PL246657B1 - Szczepy bakteriofagów i ich zastosowania - Google Patents
Szczepy bakteriofagów i ich zastosowania Download PDFInfo
- Publication number
- PL246657B1 PL246657B1 PL416716A PL41671616A PL246657B1 PL 246657 B1 PL246657 B1 PL 246657B1 PL 416716 A PL416716 A PL 416716A PL 41671616 A PL41671616 A PL 41671616A PL 246657 B1 PL246657 B1 PL 246657B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- strain
- bacteriophage
- fish
- bacteriophages
- aeromonas
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10111—Myoviridae
- C12N2795/10132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10211—Podoviridae
- C12N2795/10221—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10211—Podoviridae
- C12N2795/10232—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10211—Podoviridae
- C12N2795/10233—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest zastosowanie bakteriofagów do wytwarzania preparatu do zapobiegania lub zwalczania zakażeń zwierząt hodowlanych, zwłaszcza ryb, patogennymi szczepami bakterii wrażliwymi na działanie tych bakteriofagów, przy czym wytwarzany preparat jest przeznaczony do podawania zagrożonym zwierzętom w immersji, korzystnie w odstępach 24 - godzinnych. Ponadto zgłoszenie obejmuje też zastosowanie bakteriofagów do wytwarzania preparatu do stymulowania nieswoistych komórkowych i humoralnych mechanizmów obronnych i odporności przeciwzakaźnej ryb. Przedmiotem zgłoszenia jest także szczep bakteriofaga, wybrany z grupy obejmującej szczepy zdeponowane w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod następującymi numerami depozytowymi: F/00096 (szczep 25AhydR2PP), F/00094 (szczep 50AhydR13PP), F/00098 (szczep 22PfluR64PP), F/00099 (szczep 67PfluR64PP), F/00100 (szczep 71PfluR64PP), F/00095 (szczep 98PfluR60PP) oraz F/00101 (szczep 60AhydR15PP).
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy nowych szczepów bakteriofagów oraz ich zastosowań przydatnych zwłaszcza w przemysłowej produkcji ryb.
Akwakultura jest najszybciej rozwijającym się sektorem produkcji żywności na świecie. Jednym z głównych ograniczeń uniemożliwiających efektywne wykorzystanie tego sektora produkcji zwierzęcej jest rozwój chorób zakaźnych, które są przyczyną dużych strat ekonomicznych szacowanych w miliardach dolarów rocznie. Głównym czynnikiem etiologicznym odpowiedzialnym za rozwój chorób w akwakulturach są bakterie, szczególnie z rodzaju Aeromonas, Pseudomonas, Vibrio, Yersinia, Edwardsiella, Streptococcus, Lactococcus i Renibacterium [Pridgeon JW, 2012, Sudheesh PS, 2012]. Najczęściej stosowaną praktyką w leczeniu chorób powodowanych przez bakterie u ryb hodowlanych jest podawanie antybiotyków w karmie zwierząt. Ze względu na mniejsze spożycie karmy przez chore zwierzęta i wpływ różnych czynników środowiskowych, taki sposób podawania leków nie zawsze przynosi satysfakcjonujące efekty. Ponadto, intensywne stosowanie preparatów antybiotykowych spowodowało pojawienie się antybiotykoopornych szczepów bakterii stanowiących rezerwuar genów oporności na antybiotyki. Dzięki zjawisku transferu horyzontalnego geny te mogą zostać nabyte przez inne patogeny, w tym również bakterie chorobotwórcze dla człowieka i w ten sposób mieć bezpośredni wpływ na zdrowie ludzi. Wiele środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych powszechnie w akwakulturach zostało sklasyfikowanych przez WHO jako preparaty mające krytyczne znaczenie dla zdrowia człowieka [Almeida A, 2009, Heuer OE, 2009]. Ze względu na intensywny rozwój i znaczenie przemysłu rybnego w wielu regionach świata oraz powszechne i często nieuregulowane stosowanie preparatów antybiotykowych w tym obszarze produkcji zwierzęcej, konieczne jest podjęcie działań, które zapobiegną rozprzestrzenianiu się antybiotykooporności w akwakulturach oraz zminimalizują ryzyko występowania potencjalnych skutków ubocznych dla zdrowia człowieka [Heuer O, 2009].
Rozwiązaniem problemu wzrastającej antybiotykooporności szczepów bakteryjnych może być zastosowanie preparatów bakteriofagowych. Bakteriofagi (fagi) są naturalnie występującymi wirusami bakteryjnymi, które wykazują swoistość w stosunku do określonych gatunków lub szczepów bakterii [Richards GP, 2014]. W przeszłości stosowano je zarówno w leczeniu, jak i w zapobiegniu chorobom zakaźnym u ludzi [Eyer L, 2007]. W ostatnich latach obserwuje się wyraźny wzrost zainteresowania fagami oraz ich wykorzystaniem w nowoczesnej biotechnologii jako nośników białek i DNA w szczepionkach, a także jako alternatywy dla antybiotyków [Clark J, 2006]. Wyniki badań klinicznych oraz badań in vivo przeprowadzonych w ciągu kilku ostatnich lat potwierdzają wysoką skuteczność i bezpieczeństwo preparatów fagowych [Pirnay JP, 2012, Eyer J, 2007]. Do najważniejszych zalet terapii bakteriofagowej, które decydują o jej przewadze nad stosowanymi powszechnie antybiotykami należą: specyficzność fagów w stosunku do określonych gatunków lub szczepów bakterii, szybkie tempo mutacji bakteriofagów i tym samym szybka reakcja na pojawienie się oporności na wirusy wśród bakterii skutkująca utrzymującą się aktywnością bakteriofagów wobec patogenów, stosunkowo niski koszt terapii w porównaniu z nakładami finansowymi ponoszonymi w związku z opracowaniem nowych antybiotyków oraz brak skutków ubocznych [Atterbury RJ, 2007, Bhardwaj SB, 2014].
Zastosowanie szczepionek opartych o bakteriofagi ma wiele zalet, min. nie zawierają one genów oporności na antybiotyki, DNA wirusów jest chronione przed degradacją, szczepionki mogą być podawane drogą doustną, a ich produkcja na dużą skalę jest tania, stosunkowo prosta i bardzo szybka [Clark J, 2006].
Niektóre dane literaturowe wskazują na immunomodulujący wpływ bakteriofagów na funkcje komórek układu odpornościowego zaangażowanych zarówno w nabytą, jak i wrodzoną odpowiedź immunologiczną, takie jak fagocytoza, wybuch tlenowy komórek fagocytarnych i produkcja cytokin [Górski A, 2012]. W badaniach Weber-Dąbrowskiej i wsp. zaobserwowano wpływ fagów na kontrolę produkcji cytokin przez komórki krwi [Weber-Dąbrowska B, 2000].
Opublikowane dotychczas wyniki badań i opatentowane rozwiązania dotyczą głównie metod izolowania i charakterystyki genetycznej bakteriofagów, natomiast w mniejszym stopniu wykorzystania fagów do zwalczania patogennych bakterii w akwakulturach. Wykazano, że Fag VP-1 wykazuje swoistość wobec bakterii Vibrio anguillarum i Aeromonas salmonicida [Pereira C, 2011]. Lityczne fagi PAS-1 i ASP-1 powodują zmniejszenie zakażeń powodowanych przez Aeromonas salmonicida u pstrąga tęczowego [Kim JH2012, Patent Application Publication uS 2013/0323209 A1], natomiast fag phiAS5 należący do rodziny Myoviridae wykazuje szerokie spektrum aktywności w stosunku do bakterii z rodziny Aeromonadaceae oraz antybiotykoopornego szczepu A. salmonicida subsp. salmonicida [Kim JH,
2012] . Ochronne działanie fagów podawanych doustnie potwierdziły badania przeprowadzone na gatunku ryb Plecoglossus altivelis, zakażonych eksperymentalnie bakteriami P. plecoglossicida [Park S, 2000]. Koktajl zawierający fagi PFP1 i PFP12, wyizolowane z organizmów zakażonych ryb, wykazuje dużą aktywność lityczną w stosunku do bakterii Pseudomonas fluorescens w warunkach in vitro [Prasad Y, 2010]. Zastosowanie kombinacji trzech lub więcej fagów powoduje lizę mutantów A. salmonicida HER 1107, które nie są wrażliwe na działanie pojedynczych fagów, co wskazuje na możliwość wykorzystania bakteriofagów w celu ochrony hodowli pstrąga źródlanego przed rozwojem furunkulozy [Imbeault S, 2006]. Mieszanina kilku bakteriofagów specyficznych wobec bakterii z rodzaju Vibrio, może być stosowana w leczeniu infekcji powodowanych przez Vibrio anguillarum w hodowlach łososia atlantyckiego [Patent Application Publication US 2014/0105866 A]. Zastosowanie faga UP87 u ryb z gatunku Oreochromis niloticus (tilapia nilowa) zmniejsza ogólną liczbę bakterii A. hydrophila we krwi i nie wpływa na zwiększenie śmiertelności ryb, w porównaniu z wynikami uzyskanymi dla oksytetracykliny [Cruz-Papa D, 2014]. Fag AH1 powoduje całkowite wyeliminowanie śmiertelności ryb zakażonych doświadczalnie bakteriami Aeromonas hydrophila [Wu JE, 1981]. Natomiast zastosowanie litycznego faga FCP1 w hodowli suma zakażonego eksperymentalnie antybiotykoopornym szczepem Flavobacterium columnare hamuje objawy infekcji i zmniejsza śmiertelność ryb [Prasad Y, 2011].
Problemem wymagającym rozwiązania pozostaje dostarczenie koktajlu bakteriofagów stymulującego odporność przeciwzakaźną, który pozwalałby na zabezpieczenie lub leczenie ryb hodowlanych z zakażeń patogennymi szczepami Aeromonas sp. i Pseudomonas sp. Pożądane jest również aby uzyskiwany koktajl bakteriofagów nadawał się do łatwego stosowania w praktyce hodowlanej, nie wywoływał niepożądanych efektów ubocznych oraz posiadał ewentualne dodatkowe właściwości prozdrowotne.
Nieoczekiwanie rozwiązaniem przedstawionych problemów jest zastosowanie niniejszego wynalazku. Przedmiotem wynalazku są bakteriofagi stymulujące odporność przeciwzakaźną ryb do stosowania w leczeniu zakażeń u ryb hodowlanych, wywoływanych patogennymi szczepami bakterii wrażliwymi na działanie tych bakteriofagów, przy czym bakteriofagi są podawane zakażonym rybom w immersji co najmniej dwukrotnie w odstępach 24-godzinnych, przy czym zakażeniem jest zakażenie patogennymi szczepami Aeromonas sp. i Pseudomonas sp., zwłaszcza szczepami Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida lub Pseudomonas fluorescens u ryb hodowlanych, przy czym stosuje się szczep bakteriofaga wybrany z grupy obejmującej szczepy zdeponowane w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod następującymi numerami depozytowymi: F/00096 (szczep 25AhydR2PP), F/00094 (szczep 50AhydR13PP), F/00098 (szczep 22PfluR64PP), F/00099 (szczep 67PfluR64PP), F/00100 (szczep 71PfluR64PP), F/00095 (szczep 98PfluR60PP) oraz F/00101 (szczep 60AhydR15PP). Kolejnym przedmiotem wynalazku są bakteriofagi do stosowania w stymulowaniu odporności ryb przeciw zakażeniom bakteryjnym, przy czym stymulowane są nieswoiste komórkowe mechanizmy obronne i humoralne mechanizmy obronne, przy czym stosuje się szczep bakteriofaga wybrany z grupy obejmującej szczepy zdeponowane w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod następującymi numerami depozytowymi: F/00096 (szczep 25AhydR2PP), F/00094 (szczep 50AhydR13PP), F/00098 (szczep 22PfluR64PP), F/00099 (szczep 67PfluR64PP), F/00100 (szczep 71PfluR64PP), F/00095 (szczep 98PfluR60PP) oraz F/00101 (szczep 60AhydR15PP).
