PL247624B1 - Nowe pochodne iwermektyny, sposób ich otrzymywania oraz zastosowanie do leczenia onkologicznego - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne iwermektyny, sposób ich otrzymywania oraz zastosowanie do leczenia onkologicznego. Pojedynczo oraz podwójnie modyfikowane pochodne iwermektyny otrzymane są przez wprowadzenie grupy amidowej w pozycję C13 związku wyjściowego i/lub przekształcenie układu pseudo-benzofuranowego. Pochodne iwermektyny modyfikowane w pozycjach 13 i/lub 4 o wzorze ogólnym 1, w którym R₁ oznacza wzór 2.1, R₂ oznacza wzór 2.2, A-B-C oznacza wzór 3.1 lub wzór 3.2, X oznacza atom wodoru lub podstawnik cukrowy o wzorze 4, lub podstawnik acylowy o wzorze 5, gdzie R oznacza: grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 10 atomów węgla; grupę alkilową zawierającą od 1 do 10 atomów węgla posiadającą w dowolnej pozycji wiązanie nienasycone; grupę alkilową zawierającą od 1 do 10 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha jednym lub więcej atomami halogenu korzystnie fluor, chlor, brom, jod, które mogą się znajdować zarówno przy tym samym jak i przy różnych atomach węgla; grupę alkilową zawierającą od 1 do 10 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha grupą wybraną spośród grup: alkoksylowej, aminowej, cyjanowej, hydroksylowej, karbonylowej, aldehydowej, karboksylowej, estrowej, sulfidowej, tiolowej; grupę alkilową podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha grupą karbocykliczną lub heterocykliczną, przy czym pierścień może być ewentualnie podstawiony, jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: alkilowej, alkiloaminowej, alkoksylowej, aminowej, cyjanowej, dialkiloaminowej, halogenowej korzystnie fluor, chlor, brom, jod, hydroksylowej, karbonylowej, aldehydowej, karboksylowej, estrowej, sulfidowej, sulfonowej, tiolowej, trifluorometylowej, trifluorometoksylowej; grupę karbocykliczną lub heterocykliczną, przy czym pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: alkilowej, alkiloaminowej, alkoksylowej, aminowej, cyjanowej, dialkiloaminowej, halogenowej korzystnie fluor, chlor, brom, jod, hydroksylowej, karbonylowej, aldehydowej, karboksylowej, estrowej, sulfidowej, sulfonowej, tiolowej, trifluorometylowej, trifluorometoksylowej. Sposób otrzymywania C13-amidów iwermektyny o wzorze ogólnym 2, w którym X i R mają ww. znaczenie polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 6, będącym aminowym prekursorem iwermektyny blokowanym w pozycji C5 a chlorkiem kwasowym o wzorze ogólnym 7 w którym R ma wyżej podane znaczenie w ilości 1,2 ekwiwalenta w stosunku do ilości aminowego prekursora iwermektyny o wzorze 6, w obecności trzeciorzędowej aminy alifatycznej lub pirydyny oraz następczym odblokowaniu pozycji C5 przy użyciu kwasu p-toluenosulfonowego. Modyfikowane pochodne iwermektyny do zastosowania do leczenia onkologicznego korzystnie raka prostaty, raka piersi, raka płuc oraz raka jelita grubego.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne iwermektyny, sposób ich otrzymywania oraz zastosowanie do leczenia onkologicznego. Pojedynczo oraz podwójnie modyfikowane pochodne iwermektyny otrzymane są przez wprowadzenie grupy amidowej w pozycję C13 związku wyjściowego i/lub przekształcenie układu pseudo-benzofuranowego.

Występowanie chorób nowotworowych jest poważnym problemem cywilizacyjnym, który obejmuje wszystkie grupy społeczne oraz wiekowe. Nowotwory stanowią jedną z głównych przyczyn zgonów we współczesnym świecie. Według danych Światowej Organizacji Zdrowia (ang. World Health Organization, WHO) w 2018 roku odnotowano blisko 10 milionów zgonów spowodowanych chorobami nowotworowymi oraz ponad 18 milionów nowych przypadków zachorowań. Prognozy opublikowane przez WHO jasno pokazują, że wartości te będą dynamicznie wzrastać w kolejnych latach, osiągając w 2040 roku poziom około 30 milionów nowych zachorowań; liczba ta zatem niemalże się podwoi [World Health Organization: International Agency for Research on Cancer]. Nowotwory są równie poważnym „obciążeniem” ekonomicznym; w 2010 roku przeznaczono ponad bilion dolarów na działania związane zarówno z leczeniem, jak i z prewencją nowotworów [World Health Organization: Report on cancer]. Przytoczone fakty jednoznacznie potwierdzają, że walka z tą grupą ponad 100 różnorodnych i niezwykle trudnych do zwalczenia chorób jest jednym z najważniejszych, najtrudniejszych, a także najbardziej kosztownych wyzwań dla współczesnej nauki oraz medycyny.

Wśród znanych metod poszukiwania nowych środków przeciwnowotworowych, jedną z najbardziej efektywnych i racjonalnych pozostaje chemiczna modyfikacja różnorodnych związków pochodzenia naturalnego posiadających udowodnioną aktywność biologiczną.

Iwermektyna to 16-członowy lakton będący 22,23-dihydro pochodną awermektyny. Oba związki zostały wyizolowane po raz pierwszy w 1967 roku ze szczepu Streptomyces avermitilis [A. Crump, J. Antibiot. (Tokyo), 2017, 70, 495]. Iwermektyna wykazuje szerokie spektrum aktywności przeciwpasożytniczej i jest stosowana w leczeniu najróżniejszych chorób, takich jak: ślepota rzeczna (onchocerkoza), słoniowacizna, węgorczyca, świerzb czy wszawica [W.C. Campbell, Curr. Pharm. Biotechnol., 2012, 13, 853]. Dopuszczenie iwermektyny do stosowania u ludzi w 1987 roku znacznie poprawiło jakość życia w krajach Afryki Subsaharyjskiej, Indiach i innych, umożliwiając leczenie chorób, które wcześniej niosły pewną śmierć. Z biologicznego punktu widzenia iwermektyna działa poprzez paraliżowanie mięśni ściany ciała oraz gardzieli u nicieni i stawonogów. Mechanizm tego zjawiska jest związany ze stymulacją uwalniania kwasu - aminomasłowego (GABA), co powoduje zaburzenie przewodnictwa nerwowego u pasożytów. Nawet jednorazowa dawka iwermektyny zwiększa przepuszczalność kanałów chlorkowych otwieranych za pośrednictwem glutaminianu, co prowadzi do hiperpolaryzacji, a w konsekwencji do śmierci pasożyta. Warto zaznaczyć, że iwermektyna nie przedostaje się przez barierę krewmózg, w związku z czym efekt ten nie pojawia się u ssaków (w tym u ludzi), u których receptory GABA zlokalizowane są głównie w ośrodkowym układzie nerwowym. Większość skutków ubocznych związanych ze stosowaniem iwermektyny, tj. świąd czy biegunka, wynika z reakcji organizmu na śmierć pasożytów, nie zaś z toksycznego działania samego leku. Dolegliwości te są na ogół łagodne i ustępują po leczeniu objawowym [J. K. Podlewski, A. Chwalibogowska-Podlewska, Leki współczesnej terapii. T. 1. Warszawa: Medical Tribune, 2010, s. 410].

Poza działaniem przeciwpasożytniczym, w literaturze naukowej pojawił się ostatnio szereg publikacji opisujących wysoką aktywność przeciwnowotworową iwermektyny wobec różnego rodzaju nowotworów, w tym: raka jelita grubego, raka piersi, glejaka, raka głowy oraz szyi, białaczki, czerniaka, raka trzustki czy też raka prostaty [M. Juarez., et al., Am. J. Cancer Res., 2018, 8, 317]. Mechanizm biologicznego działania tego leku wobec komórek nowotworowych jest niezwykle różnorodny i dotyczy wielu procesów biochemicznych zachodzących w tych że komórkach. Iwermektyna wykazuje zdolność do zahamowania syntezy białek odpowiedzialnych za oporność wielolekową (ang. multi-drug resistance, MDR) oraz szlaku AKT/mTOR, który jest głównym regulatorem rozwoju raka jajnika, ale także do zablokowania szlaku Wnt/TCF odpowiedzialnego za proces proliferacji (rozmnażania się) komórek nowotworowych. Działanie iwermektyny związane jest również z degradacją PAK-1, głównej kinazy odpowiedzialnej za proces nowotworzenia, jak i ze zwiększeniem poziomu reaktywnych form tlenu (ang. reactive oxygen species, ROS) wewnątrz komórek guza, prowadząc do pojawienia się stresu oksydacyjnego i uszkodzenia DNA komórek nowotworowych. Należy podkreślić, że po zastosowaniu iwermektyny odnotowano znaczące zmniejszenie liczby macierzystych komórek nowotworowych (ang. cancer stem

PL 247624 BI cells, CSCs), czyli niewielkiej subpopulacji komórek nowotworowych (5-10% masy guza), których obecność związana jest z progresem, przerzutowaniem oraz nawrotami choroby nowotworowej [M. Juarez., et al., Am. J. Cancer Res., 2018, 8, 317],

Jak dotychczas, żadna z otrzymanych do tej pory pochodnych iwermektyny nie została przebadana pod kątem potencjalnej aktywności przeciwnowotworowej. Dane literaturowe pokazują wysoki potencjał tego leku, jednak konieczne jest sprawdzenie, jak modyfikacja chemiczna struktury iwermektyny wpłynie na jej właściwości biologiczne. Dlatego ważne jest opracowywanie nowych metod syntezy i projektowanie nowych analogów, które - oprócz wysokiej aktywności przeciwnowotworowej - będą wykazywać niską toksyczność, co umożliwi otrzymanie efektywnych i selektywnych produktów o potencjalnym zastosowaniu klinicznym.

Istotą wynalazku są nowe pochodne iwermektyny modyfikowane w pozycjach 13 i/lub 4 o wzorze ogólnym 1

w którym

Ri oznacza _o χ^ |_Ub χ-θΛ,

R2 oznacza /^H lub ^^0H

A-B-C oznacza:

.. H He CFC I^{2 4}I ^lub

X oznacza:

o atom wodoru, o lub podstawnik cukrowy następującym wzorze:

o lub podstawnik acylowy o wzorze

PL 247624 BI gdzie R oznacza:

o grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 10 atomów węgla, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha atomem halogenu korzystnie fluor, chlor, brom, jod, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną grupą karbocykliczną lub heterocykliczną, obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej, o grupę karbocykliczną lub heterocykliczną obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej.

Pochodne iwermektyny charakteryzują się tym, że w pozycji C13 zamiast reszty cukrowej przyłączone są podstawniki A/-acylowe o przeciwnej konfiguracji na atomie węgla C13 o wzorze ogólnym 2

w którym:

• X oznacza:

O a R oznacza:

o grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 10 atomów węgla, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha atomem halogenu korzystnie fluor, chlor, brom, jod, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną grupą karbocykliczną lub heterocykliczną, obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej, o grupę karbocykliczną lub heterocykliczną obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej.

Pochodne iwermektyny charakteryzuje się tym, że w pozycji C13 zamiast reszty cukrowej przyłączone są podstawniki A/-acylowe o przeciwnej konfiguracji na atomie węgla C13, a w pierścieniu pseudo-benzofuranowym, nastąpiło przegrupowanie w wyniku którego wiązanie podwójne uległo migracji z pozycji C3=C4 na C2=C3 oraz w pozycji C4 w stereoselektywnie przyłączona została grupa hydroksylowa jak o wzorze ogólnym 3

PL 247624 BI |l OH

Y 4^ wzór3

OH w którym:

X oznacza:

a R oznacza:

o grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 10 atomów węgla, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha atomem halogenu korzystnie fluor, chlor, brom, jod, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną grupą karbocykliczną lub heterocykliczną, obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej, o grupę karbocykliczną lub heterocykliczną obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej.

