PL245381B1 - Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genu w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm - Google Patents
Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genu w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm Download PDFInfo
- Publication number
- PL245381B1 PL245381B1 PL442105A PL44210522A PL245381B1 PL 245381 B1 PL245381 B1 PL 245381B1 PL 442105 A PL442105 A PL 442105A PL 44210522 A PL44210522 A PL 44210522A PL 245381 B1 PL245381 B1 PL 245381B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cadmium
- barley
- plants
- gene
- expression
- Prior art date
Links
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 70
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 65
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 51
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 title claims abstract 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 45
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 10
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 3
- 240000007036 Hordeum jubatum Species 0.000 claims description 2
- 241000173698 Hordeum pubiflorum Species 0.000 claims description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 abstract description 12
- 102000019229 U-box domains Human genes 0.000 abstract description 3
- 108050006631 U-box domains Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 3
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 39
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 229910052745 lead Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108090000069 P-type ATPases Proteins 0.000 description 2
- 102000003697 P-type ATPases Human genes 0.000 description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006550 Lantana camara Species 0.000 description 1
- 102000009112 Mannose-Binding Lectin Human genes 0.000 description 1
- 108010087870 Mannose-Binding Lectin Proteins 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 231100000693 bioaccumulation Toxicity 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 244000038280 herbivores Species 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- JBQYATWDVHIOAR-UHFFFAOYSA-N tellanylidenegermanium Chemical compound [Te]=[Ge] JBQYATWDVHIOAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia są sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genu w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy starterów do identyfikacji genu o identyfikatorze HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 kodującego białko zawierające domenę U-box. Dla genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 zaprojektowano startery pozwalające na określenie jego poziomu ekspresji w liściach i korzeniach jęczmienia z użyciem zaproponowanego systemu badania poziomu ekspresji genu. Prezentowane zgłoszenie pozwoli na selekcję odmian roślin pod kątem tolerancji na stres kadmu, przez co możliwe będzie wykorzystanie w hodowli takich form, które nie będą akumulowały w swoich tkankach metali ciężkich.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genu w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy starterów do identyfikacji genu o identyfikatorze HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 kodującego białko zawierające domenę U-box. Dla genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 zaprojektowano startery pozwalające na określenie jego poziomu ekspresji w liściach i korzeniach jęczmienia z użyciem zaproponowanego systemu badania poziomu ekspresji genu.
Metale ciężkie, do których zaliczane są między innymi ołów (Pb), kadm (Cd), cynk (Zn), rtęć (Hg), arsen (As), srebro (Ag), chrom (Cr), miedź (Cu) czy żelazo (Fe) wykazują działanie toksyczne już w niewielkich dawkach [1, 2]. Związki te nie ulegają biodegradacji, przez co obserwuje się u nich zjawisko bioakumulacji i biomagnifikacji. O ile niektóre z metali ciężkich, w ściśle określonych dawkach, niezbędne są do prawidłowego funkcjonowania organizmów roślinnych i zwierzęcych, to już nadmierna ich koncentracja wywołuje efekt toksyczny. Obecność wspomnianych metali ciężkich w glebie bądź wodzie, która dostępna jest dla roślin prowadzi do ich kumulowania w organizmie rośliny, a następnie w organizmach roślinożerców, gdzie stężenie metali ciężkich może osiągnąć jeszcze wyższe koncentracje [3]. Prezentowany wynalazek pozwoli na selekcję odmian roślin pod kątem tolerancji na stres kadmu, przez co możliwe będzie wykorzystanie w hodowli takich form, które nie będą akumulowały w swoich tkankach metali ciężkich.
Spośród metali ciężkich jedne z najwyższych wskaźników akumulacji w organizmach roślinnych wykazują Cd, Zn oraz Pb [4], a w Polsce największe zagrożenie skażeniem występuje w przypadku Cd i Pb. Wpływ tych metali ciężkich na wzrost między innymi jęczmienia zwyczajnego (Hordeum vulgare) był już badany przez zespoły badaczy [5]. W ramach badań prowadzących do opracowania niniejszego wynalazku prowadzono hodowlę hydroponiczną roślin jęczmienia z dodatkiem kadmu. Do badań wykorzystano dwa genotypy jęczmienia, Sebastian oraz mutanta hvd14.d [6], które wykazały zróżnicowaną odpowiedź na traktowanie metalem ciężkim. Odmiana Sebastian była bardziej tolerancyjna na badaną dawkę kadmu niż mutant hvd14.d, co zostało potwierdzone przez słabsze zahamowanie wzrostu oraz słabsze uszkodzenie aparatu fotosyntetycznego w odmianie Sebastian w porównaniu do mutanta. Analizy poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach obu form pozwoliły na wytypowanie genów zaangażowanych w odpowiedź jęczmienia na traktowanie kadmem, i wskazanie tych, które mogą różnicować genotypy jęczmienia tolerancyjne i wrażliwe na kadm.
