PL247175B1

PL247175B1 - Szczepy z gatunku Bacillus amyloliquefaciens i zastosowanie szczepów z gatunku Bacillus amyloliquefaciens w uprawie roślin

Info

Publication number: PL247175B1
Application number: PL445697A
Authority: PL
Inventors: Katarzyna Góralska; Hubert KARDASZ; Hubert Kardasz; Anna GIERUT-KOT; Anna Gierut-Kot; Magdalena Jopek; Ilona KAFEL-KRAWCZYK; Ilona Kafel-Krawczyk; Roksana Rakoczy-Lelek; Krzysztof Ambroziak
Original assignee: Intermag Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date: 2023-07-28
Filing date: 2023-07-28
Publication date: 2025-05-26
Also published as: WO2025027461A1; PL445697A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku są szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 oraz Bacillus amyloliquefaciens A12B, zdeponowane w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu. Wynalazek dotyczy także zastosowania szczepów Bacillus amyloliquefaciens 8/6 albo Bacillus amyloliquefaciens A12B jako środka do biostymulacji wzrostu i rozwoju roślin oraz ochrony roślin przed agrofagami. Szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 albo Bacillus amyloliquefaciens A12B lub ich pochodne, takie jak zarodniki lub metabolity, aplikuje się w postaci zawiesiny wodnej poprzez fertygację, oprysk dolistny, oprysk gleby, używa do zaprawiania nasion lub w formie stałej do aplikacji doglebowej.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są szczepy z gatunku Bacillus amyloliquefaciens oraz zastosowanie szczepów z gatunku Bacillus amyloliquefaciens w uprawie roślin warzywnych, sadowniczych i rolniczych, do biostymulacji wzrostu i rozwoju roślin oraz do ochrony przed agrofagami, w tym patogenami grzybowymi i bakteryjnymi porażającymi rośliny uprawne zarówno w okresie wegetacji, jak również w trakcie przechowywania plonów, a w konsekwencji obniżającymi plony roślin.

Jednym z głównych celów rolnictwa krajów wysoko rozwiniętych jest zmniejszenie zużycia chemicznych środków ochrony roślin przez wprowadzenie proekologicznych systemów produkcji. Upowszechnienie i wdrożenie tych systemów pozwala na przywrócenie równowagi w środowisku i wykorzystanie jego naturalnej oporności przeciwko agrofagom oraz innym szkodliwym czynnikom ograniczającym efektywność produkcji roślinnej. W społeczeństwie jest coraz powszechniejsze oczekiwanie na rozwój metod alternatywnych wobec metod chemicznych. Jednym z rozwiązań pozwalającym na ograniczenie chemizacji rolnictwa jest stosowanie bioproduktów - środków ochrony roślin bazujących na mikroorganizmach, pozwalających na ochronę roślin przed chorobami i jednocześnie na produkcję bezpiecznych dla konsumenta owoców i warzyw o zmniejszonej pozostałości chemicznych środków ochrony roślin.

Powszechnie występującą chorobą grzybową zbóż jest zgnilizna korzeni powodowana przez grzyba Pythium ultimum, który atakuje korzenie, a w szczególności sadzonek. Zainfekowane rośliny charakteryzują się opóźnionym wzrostem, a sadzonki obumierają. Gatunek Pythium może przetrwać w glebie jako oospory, czyli zarodniki, które są odporne na niekorzystne warunki, w szczególności na odwodnienie. Oospory są roznoszone przez cząstki ziemi przemieszczane przez ludzi lub maszyny, a choroba rozprzestrzenia się najszybciej w wilgotnych warunkach przy wysokiej zawartości wody (>70%) w podłożu. Zarodniki zarażają korzenie przez małe rany, w miejscu tworzenia się bocznych korzeni lub przez inne podobnie uszkodzone miejsca. Gatunek Pythium może bez problemu przetrwać w glebie lub podłożu nawet przy braku roślin.

W ostatnich latach poważny problem w Polsce zaczyna stanowić ostra plamistość oczkowa, choroba powodowana przez grzyb Rhizoctonia cerealis, zwana potocznie rizoktoniozą zbóż. Rhizoctonia cerealis jest częstym patogenem zbóż ozimych, głównie pszenicy i pszenżyta, a jego obecność stwierdza się na 80% gleb. Patogen ten może porażać także inne gatunki zbóż oraz traw. Grzyb zwalczany jest zwykle przy użyciu fungicydów stosowanych do ochrony upraw zbóż przed innymi patogenami podstawy źdźbła, jednakże problem nasila się z powodu wzrostu odporności patotypów ostrej plamistości oczkowej na stosowane substancje czynne.

Brunatna plamistość liści to choroba o dużym znaczeniu gospodarczym w większości regionów uprawy pszenicy na świecie, do niedawna występująca głównie w uprawie pszenicy na terenie Ameryki Północnej i Australii. Od połowy lat osiemdziesiątych obserwowana jest także w Europie. Choroby pszenicy są wywoływane przez wiele różnych organizmów. Czynnikiem sprawczym brunatnej plamistości jest Pyrenophora tritici-repentis (Died.) Drechsler, stadium konidialne Drechslera tritici-repentis (Died.) Drechsler. Grzyb ten jest polifagiem, poraża liczne gatunki z rodziny Gramineae w tym także pszenicę i pszenżyto. W uprawie wymienionych zbóż choroba występuje corocznie, powszechnie i stanowi istotny element kompleksu chorób o objawach typu plamistości. Pszenica, jak też pszenżyto ulegają infekcji we wszystkich fazach rozwojowych. Porażane są nie tylko liście, jak można sądzić biorąc pod uwagę nazwę choroby - brunatna plamistość liści, ale także źdźbła, kłosy i ziarniaki. Patogen ten przeżywa głównie jako uśpiona grzybnia na ściernisku i resztkach pożniwnych.

Kolejne z poważniejszych chorób grzybowych wielu roślin, zwane fuzariozami, są powodowane przez grzyba Fusarium oxysporum, powszechnie występującego w uprawach szklarniowych. Stanowi on problem głównie w uprawach pomidora, ogórka, papryki, roślin doniczkowych oraz kwiatów ciętych, może jednak zaatakować znacznie szersze spektrum roślin żywicielskich. Głównymi objawami fuzariozy są więdnięcie i usychanie liści oraz gnicie korzeni. Grzyby Fusarium oxysporum wnikają w tkanki rośliny, atakując ich wiązki przewodzące, które wskutek tego przebarwiają się na brązowo. Skutkiem porażenia, obok zamierania liści jest też zahamowanie wzrostu roślin, które jest spowodowane utrudnionym, a w kolejnych fazach rozwoju choroby, całkowicie zahamowanym przepływem wody przez roślinę. Na powierzchni porażonej rośliny można zaobserwować grzybnię, która w zaawansowanym stadium może zmienić kolor na różowy, ze względu na masową produkcję zarodników Fusarium. Grzyby Fusarium oxysporum mogą przenosić się na sąsiadujące rośliny, porażona roślina może więc stanowić znaczne zagrożenie dla całej uprawy. Chemiczne zwalczanie fuzariozy na porażonych roślinach nie jest możliwe.

Z tego względu szczególnie istotne jest zapobieganie pojawieniu się patogenów. Choć choroba rozprzestrzenia się w glebie, to może również dotknąć rośliny uprawiane w systemie bezglebowym, np. na wełnie mineralnej.

Szara pleśń powodowana przez grzyba Botrytis cinerea atakuje wiele gatunków roślin, przy czym może występować przez cały okres wegetacji, porażając wszystkie nadziemne ich części. Sprawca choroby poraża rośliny rolnicze, sadownicze i ozdobne. Szczególnie podatne na infekcje są rośliny jagodowe. Patogen może wyrządzać szkody już w fazie kiełkowania roślin, powodując zgorzel i obumieranie młodych siewek. Szara pleśń poraża także warzywa w okresie przechowywania. Grzyb do infekcji i rozwoju wymaga wysokiej wilgotności względnej powietrza oraz silnie zwilżonych liści. Rozwojowi choroby sprzyja mała ilość światła, osłabienie roślin innymi chorobami, a także niedobór wapnia i potasu w glebie.

Mączniak właściwy to zbiorowa nazwa grupy chorób wywoływanych przez grzyby porażające nadziemne części roślin. Grzyby te są wysoko wyspecjalizowane i często porażają jeden wybrany gatunek rośliny. Dlatego w każdej uprawie może występować inny gatunek grzyba, który wywołuje tę chorobę. I tak np. na różach na ogół chorobę wywołuje grzyb Podosphaera pannosa, na trawach i zbożach Erysiphe graminis lub Blumeria graminis, na winoroślach Uncinula necator, na marchwi Erysiphe heraclei a na jabłoniach Podosphaera leucotricha. Grzyby te mogą wywoływać objawy na wszystkich częściach nadziemnych: liściach, łodygach, owocach i kwiatach. Oprócz upraw warzyw i roślin ozdobnych, mączniak występuje również w uprawach owoców jagodowych. Pomimo tego, że prawie każdą uprawę atakują inne gatunki grzybów chorobotwórczych, cechą wspólną mączniaków właściwych są białe, mączyste plamy, pojawiające się najczęściej na górnej stronie liści. Zwykle zaczynają się one pojawiać w dolnej części rośliny. Kiedy grzyb się rozprzestrzenia, może pokryć całą powierzchnię liścia, powodując żółknięcie i ostatecznie zasychanie. W przypadku bardzo silnego porażenia, objawy mogą pojawić się również na spodniej stronie liścia i w zależności od gatunku innych organach nadziemnych rośliny.

