PL245415B1 - Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem - Google Patents
Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem Download PDFInfo
- Publication number
- PL245415B1 PL245415B1 PL442120A PL44212022A PL245415B1 PL 245415 B1 PL245415 B1 PL 245415B1 PL 442120 A PL442120 A PL 442120A PL 44212022 A PL44212022 A PL 44212022A PL 245415 B1 PL245415 B1 PL 245415B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- horvu
- morex
- barley
- cadmium
- plants
- Prior art date
Links
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 57
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 54
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 52
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 title claims abstract description 43
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 64
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 claims description 3
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 claims description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 3
- 240000007036 Hordeum jubatum Species 0.000 claims description 2
- 241000173698 Hordeum pubiflorum Species 0.000 claims 1
- 102100039338 Aminomethyltransferase, mitochondrial Human genes 0.000 abstract description 2
- 108050001492 Ammonium transporters Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 108050002488 SPX domains Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000011989 SPX domains Human genes 0.000 abstract description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108090000069 P-type ATPases Proteins 0.000 description 2
- 102000003697 P-type ATPases Human genes 0.000 description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229910052745 lead Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000006550 Lantana camara Species 0.000 description 1
- 102000009112 Mannose-Binding Lectin Human genes 0.000 description 1
- 108010087870 Mannose-Binding Lectin Proteins 0.000 description 1
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 231100000693 bioaccumulation Toxicity 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 244000038280 herbivores Species 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- JBQYATWDVHIOAR-UHFFFAOYSA-N tellanylidenegermanium Chemical compound [Te]=[Ge] JBQYATWDVHIOAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia są sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem, w oparciu o analizę poziomów ekspresji tych genów. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy starterów do identyfikacji genów o identyfikatorach HORVU.MOREX.r2.4HG0326300, HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HORVU.MOREX.r2.1HG0014910, kodujących odpowiednio białko szoku cieplnego, białko zawierające domenę SPX oraz transporter amonowy. Dla każdego z genów zaprojektowano startery pozwalające na określenie ich poziomu ekspresji w korzeniach jęczmienia z użyciem zaproponowanego systemu badania poziomu ekspresji genów.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem, w oparciu o analizę poziomów ekspresji tych genów. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy starterów do identyfikacji genów o identyfikatorach HORVU.MOREX.r2.4HG0326300, HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HORVU.MOREX.r2.1HG0014910 kodujących odpowiednio białko szoku cieplnego, białko zawierające domenę SPX oraz transporter amonowy. Dla każdego z genów zaprojektowano startery pozwalające na określenie ich poziomu ekspresji w korzeniach jęczmienia z użyciem zaproponowanego systemu badania poziomu ekspresji genów.
Metale ciężkie, do których zaliczane są między innymi ołów (Pb), kadm (Cd), cynk (Zn), rtęć (Hg), arsen (As), srebro (Ag), chrom (Cr), miedź (Cu) czy żelazo (Fe) wykazują działanie toksyczne już w niewielkich dawkach [1, 2]. Związki te nie ulegają biodegradacji, przez co obserwuje się u nich zjawisko bioakumulacji i biomagnifikacji. O ile niektóre z metali ciężkich, w ściśle określonych dawkach, niezbędne są do prawidłowego funkcjonowania organizmów roślinnych i zwierzęcych, to już nadmierna ich koncentracja wywołuje efekt toksyczny. Obecność wspomnianych metali ciężkich w glebie bądź wodzie, która dostępna jest dla roślin, prowadzi do ich kumulowania w organizmie rośliny, a następnie w organizmach roślinożerców, gdzie stężenie metali może osiągnąć jeszcze wyższe koncentracje [3]. Rozwiązania stanowiące istotę niniejszego wynalazku umożliwiają wskazanie czy dana roślina miała kontakt z metalem ciężkim i jej ewentualne wykluczenie z dalszych procesów przetwórczych.
