PL245916B1 - Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem - Google Patents
Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem Download PDFInfo
- Publication number
- PL245916B1 PL245916B1 PL442127A PL44212722A PL245916B1 PL 245916 B1 PL245916 B1 PL 245916B1 PL 442127 A PL442127 A PL 442127A PL 44212722 A PL44212722 A PL 44212722A PL 245916 B1 PL245916 B1 PL 245916B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- barley
- plants
- horvu
- morex
- cadmium
- Prior art date
Links
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 56
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 55
- 239000011701 zinc Substances 0.000 title claims abstract description 55
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 53
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 53
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 53
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 title claims abstract description 36
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 title claims abstract 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 55
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 8
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 8
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 claims description 4
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 claims description 4
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims description 3
- 240000007036 Hordeum jubatum Species 0.000 claims description 2
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 abstract description 2
- 210000004901 leucine-rich repeat Anatomy 0.000 abstract description 2
- 108010006444 Leucine-Rich Repeat Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 12
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 240000006550 Lantana camara Species 0.000 description 2
- 108090000069 P-type ATPases Proteins 0.000 description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 2
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229910052745 lead Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000009112 Mannose-Binding Lectin Human genes 0.000 description 1
- 108010087870 Mannose-Binding Lectin Proteins 0.000 description 1
- 102000003697 P-type ATPases Human genes 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 231100000693 bioaccumulation Toxicity 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 244000038280 herbivores Species 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- KFZAUHNPPZCSCR-UHFFFAOYSA-N iron zinc Chemical compound [Fe].[Zn] KFZAUHNPPZCSCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- JBQYATWDVHIOAR-UHFFFAOYSA-N tellanylidenegermanium Chemical compound [Te]=[Ge] JBQYATWDVHIOAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia są sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem, w oparciu o analizę poziomów ekspresji tych genów. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy starterów do identyfikacji genów o identyfikatorach HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, HORVU.MOREX.r2.1HG0012070, kodujących odpowiednio cytochrom P450 oraz receptor o powtórzeniach bogatych w leucynę. Dla każdego z genów zaprojektowano startery pozwalające na określenie ich poziomu ekspresji w liściach i korzeniach jęczmienia z użyciem zaproponowanego systemu badania poziomu ekspresji genów.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem, w oparciu o analizę poziomów ekspresji tych genów. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy starterów do identyfikacji genów o identyfikatorach HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, HORVU.MOREX.r2.1HG0012070 kodujących odpowiednio cytochrom P450 oraz receptor o powtórzeniach bogatych w leucynę. Dla każdego z genów zaprojektowano startery pozwalające na określenie ich poziomu ekspresji w liściach i korzeniach jęczmienia z użyciem zaproponowanego systemu badania poziomu ekspresji genów.
Metale ciężkie, do których zaliczane są między innymi ołów (Pb), kadm (Cd), cynk (Zn), rtęć (Hg), arsen (As), srebro (Ag), chrom (Cr), miedź (Cu) czy żelazo (Fe) wykazują działanie toksyczne już w niewielkich dawkach [1, 2]. Związki te nie ulegają biodegradacji, przez co obserwuje się u nich zjawisko bioakumulacji i biomagnifikacji. O ile niektóre z metali ciężkich, w ściśle określonych dawkach, niezbędne są do prawidłowego funkcjonowania organizmów roślinnych i zwierzęcych, to już nadmierna ich koncentracja wywołuje efekt toksyczny. Obecność wspomnianych metali ciężkich w glebie bądź wodzie, która dostępna jest dla roślin, prowadzi do ich kumulowania w organizmie rośliny, a następnie w organizmach roślinożerców, gdzie stężenie metali może osiągnąć jeszcze wyższe koncentracje [3]. Rozwiązania stanowiące istotę niniejszego wynalazku umożliwiają wskazanie czy dana roślina miała kontakt z metalem ciężkim i jej ewentualne wykluczenie z dalszych procesów przetwórczych.