Septorioza liści wywoływana przez grzyb Zymoseptoria tritici jest obecnie najważniejszą chorobą pszenicy w Europie i jedną z najbardziej szkodliwych ekonomicznie chorób tej uprawy w Stanach Zjednoczonych. Choroba charakteryzuje się nekrotycznymi zmianami na liściach i łodygach, które rozwijają się po zapadnięciu się zainfekowanych komórek i rozpowszechniają się podczas chłodnej, wilgotnej pogody. Obecnie do zwalczania choroby stosuje się kilka fungicydów, jednakże wiele populacji Z ymoseptoria tritici szybko rozwinęło odporność na fungicydy. Są prowadzone badania nad zastosowaniem biologicznych środków, ale żaden nie jest jeszcze dostępny do produkcji komercyjnej.

Powodującego kiłę kapusty pierwotniaka Plasmodiophora brassicae można znaleźć na całym świecie we wszystkich strefach umiarkowanych. Zaraża ponad 300 gatunków w 64 rodzajach roślin krzyżowych, takich jak m.in. kapusta głowiasta, kapusta włoska, gorczyca, brukselka, rzodkiewka, rzodkiew, rzepa, kalafior, brokuły, rzepak i kalarepa. Jego szkodliwość zależy od odczynu gleby: im jest niższy, tym warunki do rozwoju patogena są korzystniejsze. Najszybciej do infekcji dochodzi przy pH 5,3-5,7, temperaturze gleby 18-26°C i wilgotności powyżej 70% maksymalnej pojemności wodnej. Na tempo porażenia roślin wpływ ma również rodzaj nawozów azotowych, jakich się używa podczas uprawy warzyw. Wapnowanie i podniesienie pH gleby do minimum 7, nie powoduje niszczenia zarodników kiły w glebie, ale jedynie zahamowane zostaje ich kiełkowanie. Na chwilę obecną nie ma żadnych zarejestrowanych chemicznych środków ochrony do bezpośredniego zwalczania kiły kapusty. Instytut Ochrony Roślin w Poznaniu przeprowadził badania nad różnymi metodami sterylizacji gleby w celu ograniczenia Plasmodiophora brassicae, które wykazały, że najskuteczniejszą metodą niszczenia zarodników jest spalanie gleby, autoklawowanie oraz działanie wysokiej temperatury, natomiast głębokie mrożenie zainfekowanej gleby było zupełnie nieskuteczne.

W ostatnich latach pojawiają się liczne doniesienia na temat stosowania w uprawie roślin bakterii z gatunku Bacillus amyloliquefaciens, występujący w glebach na całym świecie. Jak opisano m.in. w publikacji Helga George pt. „Use Bacillus Amyloliquefaciens to Organically Control Plant Disease” 2019 (gardenerspath.com), bakterie te hamują rozwój wielu patogenów roślin. W publikacji wymieniano patogeny roślin zwalczane przez Bacillus amyloliquefaciens takie jak m.in. glebowe patogeny grzybowe Fusarium, Pythium, Rhizoctonia, Phytophthora i Verticillium, dolistne - kilka rdzy, mączniak prawdziwy, mączniak rzekomy, Botrytis cinerea i Alternaria. Z kolei bakteryjne patogeny dolistne, które wskazano, to Pseudomonas syringae pv. tomato i Xanthomonas. W Kanadzie szczep Bacillus amyloliquefaciens został zarejestrowany do stosowania jako środek zapobiegawczy w zwalczaniu zarazy ogniowej.

Wynalazek opisany w dokumencie EP3383183 B1 dotyczy mieszanin szkodnikobójczych zawierających jako składniki czynne Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum szczep MBI600 zdeponowany w American Type Culture Collection (ATCC) nr SD-1414 (składnik A) i cis-jasmon (składnik B), przy czym stosunek Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum szczep MBI600 do cis-jasmonu wynosi od 10¹⁶ CFU :1 g do 105 CFU : 1 g. Wynalazek dotyczy także sposobu zwalczania szkodników, zwłaszcza nicieni.

Ze zgłoszenia EP3240405 A1 znana jest kompozycja obejmująca nowy szczep Bacillus amyloliquefaciens RTI301, zdeponowany w American Type Culture Collection (ATCC) nr PTA-121165, o aktywności promującej wzrost i aktywność przeciwko patogenom roślin. Nowy szczep może być stosowany w mieszaninie z innymi mikrobiologicznymi lub chemicznymi insektycydami, fungicydami, herbicydami, ekstraktami roślinnymi i regulatorami wzrostu roślin. Kompozycja ma postać płynu lub dyspersji olejowej, a szczep Bacillus amyloliquefaciens RTI301 jest obecny w stężeniu od około 1,0x108 CFU/ml do około 1,0x10¹² CFU/ml. Kompozycja może mieć także postać pyłu, suchego zwilżalnego proszku lub granulatu, a Bacillus amyloliquefaciens RTI301 jest obecny w ilości od ok. 1,0x108 CFU/g do około 1,0x10¹² CFU/g.

Z opisu patentowego EP3197280 B1 znany jest nowy szczep bakterii gatunku Bacillus amyloliquefaciens o numerze depozytu DSMZ 29231, który został zdeponowany w Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Szczep jest stosowany w prewencji i/lub terapii chorób roślin wywołanych przez patogeny takie jak grzyby i bakterie. Do najskuteczniej zwalczanych patogenów należy gatunek grzybów Ascomycetes Sclerotinia minor oraz gatunek bakterii Ralstonia solanacearum. W opisie przedstawiono wyniki badań w szklarni na sałacie zakażonej Sclerotinia minor oraz na pomidorach zakażonych Ralstonia solanacearum.

W opisie patentowym CN104988091B B ujawniono nowy szczep Bacillus amyloliquefaciens F1, zdeponowany w China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC) pod nr 10942, o wysokiej aktywności hamującej rozwój grzybów takich jak Aspergillus niger, Aspergillus albicans, Aspergillus parasiticus, Aspergillus flavus. Białka przeciwgrzybicze wytwarzane przez nowy szczep są zwłaszcza odporne na infekcje spowodowane przez pleśń czarnego pieprzu podczas jego przechowywania.

Wynalazek opisany w CN106635921B ujawnia nowy szczep bakterii Bacillus amyloliqueaciens Y15, zdeponowany w China General Microbiological Culture Collection Center (CGMCC) pod nr 13327 zapobiegający chorobom i wspomagający wzrost roślin. Nowy szczep korzystnie jest stosowany do zapobiegania i leczenia bakteryjnej plamistości arbuzów, wirusa żółtej kędzierzawki liści pomidora i koniczyny brzoskwiniowej oraz promowania wzrostu arbuza, pomidora, ogórka, ryżu, chryzantemy i in.

Z kolei z opisu patentowego CN112011477B znany jest nowy szczep Bacillus amyloliquefaciens N-22, zdeponowany w China Center for Type Culture Collection (CCTCC) pod nr M2020256 i jego zastosowania w zapobieganiu i leczeniu brunatnej zgnilizny brzoskwiń wywoływanej przez grzyba typu Monilinia fructicola. W celu przedłużania czasu przechowywania i utrzymywania świeżości brzoskwiń po zbiorze stosuje się płynne inokulum zawierające Bacillus amyloliquefaciens N-22 w ilości 10⁹~10¹⁰cfu/mL.

Jak opisano w innej publikacji, Lin Luo i in. pt.: „Bacillus amyloliquefaciens as an excellent agent for biofertilizer andbiocontrolin agriculture: An overview for its mechanisms, Microbiological Research, Vol. 259, June 2022, bakterie Bacillus amyloliquefaciens posiadają zdolność do promowania wzrostu roślin poprzez różne mechanizmy, m.in. zwiększanie dostępności składników odżywczych w glebie, w tym poprawa podaży azotu, solubilizacja nieorganicznych i organicznych fosforanów, udostępnianiu potasu z nierozpuszczalnych form, chelatowanie jonów żelaza, jak również zwiększanie odporności roślin na stresy biotyczne ze strony patogenów glebowych.

Fosfor jest bardzo ważnym makroskładnikiem odżywczym niezbędnym do wzrostu, poprawy zdrowotności i wysokiego plonowania roślin. Fosfor w glebie może występować w formie związków organicznych i mineralnych. Poszczególne związki fosforu charakteryzują się bardzo zróżnicowaną rozpuszczalnością w wodzie i w słabych kwasach a co za tym idzie różną dostępnością dla roślin. Zawartość w glebie rozpuszczalnych związków fosforu w słabych kwasach decyduje o dostępności tego minerału dla roślin. Dostępny dla roślin fosfor stanowi tylko od 2 do 10% fosforu ogólnego zawartego w glebie. Nawozy na bazie fosforanów są rutynowo stosowane do gleby w praktyce rolniczej. Zastosowany nawóz fosforowy może być jednak szybko unieruchamiany w wyniku reakcji strącania z glinem i wapniem znajdującymi się w glebie, przez co staje się niedostępny dla roślin, stanowiąc zapas tego składnika pokarmowego w glebie, o silnie ograniczonej dostępności dla roślin. Erozja gleby prowadzi również do utraty fosforu z gruntu, który zwykle gromadzi się w jeziorach i rzekach, powodując eutrofizację wód. Wykorzystanie drobnoustrojów mających zdolność do solubilizacji fosforu, czyli zwiększania jego rozpuszczalności, a co za tym idzie dostępności dla roślin w glebie, wydaje się być idealną alternatywą dla fosforowych nawozów mineralnych.