Korzystnym jest, gdy pochodne iwermektyny ulegają reakcji przegrupowania pierścienia pseudobenzofuranowego w wyniku którego wiązanie podwójne ulega migracji z pozycji C3=C4 na C2=C3 oraz w pozycji C4 stereoselektywnie przyłączona zostaje grupa hydroksylowa o wzorze ogólnym 4

LOH ' wzór 4 w którym:

X oznacza:

PL 247624 BI o atom wodoru, o podstawnik cukrowy o następującym wzorze 5:

Sposób otrzymywania C13-amidów iwermektyny o wzorze ogólnym 2, w którym X i R mają ww. znaczenie polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 6, będącym aminowym prekursorem iwermektyny blokowanym w pozycji C5:

a chlorkiem kwasowym o wzorze ogólnym 7, w którym R ma wyżej podane znaczenie:

O

R^CI wzór 7 w ilości 1,2 ekwiwalenta w stosunku do ilości aminowego prekursora iwermektyny o wzorze 6, w obecności trzeciorzędowej aminy alifatycznej lub pirydyny oraz następczym odblokowaniu pozycji C5 przy użyciu kwasu p-toluenosulfonowego.

Korzystnym jest także, gdy jako zasadę organiczną stosuje się pirydynę i trzeciorzędowe aminy alifatyczne, najkorzystniej trietyloaminę.

Korzystnym jest, gdy jako czynnik odblokowujący stosuje się kwas p-toluenosulfonowy.

Ponadto korzystnym jest, gdy reakcje odblokowania prowadzi się w alkoholu, najkorzystniej w metanolu.

Sposób otrzymywania C13-amidów iwermektyny o wzorze ogólnym 2, w którym X i R mają ww. znaczenie podane polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 6, będącym aminowym prekursorem iwermektyny blokowanym w pozycji C5, a kwasem karboksylowym o wzorze ogólnym 8, w którym R ma wyżej podane znaczenie:

O

A

R' ΌΗ wzór 8 w ilości 1 ekwiwalenta w stosunku do ilości aminowego prekursora iwermektyny o wzorze 6, w obecności czynnika sprzęgającego oraz zasady organicznej oraz następczym odblokowaniu pozycji C5 przy użyciu kwasu p-toluenosulfonowego.

Korzystnym jest także, gdy reakcje prowadzi się w rozpuszczalniku polarnym korzystnie acetonitrylu lub prostym trzeciorzędowym amidzie, korzystnie dimetyloformamidzie.

PL 247624 BI

Korzystnym jest, gdy jako czynnik sprzęgający stosuje się heksafluorofosforan 2-(7-aza-1/-/-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylomocznika (HATU), lub karbodiimid A/,A/’-dicykloheksylokarbodiimid (DCC) lub 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)-karbodiimid (EDCI).

Korzystnym jest również, gdy jako zasadę organiczną stosuje się pirydynę lub jej pochodne, najkorzystniej 4-pirolidynopirydynę (PPy).

Korzystnym jest także, gdy używa się heksafluorofosforanu 2-(7-aza-1/-/-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylomocznika (HATU), korzystne jest użycie trzeciorzędowej aminy alifatycznej, najkorzystniej A/,A/-diizopropyloetyloaminy.

Korzystnym jest również, gdy jako czynnik odblokowujący stosuje się kwas p-toluenosulfonowy.

Ponadto korzystnym jest, gdy reakcje odblokowania prowadzi się w alkoholu, najkorzystniej w metanolu.

Sposób otrzymywania C13-amidów C4-hydroksyiwermektyny o wzorze ogólnym 3, w którym X i R mają ww. znaczenie polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 6, będącym aminowym prekursorem iwermektyny blokowanym w pozycji C5, a chlorkiem kwasowym o wzorze ogólnym 7, w którym R ma ww. znaczenie w ilości 1,2 ekwiwalenta w stosunku do ilości aminowego prekursora iwermektyny o wzorze 6, w obecności trzeciorzędowej aminy alifatycznej lub pirydyny oraz następczym odblokowaniu pozycji C5 przy użyciu fluorku tetra-n-butyloamoniowego.

Korzystnym jest również, gdy jako czynnik odblokowujący stosuje się fluorek tetra-n-butyloamoniowy oraz gdy reakcje prowadzi się w tetrahydrofuranie.

Sposób otrzymywania C13-amidów C4-hydroksyiwermektyny o wzorze ogólnym 3, w którym X i R mają ww. znaczenie polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 6, będącym aminowym prekursorem iwermektyny blokowanym w pozycji C5, a kwasem karboksylowym o wzorze ogólnym 8, w którym R ma wyżej podane znaczenie w ilości 1 ekwiwalenta w stosunku do ilości aminowego prekursora iwermektyny o wzorze 6, w obecności czynnika sprzęgającego oraz zasady organicznej oraz następczym odblokowaniu pozycji C5 przy użyciu fluorku tetra-n-butyloamoniowego.

Korzystnym jest, gdy reakcję amidowania prowadzi się tak jak opisano powyżej.

Korzystnym jest również, gdy jako czynnik odblokowujący stosuje się fluorek tetra-n-butyloamoniowy, a reakcje prowadzi się w tetrahydrofuranie.

Sposób otrzymywania C4-hydroksypochodnych iwermektyny o wzorze ogólnym 4 w którym X i R mają ww. znaczenie polega na reakcji iwermektyny o wzorze 9, przy czym X oznacza podstawnik cukrowy lub jej aglikonu o wzór 9 lub X oznacza atom wodoru, z fluorkiem tetra-n-butyloamoniowym.

gdzie:

• X oznacza:

o atom wodoru, o podstawnik cukrowy o wzorze 5.

Korzystnym jest, gdy reakcje przegrupowania szkieletu iwermektyny prowadzi się w tetrahydrofuranie.

Nowe pochodne iwermektyny do zastosowania do leczenia onkologicznego korzystnie raka prostaty, raka piersi, raka płuc oraz raka jelita grubego.

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne iwermektyny, sposób ich otrzymywania oraz zastosowanie do leczenia onkologicznego. Pojedynczo oraz podwójnie modyfikowane pochodne iwermektyny otrzymane są przez wprowadzenie grupy amidowej w pozycję C13 związku wyjściowego i/lub przekształcenie układu pseudo-benzofuranowego.

Zgodnie z powyższym, pierwszym z aspektów tego wynalazku są nowe związki o wzorze (1):

PL 247624 BI

w którym

Ri oznacza:

H _o X ^N _V lub X'⁰^.

R2 oznacza:

_o lub ^^0H

A-B-C oznacza:

H r x lub _o I² *l ^{|2 4|}

X oznacza: o atom wodoru, o lub podstawnik cukrowy o następującym wzorze:

o lub podstawnik acylowy o wzorze

a R oznacza:

o grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 10 atomów węgla, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha atomem halogenu korzystnie fluor, chlor, brom, jod, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną grupą karbocykliczną lub heterocykliczną, obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej, o grupę karbocykliczną lub heterocykliczną obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub

PL 247624 BI większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej.

Drugim aspektem wynalazku są związki o wzorze (2):

w którym:

• X oznacza:

a R oznacza:

o grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 10 atomów węgla, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha atomem halogenu korzystnie fluor, chlor, brom, jod, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną grupą karbocykliczną lub heterocykliczną, obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej, o grupę karbocykliczną lub heterocykliczną obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej.

Trzecim aspektem wynalazku są związki o wzorze 3:

w którym:

• X oznacza:

PL 247624 Β1

a R oznacza:

o grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 10 atomów węgla, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha atomem halogenu korzystnie fluor, chlor, brom, jod, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną grupą karbocykliczną lub heterocykliczną, obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej, o grupę karbocykliczną lub heterocykliczną obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej.

Czwartym aspektem wynalazku są związki o wzorze 4:

w którym:

• X oznacza:

o atom wodoru, o podstawnik cukrowy o następującym wzorze 5

Piątym aspektem wynalazku jest procedura otrzymywania nowych, pojedynczo modyfikowanych C13-amidów iwermektyny o wzorze ogólnym (2) (w którym X oraz R mają wyżej podane znaczenie) w reakcji pomiędzy C13-epi-aminową pochodną iwermektyny, blokowaną grupą sililową w pozycji C5 o wzorze (6):

PL 247624 BI

z chlorkiem kwasowym o wzorze ogólnym (7) (w którym R ma wyżej podane znaczenie):

wzór 7 w obecności trzeciorzędowej aminy alifatycznej lub pirydyny.

Reakcję prowadzi się w chlorku metylenu i w warunkach bezwodnych. Jako trzeciorzędową aminę alifatyczną najkorzystniej trietyloaminę. Korzystne jest również zastosowanie pirydyny jako zasady organicznej. Związki te neutralizują chlorowodór powstający w wyniku rozpadu chlorku kwasowego. Zapobiega to zachodzeniu niepożądanych reakcji i zapobiega rozpadowi związku wyjściowego. Do mieszaniny związku (6) i trzeciorzędowej aminy alifatycznej lub pirydyny rozpuszczonych w rozpuszczalniku organicznym dodaje się odpowiedni chlorek kwasowy (7). Reakcję prowadzi się w temperaturze nie wyższej niż 25°C. Stopień przereagowania kontroluje się za pomocą chromatografii TLC i spektrometrii ESI-MS. Po konwersji substratu, rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszcza w rozpuszczalniku chloroalifatycznym, korzystnie w chlorku metylenu lub chloroformie i ekstrahuje z roztworem H2SO4(aq) (pH = 1), a następnie wodą. Jeżeli reakcja prowadzona była w rozpuszczalniku chloroalifatycznym, pomija się etap odparowywania rozpuszczalnika i od razu przechodzi do ekstrakcji. Następnie warstwę organiczną odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszcza się przy użyciu chromatografii kolumnowej, korzystnie przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz mieszaninę rozpuszczalników organicznych, korzystnie chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%. Następnie, konieczne jest odblokowanie pozycji C5 otrzymanych amidów. W tym celu produkt rozpuszcza się w alkoholu, najkorzystniej w metanolu i dodaje kwasu p-toluenosulfonowego. Stopień przereagowania kontroluje się za pomocą chromatografii TLC i spektrometrii ESI-MS. Po konwersji substratu, rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszcza w rozpuszczalniku chloroalifatycznym, korzystnie w chlorku metylenu lub chloroformie i ekstrahuje z roztworem Na2COs (0,1 M), a następnie wodą. Następnie warstwę organiczną odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszcza się przy użyciu chromatografii kolumnowej, korzystnie przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz mieszaninę rozpuszczalników organicznych, korzystnie chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%.

W szóstym aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania pojedynczo modyfikowanych C13-amidów iwermektyny o wzorze ogólnym (2), w którym X oraz R mają wyżej podane znaczenie, w reakcji pomiędzy C13-epi-aminową pochodną iwermektyny, blokowaną grupą sililową

PL 247624 Β1 w pozycji C5 o wzorze (6) a odpowiednim kwasem karboksylowym o wzorze ogólnym (8) (w którym R ma wyżej podane znaczenie):

R^OH wzór 8 w obecności czynnika sprzęgającego oraz zasady organicznej.

Czynnik sprzęgający pełni funkcję aktywatora grupy karboksylowej. W wyniku reakcji kwasu karboksylowego z czynnikiem sprzęgającym, zostaje wytworzony aktywny ester, który reaguje z grupą aminową związku (6) prowadząc do wytworzenia C13-amidu blokowanego w pozycji C5.

Reakcję prowadzi się w rozpuszczalniku organicznym najkorzystniej w chloroformie lub chlorku metylenu. Korzystne jest prowadzenie reakcji w warunkach bezwodnych. Jako czynnik sprzęgający stosuje się heksafluorofosforan 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylomocznika (HATU) (ang. 1-[Bis(di-methylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium 3-oxid hexafluorophosphate), 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)-karbodiimid (EDCI) lub A/,A/’-dicykloheksylokarbodiimid (DCC).

Jako zasadę organiczną stosuje się pirydynę lub jej pochodne, najkorzystniej 4-pirolidynopirydynę (PPy). Gdy używa się HATU, korzystne jest użycie trzeciorzędowej aminy alifatycznej. Najkorzystniej A/,A/-diizopropyloetyloaminę.