Spośród metali ciężkich jedne z najwyższych wskaźników akumulacji w organizmach roślinnych wykazują Cd, Zn oraz Pb [4], a w Polsce największe zagrożenie skażeniem występuje w przypadku Cd i Pb. Wpływ tych metali ciężkich na wzrost między innymi jęczmienia zwyczajnego (Hordeum vulgare) był już badany przez zespoły badaczy [5]. W ramach badań prowadzących do opracowania niniejszego wynalazku prowadzono hodowlę hydroponiczną roślin jęczmienia z dodatkiem cynku i kadmu. Do badań wykorzystano dwa genotypy jęczmienia, odmianę wyjściową Sebastian oraz wyprowadzonego z niej mutanta hvd14.d [6], które wykazały zróżnicowaną odpowiedź na traktowanie metalem ciężkim. Odmiana Sebastian była bardziej tolerancyjna na badaną dawkę cynku i kadmu niż mutant hvd14.d, co zostało potwierdzone przez słabsze zahamowanie wzrostu oraz słabsze uszkodzenie aparatu fotosyntetycznego u odmiany Sebastian w porównaniu do mutanta. Analizy poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach obu form pozwoliły na wytypowanie genów zaangażowanych w odpowiedź jęczmienia na traktowanie cynkiem oraz kadmem, i wskazanie tych, które ulegają zwiększonej ekspresji zarówno u genotypów wrażliwych, jak i tolerancyjnych na cynk i kadm.
Wyróżnić można dwa główne nurty badań związanych z wpływem cynku na rozwój i wzrost roślin, związane z 1) niedoborem bądź 2) ekspozycją na toksyczne dawki tego pierwiastka. Między innymi wykazano, że cynk w koncentracji 1,5, oraz 50 μmol L-1 działa hamująco na wzrost jęczmienia, podczas gdy koncentracja 0,1 μmol L-1 pobudza wzrost siewek jęczmienia. Dodatkowo autorzy badania wskazują, że zastosowanie kwasu askorbinowego może zniwelować negatywny wpływ wyższych koncentracji cynku na wzrost jęczmienia [9]. Z kolei w innym badaniu wykazano, że każda z zastosowanych dawek cynku (10, 50, 250, 1250, 6250 μg/g suchej gleby) hamuje rozwój części nadziemnej i podziemnej jęczmienia, a efekt ten jest zależny od podanej dawki cynku [10]. W literaturze brakuje informacji odnośnie odpowiedzi globalnego transkryptomu na wyższe, toksyczne, dawki cynku. Znaleźć natomiast można opracowania dotyczące ekspresji wybranych genów na niedobór tego pierwiastka [11], czy ekspresję wybranych genów w sytuacji, gdy badano antagonistyczne działanie cynku i żelaza na jęczmień [12, 13].
Z dotychczasowego stanu techniki znane jest rozwiązanie dotyczące podniesienia tolerancji przedstawiciela zbóż (kukurydzy) na toksyczne dawki cynku. W opisie patentowym CN104212815A autorzy ujawniają gen ZmITR1 kodujący transporter regulowany cynkowo-żelazowo, który może pełnić ważną funkcję przy pobieraniu cynku z podłoża u kukurydzy. Niemniej należy podkreślić, że liczne zgłoszenia patentowe dotyczą innego z metali ciężkich - kadmu. W zgłoszeniu CN102085527A autorzy opisują możliwość wykorzystania roślin z gatunku Lantana pospolita (Lantana camara), do usuwania kadmu z podłoża. Rośliny te są hiperakumulatorami kadmu i nawet w podłożu skażonym dawką 50 mg/kg są w stanie rozwijać się w prawidłowy sposób. Podczas wzrostu pobierają kadm za pomocą systemu korzeniowego i transportują go do części nadziemnej. Stąd koncentracja kadmu w glebie ulega obniżeniu. Zgłoszenie EP12191891 opisuje możliwość obniżenia ekspresji genów kodujących transportery z rodziny ATPaz typu P, które zaangażowane są między innymi w transport kadmu. Dzięki temu możliwe jest ograniczenie transportu tego metalu do części nadziemnej rośliny, co ogranicza jego akumulację w tkankach rośliny. Autorzy zgłoszenia CN109880829A wskazują, że wprowadzenie dodatkowej kopii genu HvPAA1 (kodującego ATPazę typu P) pod kontrolą konstytutywnego promotora zwiększa tolerancję roślin jęczmienia na traktowanie kadmem. Podobny efekt, według zgłoszenia o numerze CN113584047A, można osiągnąć wykorzystując inżynierię genetyczną w celu wprowadzenia dodatkowej kopii genu HvNAT2 do roślin jęczmienia, kodującego transporter nukleozasady-kwasu askorbinowego. Z kolei zgłoszenie o numerze CN107326032A prezentuje gen MNB1 kodujący lektynę wiążącą mannozę 1, którego nadekspresja może zwiększać tolerancję roślin Arabidopsis thaliana na obecność kadmu w podłożu.