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczep bakteriofaga wybrany z grupy obejmującej szczepy zdeponowane w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod następującymi numerami depozytowymi: F/00096 (szczep 25AhydR2PP), F/00094 (szczep 50AhydR13PP), F/00098 (szczep 22PfluR64PP), F/00099 (szczep 67PfluR64PP), F/00100 (szczep 71PfluR64PP), F/00095 (szczep 98PfluR60PP) oraz F/00101 (szczep 60AhydR15PP).
Szczegółowy opis wynalazku
Ujawniono sposób otrzymywania koktajlu bakteriofagowego, stymulującego odporność przeciwzakaźną, stosowanego w profilaktyce i terapii chorób zakaźnych ryb, charakteryzujący się tym, że:
a) uzyskuje się kolekcję szczepów bakteriofagowych zawierającą szczepy specyficzne wobec wybranych szczepów bakterii,
b) wykonuje się posiew redukcyjny wybranych szczepów bakterii na stałym podłożu wzrostowym i inkubuje 48h ± 3h w 25°C (każdy ze szczepów hoduje się osobno),
c) przygotowuje się płytki 96-dołkowe z podłożem wzrostowym płynnym (płytka I) i stałym (płytka II),
d) z płytki z posiewem redukcyjnym pobiera się ezą pojedynczą kolonię bakteryjną i przenosi do pierwszego dołka na płytce I, energicznie miesza, a następnie tą samą ezą dotyka się do stałego podłoża na płytce II w odpowiadającym dołku. Tak zapełnia się całą płytkę wybierając nową kolonię dla każdej pary dołków, pozostawiając 3 dołki jako kontrolę jałowości podłoża, e) płytkę I umieszcza się w czytniku mikropłytek (25°C) i inkubuje się do czasu uzyskania w większości dołków wartości OD620 na poziomie 0,2-0,3. Po tym czasie do każdego dołka dodaje się zawiesinę szczepu bakteriofagów, dla którego poszukiwany jest szczep produkcyjny. Ponownie inkubuje się w czytniku mikropłytek (25°C) i odczytuje wartość absorbancji do czasu uwidocznienia krzywej kinetycznej namnażania fagów, na podstawie której wybiera się kolonie charakteryzujące się najlepszą zdolnością namnażania wybranego szczepu bakteriofagów,
f) płytkę II umieszcza się w cieplarce i inkubuje 24h ± 2h w 25°C, a następnie kolonie wskazane na podstawie płytki I wykorzystuje się do przygotowania inokulum szczepu produkcyjnego dla danego szczepu bakteriofagów,
g) hodowlę wybranego szczepu bakterii prowadzi się w jałowym medium hodowlanym używając przygotowanego uprzednio inokulum, inkubuje się w 25°C do czasu uzyskania odpowiedniej gęstości optycznej hodowli (OD620), po czym dodaje się zawiesinę odpowiedniego szczepu bakteriofagów i inkubuje w 25°C przez 4 h,
h) po namnożeniu bakteriofagów usuwa się biomasę bakteryjną z zawiesiny pohodowlanej za pomocą mikrofiltracji, uzyskując gotowy komponent preparatu.
Wybranym szczepem bakteryjnym jest szczep Aeromonas hydrophila 33658, Aeromonas hydrophila 7966, Aeromonas hydrophila 49140, Pseudomonas fluorescens 4B/UWM/03/13 i Pseudomonas fluorescens 8B/UWM/03/13.
Ujawniony sposób nadaje się do łatwego i szybkiego skriningu kolonii bakteryjnych pozwalających na bardzo wydajne namnażanie bakteriofagów, co ma istotne znaczenie w zastosowaniach przemysłowych.
Ujawniono także zastosowanie mieszaniny bakteriofagów stymulującej odporność przeciwzakaźną w profilaktyce i terapii chorób zakaźnych ryb powodowanych przez bakterie z rodzaju Aeromonas i Pseudomonas, przy czym wytwarzana mieszanina bakteriofagów jest przeznaczona do podawania zagrożonym zwierzętom metodą immersji.
Mieszanina bakteriofagów stymulująca odporność przeciwzakaźną wykazuje silne działanie terapeutyczne, ponieważ zmniejsza śmiertelność ryb zakażonych eksperymentalnie bakteriami Pseudomonas fluorescens.
Zwalczanym zakażeniem jest zakażenie patogennymi szczepami Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida i Pseudomonas fluorescens u ryb hodowlanych, a do wytwarzania mieszaniny bakteriofagów stosuje się szczep bakteriofaga wybrany z grupy obejmującej ujawnione w niniejszym zgłoszeniu szczepy zdeponowane dnia 17.12.2015 roku w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod następującymi numerami depozytowymi: F/00096 (szczep 25AhydR2PP), F/00094 (szczep 50AhydR13PP), F/00098 (szczep 22PfluR64PP), F/00099 (szczep 67PfluR64PP), F/00100 (szczep 71PfluR64PP), F/00095 (szczep 98PfluR60PP) oraz szczep zdeponowany dnia 15.01.2016 r. pod numerem depozytowym F/00101 (60AhydR15PP).
Kolejnym aspektem wynalazku jest szczep bakteriofaga nadający się do zapobiegania lub zwalczania zakażeń patogennymi szczepami Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida i Pseudomonas fluorescens, wybrany z grupy obejmującej: 60AhydR15PP, 25AhydR2PP, 50AhydR13PP, 22PfluR64PP, 67PfluR64PP, 71PfluR64PP, 98PfluR60PP.
Mieszanina bakteriofagów według wynalazku opiera się na naturalnych składnikach ekosystemu i nie działa w niekorzystny sposób na organizmy inne niż ściśle określone bakterie patogenne. Mieszanina bakteriofagów gwarantuje, iż selektywnie ograniczane są wyłącznie patogenne szczepy Aeromonas sp. i Pseudomonas sp.
Nieoczekiwanie okazało się również, że mieszanina bakteriofagów według wynalazku jest bezpieczna i dobrze tolerowana przez ryby, co potwierdziły badania hematologiczne i biochemiczne przeprowadzone w populacji karpia i pstrąga tęczowego.
Mieszanina bakteriofagów według wynalazku wykazuje silne działanie immunotropowe, ponieważ stymuluje nieswoiste komórkowe i humoralne mechanizmy obronne oraz odporność przeciwzakaźną u badanych gatunków ryb.
Mieszanina bakteriofagów nadaje się do stosowania w produkcji zwierzęcej, zwłaszcza do zwalczania patogennych szczepów Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida i Pseudomonas fluorescens w akwakulturach.
Ujawnione w niniejszym zgłoszeniu szczepy bakteriofagowe zostały zidentyfikowane dzięki opisanemu sposobowi. Nieoczekiwanie posiadają one szeroką swoistość polegającą na lizie co najmniej 4 określonych szczepów P. fluorescens, 11 szczepów A. hydrofila i 5 szczepów A. salmonicida. Szczepy bakteriofagowe są stabilne w chłodniczych warunkach przechowywania co najmniej przez 3 miesiące. Ponadto namnażanie tych szczepów może odbywać się z sukcesem w skali przemysłowej bez utraty ich aktywności.
W celu lepszego wyjaśnienia wynalazku został on zilustrowany na załączonych figurach.
Figura 1 przedstawia wyniki badania wrażliwości szczepu A. hydrophila 7966 na pojedyncze bakteriofagi i preparaty bakteriofagowe. 1 - A. hydrophila 7966 z 25AhydR2PP; 2 - A. hydrophila 7966 z BAFADOR II; 3 - A. hydrophila 7966 z BAFADOR III; 4 - A. hydrophila 7966 z BAFADOR IV; 5 - kontrola wzrostu A. hydrophila 7966.
Figura 2 przedstawia wyniki badania wrażliwości szczepu A. hydrophila 7965 na pojedyncze bakteriofagi i preparaty bakteriofagowe. 1 - A. hydrophila 7965 z 13AhydR10PP; 2 - A. hydrophila 965 z 14AhydR10PP; 3 - A. hydrophila 7965 z 85AhydR10PP; 4 - A. hydrophila 7965 z BAFADOR II; 5 - kontrola wzrostu A. hydrophila 7965.
Figura 3 przedstawia wyniki badania wrażliwości szczepu A. hydrophila 49140 na pojedyncze bakteriofagi i preparaty bakteriofagowe. 1 - A. hydrophila 49140 z 50AhydR13PP; 2 - A. hydrophila 49140 z BAFADOR II; 3 - A. hydrophila 49140 z BAFADOR III; 4 - A. hydrophila 49140 z BAFADOR IV; 5 - kontrola wzrostu A. hydrophila 49140.
Figura 4 przedstawia wyniki badania wrażliwości szczepu A. hydrophila 33658 na pojedyncze bakteriofagi i preparaty bakteriofagowe. 1 - A. hydrophila 33658 z 60AhydR15PP; 2 - A. hydrophila 33658 z BAFADOR II; 3 - A. hydrophila 33658 z BAFADOR III; 4 - A. hydrophila 33658 z BAFADOR IV; 5 - kontrola wzrostu A. hydrophila 33658.
Figura 5 przedstawia wyniki badania wrażliwości szczepu P. fluorescens 8B/UWM na pojedyncze bakteriofagi i preparaty bakteriofagowe. 1 - P. fluorescens 8B/UWM z 22PfluR64PP; 2 - P. fluorescens 8B/UWM z 67PfluR64PP; 3 - P. fluorescens 8B/UWM z 71PfluR64PP; 4 - P. fluorescens 8B/UWM z BAFADOR II; 5 - P. fluorescens 8B/UWM z BAFADOR III; 6 - P. fluorescens 8B/UWM z BAFADOR IV; 7 - kontrola wzrostu P. fluorescens 8B/UWM.
Figury 6- 9 przedstawiają profile restrykcyjne wybranych bakteriofagów.
Figura 6 przedstawia profil restrykcyjny bakteriofaga 60AhydR15PP po trawieniu enzymami restrykcyjnymi: Dral (ścieżka 2), Sspl (ścieżka 4) i AseI (ścieżka 6). Ścieżka 1 i 8 - marker mas czasteczkowych (1 kb).
Figura 7 przedstawia profil restrykcyjny bakteriofaga 22PfluR64PP (ścieżka 2), 67PfluR64PP (ścieżka 3), 71PfluR64PP (ścieżka 4) po trawieniu enzymem restrykcyjnym EcoRA. Ścieżka 1 - marker mas cząsteczkowych (1 kb).
Figura 8 przedstawia profil restrykcyjny bakteriofaga 50AhydR13PP po trawieniu enzymem restrykcyjnym Sspl (ścieżka 2) oraz bakteriofaga 98PfluR60PP po trawieniu enzymem EcoRI (ścieżka 3). Ścieżka 1 - marker mas cząsteczkowych (1 kb).
Figura 9 przedstawia profil restrykcyjny bakteriofaga 25AhydR2PP (ścieżka 2) po trawieniu enzymem restrykcyjnym Eco RI. Ścieżka 1 - marker mas cząsteczkowych (1 kb).