Potas zajmuje bardzo ważne miejsce w budowaniu plonu. Kluczową rolą tego pierwiastka jest odpowiedzialność za gospodarkę wodną rośliny, co jest istotne podczas okresów suszy. Poza tym uczestniczy również w regulacji pobierania azotu, a także jest ważnym elementem w budowaniu odporności na stresy. Jednak gleby w Polsce nie są bogate w przyswajalny potas i zajmują drugie miejsce po zakwaszeniu wśród czynników zmniejszających żyzność gleb, a także mających wpływ na uzyskiwane plony. Według danych GIOŚ z 2020 r. opisanych w programie „Monitoring chemizmu gleb ornych Polski, zawartość gleb w Polsce w przyswajalny potas, jest na średnim i niskim poziomie. Potas dla roślin spełnia wiele ważnych ról, z których do najważniejszych zalicza się udział w gospodarce wodnej roślin, co jest bardzo ważne w okresach deficytu wody, a właściwe odżywienie roślin tym pierwiastkiem zwiększa tolerancję na stres wodny. Rośliny dobrze odżywione tym pierwiastkiem wykorzystują mniej wody do budowy plonu, co jest szczególnie ważne w okresach suszy. U roślin dobrze odżywionych potasem występuje wyższe ciśnienie osmotyczne w komórkach, co jest korzystne z punktu widzenia mrozoodporności, a dzięki grubszym ścianom komórek źdźbła rośliny są mniej podatne na wylęganie. Potas jest odpowiedzialny także za transport substancji zapasowych do organów spichrzowych, co jest bardzo ważne w formowaniu organów zapasowych: korzeni, bulw i nasion. Aktywuje również enzymy w mitochondriach, co jest istotne z punktu odporności na stresy biotyczne i abiotyczne. Potas jest składnikiem koniecznym do syntezy białek, ponieważ potas odpowiada za prawidłową gospodarkę wodną co warunkiem efektywnego wykorzystania azotu.

W praktyce rolniczej coraz częściej używa się także nawozów na bazie krzemu. Krzem jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych pierwiastków na Ziemi. Stanowi około dwudziestu kilku procent litosfery, wchodzi w skład ponad 300 minerałów występujących w przyrodzie. Jest jednym z podstawowych składników gleb, gdyż jest składnikiem niemal wszystkich skał macierzystych, z których powstają gleby. W glebach klimatu umiarkowanego krzem zwykle występuje w fazie stałej gleby pod postacią minerałów pierwotnych i wtórnych (krzemiany i kwarc), niewielka ilość krzemu jest obecna w glebie pod postacią resztek roślin czy mikroorganizmów. Zawartość krzemu ogólnego w glebach jest bardzo wysoka, zazwyczaj wynosi około 30%. Pierwotnym źródłem krzemu dostępnego dla roślin w glebach są procesy wietrzenia pierwotnych i wtórnych krzemianów i glinokrzemianów, skały zawierające w swoim składzie minerały bogate w związki krzemu pod wpływem czynników środowiska ulegają wietrzeniu, co prowadzi do powstawania związków krzemu o różnym rodzaju krystalizacji oraz wolnej krzemionki. Rozpuszczalne w wodzie związki krzemu odgrywają ogromną rolę w procesie dostępności pewnych pierwiastków dla roślin z gleby. Wykorzystanie drobnoustrojów mających zdolność do solubilizacji Si, czyli zwiększania jego rozpuszczalności, a co za tym idzie dostępności dla roślin w glebie, wydaje się być wartościowym uzupełnieniem zawartości Si w glebach i roślinach.

W praktyce często bywa tak, że na roślinie występuje kilka patogenów jednocześnie. W takim przypadku, zastosowanie dostępnych rozwiązań może nieść za sobą konieczność stosowania w ochronie roślin kilka różnych preparatów, przeznaczonych dla zwalczania poszczególnych patogenów. Dodatkowo stosowane są także kolejne produkty, przeznaczone do biostymulacji wzrostu i rozwoju roślin. W konsekwencji prowadzi to do wzrostu kosztów ochrony roślin, a także do nadmiernej chemizacji środowiska naturalnego. Nieoczekiwanie problem ten został rozwiązany w niniejszym wynalazku.

Celem wynalazku jest wyizolowanie nowych szczepów bakterii z gatunku Bacillus amyloliquefaciens o tak szerokim działaniu, że jego wykorzystanie w uprawie roślin nie tylko chroni rośliny jednocześnie przed wieloma powszechnie występującymi agrofagami, ale także prowadzi do biostymulacji wzrostu i rozwoju roślin.

Istotą wynalazku jest szczep Bacillus amyloliquefaciens 8/6, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00390, w dniu 6 października 2021 r.

Istotą wynalazku jest szczep Bacillus amyloliquefaciens A12S3, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00391, w dniu 6 października 2021 r.

Istotą wynalazku jest również zastosowanie szczepów z gatunku Bacillus amyloliquefaciens, zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, w dniu 6 października 2021 r., wy

PL 247175 Β1 branych ze szczepów Bacillus amyloliquefaciens 8/6 nr depozytu B/00390 albo Bacillus amyloliguefaciens A12B nr depozytu B/00391, jako środka do biostymulacji wzrostu i rozwoju roślin oraz ochrony roślin przed agrofagami.

Korzystnie szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 albo Bacillus amyloliquefaciens A12B lub ich pochodne, takie jak zarodniki lub metabolity, aplikuje się: w postaci zawiesiny wodnej poprzez fertygację, oprysk dolistny, oprysk gleby, używa do zaprawiania nasion lub w formie stałej do aplikacji doglebowej.

Szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i Bacillus amyloliquefaciens A12B, będące przedmiotem wynalazku wyróżnia wszechstronność działania. Szczepy te wykazują właściwości biostymulujące m.in. poprzez solubilizację krzemu, potasu i fosforu. Każdy ze szczepów charakteryzuje się działaniem antagonistycznym jednocześnie względem wielu agrofagów powodujących choroby takie jak m.in. zgnilizna korzeni, ostra plamistość oczkowa, brunatna plamistość liści zbóż, fuzarioza, szara pleśń, septorioza liści, jak również kiła kapusty. Szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 oraz Bacillus amyloliquefaciens A12B mogą być stosowane do ochrony wielu gatunków roślin, takich zwłaszcza jak m.in. kapusta, papryka, truskawka, pszenica. Przeprowadzone badania wykazały, że zarówno szczep Bacillus amyloliquefaciens 8/6, jak i Bacillus amyloliquefaciens A12B wykazują wyjątkowo silne działanie antagonistyczne i skuteczność w supresji rozwoju grzybni względem co najmniej 15 testowanych roślinnych patogenów grzybowych. Ich zastosowanie pozwala na ograniczenie kosztów ochrony roślin, poprzez zmniejszenie ilości preparatów zwalczających różne patogeny występujące jednocześnie w tym samym okresie na roślinach, a przez to również pozwala unikać nadmiernej chemizacji roślin. Połączenie wyżej wspomnianych cech z wysoką trwałością i stabilnością tworzących spory bakterii z gatunku Bacillus amyloliquefaciens pozwala na uzyskanie preparatu, który oprócz szerokiego spectrum działania charakteryzuje się odpornością na warunki transportu i długim okresem stabilności podczas przechowywania.

W poniższych przykładach została przedstawiona charakterystyka szczepów Bacillus amyloliguefaciens 8/6 i Bacillus amyloliquefaciens A12B oraz wyniki badań, potwierdzające ich zdolność do solubilizacji fosforu, potasu i krzemu. Przedstawiono również wyniki badań potwierdzające właściwości antagonistyczne szczepów Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i Bacillus amyloliquefaciens A12B względem wybranych patogenów grzybowych, w przykładowych badaniach prowadzonych w testach laboratoryjnych oraz w doświadczeniach szklarniowych i polowych, w uprawach kapusty, papryki, truskawki i pszenicy. Przykładów tych nie należy traktować jako ograniczających istotę rozwiązania, czy zawężających zakres ochrony wynalazku, gdyż stanowią one jedynie jego ilustrację.

Przykład 1

Identyfikacja szczepu Bacillus amyloliguefaciens 8/6

Szczep Bacillus amyloliquefaciens 8/6 został zdeponowany zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu. Depozyt złożono w dniu 6 października 2021 r. Depozytowi nadano numer B/00390.

Izolacja kolonii szczepu Bacillus amyloliguefaciens 8/6

Szczep Bacillus amyloliguefaciens 8/6 został wyizolowany z gleby pozyskanej z pola uprawnego. Próbki gleby o masie 10 g zawieszano w 90 ml sterylnej wody destylowanej, po czym energicznie mieszano. Próbę ogrzewano w temperaturze 70°C przez 15 minut. Z uzyskanej zawiesiny przygotowano serię rozcieńczeń badanej próby (do 10 ⁹). Z każdego rozcieńczenia pobierano po 0,1 ml i wykonywano posiew powierzchniowy na zestalone podłoże 1/5 NPT. Skład pożywki NPT przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Składnik	Podłoże płynne	Podłoże stałe
Bulion odżywczy	o,4 g	0,4 g
Glukoza	1,0 g	1,0g
Trypsynowy hydrolizat sojowy	1,2 g	1,2 g
MES hydrate	2,o g	2,0 g
Agar	-	15,0 g
Woda	1,0 dm³	1,0 dm³

Wszystkie składniki pożywek rozpuszczano w H2O, doprowadzano do pH 5,75 i autoklawowano w temperaturze 121°C przez 15 min.