Reakcję prowadzi się w temperaturze nie wyższej ni 25°C. Stopień przereagowania kontroluje się za pomocą chromatografii TLC i spektrometrii ESI-MS. Po konwersji substratu, rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszcza w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w chlorku metylenu lub chloroformie i ekstrahuje z roztworem H2SO4(aq) (pH = 1), a następnie wodą. Jeżeli reakcja prowadzona była w rozpuszczalniku chloroalifatycznym, pomija się etap odparowywania rozpuszczalnika i od razu przechodzi do ekstrakcji. Następnie warstwę organiczną odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszcza się przy użyciu chromatografii kolumnowej, korzystnie przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz mieszaninę rozpuszczalników organicznych, korzystnie chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%. Następnie, konieczne jest odblokowanie pozycji C5 otrzymanych amidów. W tym celu produkt rozpuszcza się w alkoholu, najkorzystniej w metanolu i dodaje kwasu p-toluenosulfonowego. Stopień przereagowania kontroluje się za pomocą chromatografii TLC i spektrometrii ESI-MS. Po konwersji substratu, rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, pozostałość rozpuszcza w rozpuszczalniku chloroalifatycznym, korzystnie w chlorku metylenu lub chloroformie i ekstrahuje z roztworem Na2COs (0,1 M), a następnie wodą. Następnie warstwę organiczną odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszcza się przy użyciu chromatografii kolumnowej, korzystnie przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz mieszaninę rozpuszczalników organicznych, korzystnie chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%.

W siódmym aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób modyfikacji pierścienia pseudobenzofuranowego iwermektyny oraz jej pochodnych, przez jednoczesną migrację wiązania podwójnego wraz z przyłączeniem grupy hydroksylowej w pozycji C4, które prowadzi do otrzymania produktu o zdefiniowanej stereochemii (wzór 3). W efekcie otrzymano pojedynczo lub podwójnie modyfikowane pochodne iwermektyny o wzorze ogólnym (3) lub (4) (w których X oraz R mają wyżej podane znaczenie). W reakcji bierze udział iwermektyna (wzór 9, przy czym X oznacza podstawnik cukrowy), jej aglikon (wzór 9, przy czym X oznacza atom wodoru) lub jej pochodne opisane wzorem ogólnym (2) (w którym X oraz R mają wyżej podane znaczenie). Dodatkowo, grupa hydroksylowa w pozycji C5 tych związków może, lecz nie musi być blokowana grupą sililową. Drugim reagentem jest fluorek tetra-n-butyloamoniowy (TBAF).

PL 247624 BI

gdzie:

• X oznacza:

o atom wodoru, o podstawnik cukrowy o wzorze 5

Reakcję prowadzi się w tetrahydrofuranie. Korzystne jest prowadzenie reakcji w warunkach bezwodnych. Do roztworu iwermektyny (9, gdzie X oznacza podstawnik cukrowy), jej aglikonu (9, gdzie X oznacza atom wodoru), jej pochodnej opisanej wzorem ogólnym (2), lub tej samej pochodnej blokowanej grupą sililową w pozycji C5 dodaje się TBAF. Reakcję korzystnie prowadzić w otwartym naczyniu, w temperaturze nie wyższej niż 25°C. Stopień przereagowania kontroluje się za pomocą chromatografii TLC i spektrometrii ESI-MS. Po konwersji substratu, rozpuszczalnik odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszcza się przy użyciu chromatografii kolumnowej, korzystnie przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz mieszaninę rozpuszczalników organicznych, korzystnie chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie steżeń octanu etylu od Odo 100%.

W ósmym aspekcie przedmiotem wynalazku jest zastosowanie nowych pochodnych iwermektyny opisanych powyżej do wytwarzania preparatów możliwych do zastosowania w leczeniu chorób nowotworowych, w szczególności raka prostaty, raka piersi, raka płuc oraz raka jelita grubego.

W dokumencie przedstawiono przykłady ilustrujące wynalazek oraz opisano różne metody ich otrzymywania. Nie należy traktować tych przykładów jako ograniczających zakres zastrzeganego wynalazku. Związki te można wytwarzać dowolną odpowiednią techniką syntezy organicznej.

Materiały wyjściowe oraz rozpuszczalniki uzyskano ze źródeł komercyjnych (TriMen Chemicals, Merck) lub wytworzono dobrze znanymi metodami literaturowymi.

Widma ¹H i ¹³C NMR zostały wykonane w deuterowanym chloroformie (CDCh) na spektrometrze Varian 400. Analizy ESI-MS wykonano przy użyciu spektrometru mas Waters/Micromass ZQ (Waters Alliance) wyposażonym w pompę infuzyjną, natomiast analizy HRMS przy użyciu spektrometru mas AMD 402.

W przykładach opisano szczegółowo nowe pochodne iwermektyny według wynalazku poprzez sposób ich wytwarzania. Ustalenia stereochemii dokonano dla związków 10 i 21 przy użyciu metod rentgenostrukturalnych.

Przykład 1

Otrzymywanie C13-amidu acetylowego iwermektyny (wzór 10)

PL 247624 Β1

C13-epi-aminoiwermektynę blokowaną grupą sililową w pozycji C5 (wzór 6) (250 mg, 0,36 mmol) rozpuszczono w 5 ml chlorku metylenu i dodano trietyloaminę (108 mg, 1,07 mmol). Do mieszaniny dodano następnie chlorek acetylu (34 mg, 0,43 mmol). Pozostawiono na mieszadle magnetycznym na 24 h w temperaturze pokojowej. Po tym czasie całość ekstrahowano z roztworem H2SO4(aq) (pH = 1), a następnie z wodą. Następnie warstwę organiczną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz układ rozpuszczalników chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%. Produkt rozpuszczono w 10 ml metanolu i dodano kwasu p-toluenosulfonowego (80 mg, 0,46 mmol). Po 2 godzinach rozpuszczalnik organiczny odparowano, rozcieńczono chlorkiem metylenu i ekstrahowano z wodnym roztworem Na2COs (0,1 M), a następnie wodą. Następnie warstwę organiczną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz układ rozpuszczalników chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%.

Otrzymano C13-amid acetylowy iwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 53%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 54% (wydajność całkowita: 29%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 650.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 173.49, 169.79, 141.10, 137.82, 136.55, 135.63, 125.86, 119.64, 117.83, 117.37, 97.35, 80.21, 78.94, 77.06, 68.43, 68.24, 67.61, 67.01, 58.05, 45.53, 41.14, 38.08, 36.57, 35.68, 35.40, 34.36, 31.15, 27.88, 27.34, 23.27, 19.87, 18.96, 17.37, 15.57, 12.51, 11.77.

Ή NMR (400 MHz, CDCh) 5.83 - 5.72 (m, 2H), 5.68 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 5.42 - 5.32 (m, 2H), 5.22 (ddd, J = 16.2, 11.4, 4.8 Hz, 1H), 4.91 (dd, J = 10.5, 4.7 Hz, 2H), 4.61 (q, J = 14.3 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.22 (dd, J = 6.1, 0.8 Hz, 1H), 3.89 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 3.57 - 3.47 (m, 1H), 3.20 (dd, J = 4.6, 2.2 Hz, 1H), 3.11 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 2.71 (tt, J = 10.5, 6.7 Hz, 1H), 2.28-2.13 (m, 2H), 2.07-0.67 (m, 35H).

Przykład 2

Otrzymywanie C13-amidu propionowego iwermektyny (wzór 11).

Postępowano jak w przykładzie 1, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek propionylu (40 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid propionowy iwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 62%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 52% (wydajność całkowita: 32%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 665.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 173.50, 173.38, 141.06, 137.85, 136.77, 135.71, 125.84, 119.67, 117.84, 117.27, 97.38, 80.24, 78.97, 76.90, 68.46, 68.24, 67.61, 67.04, 57.64, 45.56, 41.15, 38.16, 36.57,35.68,35.39,34.35,31.15, 29.90,27.91,27.31, 19.86, 18.94, 17.35, 15.56, 12.44, 11.86, 10.14.

¹H NMR (401 MHz, CDCh) 5.88 - 5.77 (m, 2H), 5.61 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 5.47 - 5.36 (m, 2H), 5.27 (ddd, J = 16.4, 11.7, 4.9 Hz, 1H), 4.93 (dd, J = 10.0, 5.4 Hz, 1H), 4.66 (q, J = 14.4 Hz, 2H), 4.47 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.27 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.94 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 3.56 (td, J = 9.9, 5.2 Hz, 1H), 3.25 (dd, J = 4.4, 2.1 Hz, 1H), 3.16 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 2.81 - 2.71 (m, 1H), 2.37 - 2.15 (m, 5H), 2.03 - 0.72 (m, 34H).

Przykład 3

Otrzymywanie C13-amidu dekanoilowego iwermektyny (wzór 12).

PL 247624 BI

Postępowano jak w przykładzie 1, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek dekanoilu (82 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid dekanoilowy iwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 59%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 51% (wydajność całkowita: 30%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 763.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 173.51, 172.77, 141.08, 137.86, 136.85, 135.67, 125.85, 119.64, 117.82, 117.22, 97.37, 80.23, 78.94, 68.44, 68.24, 67.60, 67.04, 57.65, 45.55, 41.15, 38.10, 37.06, 36.56, 35.68, 35.40, 34.35, 31.78, 31.16, 29.42, 29.34, 29.31,29.19, 27.90, 27.34, 26.05, 22.59, 19.87, 18.97, 17.34, 15.57, 14.04, 12.50, 11.82.

¹H NMR (400 MHz, CDCh) 5.83 - 5.66 (m, 2H), 5.49 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 5.41 - 5.29 (m, 1H), 5.29 - 5.17 (m, 1H), 4.88 (dd, J = 9.4, 6.0 Hz, 1H), 4.61 (dd, J = 26.5, 14.4 Hz, 1H), 4.43 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.24 - 4.20 (m, 1H), 3.92 - 3.88 (m, 1H), 3.55- 3.46 (m, 1H), 3.20 (dd, J = 4.5, 2.2 Hz, 1H), 3.11 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 2.71 (tt, J = 10.5, 6.7 Hz, 1H), 2.29-2.10 (m, 4H), 1.98-0.65 (m, 51H).

Przykład 4

Otrzymywanie C13-amidu izobutyrylowego iwermektyny (wzór 13).

Postępowano jak w przykładzie 1, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek izobutyrylu (46 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid izobutyrylowy iwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 71%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 57% (wydajność całkowita: 40%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 678.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 176.40, 173.49, 141.10, 137.85, 136.91, 135.60, 125.88, 119.62, 117.82, 117.13, 97.39, 80.25, 78.94, 76.73, 68.45, 68.22, 67.59, 67.03, 57.31, 45.54, 41.13, 38.18, 36.55, 35.97, 35.66, 35.35, 34.33, 31.15, 27.93, 27.27, 19.86, 19.81, 19.73, 18.90, 17.35, 15.56, 12.39, 11.94.

Ή NMR (400 MHz, CDCh) 5.84 - 5.70 (m, 2H), 5.51 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 5.42 - 5.30 (m, 2H), 5.30 - 5.09 (m, 2H), 4.93 - 4.83 (m, 1H), 4.61 (q, J = 14.4 Hz, 2H), 4.42 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 4.22 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 3.93 - 3.87 (m, 1H), 3.76 - 3.63 (m, J = 15.8, 13.4, 9.5, 6.7 Hz, 1H), 3.55 - 3.46 (m, 1H), 3.21 (dd, J = 4.5, 2.2 Hz, 1H), 3.12 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 2.72 (tt, J = 10.5, 6.7 Hz, 1H), 2.44 (dt, J = 13.8, 6.9 Hz, 1H), 2.27-2.11 (m, 2H), 1.91 (dd, J = 11.7, 4.5 Hz, 1H), 1.83-0.62 (m, 35H).

Przykład 5

Otrzymywanie C13-amidu benzoilowego iwermektyny (wzór 14).

PL 247624 Β1

Postępowano jak w przykładzie 1, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek benzoilu (60 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid benzoilowy iwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 68%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 41% (wydajność całkowita: 28%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 712.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 173.59, 167.10, 141.34, 137.94, 136.80, 135.39, 134.52, 131.68, 128.71, 126.77, 126.13, 119.62, 117.84, 117.52,97.41,80.30,78.93,68.51,68.29,67.63,67.04,58.27, 45.58, 41.17, 38.48, 36.64, 35.68, 35.39, 34.37, 31.16, 29.65, 27.91,27.32, 19.91, 19.10, 17.35, 15.67, 12.40, 11.85.