Przykład 1. Izolacja i charakterystyka bakteriofagów
Przygotowanie banku szczepów bakterii z rodzaju Aeromonas spp. i Pseudomonas sp. izolowanych od ludzi i zwierząt hodowlanych.
Na wstępie przygotowano kolekcję 82 szczepów bakterii z rodzaju Aeromonas spp. i Pseudomonas sp. (Tabela 1). Szczepy te zostały wykorzystane w badaniach specyficzności wyizolowanych bakteriofagów. W kolekcji znalazły się zarówno szczepy wzorcowe dostępne w publicznych repozytoriach, jak również izolaty pozyskane z Uniwersytetu Adama Mickiewicza w Poznaniu, z Zakładu Patologii i Immunologii Ryb Instytutu Rybactwa Śródlądowego w Olsztynie oraz Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie (Tabela 2).
PL 246657 Β1
Tabela 1. Kolekcja szczepów bakterii z rodzaju Aeromonas spp., Pseudomonas sp., Yersinia sp., Rembacterium sp. i Enterococcus sp.
| Kod | Nazwa szczepu |
| R1 | Yersinia ruckeri 29473 |
| R2 | Aeromonas hydrophila 7966 |
| R3 | Aeromonas hydrophila 1206101 |
| R4 | Yersinia ruckeri 5304100 |
| R5 | Aeromonas sobria |
| R6 | Aeromonas hydrophila 49140 |
| R7 | Yersinia ruckeri 29473 |
| R9 | Aeromonas hydrophila 35654 |
| RIO | Aeromonas hydrophila 7965 |
| Rll | Aeromonas hydrophila 5247167 |
| R12 | Aeromonas hydrophila 7965 (290158) |
| R13 | Aeromonas hydrophila 49140 |
| R14 | Aeromonas hydrophila 33658 (788242) |
| R15 | Aeromonas hydrophila 33658 |
| R16 | Aeromonas hydrophila 35654 |
| R21 | Aeromonas hydrophila RK 70363 |
| R22 | Aeromonas hydrophila SK 3 |
| R23 | Aeromonas hydrophila ATCC 49140 |
| R24 | Aeromonas hydrophila LMG13656 |
| R25 | Aeromonas hydrophila AK 44 |
| R26 | Aeromonas hydrophila ATCC 7966T |
| R27 | Aeromonas sobria LMG 13469 |
| R28 | Aeromonas sobria CIP 7433T |
| R29 | Aeromonas sałmonicida LMG 14900T |
| R30 | Aeromonas sałmonicida LMG 37821 |
| R31 | Aeromonas sałmonicida CDC 0434-84 |
| R32 | Aeromonas sałmonicida AK 46 |
| R33 | Aeromonas sałmonicida LMG 3780' |
| R34 | Aeromonas sałmonicida LMG 13450 |
| R40 | 1B/IRS/03/13_ Aeromonas hydrophila |
| R41 | 2B/IRS/03/13_ Aeromonas hydrophila |
| R42 | 3B/IRS/O3/13_ Aeromonas hydrophila |
| R43 | 4B/IRS/03/13 _ Aeromonas hydrophila |
| R44 | 5B/IRS/04/13_ Aeromonas hydrophila |
| R45 | 6BTRS/05/13_ Aeromonas hydrophila |
| R46 | 7B/IRS/05/13_ Aeromonas hydrophila |
| R47 | 8BTRS/05/13_ Aeromonas hydrophila |
PL 246657 Β1
| R48 | 9B/IRS/05/13_ Aeromonas hydrophila |
| R49 | 10B/IRS/05/13_ Aeromonas hydrophila |
| R50 | 11 B/l R S/O 5/13_ Aeromonas hydrophila |
| R51 | 12B/IRS/06/13_ Aeromonas hydrophila |
| R52 | 13 B/IRS/06/13 _ Aeromonas hydrophila |
| R53 | IB/IRSAM/HK-^eromoHas hydrophila |
| R54 | 2B/IRS/04/14K A eromonas hydrophila |
| R55 | 3B/IRS/04/l4K_Aeromonas hydrophila |
| R56 | 4B/IRS/04/14P_ Aeromonas hydrophila |
| R57 | lB/UWMΌ3/13_l¢ΓJί/ϊ(α ruckeri |
| R58 | 2B/UWM/03/\3 _Pseudomonas fluorescens |
| R59 | 3 B/U WM/03/13_ Aeromonas hydrophila |
| R60 | 4B!\AWMl()3l\.3_Pseudomonas fluorescens |
| Ról | 5B/UWM/03/13 _Pseudomonas fluorescens |
| R62 | 6B/UWM/O3/13_Pseudomonas fluorescens |
| R63 | 7B/UWM/O3/13-Pseudomonas fluorescens |
| R64 | %BI\JWMX)3l\3_Pseudomonas fluorescens |
| R65 | 9B/UWM/03/13_Aeromonas hydrophila |
| R66 | 1OB/U WM/03/13_Yersinia ruckeri |
| R67 | 1 lB/UWM/03/13_/lerOTKonas· hydrophila |
| R68 | 13B/UWM/O3/13 _Pseudomonas fluorescens |
| R69 | 14B/UWM/03/13_Yersinia ruckeri |
| R70 | 15B/UWM/03/13_Uers/n/« ruckeri |
| R7I | 16B/UWM/04/13_j4eromona5 hydrophila/caviae |
| R72 | 17B/U WM/06/13 _Yersinia ruckeri |
| R73 | 18B/UWM/06/13__4eromonas' salmonicida suhsp.salmonicida |
| R74 | 19B/UWM/06/13_^4eromowas salmonicida suhsp.salmonicida |
| R75 | lOB/BWMlOóillflieromonas hydrophila |
| R76 | 2 lB/UWM/06/13_Ferswn« ruckeri |
| R77 | 22B/UWM/06/13 Jleromonas sobria |
| R78 | 23B/UWM/06/13_Aeromonas hydrophila |
| R79 | 24B/UWM/06/13 _Renibacterium sałmonicidum |
| R80 | 25B/UWM/07/13_Aeromonas sobria |
| R81 | 26B/UWM/07/13 ^eromonas hydrophila |
| R82 | 27B/UWM/07/13 _Aeromonas hydrophila |
| R83 | 2'8Bf\JWM/Q7/13flleromonas sobria |
| R84 | 29B/U WM/07/13 Pseudomonasfluorescens |
| R85 | 3()BI\lWiAJW3l\A_Enterococcus |
| R86 | l/14P/UWM_łl·ra/rt/α ruckeri |
PL 246657 Β1
| R87 | 2/14P/UWM_}W'.s7idi7 ruckeri |
| R88 | 3/14P/UWM_Yersinia ruckeri |
| R89 | 31B/U WM/08/1A Aeromonas hydrophila |
| R90 | 32B/U WM/08/14_Aeromonas hydrophila |
| R91 | 33Pi\JWM10^l\A_Pseudomonas fluorescens |
| R92 | 34B/UWM/08/14_Yersinia ruckeri |
Tabela 2. Szczepy bakterii z rodzaju Aeromonas spp., Pseudomonas sp., Yersinia sp., Renibacterium sp i Enterococcus sp.
| L.p. | Gatunek bakterii | Liczba szczepów | Źródło |
| 1 | Aeromonas hydrophila | 6 38 | U AM UWM |
| 2 | Aeromonas salmonicida | 6 2 | UAM UWM |
| 3 | Aeromonas sobria | 2 4 | UAM UWM |
| 4 | Pseudomonas fluorescens | 9 | UWM |
| 5 | Renibacterium salmonicidum | 1 | UWM |
| 6 | Enterococcus | 1 | UWM |
| 7 | Yersinia ruckeri | 13 | UWM |
Izolacja bakteriofagów aktywnych względem wybranych szczepów bakterii Aeromonas spp. i Pseudomonas sp. z próbek środowiskowych.
Bakteriofagi zostały wyizolowane z próbek pobranych z kolektorów wlotowych, stanowiących wstępny etap procesu oczyszczania ścieków, otrzymanych z Głównej Oczyszczalni Ścieków (GOŚ) w Łodzi lub próbek wody otrzymanych z Instytutu Rybactwa Śródlądowego (1RS) wŻabieńcu (Tabela 3).
Tabela 3. Otrzymane bakteriofagi i ich gospodarze
| L.p. | Bakteriofag | Źródło | Gospodarz |
| 1 | HAhydRlOPP | GOŚ | Aeromonas hydrophila 7965 |
| 3 | 13AhydR10PP | GOŚ | Aeromonas hydrophila 7965 |
| 4 | 14AhydR10PP | GOŚ | Aeromonas hydrophila 7965 |
| 5 | 25AhydR2PP | GOŚ | Aeromonas hydrophila 7966 |
| 6 | 50AhydR13PP | GOŚ | Aeromonas hydrophila 49140 |
| 7 | 53AhydR13PP | GOŚ | Aeromonas hydrophila 49140 |
| 8 | 60AhydR15PP | GOŚ | Aeromonas hydrophila 33658 |
| 9 | 62AhydRllPP | GOŚ | Aeromonas hydrophila 5247167 |
| 10 | 80AhydR10PP | IRS | Aeromonas hydrophila Ί965 |
| 11 | 82AhydR10PP | IRS | Aeromonas hydrophila 7965 |
| 12 | 85AhydR10PP | IRS | Aeromonas hydrophila 7965 |
| 13 | 86AhydR10PP | IRS | Aeromonashydrophila 7965 |
| 14 | 72AsobR5PP | IRS | Aeromonas sohria |
PL 246657 Β1
| 15 | 75AsobR5PP | IRS | Aeromonas sobria |
| 16 | 76AsobR5PP | IRS | Aeromonas sohria |
| 17 | 19AhydRl5PP | GOŚ | Aeromonas hydrophila 33658 |
| 18 | 22PfluR64PP | GOŚ | Pseudomonasfluorescens 8B/UWM/03/13 |
| 19 | 23PfluR64PP | GOŚ | Pseudomonas fluorescens 8B/UWM/03/13 |
| 20 | 67PiluR64PP | GOŚ | Pseudomonasfluorescens 8B/UWM/03/13 |
| 21 | 69PfluR64PP | GOŚ | Pseudomonas fluorescens 8B/UWM/03/13 |
| 22 | 70PnuR64PP | GOŚ | Pseudomonas fluorescens 8B/UWM/03/13 |
| 23 | 71PfluR64PP | GOŚ | Pseudomonas fluorescens 8B/UWM/O3/13 |
| 24 | 88PnuR61PP | IRS | Pseudomonasfluorescens 5B/UWM/03/13 |
| 25 | 98PnuR60PP | GOŚ | Pseudomonasfluorescens 4B/UWM/03/13 |
Wszystkie bakteriofagi wykorzystywane w dalszych eksperymentach zostały oczyszczone metodą pasaży do pojedynczej łysinki na płytkach z podłożem Luria-Bertani (LB). Procedura ta wymagała przynajmniej 5-krotnego pasażowania.
Dla bakteriofagów wyizolowanych metodą płytkową została wstępnie określona ich specyficzność na podstawie zdolności litycznej fagów wobec wybranych szczepów Aeromonas spp. i Pseudomonas sp. wyizolowanych od chorych ryb, uzyskanych z Zakładu Patologii i Immunologii Ryb Instytutu Rybactwa Śródlądowego w Olsztynie (IRS) i Uniwersytetu Warmińsko-Mazurskiego w Olsztynie oraz stanowiących rozszerzenie kolekcji przykładowych szczepów wyizolowanych od chorych ludzi, uzyskanych z Uniwersytetu Adama Mickiewicza w Poznaniu.