Warto podkreślić, że pośród zgłoszeń patentowych dotyczących wpływu metali ciężkich na rośliny nie znaleziono takich, które opierałyby się o informacje odnośnie poziomu ekspresji genów jęczmienia.
Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie sekwencji starterów pozwalających na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia.
Kolejnym celem twórców było opracowanie sposobu identyfikacji jęczmienia mającego wcześniejszy kontakt z cynkiem i kadmem bazujący na analizie profili ekspresji z użyciem przedstawionych starterów i porównaniu ich poziomu ekspresji z tym dla roślin kontrolnych a w efekcie wskazanie czy badane próbki miały wcześniejszy kontakt z cynkiem i kadmem.
Istotę wynalazku stanowią sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów jęczmienia, których ekspresja w liściach i korzeniach wskazuje na wcześniejszy kontakt jęczmienia z cynkiem i kadmem, przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.7HG0618780 - sekwencje nukleotydowe 1 i 2,
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0012070 - sekwencje nukleotydowe 3 i 4.
Ponadto istotę wynalazku stanowi sposób identyfikacji jęczmienia mającego wcześniejszy kontakt z cynkiem i kadmem, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej, w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin z cynkiem i kadmem, przez czas co najmniej 15 dni, korzystnie 24 dni,
b. izoluje się RNA z liści i korzeni jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych,
c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, HORVU.MOREX.r2.1HG0012070 metodą qPCR, u roślin kontrolnych oraz badanych, charakteryzujący się tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
i. dla genu HORVU.MOREX.r2.7HG0618780 - sekwencje nukleotydowe 1 i 2, ii. dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0012070 - sekwencje nukleotydowe 3 i 4,
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, HORVU.MOREX.r2.1HG0012070 w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, przy czym poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami kontrolnymi oraz badanymi,
f. identyfikuje się jęczmień, który miał kontakt z cynkiem i kadmem, wykazujący wyższy w porównaniu do roślin, tego samego genotypu, hodowanych w warunkach kontrolnych, poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, HORVU.MOREX.r2.1HG0012070.
Korzystnie, jako rośliny kontrolne stosuje się tę samą odmianę jęczmienia co rośliny badane pod kątem kontaktu z cynkiem i kadmem. Korzystnie, aby rośliny badane, były w zbliżonym wieku do roślin kontrolnych.
Korzystnie, jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 (Elongation factor 1 -a) i/lub GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [8].
Korzystnie, wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej odbywa się w pożywce Hoaglanda [7].
Korzystnie, wzrost roślin kontrolnych jęczmienia prowadzi się w następujących warunkach: temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C; fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8; intensywność światła od 750 do 1000 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 900 μmol m-2 s-1.
Przedmiot wynalazku przedstawiony został w przykładach wykonania oraz na rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia wynik analizy poziomów ekspresji genów u dwóch genotypów jęczmienia po traktowaniu cynkiem (50 μM) oraz kadmem (5 μM). Odmiana wyjściowa Sebastian jest tolerancyjna na cynk i kadm, w porównaniu do mutanta hvd14.d, który jest nadwrażliwy na cynk i kadm. Ekspresja genów badana była przez porównanie każdego z genotypów, który rósł w warunkach kontrolnych do roślin traktowanych cynkiem (10-dniowe traktowanie dawką 50 μΜ cynku) oraz kadmem (10-dniowe traktowanie dawką 5 μΜ kadmu). Analizę poziomu ekspresji prowadzono metodą qPCR, a na fig. 1 zobrazowano względny poziom ekspresji wspomnianych genów, w liściach i korzeniach badanych roślin, po traktowaniu cynkiem i kadmem w odniesieniu do warunków kontrolnych, dla których poziom ekspresji przyjęto jako wartość 1. Przykłady realizacji nie mają charakteru ograniczającego.