¹H NMR (400 MHz, CDCh) 7.79 - 7.66 (m, 2H), 7.52 - 7.33 (m, 3H), 6.11 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 5.89 - 5.69 (m, 2H), 5.44 (dd, J = 17.3, 6.8 Hz, 1H), 5.37 - 5.30 (m, 1H), 5.30 - 5.11 (m, 2H), 5.01 4.94 (m, 1H), 4.63 (dt, J = 18.4, 14.2 Hz, 3H), 4.22 (d, J = 5.1 Hz, 1H), 3.88 (dd, J = 13.8, 5.6 Hz, 1H), 3.77 - 3.64 (m, 1H), 3.50 (dt, J = 13.4, 7.0 Hz, 1H), 3.22 (dd, J = 4.6, 2.2 Hz, 1H), 3.08 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 2.82 (ddd, J = 10.5, 7.0, 3.7 Hz, 1H), 2.22 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 2.04 - 0.61 (m, 30H).

Przykład 6

Otrzymywanie C13-amidu chloroacetylowego iwermektyny (wzór 15).

Postępowano jak w przykładzie 1, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek chloroacetylu (48 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid chloroacetylowy iwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 61%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 70% (wydajność całkowita: 43%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 684 (³⁵CI), 686 (³⁷CI).

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 173.45, 165.34, 141.51, 137.92, 136.05, 134.75, 126.30, 119.53, 117.88, 117.84, 97.45, 80.33, 78.98, 76.86, 68.53, 68.25, 67.61, 66.97, 58.19, 45.56, 42.88, 41.20, 38.39, 36.56, 35.65, 35.40, 34.31, 31.16, 27.98, 27.32, 19.87, 18.90, 17.37, 15.54, 12.42, 11.93.

¹H NMR (401 MHz, CDCh) 6.72 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 5.90 - 5.70 (m, 3H), 5.47 - 5.30 (m, 4H), 4.99 - 4.92 (m, 1H), 4.68 (q, J = 14.4 Hz, 3H), 4.47 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 4.30 - 4.26 (m, 2H), 4.15 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 4.12 - 4.02 (m, 2H), 3.95 (dd, J = 5.9, 3.7 Hz, 2H), 3.75 - 3.70 (m, 1H), 3.61 - 3.52 (m, 1H), 3.46 (s, 1H), 3.27 (dd, J = 4.6, 2.2 Hz, 2H), 3.14 (dd, J = 23.1,8.2 Hz, 2H), 2.80 (ddd, J = 10.6, 7.0, 3.8 Hz, 1H), 2.32 - 2.20 (m, 3H), 2.16 - 0.73 (m, 20H).

Przykład 7

Otrzymywanie C13-amidu metoksyacetylowego iwermektyny (wzór 16).

PL 247624 BI

Postępowano jak w przykładzie 1, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek metoksyacetylu (47 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid metoksyacetylowy iwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 53%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 65% (wydajność całkowita: 34%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 680.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 173.48, 169.09, 141.03, 137.84, 136.44, 135.44, 125.87, 119.63, 117.82, 117.50, 97.37, 80.28, 78.94, 76.79, 71.80, 68.49, 68.21, 67.57, 66.98, 59.13, 56.97, 45.54, 41.14,38.35, 36.50,35.62,35.33,34.30,31.12,27.91,27.27, 19.85, 18.92, 17.34, 15.55, 12.33, 11.88.

Ή NMR (400 MHz, CDCh) 6.63 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 5.83 - 5.74 (m, 2H), 5.39 - 5.30 (m, 2H), 5.24 (td, J = 11.3, 5.6 Hz, 1H), 4.91 -4.85 (m, 1H), 4.61 (q, J = 13.8 Hz, 2H), 4.44 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 4.22 (d, J = 6.1 Hz, 1H), 3.96 - 3.85 (m, 3H), 3.52 (dd, J = 12.3, 6.7 Hz, 1H), 3.49 - 3.42 (m, 3H), 3.21 (dt, J = 9.2, 4.6 Hz, 1H), 3.12 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 2.72 (ddd, J = 17.3, 8.7, 5.2 Hz, 2H), 1.96 - 0.65 (m, 33H).

Przykład 8

Otrzymywanie C13-amidu 1-adamantylokarbonylowego iwermektyny (wzór 17).

Postępowano jak w przykładzie 1, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek 1-adamantylokarbonylu (85 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid 1-adamantylokarbonylowy iwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 64%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 60% (wydajność całkowita: 38%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 770.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 177.17, 173.60, 141.12, 138.00, 137.14, 135.67, 125.93, 119.69, 117.88, 117.10, 97.47, 80.36, 78.97, 76.45, 68.57, 68.29, 67.63, 67.13, 56.93, 45.62, 41.19, 41.09, 39.58, 38.37, 36.60, 36.46, 35.68, 35.35, 34.34, 31.19, 28.14, 28.00, 27.26, 19.91, 18.96, 17.36, 15.56, 12.31, 12.15.

¹H NMR (401 MHz, CDCh) 5.83 - 5.73 (m, 2H), 5.61 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 5.37 - 5.21 (m, 3H), 4.83 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.62 (q, J = 13.2 Hz, 2H), 4.41 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 4.23 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 3.90 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 3.48 (dd, J = 17.2, 9.3 Hz, 1H), 3.22 (dd, J = 4.6, 2.2 Hz, 1H), 3.13 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 2.72 (ddd, J = 10.6, 7.0, 3.8 Hz, 1H), 2.20 (t, J = 8.7 Hz, 2H), 2.05 - 1.97 (m, 4H), 1.95 - 0.68 (m, 43H).

Przykład 9

Otrzymywanie C13-amidu 2-furonowego iwermektyny (wzór 18).

PL 247624 BI

Postępowano jak w przykładzie 1, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek 2-furoylu (56 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid 2-furonowy iwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 67%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 62% (wydajność całkowita: 42%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 702.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 173.48, 157.86, 147.69, 143.83, 141.18, 137.84, 136.49, 135.41, 126.00, 119.64, 117.81, 117.69, 114.47, 112.26, 97.36, 80.28, 78.96, 76.89, 68.49, 68.21,67.58, 66.99, 57.37, 45.55, 41.14, 38.45, 36.55, 35.62, 35.34, 34.29, 31.10, 27.88, 27.28, 19.82, 18.95, 17.30, 15.55, 12.33, 11.81.

Ή NMR (401 MHz, CDCh) 7.46 (dd, J = 1.8, 0.8 Hz, 1H), 7.08 (dd, J = 3.5, 0.8 Hz, 1H), 6.48 (dd, J = 3.5, 1.8 Hz, 1H), 6.39 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 5.85 - 5.72 (m, 2H), 5.50 - 5.40 (m, 1H), 5.35 (s, 1H), 5.25 (ddd, J = 16.2, 11.4, 4.9 Hz, 1H), 4.98 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.69-4.55 (m, J = 15.9, 10.8, 4.9 Hz, 3H), 4.25 - 4.20 (m, 1H), 3.90 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 3.51 (dd, J = 17.0, 8.0 Hz, 1H), 3.21 (dt, J = 7.0, 2.3 Hz, 1H), 3.08 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 2.79 (ddd, J = 10.5, 6.9, 3.8 Hz, 1H), 2.20 (t, J = 8.5 Hz, 2H), 1.98 0.61 (m, 32H).

Przykład 10

Otrzymywanie C13-amidu 3-hydroksy-4-metoksybenzoilowego iwermektyny (wzór 19).

C13-epi-aminoiwermektynę blokowaną grupą sililową w pozycji C5 (wzór 6) (250 mg, 0,36 mmol) rozpuszczono w 10 ml A/,A/-dimetyloformamidu, dodano A/,A/-diizopropyloetyloaminę (276 mg, 2,14 mmol) i heksafluorofosforan 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylomocznika (HATU, 0,46 mmol, 176 mg). Pozostawiono na mieszadle magnetycznym na 15 minut w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny dodano następnie kwas 3-hydroksy-4-metoksybenzoesowy (60 mg, 0,36 mmol). Pozostawiono na mieszadle magnetycznym na 24 h w temperaturze pokojowej. Po tym czasie całość ekstrahowano z roztworem H2SO4(aq) (pH = 1), a następnie z wodą. Następnie warstwę organiczną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz układ rozpuszczalników chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu

PL 247624 BI od 0 do 100%. Produkt rozpuszczono w 10 ml metanolu i dodano kwasu p-toluenosulfonowego (80 mg, 0,46 mmol). Po 2 godzinach rozpuszczalnik organiczny odparowano, rozcieńczono chlorkiem metylenu i ekstrahowano z wodnym roztworem Na2COs (0,1 M), a następnie wodą. Następnie warstwę organiczną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz układ rozpuszczalników chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%.

Otrzymano C13-amid 3-hydroksy-4-metoksybenzoilowy iwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 57%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 35% (wydajność całkowita: 20%).

ESI-MS (m/z): [M+Naf 758.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 173.57, 166.59, 149.37, 145.60, 141.24, 137.88, 136.87, 135.55, 126.06, 119.67, 117.89, 117.48, 116.28, 113.02, 112.01, 110.23, 109.98, 97.40, 80.30, 78.91, 68.51, 68.31,67.66, 67.06, 58.24, 56.06, 45.57, 41.19, 38.51, 36.64, 35.71, 35.42, 34.38, 31.17, 27.91,27.34, 19.90, 19.10, 17.37, 15.67, 12.42, 11.81.

Ή NMR (400 MHz, CDCh) 7.79 - 7.62 (m, 2H), 7.57 - 7.42 (m, 1H), 7.32 (tt, J = 5.5, 2.7 Hz, 1H), 7.04 - 6.93 (m, 1H), 6.90 - 6.83 (m, 1H), 6.04 (dd, J = 15.9, 9.7 Hz, 1H), 5.87 - 5.69 (m, 3H), 5.49 5.39 (m, 1H), 5.35 (d, J = 1.3 Hz, 1H), 5.30 - 5.24 (m, 1H), 4.99 - 4.92 (m, 1H), 4.70 - 4.59 (m, 2H), 4.23 (s, 1H), 4.11 (dd, J = 22.1, 12.0 Hz, 1H), 3.97 - 3.77 (m, 5H), 3.50 (dd, J = 17.1, 9.6 Hz, 1H), 3.21 (dt, J = 5.2, 2.6 Hz, 1H), 3.08 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 2.84-2.76 (m, 1H), 2.32 (s, 1H), 2.28-2.17 (m, 2H), 1.97-0.60 (m, 27H).

Przykład 11

Otrzymywanie C13-amidu 3,4-dimetoksybenzoilowego iwermektyny (wzór 20).

Postępowano jak w przykładzie 10, przy czym zamiast kwasu 3-hydroksy-4-metoksybenzoesowego do mieszaniny reakcyjnej dodano kwas 3,4-dimetoksybenzoesowy (65 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid 3,4-dimetoksybenzoilowy iwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 66%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 48% (wydajność całkowita: 32%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 772.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 173.53, 166.61, 151.91, 149.20, 141.26, 137.91, 136.90, 135.48, 127.14, 126.05, 119.60, 118.63, 117.81, 117.43, 110.95, 110.19, 97.37, 80.29, 78.97, 76.93, 68.49, 68.23, 67.59, 67.03, 58.25, 56.02, 55.99, 45.57, 41.16, 38.48, 36.60, 35.66, 35.35, 34.32, 31.12, 27.87, 27.28, 19.85, 19.09, 17.32, 15.64, 12.38, 11.81.

¹H NMR (401 MHz, CDCh) 7.46 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.32 (dd, J = 8.3, 2.1 Hz, 1H), 6.89 (dd, J = 8.4, 2.5 Hz, 1H), 6.13 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 5.93 - 5.82 (m, 2H), 5.49 (dd, J = 13.7, 9.1 Hz, 1H), 5.41 5.38 (m, 1H), 5.34-5.24 (m, 2H), 5.01 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 4.74 - 4.61 (m, 3H), 4.27 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.96 - 3.88 (m, 10H), 3.54 (dd, J = 16.9, 8.3 Hz, 1H), 3.27 (dd, J = 4.6, 2.2 Hz, 1H), 3.12 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 2.86 (ddd, J = 10.5, 6.9, 3.8 Hz, 1H), 2.31 -2.23 (m, 2H), 2.03-0.70 (m, 28H).