W celu potwierdzenia wyników, badanie specyficzności wyizolowanych bakteriofagów zostało powtórzone 3-krotnie (Tabela 4 i 5).
PL 246657 Β1
Tabela 4. Specyficzność wybranych bakteriofagów na wybranych wzorcowych i środowiskowych szczepach Aeromonas spp. (kolekcja Proteon Pharmaceuticals SA).
Bakteriofagi
Szczepy bakterii
| Oh £-l O ® O Vj t. K i—। : O ® O 222Soi22S22225 Ό p ’Ρ *5 Λ ί Λ X Λ X Λ Λ Λ £ Λ Λ Λ < < < < <<<<<<<<< ’-τ σ*. ή wh rł Κ >Λ X X X X |
o
Pi
V)
| A. hydrophila | ||||||||||||||||
| R2 | cl - -- -- -- -- -- | |||||||||||||||
| R6 | - | - | - | - | - | cl | - | + | - | - | - | - | - | - | - | - |
| R9 | - | - | - | - | cl | + | - | + | - | |||||||
| RIO | - | cl | cl | - | ||||||||||||
| Rll | cl | |||||||||||||||
| R12 | - | cl | cl | - | - | - | - | - | - | - | - | cl | - | - | - | - |
| R13 | - | - | - | - | - | cl | - | cl | - | - | - | - | - | - | - | - |
| R14 | - | cl | - | - | - | cl | - | cl | - | - | - | - | - | - | - | - |
| R15 | - | cl | - | - | - | + | - | cl | - | - | - | - | - | - | - | - |
| R21 | - | - | - | - | - | cl | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| R22 | cl | - | ||||||||||||||
| R23 | cl | - | ||||||||||||||
| R24 | - | + | + | - | - | cl | - | cl | cl | - | - | - | - | - | - | - |
| R25 | - | - | - | - | - | cl | - | cl | cl | - | - | - | - | - | - | - |
| R26 | cl | - | ||||||||||||||
| R40 | cl | - | + | - | ||||||||||||
| R41 | cl | - | ||||||||||||||
| R48 | - | cl | cl | - | - | - | - | - | - | - | cl | cl | cl | - | - | - |
| R52 | - | Cl | Cl | - | - | - | - | - | - | - | cl | cl | cl | + | - | - |
| R53 | - | - | - | + | - | - | - | - | - | - | + | - | + | - | - | - |
| R55 | - | + | + | - | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - | + | - |
| R59 | cl | |||||||||||||||
| R65 | - | cl | - | - | - | - | - | cl | - | - | - | - | - | - | - | - |
| R71 | - | + | - | - | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - | + | - |
| A. salmoHteida | ||||||||||||||||
| R30 | - | - | - | - | - | cl | - | cl | cl | - | - | - | - | - | - | - |
| R31 | - | - | - | - | - | cl | - | cl | cl | - | - | - | - | - | - | - |
| R32 | cl | - | ||||||||||||||
| R33 | - | - | - | - | - | - | - | cl | cl | - | - | - | - | - | - | - |
| A. sobria | ||||||||||||||||
| RS | cl | |||||||||||||||
| R28 | - | - | - | - | cl | cl | - | |||||||||
| R80 | - | + | + | + | - | - | - | - | - | + | - | + | + | + | + | - |
„cl” - całkowita liza; „+” - zahamowanie wzrostu; - brak działania
PL 246657 Β1
Tabela 5. Specyficzność wybranych bakteriofagów na wybranych środowiskowych szczepach Pseudomonas sp. (kolekcja Proteon Pharmaceuticals SA)
| X. Bakteriofagi Szczepy baktcrii\ | 22PfluR64PP | 23PfluR64PP | 67PfluRÓ4PP | Cd cc £ X | 69PfluR64PP | 70PfluR64PP | cc cc CE 3 e cc | SSPfluRólPP | 98PfluR60PP |
| P. fluorescens | |||||||||
| R60 | - | - | - | - | - | - | - | - | cl |
| R61 | cl | + | cl | cl | cl | cl | cl | cl | cl |
| R64 | cl | + | cl | cl | + | + | cl | - | - |
| R68 | cl | + | cl | - | - | - | - | - | - |
| R91 | cl | + | cl | + | + | + | cl | - | - |
„cl” - całkowita liza; „+” - zahamowanie wzrostu; - brak działania
Wyizolowane bakteriofagi zostały namnożone z użyciem szczepu gospodarza jako szczepu produkcyjnego. Tak przygotowane próbki poddano procesowi izolacji genomowego DNA badanych bakteriofagów w oparci u o zmodyfikowaną metodę Su i wsp. [Su MT, 1998].
Charakterystyka genetyczna bakteriofagów
Wyizolowany DNA bakteriofagów został wykorzystany do przeprowadzenia analizy restrykcyjnej przy użyciu enzymów Asel, Dra\, Ssp\ i EcoRI. Uzyskane profile restrykcyjne pozwoliły na wstępną charakterystykę genetyczną bakteriofagów (Figura 6, 7, 8 i 9). Następnie dzięki wykorzystaniu techniki sekwencjonowania została przeprowadzona bardziej szczegółowa charakterystyka genetyczna fagów. Uzyskane sekwencje analizowano poprzez porównanie do genomów fagowych w bazie danych BLAST, a następnie poprzez wyznaczenie potencjalnych ramek odczytu w programie Artemis i szukanie homologii do opisanych białek fagowych, używając algorytmu blastp. Na podstawie przeprowadzonej analizy wykazano, że:
- bakteriofag 60AhydR15PP, zaklasyfikowany do rodziny Myoviridae (rząd Caudovirales), zawiera liniowy dwuniciowy DNA (kolisty kształt genomu) wielkości ok 165 kbp i wykazuje wysokie podobieństwo do grupy litycznych bakteriofagów T4, specyficznych w stosunku do licznych bakterii z rodzaju Aeromonas.
— bakteriofag 25AhydR2PP wykazuje wysoką homologię do faga AS7, należącego do rodziny T7-like. Charakteryzuje się dwuniciowym liniowym DNA o wielkości 42 kbp. Należy do fagów litycznych.
- bakteriofag 50AhydR13PP wykazuje wysoką homologię do faga AS7, należącego do rodziny T4-like. Jego genom ma wielkość 165 kbp.
- bakteriofagi 22PfluR64PP, 67PfluR64PP, 71PfluR64PP zostały zaklasyfikowane do rodziny Podoviridae (rząd Caudovirales) o krótkich, niekurczliwych ogonkach i ikosaedralnym kapsydzie, zawierającym liniowy dwuniciowy DNA wielkości ok 40 kbp. Wykazują one wysokie podobieństwo do grupy litycznych bakteriofagów T7, specyficznych w stosunku do licznych bakterii z rodzaju Pseudomonas.
— Sekwencja faga 98PfluR60PP nie wykazała podobieństwa do poznanych dotychczas rodzin fagów. Natomiast szczegółowa analiza porównawcza poszczególnych białek pozwoliła na odnalezienie homologii do typowych białek fagowych, niezbędnych do przeprowadzenia cyklu litycznego. Wielkość genomu faga 98PfluR60PP wynosi 74 kbp.
Przykład 2. Produkcja preparatu
Ustalenie i optymalizacja warunków namnażania bakteriofagów w skali laboratoryjnej.
Optymalizację przeprowadzono dla każdego ze szczepów bakteriofagowych z wykorzystaniem szczepu bakteryjnego będącego gospodarzem dla danego szczepu faga. Optymalizacji poddano następujące parametry hodowli: objętość inokulum hodowli bakteryjnej i bakteriofagów, czas czystej ho dowli i inkubacji hodowli zainfekowanej, temperaturę hodowli, stopień napowietrzania oraz rodzaj podłoża wzrostowego. Jako podłoże wzrostowe wybrano podłoże YES o pH 7,0. Optymalną objętość inokulum hodowli bakteryjnej oceniono na 2 x 109 CFU na 0,5 l podłoża hodowlanego. Zależnie od szczepu bakteriofagów hodowlę bakteryjną prowadzono do gęstości optycznej OD620= 0,2-0,8. Optymalną temperaturą wzrostu hodowli bakteryjnej okazało się 25°C. Zoptymalizowany stopień napowietrzania hodowli osiągnięto przy 140 rpm w wytrząsarce Ecotron firmy Infors. W prowadzonym procesie optymalizacji zaobserwowano, że optymalnym inokulum bakteriofagowym jest dodatek 1% objętości faga o mianie 109 PFU/ml (5 ml na 0,5 l hodowli).
Opracowanie technologii procesu produkcji i oczyszczania zawiesiny bakteriofagowej
Etapy produkcji
1. Hodowla w bioreaktorze
Pierwszym etapem linii produkcyjnej jest namnożenie cząstek bakteriofagowych specyficznie niszczących komórki bakteryjne wybranych szczepów Aeromonas spp. lub Pseudomonas sp. Dokonuje się tego poprzez zainokulowanie podłoża wzrostowego bakteryjnym szczepem produkcyjnym i prowadzenie hodowli do czasu uzyskania odpowiedniej gęstości optycznej, następnie dodaje się inokulum bakteriofagowe i prowadzi proces namnażania cząstek bakteriofagowych (warunki omówione powyżej). Po zakończonym procesie namnażania hodowla przenoszona jest w sposób sterylny za pomocą pompy perystaltycznej do dalszego etapu procesu produkcji.
Każdy ze szczepów bakteriofagów namnażany jest w osobnej hodowli. W naszych badaniach stosowany był 5-litrowy (4 litry objętości roboczej) bioreaktor typu „airlift”, którego podstawową zaletą jest wykorzystanie nowoczesnych jednorazowych toreb hodowlanych.
2. Usuwanie biomasy
Zakończony proces namnażania bakteriofagów wymaga usunięcia pozostałości bakteryjnych z płynu hodowlanego. W tym celu wykonuje się mikrofiltrację tangencjalną z zastosowaniem membrany o wielkości porów 0,45 μm, a następnie mikrofiltrację z użyciem membrany o wielkości porów 0,22 μm. Taka procedura zapewnia uzyskanie sterylnej zawiesiny bakteriofagów przy bardzo niewielkim spadku miana cząstek fagów.
3. Oznaczenie aktywności wyprodukowanego komponentu
Po zakończonym procesie filtracji zawiesina bakteriofagowa poddawana jest oznaczeniu aktywności wyrażonej w jednostkach PFU/ml (plaque forming unit/ml). Oznaczenie aktywności prowadzi się zgodnie ze zwalidowaną w Proteon Pharmaceuticals SA procedurą „Oznaczanie miana bakteriofagów w zawiesinie metodą agaru dwuwarstwowego” (Certyfikat Dobrej Praktyki Laboratoryjnej nr 10/2015/DP).
4. Przygotowanie gotowego preparatu bakteriofagowego
W tym etapie przeprowadza się mieszanie wyprodukowanych komponentów. Przed zmieszaniem wylicza się objętości poszczególnych komponentów zapewniające ich równoważną ilość w preparacie. Wyliczeń dokonuje się na podstawie oznaczonych uprzednio aktywności (PFU/ml). Gotowy preparat jest następnie porcjowany i przechowywany w temp. 2-8°C.