Dzięki zastosowaniu rozwiązań według niniejszego wynalazku możliwe jest przeprowadzenie selekcji materiału roślinnego pod kątem wcześniejszego kontaktu z toksycznymi dawkami cynku oraz kadmu i wykluczenie takich produktów roślinnych z dalszych etapów przetwórczych związanych z przygotowaniem żywności.
Przykład 1.
Sekwencje starterów według wynalazku oraz analiza poziomu ekspresji genów jęczmienia HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, HORVU.MOREX.r2.1HG0012070.
RNA wyizolowano z liści i korzeni 24-dniowych roślin jęczmienia, które rosły w warunkach kontrolnych (hodowla hydroponiczna w pożywce Hoaglanda, temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m-2 s-1) oraz tych traktowanych cynkiem oraz kadmem (przez pierwsze 14 dni hodowla prowadzona jak dla roślin kontrolnych, przez kolejne 10 dni dodano do pożywki 50 μM cynku i 5 μM kadmu), z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560). Do syntezy cDNA użyto zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) oraz 1 μg RNA. Otrzymane cDNA rozcieńczono 4-krotnie wodą oraz wykorzystano w reakcji qPCR, którą przeprowadzono z użyciem zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) dla każdej z par starterów:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.7HG0618780:
- sekwencja nukleotydowa1,
- sekwencja nukleotydowa2,
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0012070: - sekwencja nukleotydowa3,
- sekwencja nukleotydowa4.
Jako geny referencyjne w tej reakcji wykorzystano EF1 (Elongation factor 1-a) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [8]. U roślin traktowanych cynkiem i kadmem zaobserwowano wzrost poziomu ekspresji badanych genów.
P r z y k ł a d 2.
Sposób identyfikacji jęczmienia mającego wcześniejszy kontakt z cynkiem i kadmem w oparciu o analizę poziomów ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, HORVU.MOREX.r2.1 HG0012070 w liściach i korzeniach obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost siewek kontrolnych jęczmienia przez 24 dni w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m-2 s-1) w pożywce Hoaglanda [7] w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin kontrolnych z cynkiem i kadmem, natomiast wzrost roślin badanych pod kątem wcześniejszego kontaktu z cynkiem i kadmem prowadzi się przez 14 dni w takich samych warunkach kontrolnych, po czym dodaje się do pożywki 50 μM cynku oraz 5 μM kadmu na 10 kolejnych dni,
b. izoluje się RNA z liści i korzeni jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych, przy czym ten etap przeprowadza się z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560) lub MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1830), pozwalającym na otrzymanie czystego chemicznie ekstraktu RNA przy zachowaniu jego integralności,
c. prowadzi się syntezę jednoniciowego cDNA, z użyciem zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) lub równoważnego oraz 1 μg RNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów u roślin kontrolnych oraz badanych, prowadząc reakcje qPCR z użyciem otrzymanego cDNA (rozcieńczonego 4-krotnie wodą), starterów specyficznych dla genów HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, HORVU.MOREX.r2.1HG0012070 oraz zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) lub równoważnego pozwalającego na analizę amplifikacji
DNA w czasie rzeczywistym, przy czym do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.7HG0618780:
- sekwencja nukleotydowa1,
- sekwencja nukleotydowa2,
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0012070:
- sekwencja nukleotydowa3,
- sekwencja nukleotydowa4,
e. prowadzi się reakcję qPCR z użyciem starterów genów referencyjnych EF1 (Elongation factor 1-a) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [8] dla każdej próby cDNA,
f. bazując na kinetyce reakcji amplifikacji każdego z genów HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, HORVU.MOREX.r2.1HG0012070 genów referencyjnych oblicza się względny poziom ekspresji badanych genów; poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami rosnącymi w warunkach kontrolnych oraz roślin badanych pod kątem wcześniejszego kontaktu z cynkiem i kadmem, dla każdego z genotypów,
g. identyfikuje się jęczmień, który miał kontakt z cynkiem i kadmem, wykazujący w liściach i korzeniach wyższy w porównaniu do roślin kontrolnych, poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, H0RVU.M0REX.r2.1HG0012070; każdego z genotypów porównuje się poziom ekspresji każdego z badanych genów pomiędzy rośliną kontrolną a rośliną badaną, a rośliny z podwyższonym poziomem ekspresji genów są roślinami, które miały wcześniej kontakt z cynkiem i kadmem.