Płytki inkubowano w temperaturze 28°C przez 72 h. Pojedyncze kolonie posiewano redukcyjnie na odpowiednie podłoże stałe. Płytki inkubowano w temperaturze 28°C przez 72 h. Celem uzyskania czystych kolonii procedurę powtarzano kilkukrotnie.

Wyizolowane czyste kolonie Bacillus amyloliquefaciens przeniesiono do probówek zawierających pożywkę płynną NPT. Inkubowano je przez 24 h w temperaturze 28°C. Komórki przechowywano z wykorzystaniem gotowych kriofiolek (Microbank, Biocorp) przeznaczonych do przechowywania kultur bakteryjnych i grzybowych.

Oznaczenie przynależności gatunkowej szczepu Bacillus amyloliquefaciens 8/6

Przynależność gatunkową szczepu określono na podstawie analizy filogenetycznej przeprowadzonej na podstawie sekwencji:

A. genu kodującego 16S rRNA,

B. na podstawie analizy sekwencji całego genomu szczepu.

A. Analiza sekwencji genu 16S rRNA

Genomowe DNA z bakterii izolowano przy użyciu komercyjnego zestawu do izolacji DNA Genomie Mini AX Bacteria Kit (A&A Biotechnology, Polska), wg. instrukcji producenta. Jakość uzyskanych eluatów zawierających DNA oceniono spektrofotometrycznie za pomocą NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, USA).

Łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) przeprowadzono w objętości 10 gl mieszaniny reakcyjnej, zawierającej 0,2 gl polimerazy RUN wraz z 1 gl 10x stężonego buforu do polimerazy zapewnionego przez producenta (A&A Biotechnology), 0,2 gl każdego startera (Genomed S.A.), 1 gl zawierający mieszaninę 2 mM każdego deoksynukleotydowego trifosforanu (dATP, dGTP, dCTP i dTTP) (A&A Biotechnology), 50 ng matrycy genomowego DNA. Zawartość mieszaniny reakcyjnej uzupełniono ultraczystą wodą do objętości 10 gl. Reakcję PCR przeprowadzono w aparacie T Gradient Thermocycler (Biometra, Niemcy). Warunki reakcji amplifikacji zostały przeprowadzone w kolejnych etapach, rozpoczynając 10-minutową denaturacją w 94°C, następnie 35 cykli: 94°C przez 40 s, 50°C przez 40 s i 72°C przez 2 minuty i końcowy etap elongacji (72°C, 5 min).

Uzyskane produkty amplifikacji oraz wzorzec mas DNA (GeneRuler™ Express DNA Ladder; Thermo Scientific) naniesiono na 1,0% (w/v) żel agarozowy zawierający bromek etydyny. Rozdział przeprowadzono w buforze 1 x TBE (89 mM Tris-boranowy, 2 mM EDTA, pH 8,3) pod napięciem 100 mA. Produkty PCR uwidoczniono przez oświetlenie żelu lampą UV.

DNA z żelu izolowano przy użyciu komercyjnego zestawu do izolacji DNA z żeli agarozowych Gel out. W tym celu wycięto kawałek żelu zawierający właściwy produkt reakcji PCR, zawieszono w 0,4 ml R7S i inkubowano w 50°C do całkowitego rozpuszczenia agarozy. Następnie dodano 0,2 ml izopropanolu i wymieszano. Całość przeniesiono na minikolumnę do oczyszczania DNA i zwirowano (12000xg, 30 s), a następnie 2-krotnie przemyto roztworem płuczącym A1. DNA eluowano przy użyciu 30 gl wody. Jakość uzyskanych eluatów zawierających DNA oceniono spektrofotometrycznie za pomocą NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, USA).

Sekwencjonowanie produktów reakcji PCR przeprowadzono w Genomed S.A. (Warszawa). Uzyskane sekwencje DNA porównano z bazą sekwencji 16S rRNA za pomocą programu BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Identyfikacja przeprowadzona na podstawie sekwencji genu 16S rRNA pozwoliła na klasyfikację badanych izolatów do rodzaju Bacillus.

B. Sekwencjonowanie genomu i analiza

Analiza sekwencji całego genomu zostało przeprowadzone przez firmę Genomed S.A. W tym celu pobrano materiał z 18 godzinnej hodowli bakterii na pożywce NB (Nutrient Bulion; BTL sp. z o.o.). DNA izolowano przez firmę A&A Biotechnology, zestawem Genomic Mini AX Bacteria + do izolacji DNA z bakterii wg. instrukcji producenta (A&A Biotechnology, Polska).

Genomowe DNA zostało pofragmentowane metodą sonikacji używając Covaris E210 (Covaris), zgodnie z parametrami zalecanymi do przygotowania bibliotek do sekwencjonowania w technologii Illumina. Biblioteki zostały przygotowane z użyciem zestawu NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina® (New England Biolabs, E7645L) zgodnie z zaleceniami producenta. Sekwencjonowanie MiSeq wykonano w technologii sparowanych końców (ang.: paired-end; PE), 2x300nt, z użyciem kitu MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) (Illumina), zgodnie z protokołem. Odczyty z MiSeq przefiltrowano pro8 gramem Cutadapt w wersji 3.0. Kontrolę jakości wyników sekwencjonowania przeprowadzono z wykorzystaniem programu FastQC. Analizy dały 1 194 104 surowych odczytów i 1 179 656 sekwencji po przycięciu. Analiza bioinformatyczna została przeprowadzona z wykorzystaniem pakietu Bactopia w wersji 2.1.0. Składanie de novo wykonano programem Shovill z programem Skesa jako głównym programem składającym. Pozwoliło to na złożenie de novo sekwencji o długości 3 863 919 bp. Wybór genomu referencyjnego został wykonany na podstawie MinHash z wykorzystaniem pakietu sourmash. Najbardziej podobnym szczepem do próbki 8/6 z bazy danych NCBI okazał się szczep Bacillus amyloliquefaciens CC178 (NC_022653.1). Podobieństwo pomiędzy tymi szczepami wynosi 99,99%.

Przykład 2

Identyfikacja szczepu Bacillus amyloliquefaciens A12B

Szczep Bacillus amyloliquefaciens A12B został zdeponowany zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu. Depozyt złożono w dniu 6 października 2021 r. Depozytowi nadano numer B/00391.

Izolacja kolonii szczepu Bacillus amyloliquefaciens A12B

Szczep Bacillus amyloliquefaciens A12B został wyizolowany z gleby pozyskanej z pola uprawnego w taki sam sposób jak szczep Bacillus amyloliquefaciens 8/6, który został opisany w przykładzie 1.

Oznaczenie przynależności gatunkowej szczepu Bacillus amyloliquefaciens A12B

A. genu kodującego 16S rRNA,

B. na podstawie analizy sekwencji całego genomu szczepu.

A. Analiza sekwencji genu 16S rRNA

Łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) przeprowadzono w objętości 10 μl mieszaniny reakcyjnej, zawierającej 0,2 μl polimerazy RUN wraz z 1 μl 10x stężonego buforu do polimerazy zapewnionego przez producenta (A&A Biotechnology), 0,2 μl każdego startera (Genomed S.A.), 1 μl zawierający mieszaninę 2 mM każdego deoksynukleotydowego trifosforanu (dATP, dGTP, dCTP i dTTP) (A&A Biotechnology), 50 ng matrycy genomowego DNA. Zawartość mieszaniny reakcyjnej uzupełniono ultraczystą wodą do objętości 10 μΚ Reakcję PCR przeprowadzono w aparacie T Gradient Thermocycler (Biometra, Niemcy). Warunki reakcji amplifikacji zostały przeprowadzone w kolejnych etapach, rozpoczynając 10-minutową denaturacją w 94°C, następnie 35 cykli: 94°C przez 40 s, 50°C przez 40 s i 72°C przez 2 minuty i końcowy etap elongacji (72°C, 5 min).

DNA z żelu izolowano przy użyciu komercyjnego zestawu do izolacji DNA z żeli agarozowych Gel out. W tym celu wycięto kawałek żelu zawierający właściwy produkt reakcji PCR, zawieszono w 0,4 ml R7S i inkubowano w 50°C do całkowitego rozpuszczenia agarozy. Następnie dodano 0,2 ml izopropanolu i wymieszano. Całość przeniesiono na minikolumnę do oczyszczania DNA i zwirowano (12000xg, 30 s), a następnie 2-krotnie przemyto roztworem płuczącym A1. DNA eluowano przy użyciu 30 μl wody. Jakość uzyskanych eluatów zawierających DNA oceniono spektrofotometrycznie za pomocą NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, USA).

B. Sekwencjonowanie genomu i analiza

Analiza sekwencji całego genomu zostało przeprowadzone przez firmę Genomed S.A. W tym celu pobrano materiał z 18 godzinnej hodowli bakterii na pożywce NB (Nutrient Bulion; BTL sp. z o.o.).

PL 247175 Β1

DNA izolowano przez firmę A&A Biotechnology, zestawem Genomie Mini AX Bacteria + do izolacji DNA z bakterii wg. instrukcji producenta (A&A Biotechnology, Polska).