Przykład 3. Badania efektywności i bezpieczeństwa preparatu bakteriofagowego
W badaniach zastosowano 3 preparaty bakteriofagowe o następującym składzie:
- BAFADOR II: 60AhydR15PP, 62AhydR11PP, 13AhydR10PP, 14AhydR10PP,
85AhydR10PP, 22PfluR64PP, 67PfluR64PP, 71PfluR64PP,
- BAFADOR III: 60AhydR15PP, 25AhydR2PP, 50AhydR13PP, 22PfluR64PP, 67PfluR64PP, 71PfluR64PP, 98PfluR60PP,
- BAFADOR IV: 60AhydR15PP, 25AhydR2PP, 50AhydR13PP, 22PfluR64PP, 98PfluR60PP.
Wszystkie użyte preparaty charakteryzowały się równoważną ilością każdego z komponentów i aktywnością na poziomie 108 PFU/ml.
Preparaty fagowe zostały przygotowane w taki sposób, że każdy z bakteriofagów poddano zoptymalizowanej procedurze namnażania, a następnie oczyszczono od pozostałości bakteryjnych stosując mikrofiltrację i poddano oznaczeniu aktywności wyrażonej w PFU/ml. Uzyskane zawiesiny fagowe zmieszano w równoważnych ilościach uzyskując gotowy produkt. Tak przygotowane preparaty sprawdzone pod względem czystości mikrobiologicznej nie wykazywały obecności bakterii.
PL 246657 Β1
Badania in vitro
W oparciu o zmiany gęstości optycznej szczepów bakterii (pomiary ODszo), badano zdolność redukowania liczby komórek bakterii przez zastosowanie opracowanych preparatów bakteriofagowych i pojedynczych bakteriofagów, wchodzących w ich skład.
W badaniach wykorzystano 3 preparaty bakteriofagowe (BAFADOR II, BAFADOR III i BAFADOR IV) oraz zawiesiny 11 różnych bakteriofagów (13AhydR10PP, 14AhydR10PP, 25AhydR2PP, 50AhydR13PP, 60AhydR15PP, 62AhydR11PP, 85AhydR10PP, 22PfluR64PP, 67PfluR64PP, 71PfluR64PP i 98PfluR60PP).
Jako system badawczy wykorzystano 5 szczepów bakterii: A. hydrophila 7966, A. hydrophila 7965, A. hydrophila 49140, A. hydrophila 33658 i P. fluorescens 8B/UWM.
Oznaczenia przeprowadzono w tryplikatach, na płytkach 96-dołkowych. Hodowle bakteryjne, uprzednio doprowadzone do gęstości optycznej ok. 0,2, mieszano z zawiesinami bakteriofagów w stosunku objętościowym 1:1 (100 μΙ : 100 μΙ), a następnie inkubowano w temp. 25°C przez 21 godzin. Wartość OD62o mierzono co 20 minut.
Wyniki przedstawiono na figurach 1-5.
Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono znaczną przewagę mieszanek bakteriofagów nad pojedynczymi komponentami w eradykacji szczepów bakteryjnych. Ponadto, przeprowadzone badania potwierdziły większą skuteczność preparatów bakteriofagowych BAFADOR III i BAFADOR IV w porównaniu do preparatu BAFADOR II.
Badania in vivo
Ocena bezpieczeństwa stosowania prototypowego preparatu bakteriofagowego w ochronie ryb hodowlanych przed patogenami bakteryjnymi
Badania zostały przeprowadzone we współpracy z Uniwersytetem Warmińsko-Mazurskim.
Przebieg doświadczenia 1
Materiał do badań stanowiło 20 karpi, 20 pstrągów tęczowych i 20 sumów europejskich utrzymywanych w oddzielnych basenach, którym podawano preparat bakteriofagowy BAFADOR II w stężeniu 105 PFU/ml przez okres 1 godz. Ocenę wybranych parametrów hematologicznych i biochemicznych we krwi ryb przeprowadzano przed podaniem preparatu BAFADOR II oraz po upływie 1,2 i 3 dni od podania.
Tabela 6. Wpływ preparatu bakteriofagowego podawanego w immersji na wybrane parametry hematologiczne i biochemiczne u karpia (n = 20, wartości średnie ± odchylenie standardowe; * istotność różnic na poziomie p < 0,05).
| Oznaczane parametry | Okresy pobierania krwi (dni po immersji) | |||
| Przed immersja | 1 | 2 | 3 | |
| Liczba erytrocytów (RBC) (mln/mm) | 1,5 ±0,4 | 1,6 ± 0,5 | 1,7 ±0,3 | 1,6 ±0,3 |
| Wartość hcmatokrytu (Ht) (%) | 32,5 ± 3,2 | 34,5 ±3,4 | 34,9 ±3,2 | 33,4 ± 2,9 |
| Poziom hemoglobiny (Hb) (g%) | 10,6 ± 1,4 | 11,4 ± 1,4 | 11,6 ± 1,6 | 10,8 ± 1,5 |
| Średnia masa hemoglobin (g/L) | 58,4 ± 7,5 | 56,5 ± 8,4 | 55,9 ± 7,5 | 57,9 ± 8,5 |
| Średnie stężenie hemoglobiny (g/L ) | 25,6 ± 5,5 | 26,4 ± 4,8 | 27,6 ±5,2 | 26,8 ± 4,9 |
| Poziom kortyzolu (ng/L) | 179 ±27 | 185 ±32 | 191 ± 45 | 187 ±35 |
| Poziom glukozy (mg/L) | 110 ± 15 | 115 ± 14 | 114 ± 12 | 118 ± 16 |
| Aktywność aminotransferazy asparaginowej (AST) (U/L) | 84,2 ± 12,5 | 86,5 ± 13,8 | 87,2 ± 14,5 | 88,9 ± 13,3 |
| Akty wność aminotransferazy | 2,5 ± 0,8 | 2,7 ± 0,7 | 2,8 ± 0,6 | 2,9 ± 0,8 |
| alarunowej (ALT) (U/L) |
PL 246657 Β1
Tabela 7. Wpływ preparatu bakteriofagowego podawanego w immersji na wybrane parametry hematologiczne i biochemiczne u pstrąga tęczowego (n = 20, wartości średnie ± odchylenie standardowe; ‘istotność różnic na poziomie p < 0,05).
Okresy pobierania krwi (dni po immersji)
| Oznaczane parametry | Przed iminersją | 1 | 2 | 3 |
| Liczba erytrocytów (RBC) (mln/mm) | 2,4 ± 0,5 | 2,8 ± 0,6 | 2,7 ±0,5 | 2,6 ± 0,4 |
| Wartość hematokrytu (Hl) (%) | 39,8 ± 4,5 | 40,5 ±4,1 | 41,6 ± 3,8 | 42,5 ± 3,9 |
| Poziom hemoglobiny (Hb) (g%) | 26,5 ± 3,8 | 28,2 ± 3,2 | 27,8 ±2,9 | 28,9 ± 3,6 |
| Średnia masa hemoglobin (g/L) | 58,4 ± 7,5 | 56,5 ± 8,4 | 55,9 ± 7,5 | 57,9 ± 8,5 |
| Średnie stężenie hemoglobiny (g/L ) | 31,5 ±5,2 | 32,8 ±4,5 | 34,2 ±4,8 | 33,6 ± 4,2 |
| Poziom kortyzolu (ng/L) | 192 ± 34 | 198 ± 32 | 197 ±35 | 191 ±38 |
| Poziom glukozy (mg/L) | 185 ± 23 | 192 ± 26 | 193 ±27 | 189 ± 25 |
| Aktywność aminotransferazy asparaginowej (AST) (U/L) | 96,5 ± 22,4 | 98,5 ± 23,5 | 97,8 ± 24,2 | 98,5 ±24,4 |
| Akty wność aminotransferazy alaninowej (ALT) (U/L) | 4,6 ± 1,2 | 4,9 ± 1,5 | 4,8 ± 1,4 | 4,7 ± 1,7 |
| Tabela 8. Wpływ preparatu bakteriofagowego podawanego w immersji na wybrane parametry hematologiczne i biochemiczne u suma (n = 20, wartości średnie ± odchylenie standardowe; ‘istotność różnic na poziomie p < 0,05). | ||||
| Oznaczane parametry | Okresy pobierania krwi (dni po immersji) | |||
| Przed iminersją | 1 | 2 | 3 | |
| Liczba erytrocytów (RBC) (mln/mm) | 1,5 ±0,5 | 1,7 ± 0,5 | 1,8 ± 0,5 | 1,6 ±0,5 |
| Wartość hematokiytu (Ht) (%) | 19,7 ± 1,5 | 20,8 ± 1,1 | 21,4 ± 1,8 | 20,3 ± 1,9 |
| Poziom hemoglobiny (Hb) (g%) | 21,5 ±2,8 | 22,4 ± 2,2 | 23,8 ±2,8 | 22,7 ± 2,6 |
| Poziom korty zolu (ng/L) | 142 ±31 | 148 ± 34 | 147 ±29 | 141 ±27 |
| Poziom glukozy (mg/L) | 165 ± 20 | 162 ± 19 | 163 ±21 | 168 ± 22 |
Na podstawie uzyskanych wyników badań wykazano, że preparat BAFADOR II nie wpływał negatywnie na wybrane parametry hematologiczne (liczba erytrocytów, wartość hematokrytu i poziom hemoglobiny), aktywność enzymów wątrobowych AST i ALT oraz poziom glukozy do 3 dnia po podaniu rybom z gatunków: karp (Tabela 6), pstrąg tęczowy (Tabela 7) i sum europejski (Tabela 8). Nie zaobserwowano również istotnych zmian w poziomie kortyzolu, hormonu wydzielanego w trakcie stresu.
Przebieg doświadczenia 2
Materiał do badań stanowiło 20 karpi, 20 pstrągów tęczowych 20 sumów utrzymywanych w oddzielnych basenach, którym podano w immersji jednogodzinnej preparat bakteriofagowy BAFADOR II wstężeniu 105 PFU/ml. Ocenę wybranych parametrów nieswoistej odporności komórkowej i humoralnej we krwi ryb przeprowadzano przed podaniem preparatu BAFADOR II oraz po upływie 3, 5 i 7 dni od podania.