Spośród metali ciężkich jedne z najwyższych wskaźników akumulacji w organizmach roślinnych wykazują Cd, Zn oraz Pb [4], a w Polsce największe zagrożenie skażeniem występuje w przypadku Cd i Pb. Wpływ tych metali ciężkich na wzrost między innymi jęczmienia zwyczajnego (Hordeum vulgare) był już badany przez zespoły badaczy [5]. W ramach badań prowadzących do opracowania niniejszego wynalazku prowadzono hodowlę hydroponiczną roślin jęczmienia z dodatkiem kadmu. Do badań wykorzystano dwa genotypy jęczmienia, odmianę wyjściową Sebastian oraz wyprowadzonego z niej mutanta hvd14.d [6], które wykazały zróżnicowaną odpowiedź na traktowanie metalem ciężkim. Odmiana Sebastian była bardziej tolerancyjna na badaną dawkę kadmu niż mutant hvd14.d, co zostało potwierdzone przez słabsze zahamowanie wzrostu oraz słabsze uszkodzenie aparatu fotosyntetycznego u odmiany Sebastian w porównaniu do mutanta. Analizy poziomu ekspresji genów w korzeniach obu form pozwoliły na wytypowanie genów zaangażowanych w odpowiedź jęczmienia na traktowanie kadmem, i wskazanie tych, które ulegają zwiększonej ekspresji zarówno u genotypów wrażliwych, jak i tolerancyjnych na kadm.
Z dotychczasowego stanu techniki znane są rozwiązania, które pozwalają na zwiększenie tolerancji roślin na toksyczne działanie kadmu, bądź wykorzystanie roślin do usunięcia kadmu z podłoża. Na przykład w opisie patentowym CN102085527A autorzy opisują możliwość wykorzystania roślin z gatunku Lantana pospolita (Lantana camara), do usuwania kadmu z podłoża. Rośliny te są hiperakumulatorami kadmu i nawet w podłożu skażonym dawką 50 mg/kg są w stanie rozwijać się w prawidłowy sposób. Podczas wzrostu pobierają kadm za pomocą systemu korzeniowego i transportują go do części nadziemnej. Stąd koncentracja kadmu w glebie ulega obniżeniu.
Zgłoszenie EP12191891 opisuje możliwość obniżenia ekspresji genów kodujących transportery z rodziny ATPaz typu P, które zaangażowane są między innymi w transport kadmu. Dzięki temu możliwe jest ograniczenie transportu tego metalu do części nadziemnej rośliny co ogranicza jego akumulację w tkankach rośliny.
Autorzy zgłoszenia CN109880829A wskazują, że wprowadzenie dodatkowej kopii genu HvPAA1 (kodującego ATPazę typu P) pod kontrolą konstytutywnego promotora zwiększa tolerancję roślin jęczmienia na traktowanie kadmem. Podobny efekt, według zgłoszenia o numerze CN113584047A, można osiągnąć wykorzystując inżynierię genetyczną w celu wprowadzenia dodatkowej kopii genu HvNAT2, kodującego transporter nukleozasady-kwasu askorbinowego.
Z kolei zgłoszenie o numerze CN107326032A prezentuje gen MNB1 kodujący lektynę wiążącą mannozę 1, którego nadekspresja może zwiększać tolerancję roślin Arabidopsis thaliana na obecność kadmu w podłożu.
Warto podkreślić, że pośród zgłoszeń patentowych dotyczących wpływu metali ciężkich na rośliny nie znaleziono takich, które opierałyby się o informacje odnośnie poziomu ekspresji genów jęczmienia.
Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie sekwencji starterów pozwalających na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia.
Kolejnym celem twórców było opracowanie sposobu identyfikacji jęczmienia mającego wcześniejszy kontakt z kadmem bazujący na analizie profili ekspresji z użyciem przedstawionych starterów i porównaniu ich poziomu ekspresji z tym dla roślin kontrolnych a w efekcie wskazanie czy badane próbki miały wcześniejszy kontakt z kadmem.
Istotę wynalazku stanowią sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów jęczmienia, których ekspresja w korzeniach wskazuje na wcześniejszy kontakt jęczmienia z kadmem, przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0326300 - sekwencje nukleotydowe 1 i2,
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0103410 - sekwencje nukleotydowe 3 i4,
c) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0014910 - sekwencje nukleotydowe 5 i6.