Z dotychczasowego stanu techniki znane są rozwiązania, które pozwalają na zwiększenie tolerancji roślin na toksyczne działanie kadmu, bądź wykorzystanie roślin do usunięcia kadmu z podłoża. Na przykład w opisie patentowym CN102085527A autorzy opisują możliwość wykorzystania roślin z gatunku Lantana pospolita (Lantana camara), do usuwania kadmu z podłoża. Rośliny te są hiperakumulatorami kadmu i nawet w podłożu skażonym dawką 50 mg/kg są w stanie rozwijać się w prawidłowy sposób. Podczas wzrostu pobierają kadm za pomocą systemu korzeniowego i transportują go do części nadziemnej. Stąd koncentracja kadmu w glebie ulega obniżeniu.
Zgłoszenie EP12191891 opisuje możliwość obniżenia ekspresji genów kodujących transportery z rodziny ATPaz typu P, które zaangażowane są między innymi w transport kadmu. Dzięki temu możliwe jest ograniczenie transportu tego metalu do części nadziemnej rośliny co ogranicza jego akumulację w tkankach rośliny.
Autorzy zgłoszenia CN109880829A wskazują, że wprowadzenie dodatkowej kopii genu HvPAA1 (kodującego ATPazę typu P) pod kontrolą konstytutywnego promotora zwiększa tolerancję roślin jęczmienia na traktowanie kadmem. Podobny efekt, według zgłoszenia o numerze CN113584047A, można osiągnąć wykorzystując inżynierię genetyczną w celu wprowadzenia dodatkowej kopii genu HvNAT2, kodującego transporter nukleozasady-kwasu askorbinowego.
Z kolei zgłoszenie o numerze CN107326032A prezentuje gen MNB1 kodujący lektynę wiążącą mannozę 1, którego nadekspresja może zwiększać tolerancję roślin Arabidopsis thaliana na obecność kadmu w podłożu.
Pośród zgłoszeń patentowych dotyczących wpływu metali ciężkich na rośliny oraz selekcji form odpornych na metale ciężkie nie znaleziono takich, które opierałyby się o informacje odnośnie poziomu ekspresji genów jęczmienia.
Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie sekwencji starterów pozwalających na analizę poziomu ekspresji, w liściach i korzeniach jęczmienia, genu kodującego białko zawierające domenę U-box. Dzięki wykorzystaniu tych starterów możliwa jest analiza odpowiedzi roślin na stres przez pryzmat różnych mechanizmów związanych z odpowiedzią w liściach i korzeniach rośliny jęczmienia na traktowanie kadmem. Kolejnym celem twórców było opracowanie sposobu identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm, w którym kluczowym etapem jest analiza poziomu ekspresji genu w liściach i korzeniach jęczmienia bazująca na ww. sekwencjach starterów.
Istotę wynalazku stanowią sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genu jęczmienia HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 przedstawione w wykazie sekwencji (sekwencje nukleotydowe 1 i 2), którego ekspresja w liściach i korzeniach wskazuje na obniżoną tolerancję na kadm.
Ponadto istotę wynalazku stanowi sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm, pozwalający na selekcję odmian jęczmienia o zmniejszonej tolerancji na kadm, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost siewek jęczmienia w warunkach hydroponiki przez czas co najmniej 15 dni, korzystnie 24 dni, przy czym jedną grupę stanowią siewki kontrolne, których wzrost prowadzi się w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin z kadmem, natomiast drugą grupę stanowią siewki badane pod kątem ich tolerancji na kadm, których wzrost przez co najmniej 10 dni, korzystnie 14 dni, prowadzi się w takich samych warunkach jak siewki kontrolne, po czym na czas co najmniej 5 dni, korzystnie 10 dni, poddaje się je stresowi przez dodanie od 3 μM do 10 μM kadmu, korzystnie 5 μM kadmu,
b. izoluje się RNA z liści i korzeni jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych,
c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 metodą qPCR u roślin kontrolnych i badanych, charakteryzujący się tym, że do analizy poziomu ekspresji genu stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji (sekwencje nukleotydowe 1 i 2),
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, przy czym poziomy ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 porównuje się pomiędzy roślinami kontrolnymi oraz roślinami badanymi traktowanymi kadmem,
f. identyfikuje się genotypy jęczmienia wykazujące wyższy w porównaniu do genotypów analogicznych hodowanych w warunkach kontrolnych, poziom ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 wskazujący na obniżoną tolerancję na kadm.