Przedstawiona procedura powinna być przeprowadzona dla wszystkich analizowanych genotypów, a wartością użytą do oceny wcześniejszego kontaktu z cynkiem i kadmem jest krotność wzrostu ekspresji u roślin badanych. Rośliny o podwyższonych wskaźnikach miały wcześniejszy kontakt z cynkiem i kadmem. Wynik porównania dla roślin rosnących bez kontaktu z cynkiem i kadmem oraz tych mających kontakt z cynkiem i kadmem przedstawiono na fig. 1 rysunku, przy czym dla roślin rosnących w warunkach kontrolnych poziom ekspresji każdego z genów wynosi 1.
U 24-dniowych roślin jęczmienia, nadwrażliwych i tolerancyjnych na cynk i kadm, które zostały potraktowane cynkiem (dawka od 35 do 75 μM, najkorzystniej 50 μM; traktowanie od 5 do 15 dni, najkorzystniej 10) oraz kadmem (dawka od 3 do 10 μM, najkorzystniej 5 μM; traktowanie od 5 do 15 dni, najkorzystniej 10), w porównaniu do roślin rosnących w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C; fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8; intensywność światła od 750 do 1000 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 900 μmol m-2 s-1), wykazano podwyższony poziom ekspresji genów: HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, H0RVU.M0REX.r2.1HG0012070. Stąd podwyższony poziom ekspresji wspomnianych genów może być wykorzystany jako marker kontaktu roślin z cynkiem i kadmem. Porównując ekspresję tych genów w liściach oraz korzeniach badanej rośliny i liściach oraz korzeniach roślin kontrolnych możliwe jest wskazanie czy badana roślina miała kontakt z cynkiem i kadmem. Rośliny wykazujące podwyższoną ekspresję wymienionych genów, w porównaniu do roślin kontrolnych mogły mieć kontakt z wysokimi dawkami cynku i kadmu w glebie bądź wodzie, która była wykorzystana do ich podlewania.
Literatura:
[1] Hawkes J.S. 1997. What is a heavy metal? J. Chem. Educat. 74. 1374-1378.
[2] Duruibe J.O., Ogwuegbu M.O.C., Egwurugwu J.N. 2007. Heavy metal pollution and human biotoxic effects. Int. J. Phys. Sci. 2. 112-118.
[3] Asati, A., Pichhode, M., & Nikhil, K. 2016. Effect of heavy metals on plants: an overview. IJAIEM, 5(3), 56-66.
[4] Kabata-Pendias A., Piotrowska M. 1984. Zanieczyszczenia gleb i roślin uprawnych pierwiastkami śladowymi. Wyd. CBR Warszawa, 1-28.
[5] Nowakowski, W. Podgórski, M. 1989. Tolerancja siewek jęczmienia jarego na Cd i Pb w warunkach kwaśnego odczynu. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 380.
[6] Marzec, M., Gruszka, D., Tylec, P., Szarejko, I. 2016. Identification and functional analysis of the HvD14 gene involved in strigolactone signaling in Hordeum vulgare. Physiologia Plantarum, 158(3), 341-355.
[7] Hoagland, D. R., & Arnon, D. I. (1950). The water-culture method for growing plants without soil. Circular. California agricultural experiment station, 347(2nd edit).