Ponadto istotę wynalazku stanowi sposób identyfikacji jęczmienia mającego wcześniejszy kontakt z kadmem, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej, w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin z kadmem, przez czas co najmniej 15 dni, korzystnie 24 dni, b. izoluje się RNA z korzeni jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych, c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0326300,
HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HORVU.MOREX.r2.1HG0014910 metodą qPCR, u roślin kontrolnych oraz badanych, charakteryzujący się tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
i. dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0326300 - sekwencje nukleotydowe 1 i2, ii. dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0103410 - sekwencje nukleotydowe 3 i4, iii. dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0014910 - sekwencje nukleotydowe 5 i6,
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0326300,
HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HORVU.MOREX.r2.1HG0014910, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, przy czym poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami kontrolnymi oraz badanymi,
f. identyfikuje się jęczmień, który miał kontakt z kadmem, wykazujący wyższy w porównaniu do roślin, tego samego genotypu, hodowanych w warunkach kontrolnych, poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0326300, HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HORVU.MOREX.r2.1HG0014910.
Korzystnie, jako rośliny kontrolne stosuje się tą samą odmianę jęczmienia co rośliny badane pod kątem kontaktu z kadmem. Korzystnie, aby rośliny badane były w zbliżonym wieku do roślin kontrolnych.
Korzystnie, jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 (Elongation factor 1 -a) i/lub GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [8].
Korzystnie, wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej odbywa się w pożywce Hoaglanda [7].
Korzystnie, wzrost roślin kontrolnych jęczmienia prowadzi się w następujących warunkach: temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C; fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8; intensywność światła od 750 do 1000 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 900 μmol m-2 s-1.
Przedmiot wynalazku przedstawiony został w przykładach wykonania oraz na rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia wynik analizy poziomów ekspresji genów u dwóch genotypów jęczmienia po traktowaniu kadmem (5 μΜ). Odmiana wyjściowa Sebastian jest tolerancyjna na kadm, w porównaniu do mutanta hvd14.d, który jest nadwrażliwy na kadm. Ekspresja genów badana była przez porównanie każdego z genotypów, który rósł w warunkach kontrolnych do roślin traktowanych kadmem (10-dniowe traktowanie dawką 5 μΜ kadmu). Analizę poziomu ekspresji prowadzono metodą qPCR, a na fig. 1 zobrazowano względny poziom ekspresji wspomnianych genów, w korzeniach badanych roślin, po traktowaniu kadmem w odniesieniu do warunków kontrolnych, dla których poziom ekspresji przyjęto jako wartość 1. Przykłady realizacji nie mają charakteru ograniczającego.
Dzięki zastosowaniu rozwiązań według niniejszego wynalazku możliwe jest przeprowadzenie selekcji materiału roślinnego pod kątem wcześniejszego kontaktu z toksycznymi dawkami kadmu i wykluczenie takich produktów roślinnych z dalszych etapów przetwórczych związanych z przygotowaniem żywności.
Przykład 1
Sekwencje starterów według wynalazku oraz analiza poziomu ekspresji genów jęczmienia HORVU.MOREX.r2.4HG0326300, HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HORVU.MOREX.r2.1HG0014910. RNA wyizolowano z korzeni 24-dniowych roślin jęczmienia, które rosły w warunkach kontrolnych (hodowla hydroponiczna w pożywce Hoaglanda, temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m-2 s-1) oraz tych traktowanych kadmem (przez pierwsze 14 dni hodowla prowadzona jak dla roślin kontrolnych, przez kolejne 10 dni dodano do pożywki 5 μΜ kadmu), z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560). Do syntezy cDNA użyto zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) oraz 1 μg RNA. Otrzymane cDNA rozcieńczono 4-krotnie wodą oraz wykorzystano w reakcji qPCR, którą przeprowadzono z użyciem zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) dla każdej z par starterów:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0326300:
- sekwencja nukleotydowa1
- sekwencja nukleotydowa2
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0103410:
- sekwencja nukleotydowa3
- sekwencja nukleotydowa4
c) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0014910:
- sekwencja nukleotydowa5
- sekwencja nukleotydowa6
Jako geny referencyjne w tej reakcji wykorzystano EF1 (Elongation factor 1-a) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [8]. U roślin traktowanych kadmem zaobserwowano wzrost poziomu ekspresji badanych genów.