PL 246657 Β1
Tabela 9. Wpływ preparatu bakteriofagowego podawanego w immersji na wybrane parametry immunologiczne u karpia (n = 20, wartości średnie ± odchylenie standardowe; ‘istotność różnic na poziomie p < 0,05).
| Oznaczane parametry | Okresy pobierania krwi (dni po immersji) | |||
| 0 | 3 | 5 | 7 | |
| Aktywność metaboliczna fagocytów (RBA, OD 620 nm) | 0,46 ± 0,03 | 0,58 ±0,5* | 0,75 ±0,05* | 0,85 ± 0,04* |
| Aktywność bójcza fagocytów (PKA, OD 620 nm) | 0,38 ± 0,04 | 0,49 ± 0,5* | 0,60 ± 0,04* | 0,75 ± 0,05* |
| Aktywność proliferacyjna limfocytów stymulowana ConA (OD 620 nm) | 0,49 ±0,05 | 0,62 ± 0,5* | 0,86 ± 0,04* | 0,91 ± 0,05* |
| Aktywność proliferacyjna limfocytów sty mulowana LPS (OD 620 nm) | 0,32 ±0,04 | 0,56 ±0,7* | 0,69 ± 0,07* | 0,79 ± 0,05* |
| Aktywność lizozymy w surowicy (mg/L) | 1,8 ± 0,4 | 2,9 ± 0,6* | 3,6 ±0,4* | 4,1 ± 0,4* |
| Aktywność ceniloplazminy w surowicy (1U) | 64,5 ± 5,9 | 72,5 ± 4,6* | 73,5 ±4,8* | 74,0 ± 5,2* |
| Poziom białka całkowitego w surowicy (g/L) | 43,5 ± 4.0 | 50,3 ±3,5* | 51,0 ±4,5* | 50,8 ± 4,2* |
| Poziom Ig w surowicy (g/L) | 7,5 ± 0,6 | 8,9 ± 0,7* | 9,6 ± 0,8* | 10,5 ± 0,7* |
Tabela 10. Wpływ preparatu bakteriofagowego podawanego w immersji na wybrane parametry immunologiczne u pstrąga tęczowego (n = 20, wartości średnie ± odchylenie standardowe; * istotność różnic na poziomie p < 0,05).
| Oznaczane parametry | Okresy pobierania krwi (dni po immersji) | |||
| 0 | 3 | 5 | 7 | |
| Aktywność metaboliczna fagocytów (RBA, OD 620 nm) | 0,52 ± 0,04 | 0,63 ± 0,5* | 0,80 ± 0,06* | 0,89 ± 0,05* |
| Akty wność bójcza fagocytów (PKA, OD 620 mn) | 0,34 ±0,03 | 0,52 ± 0,6* | 0,69 ± 0,07* | 0,80 ± 0,06* |
| Aktywność proliferacyjna limfocytów stymulowana ConA (OD 620 nm) | 0,56 ± 0,07 | 0,72 ± 0,6* | 0,89 ± 0,05* | 0,95 ± 0,07* |
| Aktywność proliferacyjna limfocytów stymulowana LPS (OD 620 nm) | 0,39 ± 0,05 | 0,58 ±0,5* | 0,75 ± 0,06* | 0,84 ±0,06* |
| Aktywność lizozymy w surowicy (mg/L) | 89 ± 10 | 97 ± 11* | 105 ± 10* | 108±12* |
| Aktywność ceniloplazminy w surowicy (IU) | 72,5 ± 5,5 | 84,5 ± 6,5* | 85,0 ±4,5* | 82,0 ± 5,8* |
| Poziom białka całkowitego w surowicy (g/L) | 48,5 ± 5,0 | 56,5 ± 5,5* | 58,0 ± 5,0* | 55,0 ±4,5* |
| Poziom Ig w surowicy (g/L) | 8,4 ± 0,6 | 9,7 ± 0,9 | 10,8 ±0,6 | 11,5 ±0,8 |
PL 246657 Β1
Tabela 11. Wpływ preparatu bakteriofagowego podawanego w immersji na wybrane parametry immunologiczne u suma europejskiego (n = 20, wartości średnie ± odchylenie standardowe; ‘istotność różnic na poziomie p < 0,05).
| Oznaczane parametry | Okresy pobierania krwi (dni po immersji) | |||
| 0 | 3 | 5 | 7 | |
| Aktywność metaboliczna fagocytów (RBA, OD 620 nm) | 0,39 ± 0,05 | 0,58 ± 0,4* | 0,72 ± 0,05* | 0,79 ± 0,04* |
| Aktywność bójcza fagocytów (PKA. OD 620 nm) | 0,30 ± 0,04 | 0,47 ± 0,4* | 0,58 ± 0,05* | 0,67 ± 0,05* |
| Aktywność proliferacyjna limfocytów stymulowana ConA (OD 620 nm) Aktywność proliferacyjna | 0,41 ±0,04 | 0,56 ±0,5 * | 0,69 ± 0,06* | 0,75 ± 0,04* |
| limfocytów stymulowana LPS (OD 620 nm) | 0,32 ± 0,04 | 0,47 ± 0,4* | 0,61 ±0,05* | 0,70 ± 0,05* |
| Aktywność lizozymy w surow icy1 (mg/L) | 2,6 ± 0,4 | 3,4 ±0,5* | 4,2 ± 0,6* | 4,9 ± 0,5* |
| Aktywność ceruloplazminy w surowicy' (TU) | 61,0 ±6,5 | 72,5 ±4,5* | 74,0 ± 5,5* | 73,0 ± 4,5* |
| Poziom białka całkowitego w surowicy' (g/L) | 41,5 ±3,0 | 50,0 ± 3,5* | 51,5 ±4,0* | 52,0 ± 3,5* |
| Poziom Tg w surowicy (g/L) | 6,8 ± 0,5 | 7.9 ± 0,7* | 8,8 ±0,5* | 9,5 ± 0,5* |
Na podstawie uzyskanych wyników badań wykazano, że preparat BAFADOR II powoduje istotny statystycznie (p < 0,05) wzrost oznaczanych parametrów nieswoistej odporności komórkowej (aktywność metaboliczna i bójcza fagocytów, aktywność proliferacyjna limfocytów) i humoralnej (aktywność lizozymu i ceruloplazminy, poziom białka całkowitego i Ig w surowicy) u badanych gatunków ryb. Zmiany te zaobserwowano już w 3 dniu po podaniu preparatu.
Ocena efektywności stosowania prototypowego preparatu bakteriofagowego w ochronie ryb hodowlanych przed patogenami bakteryjnymi.
Badania zostały przeprowadzone we współpracy z Uniwersytetem Warmińsko-Mazurskim.
Cel: Ocena możliwości zastosowania bakteriofagów do zapobiegania infekcjom powodowanym u ryb hodowlanych przez bakterie z rodzaju Pseudomonas sp.
Materiał do badań stanowił karp zakażony eksperymentalnie w iniekcji dootrzewnowej szczepem środowiskowym Pseudomonas fluorescens wyizolowanym od chorych ryb i zidentyfikowanym na poziomie biochemicznym testem API. Do infekcji ryb zastosowano zawiesinę bakterii w stężeniu 6 x 108 (dawka 0,2 ml/sztukę). Preparaty bakteriofagowe (BAFADOR II, III i IV) podawano w immersji przez okres 1 godz.
Przebieg doświadczenia 3
Materiał do badań stanowiło 100 karpi podzielonych losowo na 5 równych grup utrzymywanych w 5 oddzielny basenach. Ryby z grupy 2, 3, 4 i 5 zostały zakażone eksperymentalnie w iniekcji dootrzewnowej szczepem środowiskowym P. fluorescens wyizolowanym od chorych ryb i zidentyfikowanym na poziomie biochemicznym testem API. Do infekcji ryb zastosowano zawiesinę bakterii w stężeniu 6 x 108 (dawka 0,2 ml/sztukę). Preparat bakteriofagowy (BAFADOR II) został podany w immersji w stężeniu 105 PFU/ml przez okres 1 godz.
PL 246657 Β1
Tabela 12. Schemat podawania bakterii i bakteriofagów.
| Nr grupy | Ilość ryb | Opis doświadczenia |
| 1 | 20 | Kontrola negatywna niezakażana i nie traktowana preparatem bakteriofagowym |
| 2 | 20 | Kontrola pozytywna zakażana bakteriami P. fluorescens'. 6xl08 CFU/ml (dawka 0,2 ml/sztukę) |
| 3 | 20 | Grupa zakażona bakteriami P. fluorescens'. 6xl08 CFU/ml (dawka 0,2 ml/rybę) i traktowana preparatem bakteriofagowym (BAFADOR II) w stężeniu 10-’ PFU/ml (25 ml preparatu w stężeniu 10s PFU/ml/2,5 L wody, kąpiel przez 1 h) po 24 godzinach od zakażenia |
| 4 | 20 | Grupa zakażona bakteriami P. fluorescens'. 6xl08 CFU/ml (dawka 0,2 ml/rybę) i traktowana preparatem bakteriofagowym (BAFADOR II) w stężeniu 105 PFU/ml (25 ml preparatu w stężeniu 108 PFU/ml /2,5 L wody, kąpiel przez 1 h) po 48 godzinach od zakażenia |
| 5 | 20 | Grupa zakażona bakteriami P. fluorescens’. 6xl08 CFU/ml (dawka 0,2 ml/rybę) i traktowana preparatem bakteriofagowym (BAFADOR II) w stężeniu 105 PFU/ml (25 ml preparatu w stężeniu 108 PFU/ml /2,5 L wody, kąpiel przez 1 h) po 24 i 48 godzinach od zakażenia |
W trakcie całego eksperymentu oceniano śmiertelność ryb (Tabela 13). Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że preparat bakteriofagowy powoduje zmniejszenie śmiertelności ryb w grupach, które otrzymały bakteriofagi zarówno 24 (grupa 3), jak i 48 godz. (grupa 4) po eksperymentalnym zakażeniu bakteriami P. fluorescens (odpowiednio 20% i 30% śnieć). Najsilniejsze działanie terapeutyczne zaobserwowano po dwukrotnym podaniu preparatu w immersji 24 i 48 godzin po zakażeniu (grupa 5; 15% śnieć).
Tabela 13. Przebieg śnieć w hodowli karpia po zakażeniu eksperymentalnym bakteriami P. fluorescens i podaniu preparatu bakteriofagowego (BAFADOR II).
| Data — | Numer grupy | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 2.10.2015 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 3.10.2015 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 4.10.2015 | 0 | 3 | 1 | 2 | 0 |
| 5.10.2015 | 0 | 3 | 1 | 2 | 1 |
| 6.10.2015 | 0 | 3 | 1 | 1 | 1 |
| 7.10.2015 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 8.10.2015 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Śmiertelność | β | 11 | Λ | ||
| (w sztukach) | |||||
| Śmiertelność kumulowana | 0% | 55% | 20% | 30% | 15% |
Przebieg doświadczenia 4
Materiał do badań stanowiło 100 karpi podzielonych losowo na 5 równych grup utrzymywanych w 5 oddzielny basenach. Ryby z grupy 2, 3, 4 i 5 zostały zakażone eksperymentalnie w iniekcji dootrzewnowej szczepem środowiskowym P. fluorescens wyizolowanym od chorych ryb i zidentyfikowanym na poziomie biochemicznym testem API. Do infekcji ryb zastosowano zawiesinę bakterii w stężeniu 6 x 108 (dawka 0,2 ml/sztukę). Preparat bakteriofagowy (BAFADOR III) został podany w immersji w stężeniu 105 PFU/ml przez okres 1 godz.
PL 246657 Β1
Tabela 14. Schemat podawania bakterii i bakteriofagów
| Nr grupy | Ilość ry b | Opis doświadczenia |
| 1 | 20 | Kontrola negatywna niezakaźana i nie traktowana preparatem bakteriofagowym |
| 2 | 20 | Kontrola pozytywna zakażana bakteriami P. fluorescens'. 6xlOs CFU/ml (dawka 0,2 ml/sztukę) |
| 3 | 20 | Grupa zakażona bakteriami P. fluorescens'. 6xl08 CFU/ml (dawka 0,2 ml/rybe) i traktowana preparatem bakteriofagowym (BAFADOR III) wr stężeniu 105 PFU/ml (25 ml preparatu w stężeniu 108 PFU/ml /2,5 L wody, kąpiel przez 1 h) po 24 godzinach od zakażenia |
| 4 | 20 | Gnipa zakażona bakteriami P. fluorescens·. 6xl08 CFU/ml (dawka 0,2 ml/rybę) i traktowana preparatem bakteriofagowym (BAFADOR III) w stężeniu 105 PFU/ml (25 ml preparatu w' stężeniu 108 PFU/ml /2,5 L wody, kąpiel przez 1 h) po 48 godzinach od zakażenia |
| 5 | 20 | Grupa zakażona bakteriami P. fluorescens'. 6xl08 CFU/ml (dawka 0,2 ml/rybę) i traktowana preparatem bakteriofagowym (BAFADOR III) w; stężeniu 10“ PFU/ml (25 ml preparatu w stężeniu 108 PFU/ml /2,5 L wody, kąpiel przez 1 h) po 24 i 48 godzinach od zakażenia |
W trakcie całego eksperymentu oceniano śmiertelność ryb (Tabela 15). Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że preparat według wynalazku powoduje zmniejszenie śmiertelności ryb w grupach, które otrzymywały bakteriofagi zarówno 24 (grupa 3), jak i 48 godz. (grupa 4) po eksperymentalnym zakażeniu bakteriami P. fluorescens (odpowiednio 15% i 25% śnieć). Najsilniejsze działanie terapeutyczne zaobserwowano po dwukrotnym podaniu preparatu w immersji 24 i 48 godzin po zakażeniu (grupa 5; 10% śnieć).
