PL245378B1 - Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm - Google Patents

Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm Download PDF

Info

Publication number
PL245378B1
PL245378B1 PL442102A PL44210222A PL245378B1 PL 245378 B1 PL245378 B1 PL 245378B1 PL 442102 A PL442102 A PL 442102A PL 44210222 A PL44210222 A PL 44210222A PL 245378 B1 PL245378 B1 PL 245378B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
horvu
morex
cadmium
gene
barley
Prior art date
Application number
PL442102A
Other languages
English (en)
Other versions
PL442102A1 (pl
Inventor
Marek Marzec
Krzysztof SITKO
Krzysztof Sitko
Original Assignee
Univ Slaski
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Slaski filed Critical Univ Slaski
Priority to PL442102A priority Critical patent/PL245378B1/pl
Publication of PL442102A1 publication Critical patent/PL442102A1/pl
Publication of PL245378B1 publication Critical patent/PL245378B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy starterów do identyfikacji genów o identyfikatorach HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1HG0003860 kodujących odpowiednio białko związane z odpowiedzią na światło dalekiej czerwieni białko odporności na choroby wchodzące w interakcje z RPM1, białko oporności na tetracyklinę, egzonukleazę RNA oraz białko transpozonowe. Prezentowane zgłoszenie pozwoli na selekcję odmian roślin pod kątem tolerancji na stres kadmu, przez co możliwe będzie wykorzystanie w hodowli takich form, które nie będą akumulowały w swoich tkankach metali ciężkich.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy starterów do identyfikacji genów o identyfikatorach HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650 HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1HG0003860, kodujących odpowiednio białko związane z odpowiedzią na światło dalekiej czerwieni, białko odporności na choroby wchodzące w interakcje z RPM1, białko oporności na tetracyklinę, egzonukleazę RNA oraz białko transpozonowe.
Dla każdego z genów zaprojektowano startery pozwalające na określenie ich poziomu ekspresji w liściach jęczmienia z użyciem zaproponowanego systemu badania poziomu ekspresji genów.
Metale ciężkie, do których zaliczane są między innymi ołów (Pb), kadm (Cd), cynk (Zn), rtęć (Hg), arsen (As), srebro (Ag), chrom (Cr), miedź (Cu) czy żelazo (Fe) wykazują działanie toksyczne już w niewielkich dawkach [1,2]. Związki te nie ulegają biodegradacji, przez co obserwuje się u nich zjawisko bioakumulacji i biomagnifikacji. O ile niektóre z metali ciężkich, w ściśle określonych dawkach, niezbędne są do prawidłowego funkcjonowania organizmów roślinnych i zwierzęcych, to już nadmierna ich koncentracja wywołuje efekt toksyczny. Obecność wspomnianych metali ciężkich w glebie bądź wodzie, która dostępna jest dla roślin prowadzi do ich kumulowania w organizmie rośliny, a następnie w organizmach roślinożerców, gdzie stężenie metali ciężkich może osiągnąć jeszcze wyższe koncentracje [3]. Prezentowany wynalazek pozwoli na selekcję odmian roślin pod kątem tolerancji na stres kadmu, przez co możliwe będzie wykorzystanie w hodowli takich form, które nie będą akumulowały w swoich tkankach metali ciężkich.
Spośród metali ciężkich jedne z najwyższych wskaźników akumulacji w organizmach roślinnych wykazują Cd, Zn oraz Pb [4], a w Polsce największe zagrożenie skażeniem występuje w przypadku Cd i Pb. Wpływ tych metali ciężkich na wzrost między innymi jęczmienia zwyczajnego (Hordeum vulgare) był już badany przez zespoły badaczy [5]. W ramach badań prowadzących do opracowania niniejszego wynalazku prowadzono hodowlę hydroponiczną roślin jęczmienia z dodatkiem kadmu. Do badań wykorzystano dwa genotypy jęczmienia, Sebastian oraz mutanta hvd14.d [6], które wykazały zróżnicowaną odpowiedź na traktowanie metalem ciężkim. Odmiana Sebastian była bardziej tolerancyjna na badaną dawkę kadmu niż mutant hvd14.d, co zostało potwierdzone przez słabsze zahamowanie wzrostu oraz słabsze uszkodzenie aparatu fotosyntetycznego w odmianie Sebastian w porównaniu do mutanta. Analizy poziomu ekspresji genów w liściach obu form pozwoliły na wytypowanie genów zaangażowanych w odpowiedź jęczmienia na traktowanie kadmem, i wskazanie tych, które mogą różnicować genotypy jęczmienia tolerancyjne i wrażliwe na kadm.
