów na leki przeciwnowotworowe obejmują także skrining metabolitów wtórnych pochodzenia roślinnego z grup polifenoli, alkaloidów, saponin i innych.

Aktywnością tego typu odznaczają się związki o charakterze polarnym lub umiarkowanie polarnym, do których możemy zaliczyć także pochodne antracenu. To substancje szeroko rozpowszechnione w świecie roślinnym. Ich obecność potwierdzono w licznych gatunkach roślin z rodzin rdestowatych, marzanowatych, szakłakowatych, bobowatych, liliowatych czy trędownikowatych.

Wśród pochodnych antracenu - glukozydów antrachinonu - powstających w szlaku biosyntezy zależnym od malonylo- i acetylokoenzymu A wyróżnić można 8-glukozyd emodyny (glikozylowaną pochodną emodyny). Istniejące dane literaturowe dotyczące wpływu pochodnych antracenu na funkcje układu nerwowego potwierdzają ich zdolność do przenikania bariery krew-mózg po podaniu obwodowym. Wang et al. (2007) wykazali, że glukozyd emodyny może wykazywać działanie neuroprotekcyjne na ogniskowe uszkodzenia mózgu wywołane niedokrwieniem i reperfuzją oraz na uszkodzenie neuronów in vivo. Jednakże obecnie większość badań skupia się na aktywności samej emodyny (Mitra et al. 2022, Leung et al. 2020, Dong et al. 2016), a wciąż brakuje doniesień na temat działania jej glikozylowanej formy, w tym badań w kontekście antyproliferacyjnych właściwości tego związku względem komórek nowotworowych układu nerwowego.

Celem rozwiązania według wynalazku jest zastosowanie glikozylowanej formy emodyny z grupy pochodnych antracenu jako związku o działaniu przeciwnowotworowym. Okazało się, że ta substancja może być stosowana jako lek lub istotny składnik preparatów farmaceutycznych w przemyśle farmaceutycznym w terapii chorych z nowotworami układu nerwowego.

Istotą rozwiązania według wynalazku jest 8-glukozyd emodyny o wzorze, jak przedstawiono poniżej, do zastosowania w leczeniu nowotworów układu nerwowego. W korzystnym wykonaniu 8-glukozyd emodyny jest stosowany w leczeniu nowotworów układu nerwowego: glejaka, glejaka wielopostaciowego oraz neuroblastomy.

Zaletą rozwiązania według wynalazku jest możliwość wykorzystania przeciwnowotworowej aktywności 8-glukozydu emodyny i stosowania go jako potencjalnego leku lub składnika preparatów farmaceutycznych w przemyśle farmaceutycznym w terapii chorych z nowotworami układu nerwowego.

W związku z powyższym autorzy osiągnięcia przeprowadzili po raz pierwszy badania przeciwnowotworowej aktywności 8-glukozydu emodyny w zarówno mysich, jak i ludzkich modelach in vitro no wotworów układu nerwowego, tj. w liniach komórkowych SK-N-AS neuroblastomy, T98G glejaka wielopostaciowego ludzkiego, także linii C6 glejaka mysiego. Żywotność komórek nowotworowych układu nerwowego traktowanych 8-glukozydem emodyny została oceniona w testach CellTiter-Glo® oraz MTT ((4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), natomiast proliferacja komórek nowotworowych w teście ELISA BrdU (bromodeoxyuridine).

Materiał biologiczny

Materiał do badań stanowiły linie komórkowe SK-N-AS (ATCC® CRL-2137™) neuroblastomy, T98G (ATCC® CRL-1690™) glejaka wielopostaciowego ludzkiego, także linii C6 (ATCC® CCL-107™) glejaka mysiego uzyskane z kolekcji szczepów ATTC (American Type Culture Collection; Manassas, VA, USA)). Komórki nowotworowe utrzymywano w pożywce hodowlanej DMEM/HAM F12 (Sigma-Aldrich; Saint Louis, MO, USA), wzbogaconej o płodową surowicę bydlęcą (10% FBS, Sigma-Aldrich) oraz antybiotyki: penicylinę -100 IU/ml i streptomycynę -100 μg/ml (Sigma-Aldrich).

a) Ocena żywotności komórek nowotworowych w teście MTT

Stopień żywotności komórek nowotworowych układu nerwowego pod wpływem 8-glukozydu emodyny oceniono eksperymentalnie w teście MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy). W tym celu komórki nowotworowe linii SK-N-AS, T98G oraz C6 w ilości 2 χ 10⁴/ml wysiano na 96-dołkowe płytki, a następnie traktowano 8-glukozydem emodyny w zakresie stężeń 5-200 μM przez 96 godzin. Kolejno badane komórki inkubowano przez 3 godziny z roztworem MTT (5 mg/ml, Sigma-Aldrich). W tym czasie MTT metabolizowany był przez żywe komórki do purpurowych kryształów formazanu, które później rozpuszczano w buforze SDS (10% SDS w 0,01 N HCl). Gęstość optyczną powstałego produktu mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek Infinite M200 Pro (Tecan, Mannedorf, Szwajcaria).