Tabela 15. Przebieg śnieć w hodowli karpia po zakażeniu eksperymentalnym bakteriami P. fluorescens i podaniu preparatu bakteriofagowego (BAFADOR III).
| Data — | Numer grupy | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 12.10.2015 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 13.10.2015 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 14.10.2015 | 0 | 3 | 1 | 1 | 0 |
| 15.10.2015 | 0 | 3 | 1 | 2 | 1 |
| 16.10.2015 | 0 | 3 | 1 | 1 | 1 |
| 17.10.2015 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| 18.10.2015 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Śmiertelność (w sztukach) | 0 | 10 | 3 | 5 | 2 |
| Śmiertelność kumulowana | 0% | 50% | 15% | 25% | 10% |
Przebieg doświadczenia 5
Materiał do badań stanowiło 100 karpi podzielonych losowo na 5 równych grup utrzymywanych w 5 oddzielny basenach. Ryby z grupy 2, 3, 4 i 5 zostały zakażone eksperymentalnie w iniekcji dootrzewnowej szczepem środowiskowym P. fluorescens wyizolowanym od chorych ryb i zidentyfikowanym na poziomie biochemicznym testem API. Do infekcji ryb zastosowano zawiesinę bakterii w stężeniu 6 x 108 (dawka 0,2 ml/sztukę). Preparat bakteriofagowy (BAFADOR IV) został podany w immersji w stężeniu 105 PFU/ml przez okres 1 godz.
PL 246657 Β1
Tabela 16. Schemat podawania bakterii i bakteriofagów.
| N r grupy | Ilość ry b | Opis doświadczenia |
| 1 | 20 | Kontrola negatywna niezakażana i nie traktowana preparatem bakteriofagowym |
| 2 | 20 | Kontrola pozytywna zakażana bakteriami P. fluorescens-. 6x10® CFU/ml (dawka 0,2 ml/sztukę) |
| 3 | 20 | Grupa zakażona bakteriami P. fluorescens: 6x10® CFU/ml (dawka 0,2 ml/rybę) i traktowana preparatem bakteriofagowym (BAFADOR IV) w stężeniu 105 PFU/inl (25 ml preparatu w stężeniu 10- PFU/ml /2,5 L wody, kąpiel przez 1 h) po 24 godzinach od zakażenia |
| 4 | 20 | Grupa zakażona bakteriami P. fluorescens: 6xl08 CFU/ml (dawka 0,2 ml/rybę) i traktowana preparatem bakteriofagowym (BAFADOR IV) w stężeniu 10’ PFU/ml (25 ml preparatu w stężeniu 108 PFU/ml /2,5 L wody, kąpiel przez 1 h) po 48 godzinach od zakażenia |
| 5 | 20 | Grupa zakażona bakteriami P. fluorescens: 6x10® CFU/ml (dawka 0,2 ml/rybę) i traktowana preparatem bakteriofagowym (BAFADOR IV) w stężeniu 105 PFU/ml (25 ml preparatu w stężeniu 10® PFU/ml /2,5 L w ody, kąpiel przez 1 h) po 24 i 48 godzinach od zakażenia |
W trakcie całego eksperymentu oceniano śmiertelność ryb (Tabela 17). Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że preparat według wynalazku powoduje zmniejszenie śmiertelności ryb w grupach, które otrzymywały bakteriofagi zarówno 24 (grupa 3), jak i 48 godz. (grupa 4) po eksperymentalnym zakażeniu bakteriami Pseudomonas fluorescens (30% śnieć). Najsilniejsze działanie terapeutyczne zaobserwowano po dwukrotnym podaniu preparatu w immersji 24 i 48 godzin po zakażeniu (grupa 5, 20% śnieć).
Tabela 17. Przebieg śnieć w hodowli karpia po zakażeniu eksperymentalnym bakteriami P. fluorescens i podaniu preparatu bakteriofagowego (BAFADOR IV).
| Data _ | Numer grupy | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 22.10.2015 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 23.10.2015 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 24.10.2015 | 0 | 3 | 1 | 1 | 0 |
| 25.10.2015 | 0 | 3 | 1 | 2 | 1 |
| 26.10.2015 | 0 | 2 | 1 | 1 | 0 |
| 27.10.2015 | 0 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| 28.10.2015 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Śmiertelność (w sztukach) | 0 | 11 | 3 | 5 | 2 |
| Śmiertelność kumulowana | 0% | 55% | 15% | 25% | 10% |
Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń wykazano znaczące zmniejszenie śmiertelności ryb, które otrzymywały preparat bakteriofagowy zarówno 24, jak i 48 godz. po eksperymentalnym zakażeniu bakteriami P. fluorescens. Najsilniejsze działanie terapeutyczne uzyskano po dwukrotnym podaniu preparatu w immersji 24 i 48 godz. po zakażeniu. Ponadto zaobserwowano, że śmiertelność ryb była najmniejsza w badaniach, w których zastosowano mieszaninę bakteriofagów oznaczoną jako
BAFADOR III i IV. W doświadczeniach tych śmiertelność ryb po dwukrotnym podaniu preparatu bakteriofagowego wynosiła 10%, natomiast w grupie, w której zastosowano preparat BAFADOR II śnięcia wynosiły 15%.
Podsumowanie wyników badań dotyczących bezpieczeństwa i skuteczności preparatu u hodowlanych gatunków ryb.
1. Preparat bakteriofagowy nie wpływa na biochemiczne i hematologiczne parametry krwi u ryb hodowlanych.
2. Preparat bakteriofagowy stymuluje nieswoiste mechanizmy odporności komórkowej i humoralnej u ryb hodowlanych.
3. Preparat bakteriofagowy zmniejsza śmiertelność ryb zakażonych patogennym szczepem bakterii
Piśmiennictwo
Pridgeon JW, and Klesius PK. Major bacterial diseases in aquaculture and their vaccine development. CAB Reviews 2012, 7, No. 048 doi: 10.1079/PAVSNNR20127048.
Sudheesh PS, Al-Ghabshi A, Al-Mazrooei N, Al-Habsi S. Comparative pathogenomics of bacteria causing infectious diseases in fish. Int J Evol Biol. 2012;2012:457264.
Almeida A, Cunha A, Gomes NC, Alves E, Costa L, Faustino MA. Phage therapy and photodynamic therapy: low environmental impact approaches to inactivate microorganisms in fish farming plants. Mar Drugs. 2009, 30;7(3):268-313.
Heuer OE, Kruse H, Grave K, Collignon P, Karunasagar I, Angulo FJ. Human health consequences of use of antimicrobial agents in aquaculture. Clin Infect Dis. 2009, 15;49(8): 1248-53.
Richards GP. Bacteriophage remediation of bacterial pathogens in aquaculture: a review of the technology, Bacteriophage, 4:4, e975540, DOI: 10.4161/21597081.2014.97554.
Eyer L, Pantucek R, Ruzickova V, Doskar J. [New perspectives of the phage therapy]. Klin Mikrobiol Infekc Lek. 2007, 13(6):231-5
Clark JR, March JB. Bacteriophages and biotechnology: vaccines, gene therapy and antibacterials. Trends Biotechnol. 2006, 24(5):212-8.
Pirnay JP, Verbeken G, Rose T, Serge Jennes S, Zizi M, Isabelle Huys I, Rob Lavigne R, Maia Merabishvili M, Mario Vaneechoutte M, Angus Buckling A, De Vos D. Introducing yesterday’s phage therapy in today’s medicine. Future Virol. 2012, 7(4): 379-390.
Atterbury RJ, Van Bergen MA, Ortiz F, Lovell MA, Harris JA, De Boer A, Wagenaar JA, Allen VM, Barrow PA. Bacteriophage therapy to reduce salmonella colonization of broiler chickens. Appl Environ Microbiol. 2007, 73(14):4543-9.
Bhardwaj SB. Bacteriophage Therapy: A possible new alternative for oral diseases.
Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci.2014, 3(6) 437-442.
Górski A, Międzybrodzki R, Borysowski J, Dąbrowska K, Wierzbicki P, Ohams M, Korczak-Kowalska G, Olszowska-Zaremba N, Łusiak-Szelachowska M, Kłak M, Jończyk E, Kaniuga E, Gołaś A, Purchla S, Weber-Dąbrowska B, Letkiewicz S, Fortuna W, Szufharowski K, Pawełczyk Z, Rogóż P, Kłosowska D. Phage as a modulator of immune responses: practical implications for phage therapy. Adv Virus Res. 2012, 3:41-71.
Weber-Dabrowska B, Mulczyk M, Górski A. Bacteriophage therapy of bacterial infections: an update of our institute's experience. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2000,48(6):547-51.
Pereira C, Silva YJ, Santos AL, Cunha A, Gomes NC, Almeida A. Bacteriophages with potential for inactivation of fish pathogenic bacteria: survival, host specificity and effect on bacterial community structure. Mar Drugs. 2011, 9(11 ):2236-55.
Kim JH, Son JS, Choi YJ, Choresca CH, Shin SP, Han JE, Jun JW, Kang DH, Oh C, Heo SJ, Park SC. Isolation and characterization of a lytic Myoviridae bacteriophage PAS-1 with broad infectivity in Aeromonas salmonicida. Curr Microbiol. 2012, 64(5):418-26
United States Patent Application Publication US 2013/0323209 Al. Novel bacteriophage and its use for preventing proliferation of pathogenic bacteria.
Kim JH, Son JS, Choi YJ, Choresca CH, Shin SP, Han JE, Jun JW, Park SC. Complete genomic sequence of a T4-like bacteriophage, phiAS4, infecting Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. Arch Virol. 2012, 157(2):391-5.
Park SC, Shimamura I, Fukunaga M, Mori KI, Nakai T. Isolation of bacteriophages specific to a fish pathogen, Pseudomonas plecoglossicida, as a candidate for disease control. Appl Environ Microbiol. 2000, 66(4): 1416-22.
Prasad Y, Kumar D, Sharma AK, Nisha D, Ninawe AS. Isolation and efficacy characterizations of lytic bacteriophages against antibiotic resistant Pseudomonas fluorescens from Sub Himalaya region. Biochem. Cell. Arch. 2010, 10:21-29.
Imbeault S, Parent S, Lagace M, Uhland CF, Blais JF. Using Bacteriophages to prevent furunculosis caused by Aeromonas salmonicida in farmed brook trout. J Aquat Anim Health 2006, 18 (3): 203-214. United States Patent Application Publication US 2014/0105866 Al. Bacteriophages useful for the prophylaxis and therapy of Vibrio anguillarum.
Cruz-Papa D, Candare CM, Cometa GF, Gudez DE, Guevara AM, Relova MB, Pap RD. Aeromonas hydrophila Bacteriophage UP87: An Alternative to Antibiotic Treatment for Motile Aeromonas Septicemia in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). The Philippine agriculturist 2014, 97(1): 96-101.