Przykład 12

Otrzymywanie C13-amidu acetylowego C4-hydroksyiwermektyny (wzór 21).

PL 247624 BI

C13-epi-aminoiwermektynę blokowaną grupą sililową w pozycji C5 (wzór 6) (250 mg, 0,36 mmol) rozpuszczono w 5 ml chlorku metylenu i dodano trietyloaminę (108 mg, 1,07 mmol). Do mieszaniny dodano następnie chlorek acetylu (34 mg, 0,43 mmol). Pozostawiono na mieszadle magnetycznym na 24 h w temperaturze pokojowej. Po tym czasie całość ekstrahowano z roztworem H2SO4(aq) (pH = 1), a następnie z wodą. Następnie warstwę organiczną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz układ rozpuszczalników chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%. Produkt rozpuszczono następnie w bezwodnym THF, po czym dodano 3-krotny nadmiar fluorku tetra-n-butyloamoniowego (TBAF) w stosunku do produktu reakcji amidowania. Pozostawiono na mieszadle magnetycznym na 3 dni w temperaturze pokojowej. Po tym czasie rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz układ rozpuszczalników chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%.

Otrzymano C13-amid acetylowy C4-hydroksyiwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 50%, oraz wydajnością reakcji odblokowania i przegrupowania 31% (wydajność całkowita: 16%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 666.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 169.90, 168.60, 139.83, 139.10, 136.29, 129.42, 126.57, 122.70, 117.39, 97.37, 82.62, 78.05, 77.20, 73.50, 71.67, 69.21,67.97, 66.90, 58.09, 40.40, 38.04, 36.48, 35.76, 35.43, 34.66, 31.22, 29.66, 27.91,27.40, 23.39, 22.82, 18.88, 17.40, 15.48, 12.55, 11.76.

Ή NMR (400 MHz, CDCh) 6.19 (s, 1H), 6.11 (dd, J = 8.7, 2.3 Hz, 1H), 5.80 (dd, J = 14.5, 11.2 Hz, 1H), 5.65 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 5.46 (dd, J = 14.5, 10.6 Hz, 1H), 5.31 - 5.22 (m, 2H), 4.96 - 4.89 (m, 1H), 4.77 (s, 1H), 4.60-4.48 (m, 2H), 4.45 (s, 1H), 4.10 (dd, J = 7.7, 2.5 Hz, 2H), 3.61 (dd, J = 14.6, 5.3 Hz, 1H), 3.18 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 2.80-2.69 (m, 1H), 2.35-2.19 (m, 2H), 2.14-0.69 (m, 34H).

Przykład 13

Otrzymywanie C13-amidu propionowego C4-hydroksyiwermektyny (wzór 22).

Postępowano jak w przykładzie 12, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek propionylu (40 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid propionowy C4-hydroksyiwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 49%, oraz wydajnością reakcji odblokowania i przegrupowania 41% (wydajność całkowita: 20%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 680.

PL 247624 BI ¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 173.72, 168.59, 139.85, 139.26, 136.39, 136.27, 129.30, 126.54, 122.61, 117.32, 97.34, 82.68, 78.04, 73.37, 71.62, 69.12, 67.91, 66.91, 57.77, 40.38, 38.12, 36.47, 35.75, 35.40, 34.63, 31.20, 29.92, 29.61,27.92, 27.33, 22.75, 18.83, 17.35, 15.44, 12.44, 11.85, 10.18.

Ή NMR (401 MHz, CDCh) 6.19 - 6.17 (m, 1H), 6.13 - 6.07 (m, 1H), 5.79 (dd,J = 14.5, 11.2 Hz, 1H), 5.68 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 5.45 (dd, J = 14.5, 10.6 Hz, 1H), 5.25 (dd, J = 10.5, 5.6 Hz, 1H), 4.89 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.77 (s, 1H), 4.57 - 4.41 (m, 3H), 4.09 (s, 2H), 3.59 (t, J = 7.3 Hz, 1H), 3.20 - 3.06 (m, J = 9.7 Hz, 2H), 2.73 (ddd, J = 10.5, 6.9, 3.7 Hz, 1H), 2.33 (qd, J = 7.5, 1.4 Hz, 2H), 2.28 - 0.60 (m, 36H).

Przykład 14

Otrzymywanie C13-amidu dekanoilowego C4-hydroksyiwermektyny (wzór 23).

Postępowano jak w przykładzie 12, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek propionylu (82 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid dekanoilowy C4-hydroksyiwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 59%, oraz wydajnością reakcji odblokowania i przegrupowania 41% (wydajność całkowita: 24%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 779.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 173.24, 168.98, 140.28, 139.36, 136.89, 136.63, 129.78, 126.90, 122.97, 117.61, 97.70, 82.92, 78.41, 77.48, 73.93, 71.98, 69.52, 68.29, 67.26, 58.05, 40.75, 38.41, 37.47, 36.84, 36.12, 35.78, 35.00, 32.14, 31.56, 29.79, 29.72, 29.67, 29.55, 28.26, 27.74, 26.42, 23.20, 22.95, 19.21, 17.69, 15.80, 14.38, 12.85, 12.12.

¹H NMR (401 MHz, CDCh) 6.19 (s, 1H), 6.12 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 5.81 (dd, J = 14.6, 11.2 Hz, 1H), 5.54 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.44 (dd, J = 14.6, 10.5 Hz, 1H), 5.33 - 5.22 (m, 1H), 4.90 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.53 (dt, J = 14.1, 11.8 Hz, 3H), 4.47 (d, J = 4.5 Hz, 1H), 4.15-4.04 (m, 5H), 3.653.55 (m, 1H), 3.17 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 2.74 (ddd, J = 10.5, 6.8, 3.7 Hz, 1H), 2.38 - 2.09 (m, 6H), 2.06 0.64 (m, 43H).

Przykład 15

Otrzymywanie C13-amidu izobutyrylowego C4-hydroksyiwermektyny (wzór 24).

Postępowano jak w przykładzie 12, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek izobutyrylu (46 mg, 0,43 mmol).

PL 247624 BI

Otrzymano C13-amid izobutyrylowy C4-hydroksyiwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 60%, oraz wydajnością reakcji odblokowania i przegrupowania 45% (wydajność całkowita: 27%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 694.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 176.82, 168.62, 139.90, 139.20, 136.50, 136.21, 129.28, 126.56, 122.57, 117.20, 97.35, 82.61, 78.03, 76.79, 73.37, 71.62, 69.09, 67.92, 66.89, 57.43, 40.34, 38.15, 36.45, 35.98, 35.72, 35.35, 34.62, 31.19, 27.93, 27.29, 22.78, 19.87, 19.70, 18.80, 17.35, 15.43, 12.41, 11.93.

Ή NMR (400 MHz, CDCh) 6.14 - 6.07 (m, 1H), 6.03 (dt, J = 11.0, 2.3 Hz, 1H), 5.72 (dd, J = 14.5, 11.2 Hz, 1H), 5.56 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 5.37 (dd, J = 14.6, 10.6 Hz, 1H), 5.20 (ddd, J = 16.3, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 4.81 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 4.68 (s, 1H), 4.51 - 4.38 (m, 2H), 4.37 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 4.08 - 3.97 (m, 2H), 3.57 - 3.47 (m, 1H), 3.10 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 2.66 (tt, J = 10.5, 6.7 Hz, 1H), 2.43 (tt, J = 13.7, 6.8 Hz, 1H), 2.24-2.10 (m, 2H), 2.05-0.57 (m, 38H).

Przykład 16

Otrzymywanie C13-amidu benzoilowego C4-hydroksyiwermektyny (wzór 25).

wzór 25

Postępowano jak w przykładzie 12, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek benzoilu (60 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid benzoilowy C4-hydroksyiwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 61%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 26% (wydajność całkowita: 16%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 728.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 168.69, 167.32, 140.15, 138.99, 136.52, 136.03, 134.45, 131.73, 129.45, 128.73, 126.87, 126.81, 122.58, 117.48, 97.37, 82.58, 78.10, 77.19, 73.59, 71.67, 69.21,68.01, 66.89, 58.33, 40.39, 38.46, 36.56, 35.75, 35.39, 34.68, 31.20, 29.67, 27.90, 27.34, 22.86, 19.01, 17.37, 15.57, 12.41, 11.82.

¹H NMR (400 MHz, CDCh) 7.83 - 7.72 (m, 2H), 7.53 - 7.35 (m, 3H), 6.16 - 6.07 (m, 2H), 5.79 (dt, J = 10.3, 8.2 Hz, 1H), 5.52 - 5.43 (m, 1H), 5.29 - 5.18 (m, 2H), 4.92 (dd, J = 10.0, 5.2 Hz, 1H), 4.70 (s, 1H), 4.67 - 4.59 (m, 1H), 4.49 (qd, J = 14.3, 2.3 Hz, 2H), 4.09 - 4.05 (m, 2H), 4.05 - 3.99 (m, 2H), 3.57 - 3.47 (m, 1H), 3.08 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 2.79 (ddd, J = 10.6, 6.9, 3.6 Hz, 1H), 2.26 - 2.13 (m, 2H), 2.07-0.38 (m, 30H).

Przykład 17

Otrzymywanie C13-amidu chloroacetylowego C4-hydroksyiwermektyny (wzór 26).

wzór 26

PL 247624 BI

Postępowano jak w przykładzie 12, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek chloroacetylu (48 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid chloroacetylowy C4-hydroksyiwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 61%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 50% (wydajność całkowita: 31%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 700 (³⁵CI), 702 (³⁷CI).

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 168.66, 165.51, 140.41, 138.73, 135.83, 135.42, 129.59, 126.98, 122.52, 117.74, 97.42, 82.60, 73.71, 71.67, 69.19, 68.04, 66.85, 58.27, 53.40, 42.87, 40.42, 38.36, 36.60, 35.75, 35.45, 34.70, 31.22, 29.68, 27.99, 27.37, 22.88, 18.81, 17.40, 15.49, 12.48, 11.90.

Ή NMR (401 MHz, CDCh) 6.80 - 6.69 (m, 1H), 6.24 - 6.12 (m, 2H), 5.83 (dd, J = 14.5, 11.2 Hz, 1H), 5.44 (dd, J = 14.8, 10.6 Hz, 1H), 5.38-5.31 (m, 2H), 4.93 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 4.60 - 4.51 (m, 2H), 4.47 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.17 - 4.05 (m, 6H), 3.79 - 3.71 (m, 1H), 3.65 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 3.19 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 2.82-2.75 (m, 1H), 2.42-0.75 (m, 30H).

Przykład 18

Otrzymywanie C13-amidu metoksyacetylowego C4-hydroksyiwermektyny (wzór 27).

Postępowano jak w przykładzie 12, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek metoksyacetylu (47 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid metoksyacetylowy C4-hydroksyiwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 50%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 45% (wydajność całkowita: 23%).

ESI-MS (m/z): [M+Naf 696.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 169.31, 168.73, 140.02, 138.98, 136.20, 136.03, 129.45, 126.63, 122.58, 117.49, 97.37, 82.65, 78.08, 77.02, 73.52, 71.87, 71.64, 69.19, 68.00, 66.88, 59.16, 57.12, 40.39, 38.39, 36.54, 35.75, 35.42, 34.69, 31.21,27.95, 27.37, 22.82, 18.85, 17.38, 15.49, 12.41, 11.86.

¹H NMR (401 MHz, CDCh) 6.70 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 6.20-6.11 (m, 2H), 5.80 (dd, J = 14.4, 11.3 Hz, 1H), 5.44 (dd, J = 14.3, 10.7 Hz, 1H), 5.31 (dt, J = 15.0, 8.1 Hz, 1H), 4.89 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.53 (dd, J = 22.4, 15.2 Hz, 3H), 4.15 - 4.06 (m, 2H), 4.03 - 3.92 (m, 2H), 3.62 (s, 1H), 3.53 (s, 3H), 3.18 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 2.77 (dd, J = 10.3 Hz, 1H), 2.33 - 2.19 (m, 2H), 2.08 - 0.68 (m, 32H).

Przykład 19

Otrzymywanie C13-amidu 1-adamantylokarbonylowego C4-hydroksyiwermektyny (wzór 28).