Korzystnie, jako rośliny kontrolne stosuje się tę samą odmianę jęczmienia co rośliny badane pod kątem tolerancji na kadm.
Korzystnie, jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 (Elongation factor 1 -a) i/lub GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [7].
Korzystnie, wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej odbywa się w pożywce Hoaglanda.
Korzystnie, wzrost roślin jęczmienia prowadzi się w następujących warunkach: temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlna od 750 do 1000 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 900 μmol m-2 s-1.
Proponowane rozwiązanie techniczne bazujące na analizie poziomów ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 w liściach i korzeniach jęczmienia jest metodą pozwalającą na selekcję odmian jęczmienia wrażliwych na kontakt z kadmem. Poprzez analizę profilu ekspresji z użyciem przedstawionych starterów możliwe jest porównanie genotypów jęczmienia między sobą i wybranie tych, które będą gorzej adaptowały się do traktowania kadmem.
Przedmiot wynalazku przedstawiony został w przykładach wykonania oraz na rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia wynik analizy poziomu ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 u dwóch genotypów po traktowaniu kadmem. Odmiana wyjściowa Sebastian jest tolerancyjna na kadm, w porównaniu do mutanta hvd14.d, który jest nadwrażliwy na kadm. Ekspresja genu badana była przez porównanie każdego z genotypów, który rósł w warunkach kontrolnych do roślin traktowanych kadmem (10-dniowe traktowanie dawką 5 μM kadmu). Analizę poziomu ekspresji prowadzono metodą qPCR, a na fig. 1 zobrazowano względny poziom ekspresji wspomnianego genu w liściach i korzeniach badanych roślin, po traktowaniu kadmem w odniesieniu do warunków kontrolnych, dla których poziom ekspresji przyjęto jako wartość 1. Przykłady wykonania nie mają charakteru ograniczającego.
Dzięki zastosowaniu rozwiązań przedstawionych w zgłoszeniu możliwe jest przeprowadzenie selekcji genotypów jęczmienia pod kątem tolerancji na obecność kadmu, a wykorzystanie ich w programach hodowlanych może pozwolić na otrzymanie odmian, które mogą być uprawiane na skażonych glebach.
Przykład 1
Sekwencje starterów według wynalazku oraz analiza poziomu ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 z wykorzystaniem tych sekwencji starterów.
RNA wyizolowano z liści i korzeni 24-dniowych roślin jęczmienia, które rosły w warunkach kontrolnych (hodowla hydroponiczna w pożywce Hoaglanda, temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μποΙ m-2 s-1) oraz tych traktowanych kadmem (przez pierwsze 14 dni hodowla prowadzona jak dla roślin kontrolnych, przez kolejne 10 dni dodano do pożywki 5 μM kadmu), z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560). Do syntezy cDNA użyto zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) oraz 1 μg RNA. Otrzymane cDNA rozcieńczono 4-krotnie wodą oraz wykorzystano w reakcji qPCR, którą przeprowadzono z użyciem zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) dla genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 z wykorzystaniem następujących starterów:
- sekwencja nukleotydowa 1,
- sekwencja nukleotydowa 2.
Jako geny referencyjne w tej reakcji wykorzystano EF1 (Elongation factor 1-a) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [7]. W odpowiedzi na traktowanie kadmem zaobserwowano wzrost poziomów ekspresji badanego genu.