Wu JE, Hui-Ming Fin HM, Jan F, Hsu YL., Chang LH. Biological Control of Fish Bacterial Pathogen, Aeromonas hydrophila, by Bacteriophage AH 1. Fish Pathology 1981, 15 (3/4):271-276.
Prasad Y, Arpana, Kumar D, Sharma AK. Lytic bacteriophages specific to Flavobacterium columnare rescue catfish, Clarias batrachus (Finn.) from columnaris disease. J Environ Biol. 2011, 32(2): 161-8.
Su MT, Tyamagondlu V. V., Bodmer R. 1998. Large- and small-scale preparation of bacteriophage lambda lysate and DNA. BioTechniques, 25(1): 44-6.
Claims (3)
1. Bakteriofagi stymulujące odporność przeciwzakaźną ryb do stosowania w leczeniu zakażeń u ryb hodowlanych, wywoływanych patogennymi szczepami bakterii wrażliwymi na działanie tych bakteriofagów, przy czym bakteriofagi są podawane zakażonym rybom w immersji co najmniej dwukrotnie w odstępach 24-godzinnych, przy czym zakażeniem jest zakażenie patogennymi szczepami Aeromonas spp. i Pseudomonas sp., zwłaszcza szczepami Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida lub Pseudomonas fluorescens u ryb hodowlanych, przy czym stosuje się szczep bakteriofaga wybrany z grupy obejmującej szczepy zdeponowane w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod następującymi numerami depozytowymi: F/00096 (szczep 25AhydR2PP), F/00094 (szczep 50AhydR13PP), F/00098 (szczep 22PfluR64PP), F/00099 (szczep 67PfluR64PP), F/00100 (szczep 71PfluR64PP), F/00095 (szczep 98PfluR60PP) oraz F/00101 (szczep 60AhydR15PP).
2. Bakteriofagi do stosowania w stymulowaniu odporności ryb przeciw zakażeniom bakteryjnym, przy czym stymulowane są nieswoiste komórkowe mechanizmy obronne i humoralne mechanizmy obronne, przy czym stosuje się szczep bakteriofaga wybrany z grupy obejmującej szczepy zdeponowane w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod następującymi numerami depozytowymi: F/00096 (szczep 25AhydR2PP), F/00094 (szczep 50AhydR13PP), F/00098 (szczep 22PfluR64PP), F/00099 (szczep 67PfluR64PP), F/00100 (szczep 71PfluR64PP), F/00095 (szczep 98PfluR60PP) oraz F/00101 (szczep 60AhydR15PP).
3. Szczep bakteriofaga wybrany z grupy obejmującej szczepy zdeponowane w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod następującymi numerami depozytowymi: F/00096 (szczep
25AhydR2PP), F/00094 (szczep 50AhydR13PP), F/00098 (szczep 22PfluR64PP), F/00099 (szczep 67PfluR64PP), F/00100 (szczep 71PfluR64PP), F/00095 (szczep 98PfluR60PP) oraz F/00101 (szczep 60AhydR15PP).
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL416716A PL246657B1 (pl) | 2016-04-03 | 2016-04-03 | Szczepy bakteriofagów i ich zastosowania |
| PCT/PL2017/050018 WO2017176136A1 (en) | 2016-04-03 | 2017-04-03 | Bacteriophage strains and their applications |
| CN201780032927.5A CN109310721B (zh) | 2016-04-03 | 2017-04-03 | 噬菌体菌株及其应用 |
| MX2018012099A MX393176B (es) | 2016-04-03 | 2017-04-03 | Cepas de bacteriofagos y sus aplicaciones. |
| CA3019820A CA3019820A1 (en) | 2016-04-03 | 2017-04-03 | Bacteriophage strains and their applications |
| EP17779411.2A EP3439677B1 (en) | 2016-04-03 | 2017-04-03 | Bacteriophage strains and their applications |
| US16/090,772 US11077155B2 (en) | 2016-04-03 | 2017-04-03 | Bacteriophage strains and their applications |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL416716A PL246657B1 (pl) | 2016-04-03 | 2016-04-03 | Szczepy bakteriofagów i ich zastosowania |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL416716A1 PL416716A1 (pl) | 2017-10-09 |
| PL246657B1 true PL246657B1 (pl) | 2025-02-24 |
Family
ID=59996955
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL416716A PL246657B1 (pl) | 2016-04-03 | 2016-04-03 | Szczepy bakteriofagów i ich zastosowania |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11077155B2 (pl) |
| EP (1) | EP3439677B1 (pl) |
| CN (1) | CN109310721B (pl) |
| CA (1) | CA3019820A1 (pl) |
| MX (1) | MX393176B (pl) |
| PL (1) | PL246657B1 (pl) |
| WO (1) | WO2017176136A1 (pl) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112280747B (zh) * | 2019-07-22 | 2022-11-18 | 渤海大学 | 一种荧光假单胞菌的烈性噬菌体ΦPf1901、噬菌体ΦPf1901的制剂及其应用 |
| CN112391357A (zh) * | 2019-08-14 | 2021-02-23 | 宁波大学 | 温和气单胞菌高效裂解性噬菌体vB_AsoP-yong及其应用 |
| CN110484513B (zh) * | 2019-08-23 | 2021-04-16 | 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所 | 噬菌体pAhMJG及其在治疗嗜水气单胞菌引发的鱼类疾病中的应用 |
| CN112574959B (zh) * | 2020-11-17 | 2022-05-24 | 厦门昶科生物工程有限公司 | 一种防治水产动物气单胞菌病害的噬菌体及微生态制剂 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2335852A (en) * | 1998-03-31 | 1999-10-06 | Martin Smirthwaite | The production, use and treatment using phage technology in aquaculture |
| EP1543169A4 (en) * | 2002-01-23 | 2007-09-12 | Us Gov Health & Human Serv | METHOD FOR DETERMINING SENSITIVITY AGAINST BACTERIOPHAGES |
| GB0808780D0 (en) * | 2008-05-15 | 2008-06-18 | Big Dna Ltd | Fish vaccines |
| US9504721B2 (en) | 2012-06-04 | 2016-11-29 | Ctc Bio, Inc. | Bacteriophage and its use for preventing proliferation of pathogenic bacteria |
| CL2012002902A1 (es) | 2012-10-17 | 2013-05-03 | Univ Chile | Cepas de bacteriofagos especifica contra bacterias pertenecientes al genero vibrio para la profilaxis y terapia de vibrio anguillarum; y composicion antibacteriana que comprende dicha cepas. |
| CN104450629A (zh) * | 2014-09-28 | 2015-03-25 | 浙江省淡水水产研究所 | 一株中华鳖气单胞菌噬菌体及其应用 |
| DK3285787T3 (da) * | 2015-04-20 | 2020-05-18 | Fixed Phage Ltd | Behandling af bakterieinfektioner i akvakultur |
-
2016
- 2016-04-03 PL PL416716A patent/PL246657B1/pl unknown
-
2017
- 2017-04-03 WO PCT/PL2017/050018 patent/WO2017176136A1/en not_active Ceased
- 2017-04-03 EP EP17779411.2A patent/EP3439677B1/en active Active
- 2017-04-03 CA CA3019820A patent/CA3019820A1/en active Pending
- 2017-04-03 US US16/090,772 patent/US11077155B2/en active Active
- 2017-04-03 MX MX2018012099A patent/MX393176B/es unknown
- 2017-04-03 CN CN201780032927.5A patent/CN109310721B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20200323931A1 (en) | 2020-10-15 |
| EP3439677C0 (en) | 2025-08-20 |
| WO2017176136A1 (en) | 2017-10-12 |
| EP3439677B1 (en) | 2025-08-20 |
| MX2018012099A (es) | 2019-06-24 |
| CN109310721B (zh) | 2022-02-18 |
| EP3439677A1 (en) | 2019-02-13 |
| MX393176B (es) | 2025-03-24 |
| PL416716A1 (pl) | 2017-10-09 |
| US11077155B2 (en) | 2021-08-03 |
| EP3439677A4 (en) | 2019-08-28 |
| CA3019820A1 (en) | 2017-10-12 |
| CN109310721A (zh) | 2019-02-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Silva et al. | Biological control of Aeromonas salmonicida infection in juvenile Senegalese sole (Solea senegalensis) with Phage AS-A | |
| Silva et al. | Influence of environmental variables in the efficiency of phage therapy in aquaculture | |
| Cao et al. | Characterization and application of a novel Aeromonas bacteriophage as treatment for pathogenic Aeromonas hydrophila infection in rainbow trout | |
| Wang et al. | Inactivation of nervous necrosis virus infecting grouper (Epinephelus coioides) by epinecidin-1 and hepcidin 1–5 antimicrobial peptides, and downregulation of Mx2 and Mx3 gene expressions | |
| El-Araby et al. | New approach to use phage therapy against Aeromonas hydrophila induced motile Aeromonas septicemia in Nile tilapia | |
| Kim et al. | Complete genome sequence and characterization of a broad-host range T4-like bacteriophage phiAS5 infecting Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida | |
| Pal | Phage Therapy an alternate disease control in Aquaculture: A review on recent advancements | |
| Orozco-Ochoa et al. | Characterization and genome analysis of six novel Vibrio parahaemolyticus phages associated with acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) | |
| PL246657B1 (pl) | Szczepy bakteriofagów i ich zastosowania | |
| Royam et al. | Isolation, characterization, and efficacy of bacteriophages isolated against Citrobacter spp. an in vivo approach in a zebrafish model (Danio rerio) | |
| Kwon et al. | Development and characterization of megalocytivirus persistently-infected cell cultures for high yield of virus | |
| Rasmussen et al. | Combining probiotic Phaeobacter inhibens DSM17395 and broad-host-range vibriophage KVP40 against fish pathogenic vibrios | |
| Cruz-Papa et al. | Aeromonas hydrophila bacteriophage UP87: An alternative to antibiotic treatment for motile Aeromonas septicemia in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) | |
| Mateus et al. | Effect of lysozyme addition on the activity of phages against Vibrio parahaemolyticus | |
| Jia et al. | Bacteriophage-based techniques for elucidating the function of zebrafish gut microbiota | |
| Chaichana et al. | Isolation, characterization and genomic analysis of bacteriophages for biocontrol of vibriosis caused by Vibrio alginolyticus | |
| Huang et al. | The bacteriophage vB_CbrM_HP1 protects crucian carp against Citrobacter braakii infection | |
| Eroğlu et al. | Genomic overview of the N4-like TEMp-D1 phage and the efficacy of antibiotic-phage synergy for the biocontrol of Photobacterium damselae subsp. damselae | |
| Zhang et al. | Biological characteristics of bacteriophage vB_Va_ZX-1 and its therapeutic effect on Chinese mitten crab infected by Vibrio alginolyticus | |
| CN114774371B (zh) | 一种弧菌噬菌体及其应用 | |
| Xiao et al. | Isolation and characterization of Bacillus cereus virulent phage CA1 | |
| EP4155382A1 (en) | Biological control of vibriosis in aquaculture | |
| RU2717451C1 (ru) | Штамм бактериофага Pseudomonas aeruginosa N 323 (500317), предназначенный для приготовления моно- и поливалентных лечебно-профилактических препаратов бактериофагов | |
| Altinok et al. | Isolation and characterization of novel Yersinia ruckeri bacteriophages for potential use in aquaculture | |
| Parida et al. | Characterization of bacteriophages infecting Escherichia coli associated with bovine mastitis |