Genomowe DNA zostało pofragmentowane metodą sonikacji używając Covaris E210 (Covaris), zgodnie z parametrami zalecanymi do przygotowania bibliotek do sekwencjonowania w technologii lllumina. Biblioteki zostały przygotowane z użyciem zestawu NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit for Illumina® (New England Biolabs, E7645L) zgodnie z zaleceniami producenta. Sekwencjonowanie MiSeq wykonano w technologii sparowanych końców (ang.: paired-end; PE), 2x300nt, z użyciem kitu MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) (lllumina), zgodnie z protokołem. Odczyty z MiSeq przefiltrowano programem Cutadapt w wersji 3.0. Kontrolę jakości wyników sekwencjonowania przeprowadzono z wykorzystaniem programu FastOC. Analizy dały 1 027 332 surowych odczytów i 1 013 656 odczytów po przycięciu. Analiza bioinformatyczna została przeprowadzona z wykorzystaniem pakietu Bactopia w wersji 2.1.0. Składanie de novo wykonano programem Shovill z programem Skesa jako głównym programem składającym. Pozwoliło to na złożenie de novo sekwencji o długości 4 035 409 bp. Wybór genomu referencyjnego został wykonany na podstawie MinHash z wykorzystaniem pakietu sourmash. Najbardziej podobnym szczepem do próbki A12B z bazy danych NCBI okazał się szczep Bacillus amyloliquefaciens CC178 (NC_022653.1). Podobieństwo pomiędzy tymi szczepami wynosi 100%.

Przykład 3

Ocenę zdolności szczepów Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i Bacillus amyloliquefaciens A12B do solubilizacji nierozpuszczonych form fosforu przeprowadzono za pomocą metody płytkowej na podłożu stałym NBRIP z fosforanem wapnia (pH 7,0). Badania prowadzono równolegle dla każdego szczepu. Skład jakościowy i ilościowy podłoża stałego NBRIP przedstawiono w tabeli 2.

Tabela 2

Składnik	Ilość, g
Glukoza	10,00
Cas(PO4)2	5,00
MgCI₂*6H₂O	5,00
MgSO₄‘7H₂O	0,25
(NH₄)₂SO4	0,10
KCI	0,20
Agar	15,00
Woda destylowana	1,00 dm³

Szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i Bacillus amyloliquefaciens A12B namnażano oddzielnie na podłożu TSB (bulion kazeinowo-sojowy zawierający: pepton kazeinowy -17g/l, pepton sojowy — 3g/l, NaCI - 5g/l, KH2PO4 - 2,5g/l, glukozę χ H2O - 2,5g/l), w temperaturze 30°C przez 24 godziny. Na zestalone podłoże NBRIP nanoszono 10 μΙ inokulum o wystandaryzowanej gęstości optycznej 1x10⁹jtk/ml. Średnicę halo (strefę przejaśnienia) wyrosłej kolonii mierzono po 14 dniach inkubacji płytek w 30°C. Pojawienie się średnicy halo wokół wyrosłej kolonii świadczyło o zdolności mikroorganizmu do solubilizacji fosforu.

Ilościowe oznaczanie zdolności szczepów do solubilizacji fosforu prowadzono na płynnym podłożu NBRIP. Skład jakościowy i ilościowy tego podłoża przedstawiono w tabeli 3.

Tabela 3

Składnik	Ilość, g
Glukoza	10,00
CagiPCU)?	5,00
MgCI₂*6H₂O	5,00
MgSO4*7H₂O	0,25
(NhhhSCU	0,10
KCI	0,20
Woda destylowana	1,00 dm³

PL 247175 Β1

Szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i Bacillus amyloliquefaciens A12B namnażano oddzielnie na podłożu TSB w 30°C przez 24 godziny. Następnie 5 ml hodowli inokulacyjnej odwirowano, a uzyskaną biomasę zawieszono w 0,85% NaCI, tak aby uzyskać gęstość optyczną około 1x10⁹ jtk/ml. 50 ml wysterylizowanego podłoża zaszczepiono 500 μΙ inokulum. Dodatkowo przygotowano próbę kontrolną tj. pożywkę niezaszczepioną. Hodowle inkubowano w 30°C z wytrząsaniem przez 48 godzin. Hodowle następnie odwirowano (4600 rpm, 20 minut), osad odrzucano i w supernatancie oznaczano ortofosforany (PO4³) za pomocą testów kuwetowych do oznaczania fosforanów firmy Merck (1.00673). Stężenie PO4³· mierzono za pomocą spektrofotometru Spectroquant Pharo 100/300 dedykowanego do badań prowadzonych z użyciem testów kuwetowych. W wyniku przeprowadzonego doświadczenia zaobserwowano, że szczep 8/6 zsolubilizował 52,3 mg (+/- 0,6) PO4³·, natomiast szczep A12B zsolubilizował 45,2 mg (+/- 0,6) PC>4³ w 1 litrze pożywki.

Przykład 4

Przeprowadzono ocenę zdolności szczepów Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i Bacillus amyloliquefaciens A12B do solubilizacji zimmobilizowanych form potasu, w teście jakościowym na podłożu stałym. Badania prowadzono równolegle dla każdego szczepu. Pojawienie się strefy przejaśnienia wokół wyrosłej kolonii świadczyło o zdolności analizowanego szczepu do udostępniania nierozpuszczalnych form potasu. Jako źródło nierozpuszczalnego potasu zastosowano Muskowit Mica - minerał z grupy krzemianów, zasadowy glinokrzemian potasu i glinu. Skład jakościowy i ilościowy tego podłoża przedstawiono w tabeli 4.

Tabela 4

Składnik	Ilość, g
Glukoza	5,000
MgSO₄*7H₂O	0,500
CaCO₃	0,100
FeCb	0,005
Cas(PO₄)2	2,000
Muskowit Mica	2,000
Agar	20,000
Woda destylowana	1,000 dm³

Szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i Bacillus amyloliquefaciens A12B namnażano oddzielnie na podłożu TSB, w temperaturze 30°C przez 24 godziny. Po okresie inkubacji hodowle zatężono 2-krotnie, a uzyskaną zawiesinę bakterii (10 μΙ) nanoszono na zestalone podłoże. Płytki inkubowano w temperaturze 30°C przez 96 h. Pojawienie się strefy przejaśnienia wokół wyrosłej kolonii świadczyło o zdolności mikroorganizmu do solubilizacji potasu.

Oznaczenie ilościowe solubilizacji potasu prowadzono na płynnym podłożu Aleksandrova. Skład jakościowy i ilościowy tego podłoża przedstawiono w tabeli 5.

Tabela 5

Składnik	Ilość, g
Glukoza	5,000
MgSOZ7H_?O	0,500
CaCOs	0,100
FeCb	0,005
Ca3(PO₄)2	2,000
Muskowit Mica	2,000
Woda destylowana	1,000 dm³

PL 247175 Β1

Szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i Bacillus amyloliquefaciens A12B namnażano oddzielnie na podłożu TSB, w 30°C przez 24 godziny. Następnie 5 ml hodowli inokulacyjnej odwirowano, a uzyskaną biomasę zawieszono w 0,85% NaCI, tak, aby uzyskać gęstość optyczną około 3x10⁸ jtk/ml. 50 ml wysterylizowanego podłoża zaszczepiono 2,5 ml inokulum. Dodatkowo przygotowano próbę kontrolną tj. pożywkę niezaszczepioną. Hodowle inkubowano w 30°C z wytrząsaniem przez 5 dni. Hodowle następnie odwirowano (4600 rpm, 20 minut), osad odrzucono i w supernatancie oznaczano potas za pomocą testów kuwetowych do oznaczania potasu firmy Merck (nr 1.14562). Stężenie K⁺ mierzono za pomocą spektrofotometru Spectroquant Pharo 100/300 dedykowanego do badań prowadzonych z użyciem testów kuwetowych.

W wyniku przeprowadzonego doświadczenia zaobserwowano, że szczep 8/6 zsolubilizował 2,67 mg (+/-0,058) K⁺, natomiast szczep A12B zsolubilizował 2,37 mg (+/-0,028) K⁺w 1 litrze pożywki.

Przykład 5

Zdolność szczepów Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i Bacillus amyloliquefaciens A12B do solubilizacji zimmobilizowanych form krzemu badano za pomocą metody płytkowej na podłożu stałym ztrikrzemianem magnezu. Badania prowadzono równolegle dla każdego szczepu. Skład jakościowy i ilościowy podłoża stałego z trikrzemianem magnezu przedstawiono w tabeli 6.

Tabela 6

Składnik	Ilość, g
Glukoza	10,0
(NH₄)₂SO4	1,0
KCI	0,2
K₂HPO₄	0,1
MgSOą	0,2
MgaOsSb	2,5
Agar	15,0
Woda destylowana	1,0 dm³

Szczepy namnażano oddzielnie na podłożu TSB, w temperaturze 30°C przez 24 godziny. Po okresie inkubacji hodowle zatężono 2-krotnie, a uzyskaną zawiesinę bakterii (10 μΙ) nanoszono na zestalone podłoże. Płytki inkubowano w temperaturze 30°C przez 96 h. Pojawienie się strefy przejaśnienia wokół wyrosłej kolonii świadczyło o zdolności badanego mikroorganizmu do solubilizacji krzemu.

Oznaczenie ilościowe solubilizacji krzemu prowadzono na płynnym podłożu z trikrzemianem magnezu. Skład jakościowy i ilościowy tego podłoża przedstawiono w tabeli 7.