Z dotychczasowego stanu techniki znane są rozwiązania, które pozwalają na zwiększenie tolerancji roślin na toksyczne działanie kadmu, bądź wykorzystanie roślin do usunięcia kadmu z podłoża. Na przykład w opisie patentowym CN102085527A autorzy opisują możliwość wykorzystania roślin z gatunku Lantana pospolita (Lantana camara), do usuwania kadmu z podłoża. Rośliny te są hiperakumulatorami kadmu i nawet w podłożu skażonym dawką 50 mg/kg są w stanie rozwijać się w prawidłowy sposób. Podczas wzrostu pobierają kadm za pomocą systemu korzeniowego i transportują go do części nadziemnej. Stąd koncentracja kadmu w glebie ulega obniżeniu.
Zgłoszenie EP12191891 opisuje możliwość obniżenia ekspresji genów kodujących transportery z rodziny ATPaz typu P, które zaangażowane są między innymi w transport kadmu. Dzięki temu możliwe jest ograniczenie transportu tego metalu do części nadziemnej rośliny co ogranicza jego akumulację w tkankach rośliny.
Autorzy zgłoszenia CN109880829A wskazują, że wprowadzenie dodatkowej kopii genu HvPAA1 (kodującego ATPazę typu P) pod kontrolą konstytutywnego promotora zwiększa tolerancję roślin jęczmienia na traktowanie kadmem. Podobny efekt, według zgłoszenia o numerze CN113584047A, można osiągnąć wykorzystując inżynierię genetyczną w celu wprowadzenia dodatkowej kopii genu HvNAT2, kodującego transporter nukleozasady-kwasu askorbinowego.
Z kolei zgłoszenie o numerze CN107326032A prezentuje gen MNB1 kodujący lektynę wiążącą mannozę 1, którego nadekspresja może zwiększać tolerancję roślin Arabidopsis thaliana na obecność kadmu w podłożu.
Pośród zgłoszeń patentowych dotyczących wpływu metali ciężkich na rośliny oraz selekcji form odpornych na metale ciężkie nie znaleziono takich, które opierałyby się o informacje odnośnie poziomu ekspresji genów jęczmienia.
Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie sekwencji starterów pozwalających na analizę poziomu ekspresji, w liściach jęczmienia, pięciu genów kodujących białko związane z odpowiedzią na światło dalekiej czerwieni, białko odporności na choroby wchodzące w interakcje z RPM1, białko oporności na tetracyklinę, egzonukleazę RNA oraz białko transpozonowe. Dzięki wykorzystaniu tych starterów możliwa jest analiza odpowiedzi roślin na stres przez pryzmat różnych mechanizmów związanych z odpowiedzią w liściach rośliny jęczmienia na traktowanie kadmem. Kolejnym celem twórców było opracowanie sposobu identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm, w którym kluczowym etapem jest analiza poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia bazująca na ww. sekwencjach starterów.
Istotę wynalazku stanowią sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów jęczmienia HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1HG0003860, których ekspresja w liściach wskazuje na podwyższoną tolerancję na kadm, przedstawione w wykazie sekwencji:
a. dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0333170 - sekwencje nukleotydowe 1 i2,
b. dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0161870 - sekwencje nukleotydowe 3 i4,
c. dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0041650 - sekwencje nukleotydowe 5 i6,
d. dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0342390 - sekwencje nukleotydowe 7 i8,
e. dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0003860 - sekwencje nukleotydowe 9 i10.