OH

PL 247624 BI

Postępowano jak w przykładzie 12, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek 1-adamantylokarbonylu (85 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid 1-adamantylokarbonylowy C4-hydroksyiwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 54%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 53% (wydajność całkowita: 29%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 786. ‘ ¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 177.55, 168.73, 140.13, 139.14, 136.80, 135.96, 129.32, 126.68, 122.44, 116.99, 97.39, 82.63, 78.06, 76.47, 73.39, 71.64, 69.09, 67.97, 66.92, 57.04, 41.08, 40.34, 39.52, 39.39, 38.32, 36.53, 36.40, 35.72, 35.33, 34.62, 31.20, 28.09, 28.03, 27.96, 27.24, 22.79, 18.82, 17.35, 15.43, 12.33, 12.14.

Ή NMR (400 MHz, CDCh) 6.17 - 6.11 (m, 1H), 6.08 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 5.75 (dd, J = 14.5, 11.2 Hz, 1H), 5.65 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 5.34 (dd, J = 14.5, 10.7 Hz, 1H), 5.30 - 5.22 (m, 1H), 4.77 (dd, J = 9.9, 4.6 Hz, 1H), 4.70 (s, 1H), 4.53 - 4.41 (m, 2H), 4.39 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.09 - 3.99 (m, 2H), 3.55 - 3.47 (m, 1H), 3.14 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 2.72 - 2.65 (m, 1H), 2.18 (dd, J = 13.3, 7.1 Hz, 2H), 2.08 -0.63 (m, 47H).

Przykład 20

Otrzymywanie C13-amidu 2-furonowy C4-hydroksyiwermektyny (wzór 29).

OH

Postępowano jak w przykładzie 12, przy czym zamiast chlorku acetylu do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek 2-furoylu (56 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid 2-furonowy C4-hydroksyiwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 56%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 47% (wydajność całkowita: 26%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺718.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 168.70, 158.06, 147.59, 143.96, 140.04, 139.10, 136.23, 135.99, 129.38, 126.73, 122.60, 117.65, 114.66, 112.34,97.35, 82.61,78.07,77.09,73.47,71.64,69.19,67.97, 66.85, 57.49, 40.37, 38.45, 36.51, 35.72, 35.38, 34.64, 31.17, 27.89, 27.35, 22.80, 18.89, 17.35, 15.50, 12.40, 11.78.

¹H NMR (400 MHz, CDCh) 7.53-7.48 (m, 1H), 7.40 (ddd, J = 8.7, 4.3, 3.4 Hz, 1H), 7.11 -7.03 (m, 1H), 6.51 - 6.39 (m, 2H), 6.16 - 6.05 (m, 2H), 5.79 (dd, J = 14.5, 11.2 Hz, 1H), 5.47 (dd, J = 14.5, 10.6 Hz, 1H), 5.30-5.20 (m, 1H), 4.93 (dd, J = 9.7, 5.2 Hz, 1H), 4.72 (s, 1H), 4.59-4.42 (m, 3H), 4.05 (dd, J = 9.2, 2.5 Hz, 2H), 3.59 - 3.50 (m, 1H), 3.08 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 2.80 - 2.72 (m, 1H), 2.18 (dd, J = 21.8, 11.2 Hz, 2H), 2.02-0.61 (m, 31H).

Przykład 21

Otrzymywanie C13-amidu 3-hydroksy-4-metoksybenzoilowego C4-hydroksyiwermektyny (wzór 30).

PL 247624 BI

OH

C13-epi-aminoiwermektynę blokowaną grupą sililową w pozycji C5 (wzór 5) (250 mg, 0,36 mmol) rozpuszczono w 10 ml A/,A/-dimetyloformamidu, dodano A/,A/-diizopropyloetyloaminę (276 mg, 2,14 mmol) i heksafluorofosforan 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylomocznika (HATU, 0,46 mmol, 176 mg). Pozostawiono na mieszadle magnetycznym na 15 minut w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny dodano następnie kwas 3-hydroksy-4-metoksybenzoesowy (60 mg, 0,36 mmol). Pozostawiono na mieszadle magnetycznym na 24 h w temperaturze pokojowej. Po tym czasie całość ekstrahowano z roztworem H2SO4(aq) (pH = 1), a następnie z wodą. Następnie warstwę organiczną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz układ rozpuszczalników chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%. Produkt rozpuszczono następnie w bezwodnym THF, po czym dodano 3-krotny nadmiar fluorku tetra-n-butyloamoniowego (TBAF) w stosunku do produktu reakcji amidowania. Pozostawiono na mieszadle magnetycznym na 3 dni w temperaturze pokojowej. Po tym czasie rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz układ rozpuszczalników chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%.

Otrzymano C13-amid 3-hydroksy-4-metoksybenzoilowy C4-hydroksyiwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 55%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 29% (wydajność całkowita: 16%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 774.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 168.61, 166.86, 149.48, 145.65, 140.05, 139.08, 136.54, 136.04, 129.36, 127.52, 126.76, 122.56, 119.51, 117.42, 113.24, 110.26, 97.34, 82.63, 78.07, 73.46, 71.67, 69.12, 67.98, 66.90, 58.31, 56.05, 40.39, 38.46, 36.52, 35.75, 35.40, 34.67, 31.19, 29.64, 27.89, 27.32, 22.80, 18.99, 17.35, 15.53, 12.40, 11.78.

Ή NMR (400 MHz, CDCh) 7.75 - 7.60 (m, 1H), 7.34 - 7.19 (m, 2H), 6.87 - 6.76 (m, 1H), 6.19 5.98 (m, 3H), 5.81 - 5.71 (m, 1H), 5.45 (dd, J = 14.3, 10.6 Hz, 1H), 5.27 - 5.16 (m, 1H), 4.93 - 4.86 (m, 1H), 4.57 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 4.44 (dt, J = 15.8, 7.9 Hz, 2H), 4.04 (dd, J = 11.8, 7.7 Hz, 2H), 3.923.81 (m, 3H), 3.77 (dd, J = 9.5, 5.0 Hz, 1H), 3.50 (dd, J = 24.1, 19.9 Hz, 1H), 3.05 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 2.88-2.78 (m, 1H), 2.78 - 2.69 (m, 1H), 2.15 (dd, J = 22.0, 10.8 Hz, 2H), 1.97-0.58 (m, 31H).

Przykład 22

Otrzymywanie C13-amidu 3,4-dimetoksybenzoilowego C4-hydroksyiwermektyny (wzór 31).

PL 247624 BI

Postępowano jak w przykładzie 21, przy czym zamiast kwasu 3-hydroksy-4-metoksybenzoesowego do mieszaniny reakcyjnej dodano kwas 3,4-dimetoksybenzoesowy (65 mg, 0,43 mmol).

Otrzymano C13-amid 3,4-dimetoksybenzoilowy C4-hydroksyiwermektyny z wydajnością pierwszego etapu 74%, oraz wydajnością reakcji odblokowania 47% (wydajność całkowita: 35%).

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 789. ‘ ¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 168.66, 166.89, 151.94, 149.18, 140.08, 139.21, 136.59, 135.98, 129.30, 126.99, 126.78, 122.50, 118.83, 117.38, 110.91, 110.19, 97.33, 82.64, 78.05, 73.38, 71.62, 69.16, 67.94, 66.87, 58.38, 56.02, 40.37, 38.45, 36.50, 35.73, 35.35, 34.63, 31.16, 27.87, 27.29, 22.77, 19.00, 17.34, 15.54, 12.41, 11.80.

Ή NMR (400 MHz, CDCh) 7.41 - 7.32 (m, 1H), 7.29 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 1H), 6.87 - 6.83 (m, 1H), 6.82-6.74 (m, 1H), 6.16-6.01 (m, 3H), 5.77 (dd, J = 14.5, 11.2 Hz, 1H), 5.45 (dd, J = 14.4, 10.6 Hz, 1H), 5.21 (ddd, J = 16.1, 11.1,4.8 Hz, 1H), 4.89 (dd, J = 10.2, 4.7 Hz, 1H), 4.59 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.46 (ddd, J = 21.9, 14.5, 2.3 Hz, 2H), 4.06 - 4.00 (m, 2H), 3.90 - 3.80 (m, 6H), 3.49 (dd, J = 9.8, 5.1 Hz, 1H), 3.10-3.02 (m, 1H), 2.81 -2.73 (m, 1H), 2.17 (dd, J = 22.3, 11.4 Hz, 2H), 2.02-0.54 (m, 32H).

Przykład 23

Otrzymywanie C4-hydroksyiwermektyny (wzór 32).

Iwermektynę (500 mg, 0,57 mmol) rozpuszczono w 10 ml bezwodnego THF. Po chwili dodano fluorku tetra-n-butyloamoniowego (TBAF, 1,71 mmol, 448 mg) i pozostawiono na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej przez 3 dni. Po tym czasie rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz układ rozpuszczalników chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%.

Otrzymano C4-hydroksyiwermektynę z wydajnością 15%.

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 914.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 168.85, 138.68, 138.53, 138.45, 134.66, 129.46, 125.37, 123.10, 118.04, 98.38, 97.35, 94.69, 82.80, 81.77, 80.30, 79.28, 78.15, 78.00, 76.58, 75.89, 73.20, 71.55, 69.17, 68.07, 67.10, 67.05, 56.51, 56.31, 56.25, 40.28, 39.64, 36.71, 35.71, 35.38, 34.39, 34.25, 34.13, 31.15, 27.97, 27.17, 22.57, 20.09, 18.30, 17.61, 17.35, 15.12, 12.36, 12.02.

Ή NMR (401 MHz, CDCh) 6.12 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 5.70 (dt, J = 26.1, 15.0 Hz, 2H), 5.41 - 5.26 (m, J = 24.1 Hz, 2H), 4.83 (dd, J = 55.3, 19.8 Hz, 3H), 4.56 - 4.43 (m, 2H), 4.06 (s, 2H), 3.89 (s, 1H), 3.73 (ddd, J = 45.1, 26.0, 13.4 Hz, 5H), 3.39 (dd, J = 24.1, 13.5 Hz, 11H), 3.17 (dt, J = 31.5, 9.0 Hz, 5H), 2.49-2.39 (m, 1H), 2.26 (dd, J = 38.3, 11.9 Hz, 5H), 1.91 (d, J = 7.0 Hz, 1H), 1.82 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 1.64 (d, 1H), 1.60-0.59 (m, 30H).

Przykład 24

Otrzymywanie aglikonu C4-hydroksyiwermektyny (wzór 33).

PL 247624 BI

Aglikon iwermektyny (400 mg, 0,68 mmol) rozpuszczono w 10 ml bezwodnego THF. Po chwili dodano fluorku tetra-n-butyloamoniowego (TBAF, 2,04 mmol, 534 mg) i pozostawiono na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej przez 3 dni. Po tym czasie rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografu CombiFlash® stosując kolumnę wypełnioną krzemionką oraz układ rozpuszczalników chloroform/octan etylu przy wzrastającym gradiencie stężeń octanu etylu od 0 do 100%.

Otrzymano aglikon C4-hydroksyiwermektyny z wydajnością 17%.

ESI-MS (m/z): [M+Na]⁺ 625.

¹³C NMR (101 MHz, CDCh) 168.45, 138.50, 138.20, 137.53, 129.53, 125.46, 123.27, 117.07, 97.32, 82.83, 77.75, 76.99, 73.27, 71.63, 68.98, 68.10, 67.06, 40.43, 39.88, 36.59, 35.78, 35.47, 34.46, 31.22, 28.00, 27.41, 22.59, 19.06, 17.40, 14.48, 12.52, 11.67.

Ή NMR (401 MHz, CDCh) 6.11 (d, J = 11.3 Hz, 2H), 5.78 - 5.63 (m, 2H), 5.32 - 5.22 (m, 2H), 4.93 (s, 1H), 4.57 - 4.44 (m, 2H), 4.07 (s, 2H), 3.96 (s, 1H), 3.74 - 3.63 (m, J = 4.1 Hz, 1H), 3.17 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 2.48 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 2.34 - 2.18 (m, 2H), 2.06 - 0.58 (m, 33H).

Badania:

Badania in vit.ro przeprowadzone wobec ludzkich linii komórek nowotworowych potwierdziły działanie cytotoksyczne związku wyjściowego, jak i jego nowych pochodnych.