Wyniki

8-Glukozyd emodyny w dawkach 5-200 μM hamował w sposób dawkozależny żywotność wszystkich analizowanych komórek nowotworowych układu nerwowego w teście MTT. Największą aktywność wykazywał w stosunku do komórek linii C6 glejaka mysiego, gdzie IC50 (stężenie hamujące wzrost komórek w 50%) wynosiło 52,67 μM. IC50 dla komórek linii T98G glejaka ludzkiego oraz SK-N-AS neuroblastomy wynosiły odpowiednio 61,24 μM oraz 108,7 μM.

Na rysunku na Fig. 1 wskazano wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μM) na żywotność komórek linii C6 glejaka mysiego po 96 godzinach inkubacji w teście MTT. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Zaś na Fig. 2 wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μM) na żywotność komórek linii T98G glejaka wielopostaciowego ludzkiego po 96 godzinach inkubacji w teście MTT. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Natomiast na Fig. 3 przedstawiono wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μM) na żywotność komórek linii SK-N-AS neuroblastomy po 96 godzinach inkubacji w teście MTT. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

b) Ocena żywotności komórek nowotworowych w teście CellTiter-Glo^®

Stopień żywotności komórek nowotworowych układu nerwowego pod wpływem 8-glukozydu emodyny potwierdzono eksperymentalnie w teście CellTiter-Glo®. CellTiter-Glo® to luminescencyjny test żywotności komórek ocenianych w oparciu o ilościowe oznaczenie ATP (adenozynotrifosforan) będącego wskaźnikiem aktywnych metabolicznie komórek. Komórki nowotworowe linii SK-N-AS, T98G oraz C6 w ilości 2 χ 10⁴/ml wysiano na 96-dołkowe płytki, a następnie traktowano 8-glukozydem emodyny w zakresie stężeń 1-150 μM przez 48 godzin. Po tym czasie dodano po 100 μ! na dołek reagenta CTG, wytrząsano przez 2 minuty oraz inkubowano przez 15 minut. Luminescencję zmierzono przy l/minutę za pomocą czytnika mikropłytek Infinite M200 Pro (Tecan).

Wyniki

8-Glukozyd emodyny w dawkach 1-150 μM hamował w sposób dawkozależny żywotność wszystkich analizowanych komórek nowotworowych układu nerwowego w teście CellTiter-Glo® hamując produkcję ATP w komórkach. Największą aktywność (najmniejsze wartości IC50) wykazywał w stosunku do komórek linii SK-N-AS neuroblastomy, kolejno C6 glejaka mysiego oraz T98G glejaka wielopostaciowego ludzkiego.

Na rysunku na Fig. 4 przedstawiono wpływ 8-glukozydu emodyny (1-150 μΜ) na żywotność komórek linii SK-N-AS neuroblastomy po 96 godzinach inkubacji w teście CellTiter-Glo®. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001, zaś na Fig. 5 wpływ 8-glukozydu emodyny (1-75 μM) na żywotność komórek linii T98G glejaka wielopostaciowego ludzkiego po 96 godzinach inkubacji w teście CellTiter-Glo®. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Fig. 6 przedstawia wpływ 8-glukozydu emodyny (1-75 μM) na żywotność komórek linii C6 glejaka mysiego po 96 godzinach inkubacji w teście CellTiter-Glo^®. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