Ponadto istotę wynalazku stanowi sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm, pozwalający na selekcję odmian jęczmienia o zwiększonej tolerancji na kadm, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost siewek jęczmienia w warunkach hydroponiki przez czas co najmniej 15 dni, korzystnie 24 dni, przy czym jedną grupę stanowią siewki kontrolne, których wzrost prowadzi się w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin z kadmem, natomiast drugą grupę stanowią siewki badane pod kątem ich tolerancji na kadm, których wzrost przez co najmniej 10 dni, korzystnie 14 dni, prowadzi się w takich samych warunkach jak dla siewek kontrolnych, po czym na czas co najmniej 5 dni, korzystnie 10 dni, poddaje się je stresowi przez dodanie od 3 μM do 10 μM kadmu, korzystnie 5 μM kadmu,
b. izoluje się RNA z liści jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych,
c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1HG0003860 metodą qPCR u roślin kontrolnych i badanych, charakteryzujący się tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
i. dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0333170 - sekwencje nukleotydowe 1 i2, ii. dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0161870 - sekwencje nukleotydowe 3 i4, iii. dla genu HORVU.MOREX.r2.1 HG0041650 - sekwencje nukleotydowe 5 i6, iv. dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0342390 - sekwencje nukleotydowe 7 i8,
v. dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0003860 - sekwencje nukleotydowe 9 i10,
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1HG0003860, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, przy czym poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami kontrolnymi oraz roślinami badanymi traktowanymi kadmem,
f. identyfikuje się genotypy jęczmienia wykazujące wyższy w porównaniu do genotypów analogicznych hodowanych w warunkach kontrolnych, poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1HG0003860 wskazujący na zwiększoną tolerancję na kadm.
Korzystnie, jako rośliny kontrolne stosuje się tą samą odmianę jęczmienia co rośliny badane pod kątem tolerancji na kadm.
Korzystnie, jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 (Elongation factor 1-a) i/lub GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [7].
Korzystnie, wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej odbywa się w pożywce Hoaglanda.
Korzystnie, wzrost roślin jęczmienia prowadzi się w następujących warunkach: temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlna od 750 do 1000 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 900 μmol m-2 s-1.
Proponowane rozwiązanie techniczne bazujące na analizie poziomów ekspresji pięciu genów w liściach jęczmienia (HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1HG0003860) jest metodą pozwalającą na selekcję odmian jęczmienia tolerancyjnych na kontakt z kadmem. Poprzez analizę profili ekspresji z użyciem przedstawionych starterów możliwe jest porównanie genotypów jęczmienia między sobą i wybranie tych, które będą lepiej adaptowały się do traktowania kadmem.
Przedmiot wynalazku przedstawiony został w przykładach wykonania oraz na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia wynik analizy poziomów ekspresji genów u dwóch genotypów po traktowaniu kadmem. Odmiana wyjściowa Sebastian jest tolerancyjna na kadm, w porównaniu do mutanta hvd14.d, który jest nadwrażliwy na kadm. Ekspresja genów badana była przez porównanie każdego z genotypów, który rósł w warunkach kontrolnych do roślin traktowanych kadmem (10-dniowe traktowanie dawką 5 μM kadmu). Analizę poziomu ekspresji prowadzono metodą qPCR, a na fig. 1 zobrazowano względny poziom ekspresji wspomnianych genów, w liściach badanych roślin, po traktowaniu kadmem w odniesieniu do warunków kontrolnych, dla których poziom ekspresji przyjęto jako wartość 1. Przykłady wykonania, nie mają charakteru ograniczającego.
Dzięki zastosowaniu rozwiązań przedstawionych w zgłoszeniu możliwe jest przeprowadzenie selekcji genotypów jęczmienia pod kątem tolerancji na obecność kadmu, a wykorzystanie ich w programach hodowlanych może pozwolić na otrzymanie odmian, które mogą być uprawiane na skażonych glebach.
Przykład 1.
Sekwencje starterów według wynalazku oraz analiza poziomu ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, H0RVU.M0REX.r2.1HG0003860 z wykorzystaniem tych sekwencji starterów.