W badaniach wykorzystano następujące linie komórkowe:

- A549 - ludzki gruczolak płuc

MDA-MB 231 - ludzki gruczolak piersi

HCT 116 - ludzki gruczolak jelita grubego

PC 3 - ludzki rak gruczołu krokowego

W badaniach wykorzystano równie normalne ludzkie unieśmiertelnione komórki keranocytów (HaCaT), w celu określenia współczynnika selektywności badanych związków, który pozwala przewidzieć czy dana substancja będzie w pierwszej kolejności działała na komórki nowotworowe czy na zdrowe komórki organizmu.

W tabeli 1 podano dane dotyczące stosowanych w badaniach linii komórkowych.

Tabela 1. Linie komórkowe użyte do badań.

Symbol linii komórkowej	Nazwa linii komórkowej	Źródło pochodzenia linii komórkowej
A549	ludzki gruczolak płuc	ATCC-CCL-185
MDA-MB 231	ludzki gruczolak piersi	ATCC - HTB-26
HCT 116	ludzki gruczolak jelita grubego	ATCC - CCL-247
PC3	ludzki rak gruczołu krokowego	ATCC - CRL-1435
HaCaT	Normalne ludzkie unieśmiertelnione kcranocyty	CLS (300493)

PL 247624 BI

W trakcie badań cytotoksyczności stosowano media hodowlane i odczynniki podane w tabeli 2.

Tabela 2. Media hodowlane i odczynniki.

Nazwa	Producent
Medium hodowlane dla linii A549	• DMEM High Glucose (Biowest SAS, Francja) • 10% FBS (VWR Gdańsk, Polska) • 0,1 mg/ml streptomycyna, lOOU/ml penicylina (odpowiednio: Biowest SAS, Francja)
Medium hodowlane dla linii MDA-MB 231	• DMEM High Glucose (Biowest SAS, Francja) • 10% FBS (VWR Gdańsk, Polska) • 0,1 mg/ml streptomycyna, 100 U/ml penicylina (odpowiednio: Biowest SAS, Francja)
Medium hodowlane dla linii HCT-116	• MEM (Biowest SAS, Francja) • 10% FBS (VWR Gdańsk, Polska) ♦ 0,1 mg/ml streptomycyna, 100 U/ml penicylina (odpowiednio: Biowest SAS, Francja)
Medium hodowlane dla linii PC3	• RPMI 1640 (Biowest SAS, Francja) • 10% FBS (VWR Gdańsk, Polska) • 0,1 mg/ml streptomycyna, 100 U/ml penicylina (odpowiednio: Biowest SAS, Francja)
Medium hodowlane dla linii HaCaT	• DMEM High Glucose (Biowest SAS, Francja) • 10% FBS (VWR Gańsk, Polska) • 0,1 mg/ml streptomycyna, 100 U/ml penicylina (odpowiednio: Biowest SAS, Francja)
Chlorowodorek doksorubicyny	• Fiolka 250 mg (Fluorochem, Anglia)

Badania cytotoksyczności zostały przeprowadzone zgodnie z poniżej opisaną procedurą. Roztwory wyjściowe (stock Solutions) testowanych związków o stężeniu 10 μΜ przygotowywano do każdego eksperymentu, rozpuszczając 1 mg preparatu w 100 μΙ DMSO. Rozpuszczalnikiem dla dalszych rozcieńczeń było czyste medium hodowlane (bez dodatków). Związki przetestowano w przedziałach stężeń od 100 do 1 μΜ.

Oznaczenie działania cytotoksycznego badanych związków oraz związku referencyjnego - powszechnie stosowanego chemioterapeutyku tj. doksorubicyny wykonywano w 72-godzinnych hodowlach in vitro. Dla oznaczenia aktywności antyproliferacyjnej związków wobec wybranych linii komórkowych zastosowano test kolorymetryczny MTT wg [Mosmann T. Journal Immunol. Methods. 1983, 65, 55-63., zmodyfikowany przez Van Rensburg CEJ, et Al., Anti-Cancer Drug. 1997, 8, 708-13.], mierzący aktywności enzymów mitochondrialnych w komórce, co jest wprost proporcjonalne do ilości zredukowanej soli tetrazolowej (MTT), a tym samym może być wyznacznikiem żywotności komórek. W każdym doświadczeniu próbki zawierające określone stężenia związku nanoszono na płytki 96-dołkowe w trzech powtórzeniach. Doświadczenia powtarzano minimum trzy razy.

a) Wszystkie badane komórki (pochodzące z hodowli in vitro) wysiewano w liczbie 1*10⁴ do dołków płytki w 200 μΙ medium hodowlanego odpowiedniego dla danej linii komórkowej, a następnie preinkubowano przez 24 godziny w 37°C przy 5% nasyceniu CO2.

b) Po 24 godzinach usunięto medium i dodano świeże medium z dodatkiem badanych związków w różnych stężeniach (od 100 μΜ do 1 μΜ). Kontrole stanowiły komórki hodowane w medium bez dodatku badanych związków.

c) Płytki inkubowano przez kolejne 72 godziny w 37°C przy 5% nasyceniu CO2.

d) Po zakończeniu inkubacji komórek ze związkami wykonano test MTT.

e) W każdym doświadczeniu próbki zawierające określone stężenie związku wysiewano w trzech powtórzeniach, po 7 stężeń dla danego związku. Kontrolę wzrostu komórek nietraktowanych prowadzono w 12 dołkach. Doświadczenie powtarzano 3 razy.

PL 247624 BI

Odczyt MTT:

Po zakończeniu 72 h inkubacji medium zostało usunięte i dodano po 200 μΙ na dołek roztwór MTT 0,5 mg/ml rozpuszczony w świeżym medium bez surowicy i inkubowano przez 4 godziny w 37°C. Następnie usuwano medium, a komórki zalewano mieszaniną DMSO (dimetylosulfotlenek) z izopropanolem (1:1) w celu uwolnienia i rozpuszczenia kryształków formazanu. Gęstość optyczną rozpuszczonych kryształków formazanu zmierzono za pomocą czytnika UVM 340 (ASYS Hitech GmbH, Austria) przy długości fali 570 nm.

Na podstawie pomiaru absorbancji poszczególnych dołków wyliczano % zahamowania proliferacji dla każdego ze związków w danym stężeniu według wzoru:

% zahamowania proliferacji

- 100 gdzie:

A_m - średnia wartość absorbancji medium kontrolnego

Ak - średnia wartość absorbancji kontroli komórek, tj. komórek nietraktowanych

At - średnia wartość absorbancji komórek potraktowanych badanymi związkami w danym stężeniu

Z danych % zahamowania proliferacji oszacowano aktywność cytotoksyczną przez określenie maksymalnego stężenia hamującego ICso (stężenie związku, które odpowiada 50% żywotności komórek w porównaniu z kontrolą). Wartość ICso została oszacowana przy użyciu programu Graph Pad.

Dodatkowo, potencjał cytotoksyczny komórek nowotworowych dla wszystkich testowanych związków wyrażono jako czynnik selekcyjny (wskaźnik selektywności, SI) i obliczono za pomocą wzoru:

komórek prawidłowych dia. komórek nowotwor owych

Jako związek odniesienia użyto leku przeciwnowotworowego - doksorubicyny. SI > 1,0 wskazuje, że związek wykazuje wyższą skuteczność oddziaływania na komórki nowotworowe niż toksyczność w stosunku do komórek zdrowych.

Wyniki badań aktywności cytotoksycznej przedstawione w formie stężenia wyrażonego w μΜ dla wybranych związków przedstawione są w tabeli 3.

Wszystkie otrzymane pochodne iwermektyny wykazują wysoką aktywnością cytotoksyczną, porównywalną do powszechnie stosowanych leków przeciwnowotworowych tj. doksorubicyny. W szczególności bardzo wysoką aktywność cytotoksyczną wykazują związki o wzorach: 10, 12, 15, 16, 19, 20, 26, 27, 28, 29, 32, 33 oraz iwermektyna (IWR) (tabela 3) w porównaniu do komórek prawidłowych (HaCaT). Dodatkowo większość otrzymanych pochodnych charakteryzuje się korzystnymi współczynnikami selektywności (SI).

PL 247624 BI

Tabela 3.	Aktywność cytotoksyczną (ICso, μΜ) badanych związków oszacowano za pomocą testu MTTa
	nowotworowe		Komórki					prawidłowe
Związki	PC3‘ ic5o b	1 sr	MDA-MB2311 IC50 SI	A5491 IC50 SI	HCT-116S IC5O SI	HaCaT11 ICW
1WRJ	8.5 ± 0.2	1.3	8.8 ±0.3	1.2	9.9 ±0.9	1.1	9.4+1.2	1.1	10.8 ± 3.1
Agi ikon IWR	17.1 ± 1.2	1.0	12.1 ±0.1	1.4	8.4 ±1.3	2.0	16.7 ± 1.9	1.0	16.9 ± 8.1
10	17.5 + 3.3	1.6	7.6 + 0.5	3.7	12.5+0.8	2.3	10.1+0.4	2.8	28.5 + 6.5
11	8.7+1.9	1.6	10.9 + 0.3	1.3	12.3 ±3.8	1.1	16.7 + 0.8	0.8	14.2 + 2.9
12	7.6 + 0.6	1.5	9.8 ±2.3	1.2	19.4 ±0.9	0.6	9.6 ±0.6	1.2	11.3 ± 4.1
13	9.2 + 0.6	1.1	7.8+1.2	1.3	8.2 ±0.4	1.2	17.2 + 2.2	0.6	10.1 ±2.1
14	8.2 + 0.7	1.1	8.5±0.1	1.1	11.8 ±2.9	0.7	14.1 ±2.1	0.6	9.1 ± 1.3
15	17.6 ±3.4	1.6	9.5 ± 1.7	3.0	37.9 ±4.4	0.8	6.5 ±1.0	4.4	28.9 ± 1.3
16	8.3 + 0.4	1.5	10.1 ±0.4	1.2	11.4 ±3.4	1.1	14.5 + 0.8	0.8	12.6 + 3.4
17	9.1 ±0.8	0.7	10.3 ±3.5	0.6	11.5 ±3.4	0.5	5.1 ± 1.4	1.2	6.4 ±0.5
18	7.8 ± 0.7	1.0	28.5 ±0.6	0.3	12.5 ±1.6	0.6	21.7 + 0.9	0.4	8.2 + 1.9
19	8.6 ± 0.3	1.2	13.1 ± 1.2	0.8	16.2 ±2.3	0.6	4.5 ±0.6	2.3	10.5 ±2.8
20	8.1 ± 1.1	1.3	8.2 ±0.3	1.3	9.7 ±1.7	1.1	2.5 + 0.1	4.3	10.8 ±2.6
21	25.8 ±4.1	0.8	45.5 ±8.1	0.5	29.4 ±1.1	0.7	15.9 ±2.9	1.3	21.4 ±6.4
22	13.8 ±3.2	1.5	14.6 ±6.2	1.4	20.0 ±1.9	1.0	13.9 ± 3.1	1.4	20.2 ± 1.7
23	18.3 ±3.7	0.4	10.2 + 0.3	0.8	10.2 ±0.3	0.8	12.7 + 0.7	0.6	8.2+0.5
24	16.5 ±4.6	0.5	27.2 + 0.1	0.3	22.0 ±1.2	0.4	31.5 + 0.2	0.3	8.2 + 2.1
25	12.2 ± 0.9	0.5	9.6 + 0.4	0.7	9.2 ±0.3	0.7	18.5 ±4.8	0.3	6.5 +0.3
26	8.8 ± 0.6	3.2	8.8 ±0.2	3.2	13.8 ±0.3	2.0	35.1 ± 1.1	0.8	27.9 ± 1.8
27	11.3 + 0.1	2.8	17.3 ±0.5	1.8	15.6 + 3.4	2.0	29.3 + 2.4	1.1	31.2 + 9.5
28	9.6 ± 0.3	2.3	15.4 ±5.1	1.5	13.2 ±1.3	1.7	9.8 + 0.1	2.3	22.8 ±2.7
29	8.9 ±0.1	1.7	8.9±0.1	1.7	15.3 ±0.7	1.0	29.3 ±2.1	0.5	15.1 +2.1
30	7.7 + 0.4	1.0	8.2+1.1	0.9	8.5 + 0.5	0.9	8.4 + 0.5	0.5	7.7+0.1
31	7.2 ± 0.4	1.3	7.3 ±0.5	1.3	9.1 ±0.7	1.0	16.2 + 2.4	0.5	9.3 + 0.6
32	7.4 ± 0.2	3.0	8.4 ±0.3	2.7	9.8 ±0.4	2.3	14.1 ±0.4	1.6	22.8 ±0.3
33	9.3 ±0.1	1.6	14.8 ±0.9	1.0	3.9 ±0.2	3.9	8.9 ±0.2	1.7	15.3 ±0.6
DX'	0.6 ± 0.02	0.5	1.83 ± 0.1	0.15	0.63 ± 0.2	0.5	0.6 ± 0.02	0.5	0.29 ±0.1

^aDane wyrażono jako średnią ± SD, ^bIC5o (M) - stężenie związku, które odpowiada 50% zahamowaniu wzrostu linii komórkowej (w porównaniu z kontrolą) po inkubacji komórek przez 72 godziny z poszczególnym związkiem. ^CSI (wskaźnik selektywności) = IC50 dla prawidłowej linii komórkowej / IC5o dla nowotworowej linii komórkowej, ^dLudzkie komórki raka płuc (A549), ^eLudzkie komórki raka piersi (MDA-MB123), 'Ludzkie komórki raka płuc (A549), ⁹Ludzkie komórki raka jelita grubego (HCT-116), ^hLudzka nieśmiertelna linia komórkowa keranocytów. 'Wybrany związek referencyjny powszechnie stosowany w leczeniu raka (doksorubicyna), 'iwermektyna.