c) Ocena zahamowania proliferacji komórek nowotworowych w teście ELISA BrdU

Stopień zahamowania proliferacji komórek nowotworowych układu nerwowego pod wpływem 8glukozydu emodyny potwierdzono eksperymentalnie w teście ELISA BrdU. Test BrdU oparty jest na pomiarze inkorporacji znakowanego nukleozydu bromodeoksyurydyny (BrdU) do nowopowstającej nici DNA dzielących się komórek. Poziom wbudowanej BrdU oceniono kolorymetrycznie dokonując pomiaru barwnego produktu powstałego na skutek reakcji enzymatycznej z substratu - tetrametylobenzydyny (TMB). Zawiesinę komórek linii SK-N-AS, T98G oraz C6 o gęstości 2 χ 104 wylano na płytkę 96-dołkową (100 μl/dołek), a następnie inkubowano 24 godziny w temperaturze 37°C. Po wskazanym czasie podłoże hodowlane usunięto, a komórki traktowano 8-glukozydem emodyny w zakresie stężeń 5-200 μM, po czym przeprowadzono komercyjny test Cell Proliferation ELISA BrdU Kit (Roche, Bazylea, Szwajcaria) zgodnie z instrukcją producenta. Pomiaru absorbancji dokonano przy użyciu Infinite M200 Pro microplate reader przy długości fali 450 nm (Tecan).

Wyniki

8-Glukozyd emodyny w dawkach 5-200 μΜ hamował w sposób dawkozależny proliferację wszystkich analizowanych komórek nowotworowych układu nerwowego w teście Cell Proliferation ELISA BrdU Kit (Roche). W przypadku linii komórkowej C6 oraz T98G istotność statystyczną uzyskano przy stężeniach 50, 100, 200 μM. Z kolei w przypadku linii SK-KN-AS jedynie w przypadku stężeń 100 i 200 μM.

Na rysunku na Fig. 7 przedstawiono wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μΜ) na proliferację komórek linii C6 glejaka mysiego po 96 godzinach inkubacji w teście BrdU. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 zaś na Fig. 8 wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μΜ) na proliferację komórek linii T98G glejaka wielopostaciowego ludzkiego po 96 godzinach inkubacji w teście BrdU. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Na Fig. 9 pokazano wpływ 8-glukozydu emodyny (5-200 μΜ) na proliferację komórek linii SK-N-AS neuroblastomy po 96 godzinach inkubacji w teście BrdU. Dane przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe (± SD); one-way ANOVA, Tukey post-hoc testing; * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.

Wnioski

8-Gluzkozyd emodyny hamuje żywotność komórek nowotworowych linii SK-N-AS (ATCC^® CRL-2137™) neuroblastomy, T98G (ATcC® CRL-1690™) glejaka wielopostaciowego ludzkiego oraz C6 (ATCC® CCL-107™) glejaka mysiego w testach CellTiter-Glo® oraz ΜΤΤ, a także proliferację komórek nowotworowych w teście ELISA BrDU w zakresie stężeń 1-200 μM. Potwierdzenie antyproliferacyjnych właściwości 8-glukozydu emodyny daje możliwość w przyszłości wykorzystania badanego związku w przemyśle farmaceutycznym jako potencjalnego leku lub składnika preparatów farmaceutycznych w terapii pacjentów z nowotworami układu nerwowego.

Otrzymane wyniki pozwalają na potwierdzenie przeciwnowotworowego działania 8-glukozydu emodyny i kwalifikację tego związku do dalszych badań farmakologicznych.

Literatura

Dong X., Fu J., Yin X., Cao S., Li X., Lin L., Ni J. Emodin: A Review of its Pharmacology, Toxicity and Pharmacokinetics. Phytother Res. 2016 Aug; 30(8): 1207-1218.

PL 247644 Β1

Leung S., Lai J., Wu J., Tsai YR., Chen YH., Kang SJ., Chiang YH., Chang CF., Chen KY. Neuroprotective Effects of Emodin against Ischemia/Reperfusion Injury through Activating ERK-1/2 Signaling Pathway. Int J Mol Soi. 2020 Apr 21; 21(8): 2899.

Mitra S., Anjum J., Muni M., Das R., Rauf A., Islam F., Emran T., Semwal P., Hemeg H., Alhumaydhi F., Wilairatana P. Exploring thejourney of emodin as a potential neuroprotective agent: Novel therapeutic insights with molecular mechanism of action. Biomed Pharmacother. 2022 May; 149: 112877.

Wang C., Zhang D., Ma H., Liu J. Neuroprotective effects of emodin-8-O-beta-D-glucoside in vivo and in vitro. Eur J Pharmacol. 2007 Dec 22; 577(1-3): 58-63.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. 8-Glukozyd emodyny do zastosowania w leczeniu nowotworów układu nerwowego.
2. 8-Glukozyd emodyny do zastosowania według zastrz. 1, znamienny tym, że jest stosowany w leczeniu nowotworów układu nerwowego: glejaka, glejaka wielopostaciowego oraz neuroblastomy.