PL 245916 Β1
[8] Rapacz, M., Stępień, A., Skorupa, K. (2012). Internal standards forquantitative RT-PCR studies ot gene expression under drought treatment in barley (Hordeum vulgare L.): the effects of developmental stage and leaf age. Acta Physiologiae Plantarum, 34(5), 1723-1733.
[9] Wu, F., Zhang, G. (2002). Alleviation of cadmium-toxicity by application ot zinc and ascorbic acid in barley. Journal ot Plant Nutrition, 25(12), 2745-2761.
[10] Aery, N. C., Jagetiya, B. L. (1997). Relative toxicity ot cadmium, lead, and zinc on barley. Communications in soil science and plant analysis, 28(11-12), 949-960.
[11] Huang, C., Barker, S. J., Langridge, P., Smith, F. W., & Graham, R. D. (2000). Zinc deficiency upregulates expression of high-affinity phosphate transporter genes in both phosphate-sufficient anddeficient barley roots. Plant Physiology, 124(1), 415-422.
[12] Hodoshima, H., Enomoto, Y., Shoji, K., Shimada, H., Goto, F., & Yoshihara, T. (2007). Differential regulation of cadmium-inducible expression of iron-deficiency-responsive genes in tobacco and barley. Physiologia Plantarum, 129(3), 622-634.
[13] Sharma, S. S., Kaul, S., Metwally, A., Goyal, K. C., Finkemeier, I., Dietz, K. J. (2004). Cadmium toxicity to barley (Hordeum vulgare) as affected by varying Fe nutritional status. Plant science, 166(5), 1287-1295.
Wykaz sekwencji starterów
Sekwencja nukleotydowa 1 startera: 5’ TTCGACCATGCCGTCATCAA 3’
Sekwencja nukleotydowa 2 startera: 5’ GATCTCCCGGAACAGCGTAG 3’
Sekwencja nukleotydowa 3 startera: 5’ ACATAGCTCCTGAACTGGCG 3’
Sekwencja nukleotydowa 4 startera: 5’ TTGGATGCTTGCCCATCACT 3’
Claims (6)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomów ekspresji genów jęczmienia, których ekspresja w liściach i korzeniach wskazuje na wcześniejszy kontakt jęczmienia z cynkiem i kadmem, przedstawione w wykazie sekwencji:a) dla genu HORVU.MOREX.r2.7HG0618780 - sekwencje nukleotydowe 1 i 2,b) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0012070 - sekwencje nukleotydowe 3 i 4.
- 2. Sposób identyfikacji jęczmienia mającego wcześniejszy kontakt z cynkiem i kadmem, obejmujący następujące etapy:a. prowadzi się wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej, w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin z cynkiem i kadmem, przez czas co najmniej 15 dni, korzystnie 24 dni,b. izoluje się RNA z liści i korzeni jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych,c. przeprowadza się syntezę cDNA,d. analizuje się poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, HORVU.MOREX.r2.1HG0012070 metodą qPCR, u roślin kontrolnych oraz badanych, znamienny tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:i. dla genu HORVU.MOREX.r2.7HG0618780 - sekwencje nukleotydowe 1 i 2, ii. dla genu HORVU.MOREX.r2.1 HG0012070 - sekwencje nukleotydowe 3 i 4,e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, HORVU.MOREX.r2.1 HG0012070, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, przy czym poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami kontrolnymi oraz badanymi,f. identyfikuje się jęczmień, który miał kontakt z cynkiem i kadmem, wykazujący w liściach i korzeniach wyższy w porównaniu do roślin, tego samego genotypu, hodowanych w warunkach kontrolnych, poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.7HG0618780, HORVU.MOREX.r2.1 HG0012070.
- 3. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że jako rośliny kontrolne stosuje się tę samą odmianę jęczmienia co rośliny badane pod kątem kontaktu z cynkiem i kadmem.
- 4. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 (Elongation factor 1-a) i/lub GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase).
- 5. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej odbywa się w pożywce Hoaglanda.