RNA wyizolowano z liści 24-dniowych roślin jęczmienia, które rosły w warunkach kontrolnych (hodowla hydroponiczna w pożywce Hoaglanda, temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m-2 s-1) oraz tych traktowanych kadmem (przez pierwsze 14 dni hodowla prowadzona jak dla roślin kontrolnych, przez kolejne 10 dni dodano do pożywki 5 μΜ kadmu), z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560). Do syntezy cDNA użyto zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) oraz 1 μg RNA. Otrzymane cDNA rozcieńczono 4-krotnie wodą oraz wykorzystano w reakcji qPCR, którą przeprowadzono z użyciem zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) dla każdej z par starterów:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0333170:
- Sekwencja nukleotydowa 1
- Sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0161870:
- Sekwencja nukleotydowa 3
- Sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0041650:
- Sekwencja nukleotydowa 5
- Sekwencja nukleotydowa 6
d) dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0342390:
- Sekwencja nukleotydowa 7
- Sekwencja nukleotydowa 8
e) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0003860:
- Sekwencja nukleotydowa 9
- Sekwencja nukleotydowa 10
Jako geny referencyjne w tej reakcji wykorzystano EF1 (Elongation factor 1-a) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [7]. W odpowiedzi na traktowanie kadmem zaobserwowano wzrost poziomów ekspresji badanych genów.
Przykład 2.
Sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm w oparciu o analizę poziomów ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1HG0003860 w liściach jęczmienia obejmujący następujące etapy:
1. prowadzi się wzrost siewek kontrolnych jęczmienia przez 24 dni w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m-2 s-1) na pożywce Hoaglanda [8], natomiast wzrost roślin mających kontakt z kadmem prowadzi się przez 14 dni w tych samych warunkach kontrolnych, po czym dodaje się do pożywki 5 μM kadmu na 10 kolejnych dni,
2. izoluje się RNA z liści jęczmienia, przy czym ten etap przeprowadza się z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560) lub MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1830) pozwalający na otrzymanie czystego chemicznie ekstraktu RNA przy zachowaniu jego integralności,
3. prowadzi się syntezę jednoniciowego cDNA, z użyciem zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) lub równoważnego oraz 1 μg RNA,
4. analizuje się poziom ekspresji genów u roślin kontrolnych oraz badanych, prowadząc reakcje qPCR z użyciem otrzymanego cDNA (rozcieńczonego 4-krotnie wodą), starterów specyficznych dla genów HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870. HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1HG0003860 oraz zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) lub równoważnego pozwalającego na analizę amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym, przy czym do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się następujące sekwencje starterów:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0333170:
- Sekwencja nukleotydowa 1
- Sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0161870:
- Sekwencja nukleotydowa 3
- Sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0041650:
- Sekwencja nukleotydowa 5
- Sekwencja nukleotydowa 6
d) dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0342390:
- Sekwencja nukleotydowa 7
- Sekwencja nukleotydowa 8
e) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0003860:
- Sekwencja nukleotydowa 9
- Sekwencja nukleotydowa 10
5. prowadzi się reakcję qPCR z użyciem starterów genów referencyjnych EF1 (Elongation factor 1-a) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [7] dla każdej próby cDNA,
6. bazując na kinetyce reakcji amplifikacji każdego z genów HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1HG0003860 oraz genów referencyjnych oblicza się względny poziom ekspresji badanych genów; poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami rosnącymi w warunkach kontrolnych oraz roślinami narażonymi na 10-dniowy stres traktowania kadmem, dla każdego z genotypów,
7. identyfikuje się genotypy jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm, na podstawie podwyższonego poziomu ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1HG0003860; dla każdego z genotypów porównuje się poziom ekspresji każdego z badanych genów pomiędzy kontrolą a roślinami traktowanymi kadmem; wyższa ekspresja genów u roślin stresowanych oznacza wyższą tolerancję rośliny na kadm.
Przedstawiona procedura powinna być przeprowadzona dla wszystkich analizowanych genotypów, a wartością użytą do porównania ich tolerancji na kadm jest krotność wzrostu ekspresji u roślin stresowanych. Rośliny o najwyższych wskaźnikach są najbardziej tolerancyjne.
Otrzymane wyniki porównuje się pomiędzy dwiema bądź większą liczbą odmian. Im wyższy poziom ekspresji tym większa tolerancja na kadm. Wynik porównania dwóch odmian o zróżnicowanej tolerancji na kadm przedstawiono na fig. 1 rysunku.