Tabela 7

Składnik	Ilość, g
Glukoza	10,0
(ΝΗ₄)₂δΟ₄	1,0
KCI	0,2
K2HPO4	0,1
MgSO₄	0,2
MgjOgSis	2,5
Woda destylowana	1,0 dm³

Szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i Bacillus amyloliquefaciens A12B namnażano oddzielnie na podłożu TSB, w 30°C przez 24 godziny. Następnie 5 ml hodowli inokulacyjnej odwirowano, a uzyskaną biomasę zawieszono w 0,85% NaCI, tak, aby uzyskać gęstość optyczną około 3x10⁸ jtk/ml.

PL 247175 Β1

100 ml wysterylizowanego płynnego podłoża zaszczepiono 2 ml inoculum. Dodatkowo przygotowano próbę kontrolną, tj. pożywkę niezaszczepioną. Hodowle inkubowano w 30°C z wytrząsaniem przez 5 dni. Hodowle następnie odwirowano (4600 rpm, 20 minut), osad odrzucono i w supernatancie oznaczano zawartość krzemu za pomocą testów kuwetowych do oznaczania kwasu krzemowego firmy Merck (1.00857). Stężenie S1O2 mierzono za pomocą spektrofotometru Spectroquant Pharo 100/300 dedykowanego do badań prowadzonych z użyciem testów kuwetowych. W wyniku przeprowadzonego doświadczenia zaobserwowano, że szczep 8/6 zsolubilizował 41,3 mg (+/- 0,2) S1O2, natomiast A12B zsolubilizował 39,3 mg (+/- 0,2) S1O2 w 1 litrze pożywki.

Przykład 6

Szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 oraz Bacillus amyloliquefaciens A12B zastosowano w uprawie kapusty, papryki i pszenicy oraz przeprowadzono badania w kierunku właściwości biostymulujących wzrost i rozwój tych roślin.

Doświadczenie szklarniowe na kapuście i papryce - aplikacja przez fertygację

Nasiona kapusty głowiastej białej odm. Jaguar F1 wysiano do multiplatów. Rośliny podlano w multiplatach 2-krotnie zawiesiną zawierającą: jedna szczep Bacillus amyloliquefaciens 8/6, a druga Bacillus amyloliquefaciens Α12B, każdy w ilości 10⁸ jtk/ml, w dniu siewu oraz 7 dni przed wysadzeniem roślin do ziemi sztucznie zasiedlonej przez Plasmodiophora brassicae. Kombinacje kontrolne podlewano wodą. Badania prowadzono równolegle dla każdego szczepu. Doświadczenie założono w 4 powtórzeniach, jedno powtórzenie obejmowało 5 roślin. Po 7 i 11 tygodniach od przesadzenia roślin do zakażonego podłoża oceniono świeżą masę części nadziemnej i korzeni (tabela 8). Standard IR to komercyjny środek ochrony roślin. Wyniki zebrane w tabeli 8 wykazały, że 8/6 i A12B wpływają na zwiększenie masy kapusty. Szczepy 8/6 i A12B zwiększyły biomasę kapusty o 25%.

Tabela 8

Kombinacja	Biomasa roślin kapusty (część nadziemna + korzenie), g
Kontrola	53,26
8/6	70,55
A12B	71,08
Standard IR	47,98

Nasiona papryki odmiany Robertina wysiano do skrzynek wysiewnych, a następnie rośliny przepikowano do multiplatów. Rośliny podlano zawiesiną zawierającą: jedna szczep Bacillus amyloliquefaciens 8/6, a druga Bacillus amyloliquefaciens Α12B, każdy w ilości 10⁸ jtk/ml, 10 dni przed ich wysadzeniem do zakażonego przez Fusarium oxysporum podłoża (sztuczna inokulacja). Następnie dokonano 2 kolejnych aplikacji: 24 godziny i 12 dni po posadzeniu do podłoża. Badania prowadzono równolegle dla każdego szczepu. Doświadczenie założono w 4 powtórzeniach, jedno powtórzenie obejmowało 5 roślin. Po miesiącu od przesadzenia roślin do zakażonego podłoża zakończono doświadczenie i oceniono świeżą i suchą masę części nadziemnej i korzeni. Parametry biometryczne roślin papryki traktowanych szczepami Bacillus amyloliquefaciens 8/6 oraz Α12B w dniu zakończenia doświadczenia przedstawiono w tabeli 9. Kontrolę stanowiła woda, a Standard IR to komercyjny środek ochrony roślin.

Tabela 9

Kombinacja	Dawka	Masa roślin, q
Świeża masa części nadziemnej	Sucha masa części nadziemnej	Świeża masa korzeni	Sucha masa korzeni
Kontrola	-	16,84	2,42	3,65	0,47
8/6	1 aplikacja: 5 ml zawiesiny na 1 litr wody/taca multiplatu, 2 i 3 aplikacja: 2,5 ml zawiesiny na 2 litry wody/100 ml na roślinę	37,62	4,51	6,95	0,94
A12B	jw.	19,84	3,27	5,42	0,77
Standard IR	1 aplikacja: 0,5 g preparatu/1 litr wody/taca zawiesiny, 2 i 3 aplikacja: 1 g zawiesiny na 2 litry wody/100 ml na roślinę	25,81	3,67	6,83	0,89

PL 247175 Β1

Wyniki doświadczenia potwierdzają, że zastosowanie szczepów Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i A12B przyczyniło się do zwiększenia świeżej i suchej masy części nadziemnej i korzeni papryki.

Doświadczenie połowę na pszenicy jarej - aplikacja przez oprysk dolistny

Szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 oraz Bacillus amyloliquefaciens A12B zostały przetestowane w doświadczeniu poletkowym. Pszenicę jarą wysiano na poletka doświadczalne o powierzchni 15 m². Doświadczenie prowadzono w układzie bloków losowanych w 4 powtórzeniach. Zawiesinę zawierającą: jedna szczep Bacillus amyloliquefaciens 8/6, a druga Bacillus amyloliquefaciens Α12B, każdy w ilości 10⁸ jtk/ml, aplikowano dolistnie stosując 4 l/ha cieczy roboczej. Badania prowadzono równolegle dla każdego szczepu. Kontrola opryskiwana była wodą. W tabeli 10 przedstawiono ocenę zachowanej powierzchni asymilacyjnej liści pszenicy jarej oraz wielkość plonu. Kontrolę stanowiła woda, a Standard I to komercyjny środek ochrony roślin.

Tabela 10

Kombinacje doświadczalne	Dawka na ha	Zachowana powierzchnia asymilacyjna liści flagowych w BBCH 73-75	Plon, t/ha
Kontrola	woda	85,50	6,06
8/6	4I	92,75	6,23
A12B	4I	94,75	6,26
Standard I	1 I	96,25	6,20

Wyniki doświadczenia potwierdzają, że zastosowanie szczepów Bacillus amyloliquefaciens 8/6 oraz A12B ograniczało porażenie roślin przez choroby grzybowe, przez co powierzchnia asymilacyjna liścia (prowadzenie fotosyntezy) była największa. Ponadto aplikacja dolistna szczepów przyczyniła się do zwiększenia plonu pszenicy jarej o 3% w porównaniu do kontroli. Przeprowadzone badania potwierdziły, że szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i A12B wykazują właściwości biostymulujące wzrost i rozwój roślin uprawnych.

Przykład 7

Określenie właściwości antagonistycznych szczepów Bacillus amyloliguefaciens 8/6 i Bacillus amyloliguefaciens A12B względem wybranych patogenów grzybowych.

Antagonizm względem patogenów grzybowych przeprowadzono w testach laboratoryjnych. Badania prowadzono równolegle dla każdego szczepu. Na szalki z agarem PDA (Potato-Dextrose Agar), w odległości 2 cm od krawędzi, nakładano krążek z grzybnią, wycięty przy użyciu korkoboru. Izolaty grzybowe inkubowano w temperaturze standardowej przez okres od 1-5 dni, do momentu aż grzybnia dochodziła do środka szalki. Następnie w odległości 5 cm od krążka z grzybnią rozprowadzano świeżą zawiesinę bakterii o objętości 10 μΙ. Szalki inkubowano następnie w temperaturze pokojowej przez 14 dni, wykonując odczyt po 7 i 14 dniach. Działanie antagonistyczne określano na podstawie wystąpienia (bądź nie) strefy zahamowania wzrostu grzybni w obszarze wzrostu bakterii. Do testów wykorzystano 15 izolatów patogenów:

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

15.

Numer kolekcji Numer kolekcji Numer kolekcji Numer kolekcji Numer kolekcji Numer kolekcji Numer kolekcji Numer kolekcji Numer kolekcji Numer kolekcji Numer kolekcji Numer kolekcji Numer kolekcji Numer kolekcji Numer kolekcji

OR: 1089 Gatunek patogena: Mycosphaerella fragariae

OR: 59 Gatunek patogena: Rhizoctonia cerealis

OR: 2029 Gatunek patogena: Fusarium oxysporum

OR: 2160 Gatunek patogena: Fusarium solani

OR: 2105 Gatunek patogena: Fusarium culmorum

OR: 1715 Gatunek patogena: Phytophtora cactorum

OR: 2207 Gatunek patogena: Phytophthora nicotianae

OR: 1664 Gatunek patogena: Helminthosporium solani

OR: 2369 Gatunek patogena: Phytium ultimum

OR: 2227 Gatunek patogena: Botrytis allii

OR: 2299 Gatunek patogena: Botrytis cinerea

OR: 2233 Gatunek patogena: Alternaria brassicae

OR: 1548 Gatunek patogena: Alternaria dauci

OR: 2046 Gatunek patogena: Alternaria solani

OR: 2157 Gatunek patogena: Colletotrichum acutatum

PL 247175 Β1

W wyniku przeprowadzonych doświadczeń wykazano działanie antagonistyczne obu szczepów Bacillus amyloliquefaciens 8/6 oraz A12B względem każdego z ww. 15 testowanych patogenów grzybowych. Inhibicja wzrostu grzybni w każdym przypadku następowała kilkanaście, a nawet kilkadziesiąt mm przed miejscem wzrostu bakterii, co świadczy o wyjątkowo silnym działaniu antagonistycznym szczepów Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i A12B.