Przykład 2
Sposób identyfikacji jęczmienia mającego wcześniejszy kontakt z kadmem w oparciu o analizę poziomów ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0326300, HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HORVU.MOREX.r2.1HG0014910 w korzeniach obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost siewek kontrolnych jęczmienia przez 24 dni w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m-2 s-1) w pożywce Hoaglanda [7] w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin kontrolnych z kadmem, natomiast wzrost roślin badanych pod kątem wcześniejszego kontaktu z kadmem prowadzi się przez 14 dni w takich samych warunkach kontrolnych, po czym dodaje się do pożywki 5 μM kadmu na 10 kolejnych dni,
b. izoluje się RNA z korzeni jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych, przy czym ten etap przeprowadza się z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560) lub MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1830), pozwalającym na otrzymanie czystego chemicznie ekstraktu RNA przy zachowaniu jego integralności,
c. prowadzi się syntezę jednoniciowego cDNA, z użyciem zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) lub równoważnego oraz 1 μg RNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów u roślin kontrolnych oraz badanych, prowadząc reakcje qPCR z użyciem otrzymanego cDNA (rozcieńczonego 4-krotnie wodą), starterów specyficznychdla genów HORVU.MOREX.r2.4HG0326300, HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HORVU.MOREX.r2.1HG0014910 oraz zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) lub równoważnego pozwalającego na analizę amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym, przy czym do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji: a) dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0326300:
- sekwencja nukleotydowa 1
- sekwencja nukleotydowa 2
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0103410:
- sekwencja nukleotydowa 3
- sekwencja nukleotydowa 4
c) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0014910:
- sekwencja nukleotydowa 5
- sekwencja nukleotydowa 6
e. prowadzi się reakcję qPCR z użyciem starterów genów referencyjnych EF1 (Elongation factor 1-a) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [8] dla każdej próby cDNA,
f. bazując na kinetyce reakcji amplifikacji każdego z genów HORVU.MOREX.r2.4HG0326300, HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HORVU.MOREX.r2.1 HG0014910 genów referencyjnych oblicza się względny poziom ekspresji badanych genów; poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami rosnącymi w warunkach kontrolnych oraz roślin badanych pod kątem wcześniejszego kontaktu z kadmem, dla każdego z genotypów,
g. identyfikuje się jęczmień, który miał kontakt z kadmem, wykazujący w korzeniach wyższy w porównaniu do roślin kontrolnych, poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0326300, HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HORVU.MOREX.r2.1HG0014910 każdego z genotypów porównuje się poziom ekspresji każdego z badanych genów pomiędzy rośliną kontrolną a rośliną badaną, a rośliny z podwyższonym poziomem ekspresji genów są roślinami, które miały wcześniej kontakt z kadmem.
Przedstawiona procedura powinna być przeprowadzona dla wszystkich analizowanych genotypów, a wartością użytą do oceny wcześniejszego kontaktu z kadmem jest krotność wzrostu ekspresji u roślin badanych. Rośliny o podwyższonych wskaźnikach miały wcześniejszy kontakt z kadmem. Wynik porównania dla roślin rosnących bez kontaktu z kadmem oraz tych mających kontakt z kadmem przedstawiono na fig. 1 rysunku, przy czym dla roślin rosnących w warunkach kontrolnych poziom ekspresji każdego z genów wynosi 1.
U 24-dniowych roślin jęczmienia, nadwrażliwych i tolerancyjnych na kadm, które zostały potraktowane kadmem (dawka od 3 do 10 μM, najkorzystniej 5 μM; traktowanie od 5 do 15 dni, najkorzystniej 10), w porównaniu do roślin rosnących w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C; fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8; intensywność światła od 750 do 1000 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 900 μmol m-2 s-1), wykazano podwyższony poziom ekspresji genów: HORVU.MOREX.r2.4HG0326300, HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HORVU.MOREX.r2.1HG0014910. Stąd podwyższony poziom ekspresji wspomnianych genów może być wykorzystany jako marker kontaktu roślin z kadmem. Porównując ekspresję tych genów w korzeniach badanej rośliny i korzeniach roślin kontrolnych możliwe jest wskazanie czy badana roślina miała kontakt z kadmem. Rośliny wykazujące podwyższoną ekspresję wymienionych genów, w porównaniu do roślin kontrolnych mogły mieć kontakt z wysokimi dawkami kadmu w glebie bądź wodzie, która była wykorzystana do ich podlewania. Literatura:
[1] Hawkes J.S. 1997. What is a heavy metal? J. Chem. Educat. 74. 1374-1378.