U 24-dniowych roślin jęczmienia, tolerancyjnych na kadm, które zostały potraktowane kadmem (dawka od 3 do 10 μM, najkorzystniej 5 μΜ; traktowanie od 5 do 15 dni, najkorzystniej 10), w porównaniu do roślin rosnących w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C; fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8; intensywność światła od 100 do 150 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 120 μmol m-2 s-1), wykazano podwyższoną ekspresję wspomnianych genów. Ekspresja genów HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1HG0003860 nie ulegała zmianie w takich samych warunkach traktowania u roślin jęczmienia wrażliwych na kadm. Stąd rośliny wykazujące podwyższoną ekspresję wymienionych genów w odpowiedzi na traktowanie kadmem zaliczone mogą być do genotypów tolerancyjnych na kadm.
Literatura:
[1] Hawkes J.S. 1997. What is a heavy metal? J. Chem. Educat. 74. 1374-1378.
[2] Duruibe J.O., Ogwuegbu M.O.C., Egwurugwu J.N. 2007. Heavy metal pollution and human biotoxic effects. Int. J. Phys. Sci. 2. 112-118.
[3] Asati, A., Pichhode, M., & Nikhil, K. 2016. Effect of heavy metals on plants: an overview. IJAIEM, 5(3), 56-66.
[4] Kabata-Pendias A., Piotrowska M. 1984. Zanieczyszczenia gleb i roślin uprawnych pierwiastkami śladowymi. Wyd. CBR Warszawa, 1-28.
[5] Nowakowski, W. Podgórski, M. 1989. Tolerancja siewek jęczmienia jarego na Cd i Pb w warunkach kwaśnego odczynu. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 380.
[6] Marzec, M., Gruszka, D., Tylec, P., Szarejko, I. 2016. Identification and functional analysis of the HvD14 gene involved in strigolactone signaling in Hordeum vulgare. Physiologia Plantarum, 158(3), 341-355.
[7] Rapacz, M., Stępień, A., & amp; Skorupa, K. (2012). Internal standards for quantitative RT-PCR studies of gene expression under drought treatment in barley (Hordeum vulgare L.): the effects of developmental stage and leaf age. Acta Physiologiae Plantarum, 34(5), 1723-1733.
[8] Hoagland, D. R., & Amon, D. I. (1950). The water-culture method for growing plants without soil. Circular. California agricultural experiment station, 347(2nd edit).
PL 245378 Β1
Wykaz sekwencji starterów <110> Uniwersytet Śląski w Katowicach <120> Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm
<130> 631
<140> P.442102 <141> 2023-02-27 <160> 10 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 1 ttaacggtga cactgggctc 20
<210> <211> <212> <213> 2 20 DNA Hordeum vulgare
<400> 2
tcttgagttg gttggtcggc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 3 atggcgaacc ccatgaacaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 4 cgcgcgcttt ctggaatatg 20
PL 245378 Β1
<210> <211> <212> <213> 5 20 DNA Hordeum yulgare
<400> 5
agcatgctgc cggtagattt 20
<210> <211> <212> <213> 6 20 DNA Hordeum yulgare
<400> 6 gtgtcalgca atggtccagc 20
<210> <211> <212> <213> 7 20 DNA Hordeum yulgare
<400> 7 catggactat ccggcgtacc 20
<210> <211> <212> <213> 8 20 DNA Hordeum yulgare
<400> 8 cagctctgag tgaggaaccg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum yulgare <400> 9 gcgaagaagg ttcaatgccc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum yulgare <400> 10 gggcatgcgt tcaaatcctc 20

Claims (6)

1. Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów jęczmienia, których ekspresja w liściach wskazuje na podwyższoną tolerancję na kadm, przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0333170 - sekwencje nukleotydowe 1 i2,
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0161870 - sekwencje nukleotydowe 3 i4,
c) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0041650 - sekwencje nukleotydowe 5 i6,
d) dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0342390 - sekwencje nukleotydowe 7 i8,
e) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0003860 - sekwencje nukleotydowe 9 i10.
2. Sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost siewek jęczmienia w warunkach hydroponiki przez czas co najmniej 15 dni, korzystnie 24 dni, przy czym jedną grupę stanowią siewki kontrolne, których wzrost prowadzi się w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin z kadmem, natomiast drugą grupę stanowią siewki badane pod kątem ich tolerancji na kadm, których wzrost przez co najmniej 10 dni, korzystnie 14 dni, prowadzi się w takich samych warunkach j ak siewki kontrolne, po czym na czas co najmniej 5 dni, korzystnie 10 dni, poddaje się je stresowi przez dodanie od 3 μM do 10 μM kadmu, korzystnie 5 μM kadmu,
b. izoluje się RNA z liści jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych,
c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, H0RVU.M0REX.r2.1HG0003860 metodą qPCR, u roślin kontrolnych i badanych, znamienny tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
i. dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0333170 - sekwencje nukleotydowe 1 i2, ii. dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0161870 - sekwencje nukleotydowe 3 i4, iii. dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0041650 - sekwencje nukleotydowe 5 i6, iv. dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0342390 - sekwencje nukleotydowe 7 i8,
v. dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0003860 - sekwencje nukleotydowe 9 i10,
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1 HG0003860, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, przy czym poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami kontrolnymi oraz roślinami badanymi,
f. identyfikuje się genotypy jęczmienia wykazujące wyższy w porównaniu do genotypów analogicznych hodowanych w warunkach kontrolnych, poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0333170, HORVU.MOREX.r2.2HG0161870, HORVU.MOREX.r2.1HG0041650, HORVU.MOREX.r2.4HG0342390, HORVU.MOREX.r2.1HGOOO386O wskazujący na podwyższoną tolerancję na kadm .
3. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że jako rośliny kontrolne stosuje się tą samą odmianę jęczmienia co rośliny badane pod kątem tolerancji na kadm.
4. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 (Elongation factor 1-a) i/lub GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase).
5. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej odbywa się w pożywce Hoaglanda.
6. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że wzrost roślin jęczmienia prowadzi się w następujących warunkach: temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C, fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8, intensywność świetlna od 750 do 1000 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 900 μmol m-2 s-1.
PL442102A 2022-08-27 2022-08-27 Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm PL245378B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL442102A PL245378B1 (pl) 2022-08-27 2022-08-27 Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL442102A PL245378B1 (pl) 2022-08-27 2022-08-27 Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL442102A1 PL442102A1 (pl) 2024-03-04
PL245378B1 true PL245378B1 (pl) 2024-07-15

Family

ID=90106979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL442102A PL245378B1 (pl) 2022-08-27 2022-08-27 Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL245378B1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
PL442102A1 (pl) 2024-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Khan et al. Functional characterization of a new metallochaperone for reducing cadmium concentration in rice crop
Dai et al. Physiological and transcriptomic analyses of mulberry (Morus atropurpurea) response to cadmium stress
Zhang et al. Regulation of cadmium tolerance and accumulation by miR156 in Arabidopsis
Rasheed et al. Role of genetic factors in regulating cadmium uptake, transport and accumulation mechanisms and quantitative trait loci mapping in rice. a review.
Xiao et al. Relationship between ionomics and transcriptomics of rice plant in response to arsenite stress
Sabella et al. Effects of cadmium on root morpho-physiology of durum wheat
Cai et al. Effects of external Mn2+ activities on OsNRAMP5 expression level and Cd accumulation in indica rice
Pottier et al. Genotypic variations in the dynamics of metal concentrations in poplar leaves: A field study with a perspective on phytoremediation
Corso et al. Adaptation of Arabidopsis halleri to extreme metal pollution through limited metal accumulation involves changes in cell wall composition and metal homeostasis
Satoh-Nagasawa et al. Functional relationship heavy metal P-type ATPases (OsHMA 2 and OsHMA3) of rice (Oryza sativa) using RNAi
Yan et al. Carbon dots inhibit root growth by disrupting auxin biosynthesis and transport in Arabidopsis
Zhu et al. Integrated physio-biochemical and RNA sequencing analysis revealed mechanisms of long non-coding RNA-mediated response to cadmium toxicity in wheat
PL242227B1 (pl) Sekwencje starterów do identyfikacji genów jęczmienia, sposób analizy ekspresji genów jęczmienia oraz sposób identyfikacji pozwalający na selekcję mutantów jęczmienia niewrażliwych na strigolaktony
Horvath et al. Microarray analysis of late-season velvetleaf (Abutilon theophrasti) effect on corn
PL245380B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm
PL245379B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm
PL245261B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm
PL245382B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm
PL245381B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genu w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na kadm
PL245414B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem
PL245473B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk
PL245525B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk
PL245552B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk i kadm
PL245415B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem
PL245524B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na cynk