Przykład 2
Sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm w oparciu o analizę poziomu ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 w liściach i korzeniach jęczmienia obejmujący następujące etapy:
1. prowadzi się wzrost siewek kontrolnych jęczmienia przez 24 dni w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m-2 s-1) na pożywce Hoaglanda [8], natomiast wzrost roślin mających kontakt z kadmem prowadzi się przez 14 dni w tych samych warunkach kontrolnych, po czym dodaje się do pożywki 5 μΜ kadmu na 10 kolejnych dni,
2. izoluje się RNA z liści i korzeni jęczmienia, przy czym ten etap przeprowadza się z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560) lub MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1830) pozwalający na otrzymanie czystego chemicznie ekstraktu RNA przy zachowaniu jego integralności,
3. prowadzi się syntezę jednoniciowego cDNA, z użyciem zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) lub równoważnego oraz 1 μg RNA,
4. analizuje się poziom ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 u roślin kontrolnych oraz badanych, prowadząc reakcje qPCR z użyciem otrzymanego cDNA (rozcieńczonego 4-krotnie wodą), starterów specyficznych dla genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 oraz zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) lub równoważnego pozwalającego na analizę amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym, przy czym do analizy poziomu ekspresji genu stosuje się następujące sekwencje starterów:
- sekwencja nukleotydowa 1,
- sekwencja nukleotydowa 2,
5. prowadzi się reakcję qPCR z użyciem starterów genów referencyjnych EF1 (Elongation factor
1-a) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [7] dla każdej próby cDNA, 6. bazując na kinetyce reakcji amplifikacji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 oraz genów referencyjnych oblicza się względny poziom ekspresji badanego genu; poziomy ekspresji genu porównuje się pomiędzy roślinami rosnącymi w warunkach kontrolnych oraz roślinami narażonymi na 10-dniowy stres traktowania kadmem, dla każdego z genotypów,
7. identyfikuje się genotypy jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm, na podstawie podwyższonego poziomu ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660; dla każdego z genotypów porównuje się poziom ekspresji pomiędzy kontrolą a roślinami traktowanymi kadmem; im wyższa ekspresja genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 u roślin stresowanych tym bardziej zostały one uszkodzone przez kadm, co oznacza niższą tolerancję rośliny na kadm.
Przedstawiona procedura powinna być przeprowadzona dla wszystkich analizowanych genotypów, a wartością użytą do porównania ich wrażliwości na kadm jest krotność wzrostu ekspresji u roślin stresowanych. Rośliny o najwyższych wskaźnikach są najbardziej wrażliwe. Otrzymane wyniki porównuje się pomiędzy dwiema bądź większą liczbą odmian. Im wyższy poziom ekspresji tym mniejsza tolerancja na kadm. Wynik porównania dwóch odmian o zróżnicowanej tolerancji na kadm przedstawiono na fig. 1 rysunku.
U 24-dniowych roślin jęczmienia, nadwrażliwych na kadm, które zostały potraktowane kadmem (dawka od 3 do 10 μM, najkorzystniej 5 μM; traktowanie od 5 do 15 dni, najkorzystniej 10), w porównaniu do roślin rosnących w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C; fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8; intensywność światła od 100 do 150 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 120 μmol m-2 s-1), wykazano podwyższoną ekspresję wspomnianego genu. Ekspresja genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 nie ulegała zmianie w takich samych warunkach traktowania u roślin jęczmienia tolerancyjnych na kadm. Stąd rośliny wykazujące podwyższoną ekspresję wymienionego genu w odpowiedzi na traktowanie kadmem zaliczone mogą być do genotypów wrażliwych na kadm.
Literatura:
[1] Hawkes J.S. 1997. What is a heavy metal? J. Chem. Educat. 74. 1374-1378.
[2] Duruibe J.O., Ogwuegbu M.O.C., Egwurugwu J.N. 2007. Heavy metal pollution and human biotoxic effects. Int. J. Phys. Sci. 2. 112-118.
[3] Asati, A., Pichhode, M., & Nikhil, K. 2016. Effect of heavy metals on plants: an overview. IJAIEM, 5(3), 56-66.
[4] Kabata-Pendias A., Piotrowska M. 1984. Zanieczyszczenia gleb i roślin uprawnych pierwiastkami śladowymi. Wyd. CBR Warszawa, 1-28.
[5] Nowakowski, W. Podgórski, M. 1989. Tolerancja siewek jęczmienia jarego na Cd i Pb w warunkach kwaśnego odczynu. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 380.
[6] Marzec, M., Gruszka, D., Tylec, P., Szarejko, I. 2016. Identification and functional analysis of the HvD14 gene involved in strigolactone signaling in Hordeum vulgare. Physiologia Plantarum, 158(3), 341-355.
[7] Rapacz, M., Stępień, A., & Skorupa, K. (2012). Internal standards for quantitative RT-PCR studies of gene expression under drought treatment in barley (Hordeum vulgare L.): the effects of developmental stage and leaf age. Acta Physiologiae Plantarum, 34(5), 1723-1733.
[8] Hoagland, D. R., & Arnon, D. I. (1950). The water-culture method for growing plants without soil. Circular. California agricultural experiment station, 347 (2nd edit).
PL 245381 Β1
Wykaz sekwencji starterów <110> Uniwersytet Śląski w Katowicach <120> Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genu w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm <130> 634 <140> P.442105 <141> 2023-02-27 <160> 2 <170> Patentln yersion 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 1 ctcgccgtta gctacatcgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 2 gaagagcgct cggtagaaca
Claims (6)
1. Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genu jęczmienia HORVU.MOREK. r2.5HG0395660, którego ekspresja w liściach i korzeniach wskazuje na obniżoną tolerancję na kadm, przedstawione w wykazie sekwencji, to jest sekwencje nukleotydowe 1 i 2.
2. Sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost siewek jęczmienia w warunkach hydroponiki przez czas co najmniej 15 dni, korzystnie 24 dni, przy czym jedną grupę stanowią siewki kontrolne, których wzrost prowadzi się w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin z kadmem, natomiast drugą grupę stanowią siewki badane pod kątem ich tolerancji na kadm, których wzrost przez co najmniej 10 dni, korzystnie 14 dni, prowadzi się w takich samych warunkach jak siewki kontrolne, po czym na czas co najmniej 5 dni, korzystnie 10 dni, poddaje się je stresowi przez dodanie od 3 pM do 10 pM kadmu, korzystnie 5 pM kadmu,
b. izoluje się RNA z liści i korzeni jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych,
c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 metodą qPCR, u roślin kontrolnych i badanych, znamienny tym, że do analizy poziomu ekspresji genu stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji (sekwencje nukleotydowe 1 i 2),
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, przy czym poziomy ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 porównuje się pomiędzy roślinami kontrolnymi oraz roślinami badanymi,
f. identyfikuje się genotypy jęczmienia wykazujące wyższy w porównaniu do genotypów analogicznych hodowanych w warunkach kontrolnych, poziom ekspresji genu HORVU.MOREX.r2.5HG0395660 wskazujący na obniżoną tolerancję na kadm.
3. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że jako rośliny kontrolne stosuje się tę samą odmianę jęczmienia co rośliny badane pod kątem tolerancji na kadm.
4. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 (Elongation factor 1-a) i/lub GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase).
5. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej odbywa się w pożywce Hoaglanda.
6. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że wzrost roślin jęczmienia prowadzi się w następujących warunkach: temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlna od 750 do 1000 pmol nr2 s1, najkorzystniej 900 pmol nr2 s1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442105A PL245381B1 (pl) | 2022-08-27 | 2022-08-27 | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genu w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442105A PL245381B1 (pl) | 2022-08-27 | 2022-08-27 | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genu w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL442105A1 PL442105A1 (pl) | 2024-03-04 |
| PL245381B1 true PL245381B1 (pl) | 2024-07-15 |
Family
ID=90106964
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL442105A PL245381B1 (pl) | 2022-08-27 | 2022-08-27 | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genu w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL245381B1 (pl) |
-
2022
- 2022-08-27 PL PL442105A patent/PL245381B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL442105A1 (pl) | 2024-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Khan et al. | Functional characterization of a new metallochaperone for reducing cadmium concentration in rice crop | |
| Dai et al. | Physiological and transcriptomic analyses of mulberry (Morus atropurpurea) response to cadmium stress | |
| Zhao et al. | The metallochaperone OsHIPP56 gene is required for cadmium detoxification in rice crops | |
| Xiao et al. | Relationship between ionomics and transcriptomics of rice plant in response to arsenite stress | |
| Shukla et al. | Differential transcriptome modulation leads to variation in arsenic stress response in Arabidopsis thaliana accessions | |
| Satoh-Nagasawa et al. | Functional relationship heavy metal P-type ATPases (OsHMA 2 and OsHMA3) of rice (Oryza sativa) using RNAi | |
| Fahr et al. | Assessment of lead tolerance and accumulation in metallicolous and non-metallicolous populations of Hirschfeldia incana | |
| Zhu et al. | Integrated physio-biochemical and RNA sequencing analysis revealed mechanisms of long non-coding RNA-mediated response to cadmium toxicity in wheat | |
| Bovet et al. | Cadmium partitioning and gene expression studies in Nicotiana tabacum and Nicotiana rustica | |
| PL242227B1 (pl) | Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony | |
| Horvath et al. | Microarray analysis of late-season velvetleaf (Abutilon theophrasti) effect on corn | |
| Gómez-Sagasti et al. | Early transcriptomic response of Arabidopsis thaliana to polymetallic contamination: implications for the identification of potential biomarkers of metal exposure | |
| PL245382B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm | |
| PL245261B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm | |
| PL245379B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm | |
| PL245380B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm | |
| PL245378B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm | |
| PL245415B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem | |
| PL245414B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem | |
| PL245473B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk | |
| PL245416B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem | |
| PL245525B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk | |
| PL245871B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk i kadm | |
| PL245552B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk i kadm | |
| PL245910B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na cynk i kadm |