[2] Duruibe J.O., Ogwuegbu M.O.C., Egwurugwu J.N. 2007. Heavy metal pollution and human bio- toxic effects. Int. J. Phys. Sci. 2. 112-118.
[3] Asati, A., Pichhode, M., & Nikhil, K. 2016. Effect of heavy metals on plants: an overview. IJAIEM, 5(3), 56-66.
[4] Kabata-Pendias A., Piotrowska M. 1984. Zanieczyszczenia gleb i roślin uprawnych pierwiastkami śladowymi. Wyd. CBR Warszawa, 1-28.
[5] Nowakowski, W. Podgórski, M. 1989. Tolerancja siewek jęczmienia jarego na Cd i Pb w warunkach kwaśnego odczynu. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 380.
[6] Marzec, M., Gruszka, D., Tylec, P., Szarejko, I. 2016. Identification and functional analysis of the HvD14 gene involved in strigolactone signaling in Hordeum vulgare. Physiologia Plantarum, 158(3), 341-355.
[7] Hoagland, D. R., & Arnon, D. I. (1950). The water-culture method for growing plants without soil. Circular. California agricultural experiment station, 347(2nd edit).
[8] Rapacz, M., Stępień, A., Skorupa, K. (2012). Internal standards for quantitative RT-PCR studies of gene expression under drought treatment in barley (Hordeum vulgare L.): the effects of developmental stage and leaf age. Acta Physiologiae Plantarum, 34(5), 1723-1733.
[9] Wu, F., Zhang, G. (2002). Alleviation of cadmium-toxicity by application of zinc and ascorbic acid in barley. Journal of Plant Nutrition, 25(12), 2745-2761.
[10] Aery, N. C., Jagetiya, B. L. (1997). Relative toxicity of cadmium, lead, and zinc on barley. Communications in soil science and plant analysis, 28(11-12), 949-960.
PL 245415 Β1
[11] Huang, C., Barker, S. J., Langridge, P., Smith, F. W., & Graham, R. D. (2000). Zinc deficiency up-regulates expression of high-affinity phosphate transporter genes in both phosphate-sufficient and-deficient barley roots. Plant Physiology, 124(1), 415-422.
[12] Hodoshima, H., Enomoto, Y., Shoji, K., Shimada, H., Goto, F., & Yoshihara, T. (2007). Differential regulation of cadmium-inducible expression of iron-deficiency-responsive genes in tobacco and barley. Physiologia Plantarum, 129(3), 622-634.
[13] Sharma, S. S., Kaul, S., Metwally, A., Goyal, K. C., Finkemeier, I., Dietz, K. J. (2004). Cadmium toxicity to barley (Hordeum vulgare) as affected by varying Fe nutritional status. Plant science, 166(5), 1287-1295.
Wykaz sekwencji starterów <110> Uniwersytet Śląski w Katowicach <120> Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem
| <130> | 649 |
| <140> P.442120 <141> 2023-02-27 <160> 6 <170> Patcntln vcrsion 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 1 caggagaaca cggacagctc | 20 |
| <210> 2 | |
| <211> 20 | |
| <212> DNA | |
| <213> Hordeum vulgarc | |
| <400> 2 | |
| caggagaaca cggacagctc | 20 |
| <210> 3 | |
| <211> 20 | |
| <212> DNA | |
| <213> Hordeum yulgare | |
| <400> 3 | |
| caacaccacc gattgctcac | 20 |
| <210> <211> <212> <213> | 4 20 DNA Hordeum yulgare |
<400> 4
PL 245415 Β1 gcaaatcaal ccagaggccg <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 5 ccggagacga catcaactcg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Hordeum vulgarc <400> 6 cgaatgactl gacgccgagg 20
Claims (6)
1. Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomów ekspresji genów jęczmienia, których ekspresja w korzeniach wskazuje na wcześniejszy kontakt jęczmienia z kadmem, przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0326300 - sekwencje nukleotydowe 1 i 2,
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0103410 - sekwencje nukleotydowe 3 i 4,
c) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0014910 - sekwencje nukleotydowe 5 i 6.