Przykład 8

Zastosowanie szczepu Bacillus amyloliguefaciens 8/6 do ochrony pszenicy ozimej przed zgnilizna korzeni powodowana przez grzyba Pythium ultimum oraz ostra plamistością oczkową powodowana przez grzyba Rhizictonia cerealis.

W wazonowych doświadczeniach z zaprawianiem ziarna pszenicy ozimej odmiany Fidelius, oceniono wpływ jej zaprawiania na występowanie Pythium ultimum i Rhizictonia cerealis. Ziarno pszenicy zostało zaprawione szczepem Bacillus amyloliquefaciens 8/6 (zawiesina wodna zawierająca Bacillus amyloliquefaciens 8/6 w ilości 10⁸ jtk/ml). Podłoże przed siewem było sztucznie inokulowane patogenami grzybowymi. Każda kombinacja była rozlosowana w 4 powtórzeniach, jedno powtórzenie stanowiła 1 doniczka, w której wysiano 50 ziaren pszenicy. Wpływ zaprawiania ziarna pszenicy szczepem Bacillus amyloliquefaciens 8/6 na ograniczenia porażenia przez Pythium i Rhizictonia zobrazowano w tabeli 11. Kontrolę stanowiła woda, a Standard I to komercyjny środek ochrony roślin.

Tabela 11

Kombinacje	Dawka preparatu użyta do zaprawiania	Pythium ultimum	Rhizictonia cerealis
% Porażenia	% Skuteczności	% Porażenia	% Skuteczności
Kontrola	-	11,2	-	33	-
8/6	200 ml/100 kg ziarna	3,0	73	9	72
Standard I	66,7 ml/100 kg ziarna	0,6	94	1	96

Zaobserwowano, że nowy szczep 8/6 wykazuje wysoką skuteczność (powyżej 70%) w ograniczeniu porażenia siewek pszenicy ozimej przez Pythium ultimum oraz Rhizoctonia cerealis, w porównaniu do obiektu kontrolnego.

Przykład 9

Zastosowanie szczepów Bacillus amyloliguefaciens 8/6 i Bacillus amyloliguefaciens A12B do ochrony papryki przed fuzarioza powodowana przez grzyba Fusarium oxysporum.

Ocenę skuteczności szczepów Bacillus amyloliguefaciens 8/6 i Bacillus amyloliguefaciens A12B w ograniczaniu fuzariozy papryki przeprowadzono w doświadczeniu szklarniowym. Rośliny papryki odmiany Robertina podlano 5 ml zawiesiny wodnej zawierającej: jedna szczep Bacillus amyloliguefaciens 8/6, a druga Bacillus amyloliguefaciens A12B, każdy w ilości 1 -10⁸ jtk/ml, na 10 dni przed ich wysadzeniem do sztucznie zakażonego przez patogena Fusarium oxysporum podłoża. Następnie dokonano 2 kolejnych aplikacji używając 1 ml zawiesiny wodnej zawierającej szczep 8/6 lub 1 ml zawiesiny wodnej zawierającej szczep A12B, w odstępach 7-14 dni. Doświadczenie założono w czterech powtórzeniach po 5 roślin w układzie bloków losowanych. W tabeli 12 pokazano wpływ szczepów Bacillus amyloliguefaciens 8/6 oraz A12B na ograniczenie porażenia roślin papryki przez Fusarium oxysporum. Kontrolę stanowiła woda, a Standard I to komercyjny środek ochrony roślin.

Tabela 12

Kombinacja	Dawka	Liczba roślin z objawami fuzariozy/ skuteczność [%]
7 dni po 3 aplikacji	Skuteczność, %	14 dni po 3 aplikacji	Skuteczność, %	21 dni po 3 aplikacji	Skuteczność, %
Kontrola	-	2,0	-	2,75	-	3.5
8/6	51/ha	0,25	87,5%	0,25	90,9%	1,5	57,1%
Α12Ξ	51/ha	1,25	37,5%	2,5	9,1%	3,25	7,1%
Standard I	0,1 kg/ha	0,5	75%	1,25	54,5%	3,5	-

PL 247175 Β1

Uzyskane wyniki potwierdzają, że szczep Bacillus amyloliquefaciens 8/6 skutecznie ograniczył porażenie roślin przez Fusarium oxysporum -14 dni po 3 aplikacji skuteczność wynosiła powyżej 90%, znacznie więcej niż zastosowany środek referencyjny Standard I. Była to najwyższa skuteczność w całym doświadczeniu. Ponadto szczep Bacillus amyloliquefaciens 8/6 spowodował zwiększenie świeżej i suchej masy części nadziemnej i korzeni papryki, co pokazano już w tabeli 8 z przykładu 6. Natomiast szczep Bacillus amyloliquefaciens A12B nie okazał się być aż tak skuteczny jak szczep 8/6 i podczas pierwszej oceny wykazał skuteczność na poziomie około 40%, a w kolejnych ocenach skuteczność spadła, jednakże podobnie jak szczep Bacillus amyloliquefaciens 8/6, także szczep A12B zwiększył masę roślin papryki w porównaniu do kontroli.

Przykład 10

Zastosowanie szczepów Bacillus amyloliguefaciens 8/6 i Bacillus amyloliguefaciens A12B do ochrony truskawki przed szara pleśnią powodowana przez grzyba Botrytis cinerea.

Ocenę skuteczności szczepów Bacillus amyloliguefaciens 8/6 oraz A12B w ograniczaniu szarej pleśni truskawki przeprowadzono w doświadczeniu polowym poprzez oprysk dolistny.

Szczepy Bacillus amyloliguefaciens 8/6 i A12B, w doświadczeniu polowym w uprawie truskawki aplikowane były dolistnie cztery razy od fazy początku kwitnienia co 7-10 dni. W każdej aplikacji stosowano dawkę 4 I zawiesiny wodnej zawierającej: jedna szczep Bacillus amyloliguefaciens 8/6, a druga Bacillus amyloliguefaciens Α12B, każdy w ilości 1 · 10⁸ jtk/ml na 1 ha. Doświadczenie założono w układzie bloków losowanych w czterech powtórzeniach. Badania prowadzono równolegle dla każdego szczepu. Średni procent porażenia powierzchni owoców truskawki oraz skuteczność działania szczepów 8/6 i A12B w ochronie truskawki przed Botrytis cinerea pokazano w tabeli 13. Kontrolę stanowiła woda, a Standard I to komercyjny środek ochrony roślin.

Tabela 13 % Porażonych owoców/% Skuteczność

Dawka

Kombinacja	l/ha	10 dni po 1 aplikacji	7 dni po 2 aplikacji	7 dni po 3 aplikacji	14 dni po 3 aplikacji	7 dni po 4 aplikacji
Kontrola	-	39	-	29	-	25	-	32	-	63	-
^8/6	4	26	33	20	31	12	52	24	25	51	19
A12B	4	23	41	23	21	19	24	12	63	45	29
Standard I	1,25	24	38	23	21	25		14	56	41	35

Skuteczność szczepu 8/6 przez pierwsze 17 dni trwania doświadczenia kształtowała się na poziomie około 30%. Najwyższą jego skuteczność przeciwko Botrytis cinerea stwierdzono 7 dnia po 3 aplikacji i wyniosła 52%. Skuteczność szczepu A12B 10 dni po 1 aplikacji była najwyższa w całym doświadczeniu w kolejnych dwóch ocenach skuteczność spadła do 20%, jednakże 14 dni po 3 aplikacji skuteczność szczepu wynosiła 62% i była najwyższa w całym doświadczeniu.

Dodatkowo, w trakcie trwania doświadczenia, 3-krotnie zebrano owoce, które zostały następnie umieszczone w temperaturze 5°C na 5 dni. Po tym czasie wyciągnięto truskawki i w 5-cio stopniowej skali (0 - brak uszkodzeń, 1 - pojedyncze brązowe plamy, 2 - widoczne liczne brązowe plamy, 3 -mokre plamy, 4 - widoczna pleśń, 5-50% owocu pokryte pleśnią) oceniono uszkodzenia owoców spowodowane przez szarą pleśń. Każdorazowo ocenę prowadzono na 2 kg próbie owoców. W tabeli 14 przedstawiono wpływ aplikacji zawiesin wodnych zawierających szczepy Bacillus amyloliguefaciens 8/6 albo A12B na trwałość owoców truskawki. W każdym z 3 zbiorów po 5 dniowym okresie przetrzymywania owoców w 5°C, najwięcej truskawek bez lub z niewielkimi objawami

PL 247175 Β1 uszkodzeń (zakwalifikowanych w 5-stopniowej skali jako 0 i 1 ) było w kombinacji traktowanej dolistnie zawiesiną wodną zawierającą szczep Bacillus amyloliquefaciens w ilości 1 · 10⁸ jtk/ml. Dla kombinacji taktowanej szczep Bacillus amyloliquefaciens 8/6 było najmniej owoców, które w 50% były pokryte pleśnią. (Tabela 14). Kontrolę stanowiła woda, a Standard I to komercyjny środek ochrony roślin.