Wpływ pochodnych iwermektyny na wczesną i późną apoptozę w komórkach nowotworowych.

Badanie apoptozy (aneksyna V/jodek propidyny) zostały przeprowadzone zgodnie z poniżej opisaną procedurą. Roztwory wyjściowe (stock Solutions) testowanych związków o stężeniu 10 μΜ przygotowywano do każdego eksperymentu (na świeżo), rozpuszczając 1 mg preparatu w 100 μl DMSO. Rozpuszczalnikiem dla dalszych rozcieńczeń było w czyste medium hodowlane (bez dodatków). Do zbadania apoptozy użyto stężenia IC50 odpowiednio dla linii komórkowej i związku.

Badane komórki wysiano na 6-dołkowej płytce w stężeniu od 0,8*105 do 1*105 komórek/ml w 3 ml medium hodowlanego, a następnie preinkubowano przez 24 godziny w 37°C przy 5% nasyceniu CO2. Po zakończonej inkubacji usuwano medium i dodawano świeże medium odpowiednie dla danej linii komórkowej z badanym związkiem w stężeniu IC50. Po 72 godzinach inkubacji komórki zbierano i wybarwiano zgodnie z protokołem producenta. Zastosowano zestaw FITC Aneksyna V do wykrywania apoptozy (BD Pharmingen). Barwione komórki analizowano natychmiast za pomocą cytometru przepływowego BD FACSCalibur, (USA).

Wpływ pochodnych iwermektyny na wczesną i późną apoptozę przedstawiono za pomocą analizy cytometrii przepływowej (Wykres 1 i 2). Badanie to pokazuje, że 72-godzinna inkubacja komórek z iwermektyną (IWR) i jej wybranymi pochodnymi (związki o wzorach IWR, 10, 12, 15, 16, 19, 20, 26, 27, 28, 29, 32, 33) w stężeniu IC50 wykazała najwyższy odsetek komórek znajdujących się w późnej apoptozie i nekrozie w porównaniu do kontroli bez związku. Spośród wszystkich badanych linii komórkowych związki opisane w drugim i trzecim aspekcie patentu (26, 27, 28, 29, 32 i 33) najsilniej indukowały późną apoptozę w komórkach PC3. Jednakże związki opisane w pierwszym aspekcie patentu najsilniej indukowały późną apoptozę i nekrozę w komórkach MDA-MB 123 i A549.

Statystyka

Wszystkie dane statystyczne zebrane z doświadczeń in vitro pochodzą z eksperymentów przeprowadzonych w co najmniej trzech powtórzeniach biologicznych. Wyrażano je jako średnia +/- odchylenie standardowe (SD). Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu GraphPad Prism.

PL 247624 BI

Wczesna e Pożna lub Nekroza

nizo]diHln fouzod qn[ ΓουκπζίΐΜ ολα ^cunine») s a c:

c £

δ &

s Λ

-α o

Ł c CśJ c: £ Έ c

PL 247624 BI

Claims (22)

1. Pochodne iwermektyny modyfikowane w pozycjach 13 i/lub 4 o wzorze ogólnym 1

w którym

Ri oznacza:

H _o X'^NK tob X°Y.

R2 oznacza:

_o lub

A-B-C oznacza:

u H ,, _o I^{2 4}I ^{|2 4|}

X oznacza:

o atom wodoru, o lub podstawnik cukrowy o następującym wzorze:

o lub podstawnik acylowy o wzorze

O gdzie R oznacza:

o grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 10 atomów węgla, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha atomem halogenu korzystnie fluor, chlor, brom, jod, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną grupą karbocykliczną lub heterocykliczną, obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej, o grupę karbocykliczną lub heterocykliczną obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej.

PL 247624 BI

2. Pochodne iwermektyny według zastrz. 1, znamienne tym, że w pozycji C13 zamiast reszty cukrowej przyłączone są podstawniki A/-acylowe o przeciwnej konfiguracji na atomie węgla C13 o wzorze ogólnym 2

O

V'^R a R oznacza:

o grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 10 atomów węgla, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha atomem halogenu korzystnie fluor, chlor, brom, jod, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną grupą karbocykliczną lub heterocykliczną, obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej, o grupę karbocykliczną lub heterocykliczną obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej.

3. Pochodne iwermektyny według zastrz. 1, znamienne tym, że w pozycji C13 zamiast reszty cukrowej przyłączone są podstawniki A/-acylowe o przeciwnej konfiguracji na atomie węgla C13 uzyskane w wyniku przegrupowania pierścienia pseudo-benzofuranowego, w wyniku którego wiązanie podwójne uległo migracji z pozycji C3=C4 na C2=C3 oraz w pozycji C4 w stereoselektywnie przyłączona została grupa hydroksylowa jak o wzorze ogólnym 3

w którym:

X oznacza:

PL 247624 BI

a R oznacza:

o grupę alkilową prostą lub rozgałęzioną zawierającą od 1 do 10 atomów węgla, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną w dowolnej pozycji łańcucha atomem halogenu korzystnie fluor, chlor, brom, jod, o grupę alkilową zawierającą od 1 do 4 atomów węgla podstawioną grupą karbocykliczną lub heterocykliczną, obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej, o grupę karbocykliczną lub heterocykliczną obejmującą pierścień furanu, adamantylu lub grupę fenylową, przy czym jej pierścień może być ewentualnie podstawiony jedną lub większą ilością, identycznych lub różnych grup, wybranych spośród: C1-C4 alkilowej, C1-C4 alkoksylowej, hydroksylowej.

4. Pochodne iwermektyny według zastrz. 1, znamienne tym, że uległy one reakcji przegrupowania pierścienia pseudo-benzofuranowego w wyniku którego wiązanie podwójne ulega migracji z pozycji C3=C4 na C2=C3 oraz w pozycji C4 stereoselektywnie przyłączona zostaje grupa hydroksylowa o wzorze ogólnym 4

w którym:

X oznacza:

o atom wodoru, o podstawnik cukrowy o następującym wzorze 5:

PL 247624 BI

5. Sposób otrzymywania C13-amidów iwermektyny o wzorze ogólnym 2, w którym X i R mają znaczenie podane w zastrzeżeniu 2, znamienny tym, że polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 6, będącym aminowym prekursorem iwermektyny blokowanym w pozycji C5:

a chlorkiem kwasowym o wzorze ogólnym 7, w którym R ma wyżej podane znaczenie:

O

ROi wzór 7 w ilości 1,2 ekwiwalenta w stosunku do ilości aminowego prekursora iwermektyny o wzorze 6, w obecności trzeciorzędowej aminy alifatycznej lub pirydyny oraz następczym odblokowaniu pozycji C5 przy użyciu kwasu p-toluenosulfonowego.

6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako czynnik odblokowujący stosuje się kwas p-toluenosulfonowy.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że reakcje prowadzi się w alkoholu, najkorzystniej w metanolu.

8. Sposób otrzymywania C13-amidów iwermektyny o wzorze ogólnym 2, w którym X i R mają znaczenie podane w zastrzeżeniu 2, znamienny tym, że polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 6, będącym aminowym prekursorem iwermektyny blokowanym w pozycji C5, a kwasem karboksylowym o wzorze ogólnym 8, w którym R ma wyżej podane znaczenie:

O R^OH wzór 8 w ilości 1 ekwiwalenta w stosunku do ilości aminowego prekursora iwermektyny o wzorze 6, w obecności czynnika sprzęgającego oraz zasady organicznej oraz następczym odblokowaniu pozycji C5 przy użyciu kwasu p-toluenosulfonowego.

9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako czynnik sprzęgający stosuje się heksafluorofosforan 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylomocznika (HATU), lub karbodiimid Λ/,Λ/’-dicykloheksylokarbodiimid (DCC) lub 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid (EDCI).

10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako zasadę organiczną stosuje się pirydynę lub jej pochodne najkorzystniej 4-pirolidynopirydynę (PPy).

11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że gdy używa się heksafluorofosforanu 2-(7-aza-1/-/-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylomocznika (HATU), korzystne jest użycie trzeciorzędowej aminy alifatycznej, najkorzystniej A/,A/-diizopropyloetyloaminy.

PL 247624 BI

12. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako czynnik odblokowujący stosuje się kwas p-toluenosulfonowy.

13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że reakcje prowadzi się w alkoholu, najkorzystniej w metanolu.

14. Sposób otrzymywania C13-amidów C4-hydroksyiwermektyny o wzorze ogólnym 3, w którym X i R mają znaczenie podane w zastrzeżeniu 3, znamienny tym, że polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 6, będącym aminowym prekursorem iwermektyny blokowanym w pozycji C5, a chlorkiem kwasowym o wzorze ogólnym 7 (w którym R ma wyżej podane znaczenie) w ilości 1,2 ekwiwalenta w stosunku do ilości aminowego prekursora iwermektyny o wzorze 6, w obecności trzeciorzędowej aminy alifatycznej lub pirydyny oraz następczym odblokowaniu pozycji C5 przy użyciu fluorku tetra-n-butyloamoniowego.

15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że jako czynnik odblokowujący stosuje się fluorek tetra-n-butyloamoniowy.

16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że reakcje prowadzi się w tetrahydrofuranie.

17. Sposób otrzymywania C13-amidów C4-hydroksyiwermektyny o wzorze ogólnym 3, w którym X i R mają znaczenie podane w zastrzeżeniu 3, znamienny tym, że polega na reakcji pomiędzy związkiem o wzorze ogólnym 6, będącym aminowym prekursorem iwermektyny blokowanym w pozycji C5, a kwasem karboksylowym o wzorze ogólnym 8, w którym R ma wyżej podane znaczenie w ilości 1 ekwiwalenta w stosunku do ilości aminowego prekursora iwermektyny o wzorze 6, w obecności czynnika sprzęgającego oraz zasady organicznej oraz następczym odblokowaniu pozycji C5 przy użyciu fluorku tetra-n-butyloamoniowego.

18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że jako czynnik odblokowujący stosuje się fluorek tetra-n-butyloamoniowy.

19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że reakcje prowadzi się w tetrahydrofuranie.

20. Sposób otrzymywania C4-hyd raksy pochodnych iwermektyny o wzorze ogólnym 4 w którym X i R mają znaczenie podane w zastrzeżeniu 4, znamienny tym, że polega na reakcji iwermektyny o wzorze 9, przy czym X oznacza podstawnik cukrowy lub jej aglikonu o wzór 9, przy czym X oznacza atom wodoru z fluorkiem tetra-n-butyloamoniowym.

wzór 9 gdzie:

• X oznacza:

o atom wodoru, o podstawnik cukrowy o wzorze 5.

21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że reakcje prowadzi się w tetrahydrofuranie.

22. Modyfikowane pochodne iwermektyny określonych zastrzeżeniem 1,2,3 oraz 4, do zastosowania do leczenia onkologicznego korzystnie raka prostaty, raka piersi, raka płuc oraz raka jelita grubego.