- 6. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że wzrost roślin kontrolnych jęczmienia prowadzi się w następujących warunkach: temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C; fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8; intensywność światła od 750 do 1000 pmol m-2 s'1, najkorzystniej 900 pmol m-2 s-1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442127A PL245916B1 (pl) | 2022-08-27 | 2022-08-27 | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL442127A PL245916B1 (pl) | 2022-08-27 | 2022-08-27 | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL442127A1 PL442127A1 (pl) | 2024-03-04 |
| PL245916B1 true PL245916B1 (pl) | 2024-10-28 |
Family
ID=90106966
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL442127A PL245916B1 (pl) | 2022-08-27 | 2022-08-27 | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL245916B1 (pl) |
-
2022
- 2022-08-27 PL PL442127A patent/PL245916B1/pl unknown
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DERAKHSHANI B., JAFARY H., MALEKI ZANJANI B., HASANPUR K., MISHINA K., TANAKA T. I IN.: "PLoS ONE 15(4): e0230820", COMBINED QTL MAPPING AND RNA-SEQ PROFILING REVEALS CANDIDATE GENES ASSOCIATED WITH CADMIUM TOLERANCE IN BARLEY, DOI: doi.org/10.1371/journal.pone.0230820 * |
| JINGWEN TIONG, GLENN MCDONALD, YUSUF GENC, NEIL SHIRLEY, PETER LANGRIDGE, CHUN Y. HUANG: "New Phytologist (2015) 207:1097–1109", INCREASED EXPRESSION OF SIX ZIP FAMILY GENES BY ZINC (ZN)DEFICIENCY IS ASSOCIATED WITH ENHANCED UPTAKE AND ROOT-TO-SHOOT TRANSLOCATION OF ZN IN BARLEY (HORDEUM VULGARE), DOI: 10.1111/nph.13413 * |
| KINTLOVÁ M., VRÁNA J., HOBZA R., BLAVET N., HUDZIECZEK V.: "Front. Plant Sci. 12: 629089", TRANSCRIPTOME RESPONSE TO CADMIUM EXPOSURE IN BARLEY (HORDEUM VULGARE L.), DOI: 10.3389/fpls.2021.629089 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL442127A1 (pl) | 2024-03-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dai et al. | Physiological and transcriptomic analyses of mulberry (Morus atropurpurea) response to cadmium stress | |
| Wang et al. | Silver nanoparticles regulate Arabidopsis root growth by concentration-dependent modification of reactive oxygen species accumulation and cell division | |
| Imtiaz et al. | Physiological and anthocyanin biosynthesis genes response induced by vanadium stress in mustard genotypes with distinct photosynthetic activity | |
| Hasanuzzaman et al. | Arsenic toxicity in plants and possible remediation | |
| Xiao et al. | Relationship between ionomics and transcriptomics of rice plant in response to arsenite stress | |
| Xue et al. | Citric acid inhibits Cd uptake by improving the preferential transport of Mn and triggering the defense response of amino acids in grains | |
| Fahr et al. | Assessment of lead tolerance and accumulation in metallicolous and non-metallicolous populations of Hirschfeldia incana | |
| Muslu et al. | Effects of copper and chromium and high temperature on growth, proline and protein content in wheat seedlings | |
| Kaviani et al. | Phytoremediation of Pb‐contaminated soil by Salicornia iranica: key physiological and molecular mechanisms involved in Pb detoxification | |
| Marrugo-Madrid et al. | Phytoremediation of mercury in soils impacted by gold mining: A case-study of Colombia | |
| Al-Qurainy et al. | Biochemical and genetical responses of Phoenix dactylifera L. to cadmium stress | |
| Ali et al. | Expression analysis of transcription factor (CBF/DREB) gene and biochemical response of Cannabis sativa to cadmium toxicity and foliar application of molybdenum | |
| PL245914B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem | |
| PL245915B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem | |
| PL245912B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem | |
| Selvaraj et al. | Effect of nickel chloride on the growth and biochemical characteristics of Phaseolus mungo L | |
| PL245913B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem | |
| PL245911B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem | |
| PL245910B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na cynk i kadm | |
| PL245868B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na cynk i kadm | |
| PL245551B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na cynk | |
| PL245871B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk i kadm | |
| PL245552B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk i kadm | |
| PL245416B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem | |
| PL245414B1 (pl) | Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z kadmem |