Tabela 14

	% porażonych owoców
ZBIÓR 1 - obserwacja owoców 5 dni po zbiorze
Skala	0	1	2	3	4	5
<ontrola	0	9	26	14	40	11
8/6	0	30	10	10	40	10
A12B	0	13	13	8	25	41
Standard I	0	11	11	22	56	0
	ZBIÓR II - obserwacja owoców 5 dni po zbiorze
Skala	0	1	2	3	4	5
Kontrola	0	55	19	7	11	8
8/6	33	25	17	8	14	3
A12B	0	56	18	13	10	3
Standard I	30	18	13	15	18	6
	ZBIÓR III - obserwacja owoców 5 dni po zbiorze
Skala	0	1	2	3	4	5
Kontrola	19	17	15	15	22	12
8/6	22	35	25	11	19	8
A12B	0	17	18	21	23	21
Standard I	0	20	25	22	20	12

Przykład 11

Zastosowanie szczepów Bacillus amyloliguefaciens 8/6 i Bacillus amyloliguefaciens A12B do ochrony pszenicy jarej przed brunatna plamistością liści zbóż, powodowana przez grzyba Pyrenophora tritici-repentis, mączniakiem właściwym powodowanym przez grzyba Blumeria graminis oraz septoriozę liści wywoływana przez grzyb Zymoseptoria tritici.

Szczepy Bacillus amyloliguefaciens 8/6 i Bacillus amyloliguefaciens A12B aplikowano dolistnie w uprawie pszenicy jarej, w dawce 4 I wodnej zawiesiny zawierającej: jedna szczep Bacillus amyloliguefaciens 8/6, a druga Bacillus amyloliguefaciens A12B, każdy w ilości 1 · 10⁸ jtk/ml, na 1 ha. Doświadczenie prowadzone było na poletkach w 4 powtórzeniach. Badania prowadzono równolegle dla każdego szczepu. Jako produkt referencyjny zastosowano Standard II w dawce 1 l/ha. Preparaty aplikowano w fazie rozwoju roślin BBCH 21-29, BBCH 31-32, BBCH 37-39 i BBCH 51-59. Analiza porażenia grzybem Pyrenophora tritici-repentis wykonana po ostatnim zabiegu wykazała, że szczep Bacillus amyloliguefaciens 8/6 oraz A12B chroni rośliny przed tym patogenem, a skuteczność szczepów 8/6 i A12B na dolnych liściach wynosiła odpowiednio 60% i 49% natomiast na liściach podflagowych powyżej 70% (tabela 15). Analiza występowania dwóch pozostałych ważnych patogenów w uprawie pszenicy Blumeria graminis oraz Zymoseptoria tritici wykazała, że szczepy 8/6 i A12B ograniczają porażenie roślin przez Blumeria graminis w 70% (tabela 16), a w przypadku porażenia przez Zymoseptoria tritici o 61 % (8/6) i 72% (Α12B) (tabela 17). Kontrolę stanowiła woda, a Standard II to komercyjny środek ochrony roślin.

PL 247175 Β1

Tabela 15

Kombinacje	Obserwacja Pyrenophora tritici-repentis w fazie BBCH 69-71
% porażonej powierzchni liści	% skuteczności	% porażonej powierzchni liści	% skuteczności	% porażonej powierzchni liści	% skuteczności
Liście dolne L3	Liście podflagowe -L2	Liście flagowe - L1
Kontrola	5,88	-	3,25	-	0	-
8/6	2,38	60	0,94	71	0	-
A12B	3,00	49	0,81	75	0	-
Standard II	1,69	71	0,50	85	0	-

Tabela 16

Kombinacje	Obserwacja Biumeria graminis w fazie BBCH 69-71
% porażonej powierzchni liści	% skuteczności	% porażonej powierzchni liści	% skuteczności
Liście dolne - L3	Liście podflagowe L2
Kontrola	3,94	-	0,75	-
8/6	1,19	70	0,00	100
A12B	1,19	70	0,00	100
Standard II	0,69	82	0,00	100

Tabela 17

Wyniki przeprowadzonych doświadczeń potwierdzają, że szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i A12B skutecznie chronią rośliny pszenicy przed chorobami grzybowymi, co zostało potwierdzone w analizie zachowania powierzchni asymilacyjnej powierzchni liści flagowych L1. Szczepy 8/6 i A12B chroni asymilacyjną powierzchnię liści pszenicy w ponad 90%. Jednocześnie szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i A12B spowodowały zwiększenie plonu pszenicy jarej o 3% w porównaniu do kontroli, co pokazano już w tabeli 10 z przykładu 6.

Przykład 12

Zastosowanie szczepów Bacillus amyloliguefaciens 8/6 i Bacillus amyloliguefaciens A12B do ochrony pszenicy jarej przed brunatna plamistością liści zbóż, powodowana przez grzyba Pyrenophora tritici-repentis oraz septoriozę liści wywoływana przez grzyb Zymoseptoria tritici.

Szczepy Bacillus amyloliguefaciens 8/6 i Bacillus amyloliguefaciens A12B, w doświadczeniu polowym w uprawie pszenicy ozimej aplikowne były oddzielnie poprzez oprysk dolistny w dawce 5 I wodnej

PL 247175 Β1 zawiesiny na ha zawierającej 1 · 10⁸ jtk/ml szczepu Bacillus amyloliquefaciens 8/6 albo Bacillus amyloliquefaciens A12B.

Doświadczenie prowadzone było na poletkach w 4 powtórzeniach. Jako produkt referencyjny zastosowano Standard II w dawce 1 kg/ha. Kontrolę stanowiła woda. Preparaty aplikowano w fazie rozwoju pszenicy BBCH 30, BBCH 39, BBCH 57-59. Analiza wyników zebrana w tabeli 18 wykazała, że szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i A12B skutecznie chronią pszenicę ozimą przed Zymoseptoria tritici. Na liściach flagowych skuteczność jest wysoka i wynosi około 70% dla 8/6 i ponad 90% dla A12B, a na niższych liściach, w tym liściach podflagowych, skuteczność 8/6 wynosi 23%, a szczepu A12B 34%. Natomiast analiza wyników zebrana w tabeli 19 wykazała, że szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i A12B skutecznie chronią pszenicę ozimą przed Pyrenophora tritici-repentis. Na liściach flagowych skuteczność jest wysoka i wynosi ponad 60%, a na niższych liściach, w tym liściach podflagowych, skuteczność wyniosła około 20%.

Tabela 18

Kombinacje	Obserwacja Zymoseptoria tritici w fazie BBCH 73-75
% porażonej powierzchni liści	% skuteczności	% porażonej powierzchni liści	% skuteczności
Liście podflagowe - L2	Liście flagowe - L1
KONTROLA	19,38	-	2,38	-
8/6	14,88	23	0,56	76
A12B	12,81	34	0,19	92
Standard II	11,00	43	0,13	95

Tabela 19

Kombinacje	Obserwacja Pyrenophora tritici-repentis w fazie BBCH 75-77
% porażonej powierzchni liści	% skuteczności	% porażonej powierzchni liści	% skuteczności
Liście podflagowe - L2	Liście flagowe - L1
KONTROLA	6,00	-	1,00	-
8/6	5,00	17	0,31	69
A12B	4,50	25	0,38	62
Standard II	4,75	21	0,38	62

Wyniki przeprowadzonych doświadczeń potwierdzają, że szczepy Bacillus amyloliquefaciens 8/6 i A12B skutecznie chronią rośliny pszenicy przed chorobami grzybowymi, co zostało potwierdzone w analizie zachowania powierzchni asymilacyjnej powierzchni liści flagowych L1. Nowe szczepy 8/6 i A12B chronią asymilacyjną powierzchnię liści pszenicy w 95% (tabela 20).

Tabela 20

Kombinacje	Plon (t/ha)	Zachowana powierzchnia asymilacyjna liści (%)
KONTROLA	7,60	89,25
8/6	7,64	95,00
A12B	7,75	95,75
Standard II	7,70	96,00

Claims

1. Szczep Bacillus amyloliquefaciens 8/6, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00390, w dniu 6 października 2021 r.

2. Szczep Bacillus amyloliquefaciens A12B, zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, pod numerem B/00391, w dniu 6 października 2021 r.

3. Zastosowanie szczepów z gatunku Bacillus amyloliquefaciens, zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów PCM w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk im. Ludwika Hirszfelda we Wrocławiu, w dniu 6 października 2021 r., wybranych ze szczepów Bacillus amyloliquefaciens 8/6 nr depozytu B/00390 albo Bacillus amyloliquefaciens A12B nr depozytu B/00391, jako środka do biostymulacji wzrostu i rozwoju roślin oraz ochrony roślin przed agrofagami.

4. Zastosowanie, według zastrz. 3, znamienne tym, że szczep Bacillus amyloliquefaciens 8/6 albo Bacillus amyloliquefaciens A12B lub ich pochodne, takie jak zarodniki lub metabolity, aplikuje się: w postaci zawiesiny wodnej poprzez fertygację, oprysk dolistny, oprysk gleby, używa do zaprawiania nasion lub w formie stałej do aplikacji doglebowej.