2. Sposób identyfikacji jęczmienia mającego wcześniejszy kontakt z kadmem, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej, w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin z kadmem, przez czas co najmniej 15 dni, korzystnie 24 dni,
b. izoluje się RNA z korzeni jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych,
c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0326300, HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HORVU.MGREX.r2.1HG0014910 metodą qPCR, u roślin kontrolnych oraz badanych, znamienny tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
i. dla genu HORVU.MOREX.r2.4HG0326300 - sekwencje nukleotydowe 1 i 2, ii. dla genu HORVU.MOREX.r2.2HG0103410 - sekwencje nukleotydowe 3 i 4, iii. dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0014910 - sekwencje nukleotydowe 5 i 6,
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.4HG0326300, HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HGRVU.MOREX.r2.1HG0014910 w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, przy czym poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami kontrolnymi oraz badanymi,
f. identyfikuje się jęczmień, który miał kontakt z kadmem, wykazujący w korzeniach wyższy w porównaniu do roślin, tego samego genotypu, hodowanych w warunkach kontrolnych, poziom ekspresji genów HORVU.MGREX.r2.4HG0326300, HORVU.MOREX.r2.2HG0103410, HORVU.MOREX.r2.1 HG0014910.
3. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że jako rośliny kontrolne stosuje się tą samą odmianę jęczmienia co rośliny badane pod kątem kontaktu z kadmem.
4. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 (Elongation factor 1-a) i/lub GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase).
5. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej odbywa się w pożywce Hoaglanda.
6. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że wzrost roślin kontrolnych jęczmienia prowadzi się w następujących warunkach: temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C; fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8; intensywność światła od 750 do 1000 pmol m-2 s'1, najkorzystniej 900 pmol m-2 s-1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442120A PL245415B1 (pl) | 2022-08-27 | 2022-08-27 | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442120A PL245415B1 (pl) | 2022-08-27 | 2022-08-27 | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL442120A1 PL442120A1 (pl) | 2024-03-04 |
| PL245415B1 true PL245415B1 (pl) | 2024-07-22 |
Family
ID=90106948
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL442120A PL245415B1 (pl) | 2022-08-27 | 2022-08-27 | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL245415B1 (pl) |
-
2022
- 2022-08-27 PL PL442120A patent/PL245415B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL442120A1 (pl) | 2024-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Khan et al. | Functional characterization of a new metallochaperone for reducing cadmium concentration in rice crop | |
| Dai et al. | Physiological and transcriptomic analyses of mulberry (Morus atropurpurea) response to cadmium stress | |
| Wang et al. | Silver nanoparticles regulate Arabidopsis root growth by concentration-dependent modification of reactive oxygen species accumulation and cell division | |
| Andresen et al. | Cadmium toxicity in plants | |
| Quinet et al. | Combined transcriptomic and physiological approaches reveal strong differences between short‐and long‐term response of rice (Oryza sativa) to iron toxicity | |
| Xiao et al. | Relationship between ionomics and transcriptomics of rice plant in response to arsenite stress | |
| Imtiaz et al. | Physiological and anthocyanin biosynthesis genes response induced by vanadium stress in mustard genotypes with distinct photosynthetic activity | |
| Fahr et al. | Assessment of lead tolerance and accumulation in metallicolous and non-metallicolous populations of Hirschfeldia incana | |
| Kaviani et al. | Phytoremediation of Pb‐contaminated soil by Salicornia iranica: key physiological and molecular mechanisms involved in Pb detoxification | |
| Al-Qurainy et al. | Biochemical and genetical responses of Phoenix dactylifera L. to cadmium stress | |
| Zhu et al. | Integrated physio-biochemical and RNA sequencing analysis revealed mechanisms of long non-coding RNA-mediated response to cadmium toxicity in wheat | |
| Jabeen et al. | Silver nanoparticles mitigated cadmium toxicity in tobacco by modulating biochemical, cellular and genetic responses | |
| PL245416B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem | |
| PL245414B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem | |
| Selvaraj et al. | Effect of nickel chloride on the growth and biochemical characteristics of Phaseolus mungo L | |
| PL245916B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem | |
| PL245871B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk i kadm | |
| PL245552B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk i kadm | |
| PL245910B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na cynk i kadm | |
| PL245912B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem | |
| PL245913B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem | |
| PL245382B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na kadm | |
| PL245551B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na cynk | |
| PL245868B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na cynk i kadm | |
| PL245914B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem |