PL245912B1 - Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem - Google Patents

Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem Download PDF

Info

Publication number
PL245912B1
PL245912B1 PL442123A PL44212322A PL245912B1 PL 245912 B1 PL245912 B1 PL 245912B1 PL 442123 A PL442123 A PL 442123A PL 44212322 A PL44212322 A PL 44212322A PL 245912 B1 PL245912 B1 PL 245912B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
barley
plants
horvu
zinc
morex
Prior art date
Application number
PL442123A
Other languages
English (en)
Other versions
PL442123A1 (pl
Inventor
Marek Marzec
Original Assignee
Univ Slaski
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Slaski filed Critical Univ Slaski
Priority to PL442123A priority Critical patent/PL245912B1/pl
Publication of PL442123A1 publication Critical patent/PL442123A1/pl
Publication of PL245912B1 publication Critical patent/PL245912B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem, w oparciu o analizę poziomów ekspresji tych genów. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy starterów do identyfikacji genów o identyfikatorach HORVU.MOREX.r2.1HG0066880, HORVU.MOREX.r2.5HG0406720, kodujących odpowiednio białko oporności na choroby oraz fosfolipazę A1. Dla każdego z genów zaprojektowano startery pozwalające na określenie ich poziomu ekspresji w korzeniach jęczmienia z użyciem zaproponowanego systemu badania poziomu ekspresji genów.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem, w oparciu o analizę poziomów ekspresji tych genów. Bardziej szczegółowo zgłoszenie dotyczy starterów do identyfikacji genów o identyfikatorach HORVU.MOREX.r2.1HG0066880, HORVU.MOREX.r2.5HG0406720 kodujących odpowiednio białko oporności na choroby oraz fosfolipazę A1. Dla każdego z genów zaprojektowano startery pozwalające na określenie ich poziomu ekspresji w korzeniach jęczmienia z użyciem zaproponowanego systemu badania poziomu ekspresji genów.
Metale ciężkie, do których zaliczane są między innymi ołów (Pb), kadm (Cd), cynk (Zn), rtęć (Hg), arsen (As), srebro (Ag), chrom (Cr), miedź (Cu) czy żelazo (Fe), wykazują działanie toksyczne już w niewielkich dawkach [1, 2]. Związki te nie ulegają biodegradacji, przez co obserwuje się u nich zjawisko bioakumulacji i biomagnifikacji. O ile niektóre z metali ciężkich, w ściśle określonych dawkach, niezbędne są do prawidłowego funkcjonowania organizmów roślinnych i zwierzęcych, to już nadmierna ich koncentracja wywołuje efekt toksyczny. Obecność wspomnianych metali ciężkich w glebie bądź wodzie, która dostępna jest dla roślin, prowadzi do ich kumulowania w organizmie rośliny, a następnie w organizmach roślinożerców, gdzie stężenie metali może osiągnąć jeszcze wyższe koncentracje [3]. Rozwiązania stanowiące istotę niniejszego wynalazku umożliwiają wskazanie czy dana roślina miała kontakt z metalem ciężkim i jej ewentualne wykluczenie z dalszych procesów przetwórczych.
Spośród metali ciężkich jedne z najwyższych wskaźników akumulacji w organizmach roślinnych wykazują Cd, Zn oraz Pb [4], a w Polsce największe zagrożenie skażeniem występuje w przypadku Cd i Pb. Wpływ tych metali ciężkich na wzrost między innymi jęczmienia zwyczajnego (Hordeum vulgare) był już badany przez zespoły badaczy [5]. W ramach badań prowadzących do opracowania niniejszego wynalazku prowadzono hodowlę hydroponiczną roślin jęczmienia z dodatkiem cynku. Do badań wykorzystano dwa genotypy jęczmienia, odmianę wyjściową Sebastian oraz wyprowadzonego z niej mutanta hvd14.d [6], które wykazały zróżnicowaną odpowiedź na traktowanie metalem ciężkim. Odmiana Sebastian była bardziej tolerancyjna na badaną dawkę cynku niż mutant hvd14.d, co zostało potwierdzone przez słabsze zahamowanie wzrostu oraz słabsze uszkodzenie aparatu fotosyntetycznego u odmiany Sebastian w porównaniu do mutanta. Analizy poziomu ekspresji genów w korzeniach obu form pozwoliły na wytypowanie genów zaangażowanych w odpowiedź jęczmienia na traktowanie cynkiem, i wskazanie tych, które ulegają zwiększonej ekspresji zarówno u genotypów wrażliwych, jak i tolerancyjnych na cynk.
Wyróżnić można dwa główne nurty badań związanych z wpływem cynku na rozwój i wzrost roślin, związane z 1) niedoborem bądź 2) ekspozycją na toksyczne dawki tego pierwiastka. Między innymi wykazano, że cynk w koncentracji 1,5, oraz 50 μmol L-1 działa hamująco na wzrost jęczmienia, podczas gdy koncentracja 0,1 μmol L-1 pobudza wzrost siewek jęczmienia. Dodatkowo autorzy badania wskazują, że zastosowanie kwasu askorbinowego może zniwelować negatywny wpływ wyższych koncentracji cynku na wzrost jęczmienia [9]. Z kolei w innym badaniu wykazano, że każda z zastosowanych dawek cynku (10, 50, 250, 1250, 6250 μg/g suchej gleby) hamuje rozwój części nadziemnej i podziemnej jęczmienia, a efekt ten jest zależny od podanej dawki cynku [10]. W literaturze brakuje informacji odnośnie odpowiedzi globalnego transkryptomu na wyższe, toksyczne, dawki cynku. Znaleźć natomiast można opracowania dotyczące ekspresji wybranych genów na niedobór tego pierwiastka [11], czy ekspresję wybranych genów w sytuacji, gdy badano antagonistyczne działanie cynku i żelaza na jęczmień [12, 13].
Z dotychczasowego stanu techniki znane jest rozwiązanie dotyczące podniesienia tolerancji przedstawiciela zbóż (kukurydzy) na toksyczne dawki cynku. W opisie patentowym CN104212815A autorzy ujawniają gen ZmITR1 kodujący transporter regulowany cynkowo-żelazowo, który może pełnić ważną funkcję przy pobieraniu cynku z podłoża u kukurydzy. Niemniej należy podkreślić, że liczne zgłoszenia patentowe dotyczą innego z metali ciężkich - kadmu. W zgłoszeniu CN102085527A autorzy opisują możliwość wykorzystania roślin z gatunku Lantana pospolita (Lantana camara), do usuwania kadmu z podłoża. Rośliny te są hiperakumulatorami kadmu i nawet w podłożu skażonym dawką 50 mg/kg są wstanie rozwijać się w prawidłowy sposób. Podczas wzrostu pobierają kadm za pomocą systemu korzeniowego i transportują go do części nadziemnej. Stąd koncentracja kadmu w glebie ulega obniżeniu. Zgłoszenie EP12191891 opisuje możliwość obniżenia ekspresji genów kodujących transportery z rodziny ATPaz typu P, które zaangażowane są między innymi w transport kadmu. Dzięki temu możliwe jest ograniczenie transportu tego metalu do części nadziemnej rośliny, co ogranicza jego akumulację w tkankach rośliny. Autorzy zgłoszenia CN109880829A wskazują, że wprowadzenie dodatkowej kopii genu HvPAA1 (kodującego ATPazę typu P) pod kontrolą konstytutywnego promotora zwiększa tolerancję roślin jęczmienia na traktowanie kadmem. Podobny efekt, według zgłoszenia o numerze CN113584047A, można osiągnąć wykorzystując inżynierię genetyczną w celu wprowadzenia dodatkowej kopii genu HvNAT2 do roślin jęczmienia, kodującego transporter nukleozasady-kwasu askorbinowego. Z kolei zgłoszenie o numerze CN107326032A prezentuje gen MNB1 kodujący lektynę wiążącą mannozę 1, którego nadekspresja może zwiększać tolerancję roślin Arabidopsis thaliana na obecność kadmu w podłożu.
Warto podkreślić, że pośród zgłoszeń patentowych dotyczących wpływu metali ciężkich na rośliny nie znaleziono takich, które opierałyby się o informacje odnośnie poziomu ekspresji genów jęczmienia.
Celem twórców niniejszego wynalazku było opracowanie sekwencji starterów pozwalających na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia.
Kolejnym celem twórców było opracowanie sposobu identyfikacji jęczmienia mającego wcześniejszy kontakt z cynkiem bazujący na analizie profili ekspresji z użyciem przedstawionych starterów i porównaniu ich poziomu ekspresji z tym dla roślin kontrolnych a w efekcie wskazanie czy badane próbki miały wcześniejszy kontakt z cynkiem.
Istotę wynalazku stanowią sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów jęczmienia, których ekspresja w korzeniach wskazuje na wcześniejszy kontakt jęczmienia z cynkiem, przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0066880 - sekwencje nukleotydowe 1 i 2,
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.5HG0406720 - sekwencje nukleotydowe 3 i 4.
Ponadto istotę wynalazku stanowi sposób identyfikacji jęczmienia mającego wcześniejszy kontakt z cynkiem, obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej, w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin z cynkiem, przez czas co najmniej 15 dni, korzystnie 24 dni, b. izoluje się RNA z korzeni jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych, c. przeprowadza się syntezę cDNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.1HG0066880,
HORVU.MOREX.r2.5HG0406720 metodą qPCR, u roślin kontrolnych oraz badanych, charakteryzujący się tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
i. dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0066880 - sekwencje nukleotydowe 1 i 2, ii. dla genu HORVU.MOREX.r2.5HG0406720 - sekwencje nukleotydowe 3 i 4,
e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.1HG0066880, HORVU.MOREX.r2.5HG0406720, w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, przy czym poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami kontrolnymi oraz badanymi, f. identyfikuje się jęczmień, który miał kontakt z cynkiem, wykazujący wyższy w porównaniu do roślin, tego samego genotypu, hodowanych w warunkach kontrolnych, poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.1HG0066880, HORVU.MOREX.r2.5HG0406720.
Korzystnie, jako rośliny kontrolne stosuje się tą samą odmianę jęczmienia co rośliny badane pod kątem kontaktu z cynkiem. Korzystnie, aby rośliny badane, były w zbliżonym wieku do roślin kontrolnych.
Korzystnie, jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 (Elongation factor 1 -a) i/lub GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [8].
Korzystnie, wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej odbywa się w pożywce Hoaglanda [7].
Korzystnie, wzrost roślin kontrolnych jęczmienia prowadzi się w następujących warunkach: temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C; fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8; intensywność światła od 750 do 1000 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 900 μmol m-2 s-1.
Przedmiot wynalazku przedstawiony został w przykładach wykonania oraz na rysunku, na którym: fig. 1 przedstawia wynik analizy poziomów ekspresji genów u dwóch genotypów jęczmienia po traktowaniu cynkiem (50 μM). Odmiana wyjściowa Sebastian jest tolerancyjna na cynk, w porównaniu do mutanta hvd14.d, który jest nadwrażliwy na cynk. Ekspresja genów badana była przez porównanie każdego z genotypów, który rósł w warunkach kontrolnych do roślin traktowanych cynkiem (10-dniowe traktowanie dawką 50 μM cynku). Analizę poziomu ekspresji prowadzono metodą qPCR, a na fig. 1 zobrazowano względny poziom ekspresji wspomnianych genów, w korzeniach badanych roślin, po traktowaniu cynkiem w odniesieniu do warunków kontrolnych, dla których poziom ekspresji przyjęto jako wartość 1. Przykłady realizacji nie mają charakteru ograniczającego.
Dzięki zastosowaniu rozwiązań według niniejszego wynalazku możliwe jest przeprowadzenie selekcji materiału roślinnego pod kątem wcześniejszego kontaktu z toksycznymi dawkami cynku i wykluczenie takich produktów roślinnych z dalszych etapów przetwórczych związanych z przygotowaniem żywności.
Przykład 1
Sekwencje starterów według wynalazku oraz analiza poziomu ekspresji genów jęczmienia HORVU.MOREX.r2.1HG0066880, HORVU.MOREX.r2.5HG0406720.
RNA wyizolowano z korzeni 24-dniowych roślin jęczmienia, które rosły w warunkach kontrolnych (hodowla hydroponiczna w pożywce Hoaglanda, temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m-2 s-1) oraz tych traktowanych cynkiem (przez pierwsze 14 dni hodowla prowadzona jak dla roślin kontrolnych, przez kolejne 10 dni dodano do pożywki 50 μΜ cynku), z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560). Do syntezy cDNA użyto zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) oraz 1 μg RNA. Otrzymane cDNA rozcieńczono 4-krotnie wodą oraz wykorzystano w reakcji qPCR, którą przeprowadzono z użyciem zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) dla każdej z par starterów:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0066880:
- sekwencja nukleotydowa1
- sekwencja nukleotydowa2
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.5HG0406720:
- sekwencja nukleotydowa3
- sekwencja nukleotydowa4
Jako geny referencyjne w tej reakcji wykorzystano EF1 (Elongation factor 1-a) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [8]. U roślin traktowanych cynkiem zaobserwowano wzrost poziomu ekspresji badanych genów.
Przykład 2
Sposób identyfikacji jęczmienia mającego wcześniejszy kontakt z cynkiem w oparciu o analizę poziomów ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.1HG0066880, HORVU.MOREX.r2.5HG0406720 w korzeniach obejmujący następujące etapy:
a. prowadzi się wzrost siewek kontrolnych jęczmienia przez 24 dni w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza 20°C; fotoperiod 16/8; intensywność światła 900 μmol m-2 s-1) w pożywce Hoaglanda [7] w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin kontrolnych z cynkiem, natomiast wzrost roślin badanych pod kątem wcześniejszego kontaktu z cynkiem prowadzi się przez 14 dni w takich samych warunkach kontrolnych, po czym dodaje się do pożywki 50 μM cynku na 10 kolejnych dni,
b. izoluje się RNA z korzeni jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych, przy czym ten etap przeprowadza się z użyciem mirVana™ miRNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1560) lub MagMAX™-96 Total RNA Isolation Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy AM1830), pozwalającym na otrzymanie czystego chemicznie ekstraktu RNA przy zachowaniu jego integralności,
c. prowadzi się syntezę jednoniciowego cDNA, z użyciem zestawu RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (ThermoScientific, Waltham, MA, USA, numer katalogowy K1622) lub równoważnego oraz 1 μg RNA,
d. analizuje się poziom ekspresji genów u roślin kontrolnych oraz badanych, prowadząc reakcje qPCR z użyciem otrzymanego cDNA (rozcieńczonego 4-krotnie wodą), starterów specyficznych dla genów HORVU.MOREX.r2.1HG0066880, HORVU.MOREX.r2.5HG0406720 oraz zestawu LightCycler 480 SYBR Green I Master (LifeScience Roche, Indianapolis, IN, USA, numer katalogowy 04707516001) lub równoważnego pozwalającego na analizę amplifikacji DNA w czasie rzeczywistym, przy czym do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
a) dla genu HORVU.MOREX.r2.1HG0066880:
- sekwencja nukleotydowa1
- sekwencja nukleotydowa2
b) dla genu HORVU.MOREX.r2.5HG0406720:
- sekwencja nukleotydowa3
- sekwencja nukleotydowa4
e. prowadzi się reakcję qPCR z użyciem starterów genów referencyjnych EF1 (Elongation factor 1 -a) oraz GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) [8] dla każdej próby cDNA,
f. bazując na kinetyce reakcji amplifikacji każdego z genów HORVU.MOREX.r2.1HG0066880, HORVU.MOREX.r2.5HG0406720 oraz genów referencyjnych oblicza się względny poziom ekspresji badanych genów; poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami rosnącymi w warunkach kontrolnych oraz roślin badanych pod kątem wcześniejszego kontaktu z cynkiem, dla każdego z genotypów,
g. identyfikuje się jęczmień, który miał kontakt z cynkiem, wykazujący w korzeniach wyższy w porównaniu do roślin kontrolnych, poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.1HG0066880, HORVU.MOREX.r2.5HG0406720; dla każdego z genotypów porównuje się poziom ekspresji każdego z badanych genów pomiędzy rośliną kontrolną a rośliną badaną, a rośliny z podwyższonym poziomem ekspresji genów są roślinami, które miały wcześniej kontakt z cynkiem.
Przedstawiona procedura powinna być przeprowadzona dla wszystkich analizowanych genotypów, a wartością użytą do oceny wcześniejszego kontaktu z cynkiem jest krotność wzrostu ekspresji u roślin badanych. Rośliny o podwyższonych wskaźnikach miały wcześniejszy kontakt z cynkiem. Wynik porównania dla roślin rosnących bez kontaktu z cynkiem oraz tych mających kontakt z cynkiem przedstawiono na fig. 1 rysunku, przy czym dla roślin rosnących w warunkach kontrolnych poziom ekspresji każdego z genów wynosi 1.
U 24-dniowych roślin jęczmienia, nadwrażliwych i tolerancyjnych na cynk, które zostały potraktowane cynkiem (dawka od 35 do 75 μΜ, najkorzystniej 50 μΜ; traktowanie od 5 do 15 dni, najkorzystniej 10), w porównaniu do roślin rosnących w warunkach kontrolnych (temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C; fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8; intensywność światła od 750 do 1000 μmol m-2 s-1, najkorzystniej 900 μmol m-2 s-1), wykazano podwyższony poziom ekspresji genów: HORVU.MOREX.r2.1HG0066880, HORVU.MOREX.r2.5HG0406720. Stąd podwyższony poziom ekspresji wspomnianych genów może być wykorzystany jako marker kontaktu roślin z cynkiem. Porównując ekspresję tych genów w korzeniach badanej rośliny i korzeniach roślin kontrolnych możliwe jest wskazanie czy badana roślina miała kontakt z cynkiem. Rośliny wykazujące podwyższoną ekspresję wymienionych genów, w porównaniu do roślin kontrolnych mogły mieć kontakt z wysokimi dawkami cynku w glebie bądź wodzie, która była wykorzystana do ich podlewania.
Literatura:
[1] Hawkes J.S. 1997. What is a heavy metal? J. Chem. Educat. 74. 1374-1378.
[2] Duruibe J.O., Ogwuegbu M.O.C., Egwurugwu J.N. 2007. Heavy metal pollution and human biotoxic effects. Int. J. Phys. Sci. 2. 112-118.
[3] Asati, A., Pichhode, M., & Nikhil, K. 2016. Effect of heavy metals on plants: an overview. IJAIEM, 5(3), 56-66.
[4] Kabata-Pendias A., Piotrowska M. 1984. Zanieczyszczenia gleb i roślin uprawnych pierwiastkami śladowymi. Wyd. CBR Warszawa, 1-28.
[5] Nowakowski, W. Podgórski, M. 1989. Tolerancja siewek jęczmienia jarego na Cd i Pb w warunkach kwaśnego odczynu. Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, 380.
[6] Marzec, M., Gruszka, D., Tylec, P., Szarejko, I. 2016. Identification and functional analysis of the HvD14 gene involved in strigolactone signaling in Hordeum vulgare. Physiologia Plantarum, 158(3), 341-355.
[7] Hoagland, D. R., & Arnon, D. I. (1950). The water-culture method for growing plants without soil. Circular. California agricultural experiment station, 347(2nd edit).
[8] Rapacz, M., Stępień, A., Skorupa, K. (2012). Internal standards for quantitative RT-PCR studies of gene expression under drought treatment in barley (Hordeum vulgare L.): the effects of developmental stage and leaf age. Acta Physiologiae Plantarum, 34(5), 1723-1733.
[9] Wu, F., Zhang, G. (2002). Alleviation of cadmium-toxicity by application of zinc and ascorbic acid in barley. Journal of Plant Nutrition, 25(12), 2745-2761.
[10] Aery, N. C., Jagetiya, B. L. (1997). Relative toxicity of cadmium, lead, and zinc on barley. Communications in soil science and plant analysis, 28(11-12), 949-960.
[11] Huang, C., Barker, S. J., Langridge, P., Smith, F. W., & Graham, R. D. (2000). Zinc deficiency upregulates expression of high-affinity phosphate transporter genes in both phosphate-sufficient anddeficient barley roots. Plant Physiology, 124(1), 415-422.
[12] Hodoshima, H., Enomoto, Y., Shoji, K., Shimada, H., Goto, F., & Yoshihara, T. (2007). Differential regulation of cadmium-inducible expression of iron-deficiency-responsive genes in tobacco and barley. Physiologia Plantarum, 129(3), 622-634.
PL 245912 Β1
[13]Sharma, S. S., Kaul, S., Metwally, A., Goyal, K. C., Finkemeier, I., Dietz, K. J. (2004). Cadmium toxicity to barley (Hordeum vulgare) as affected by varying Fe nutritional status. Plant science, 166(5), 1287-1295.
Wykaz sekwencji starterów
Sekwencja nukleotydowa 1 startera: 5’ GTCAGGGGTTGAAACAGGCT 3’
Sekwencja nukleotydowa 2 startera: 5’ GGTACATGCGAGGGTAGCTC 3’
Sekwencja nukleotydowa 3 startera: 5’ AAGAAGAGGACGCGCTCAAA 3’
Sekwencja nukleotydowa 4 startera: 5’ AAGGTTACCCTCCTCGTGGT 3’

Claims (6)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomów ekspresji genów jęczmienia, których ekspresja w korzeniach wskazuje na wcześniejszy kontakt jęczmienia z cynkiem, przedstawione w wykazie sekwencji:
    a) dla genu HORVU.MOREX.r2.1 HG0066880 - sekwencje nukleotydowe 1 i 2,
    b) dla genu HORVU.MOREX.r2.5HG0406720 - sekwencje nukleotydowe 3 i 4.
  2. 2. Sposób identyfikacji jęczmienia mającego wcześniejszy kontakt z cynkiem, obejmujący następujące etapy:
    a. prowadzi się wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej, w warunkach zapewniających brak kontaktu roślin z cynkiem, przez czas co najmniej 15 dni, korzystnie 24 dni,
    b. izoluje się RNA z korzeni jęczmienia roślin kontrolnych oraz roślin badanych,
    c. przeprowadza się syntezę cDNA,
    d. analizuje się poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.1 HG0066880, HORVU.MOREX.r2.5HG0406720 metodą qPCR, u roślin kontrolnych oraz badanych, znamienny tym, że do analizy poziomu ekspresji genów stosuje się sekwencje starterów przedstawione w wykazie sekwencji:
    i. dla genu HORVU.MOREX.r2.1 HG0066880 - sekwencje nukleotydowe 1 i 2, ii. dla genu HORVU.MOREX.r2.5HG0406720 - sekwencje nukleotydowe 3 i 4,
    e. oblicza się relatywny poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.1HG0066880, HORVU.MOREX.r2.5HG0406720 w oparciu o poziomy ekspresji genów referencyjnych, przy czym poziomy ekspresji genów porównuje się pomiędzy roślinami kontrolnymi oraz badanymi,
    f. identyfikuje się jęczmień, który miał kontakt z cynkiem, wykazujący w korzeniach wyższy w porównaniu do roślin, tego samego genotypu, hodowanych w warunkach kontrolnych, poziom ekspresji genów HORVU.MOREX.r2.1 HG0066880, HORVU.MGREX.r2.5HG0406720.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że jako rośliny kontrolne stosuje się tą samą odmianę jęczmienia co rośliny badane pod kątem kontaktu z cynkiem.
  4. 4. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że jako geny referencyjne stosuje się geny: EF1 (Elongation factor 1-a) i/lub GPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase).
  5. 5. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że wzrost roślin kontrolnych jęczmienia w hodowli hydroponicznej odbywa się w pożywce Hoaglanda.
  6. 6. Sposób według zastrz. 2 znamienny tym, że wzrost roślin kontrolnych jęczmienia prowadzi się w następujących warunkach: temperatura powietrza od 18 do 22°C, najkorzystniej 20°C; fotoperiod od 14/10 do 20/4, najkorzystniej 16/8; intensywność światła od 750 do 1000 pmol m-2 s'1, najkorzystniej 900 pmol m-2 s-1.
PL442123A 2022-08-27 2022-08-27 Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem PL245912B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL442123A PL245912B1 (pl) 2022-08-27 2022-08-27 Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL442123A PL245912B1 (pl) 2022-08-27 2022-08-27 Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL442123A1 PL442123A1 (pl) 2024-03-04
PL245912B1 true PL245912B1 (pl) 2024-10-28

Family

ID=90106988

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL442123A PL245912B1 (pl) 2022-08-27 2022-08-27 Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL245912B1 (pl)

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMELIE DETTERBECK, MANUELA NAGEL, STEFAN RENSCH, MICHAEL WEBER, ANDREAS BÖRNER, DANIEL P. PERSSON, JAN KOFOD SCHJOERRING, VESSELIN: "Biochem J ; 2019, 476 (13): 1889–1909", THE SEARCH FOR CANDIDATE GENES ASSOCIATED WITH NATURAL VARIATION OF GRAIN ZN ACCUMULATION IN BARLEY, DOI: org/10.1042/BCJ20190181 *
JINGWEN TIONG, GLENN K. MCDONALD, YUSUF GENC, PAI PEDAS, JULIE E. HAYES, JOHN TOUBIA, PETER LANGRIDGE, CHUN Y. HUANG: "New Phytologist, 2014, 201:131–143", HVZIP7 MEDIATES ZINC ACCUMULATION IN BARLEY (HORDEUM VULGARE) AT MODERATELY HIGH ZINC SUPPLY, DOI: 10.1111/nph.12468 *
MIKKELSEN MD, PEDAS P, SCHILLER M, VINCZE E, MILLS RF: "PLoS ONE, 2012, 7(11): e49027", BARLEY HVHMA1 IS A HEAVY METAL PUMP INVOLVED IN MOBILIZING ORGANELLAR ZN AND CU AND PLAYS A ROLE IN METAL LOADING INTO GRAINS, DOI: 10.1371/journal.pone.0049027 *
PALOMA MENGUER, THOMAS VINCENT, ANTHONY J. MILLER, JAMES K.M. BROWN, EVA VINCZE, SØREN BORG, PREBEN BACH HOLM, DALE SANDERS, DORIN: "Plant Biotechnol J; 2018, 16(1):63-71", IMPROVING ZINC ACCUMULATION IN CEREAL ENDOSPERM USING HVMTP1, A TRANSITION METAL TRANSPORTER, DOI: 10.1111/pbi.12749 *

Also Published As

Publication number Publication date
PL442123A1 (pl) 2024-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dai et al. Physiological and transcriptomic analyses of mulberry (Morus atropurpurea) response to cadmium stress
Wang et al. Silver nanoparticles regulate Arabidopsis root growth by concentration-dependent modification of reactive oxygen species accumulation and cell division
Khan et al. Functional characterization of a new metallochaperone for reducing cadmium concentration in rice crop
Imtiaz et al. Physiological and anthocyanin biosynthesis genes response induced by vanadium stress in mustard genotypes with distinct photosynthetic activity
Xue et al. Citric acid inhibits Cd uptake by improving the preferential transport of Mn and triggering the defense response of amino acids in grains
Xiao et al. Relationship between ionomics and transcriptomics of rice plant in response to arsenite stress
Pires-Lira et al. Potential of Panicum aquanticum Poir.(Poaceae) for the phytoremediation of aquatic environments contaminated by lead
Meng et al. Toxicity effects of zinc supply on growth revealed by physiological and transcriptomic evidences in sweet potato (Ipomoea batatas (L.) Lam)
Fahr et al. Assessment of lead tolerance and accumulation in metallicolous and non-metallicolous populations of Hirschfeldia incana
Marrugo-Madrid et al. Phytoremediation of mercury in soils impacted by gold mining: A case-study of Colombia
Kılıç et al. The influence of nanosized zero-valent iron (nZVI) on the micropropagation, antioxidant activity, and phenolic compound content of cherry laurel (Prunus laurocerasus L.)
Ali et al. Expression analysis of transcription factor (CBF/DREB) gene and biochemical response of Cannabis sativa to cadmium toxicity and foliar application of molybdenum
Selvaraj et al. Effect of nickel chloride on the growth and biochemical characteristics of Phaseolus mungo L
PL245913B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem
PL245914B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem
PL245916B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem
PL245915B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem i kadmem
PL245911B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji jęczmienia, który miał kontakt z cynkiem
PL245910B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na cynk i kadm
PL245868B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na cynk i kadm
PL245551B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na cynk
PL245552B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk i kadm
PL245871B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w liściach i korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk i kadm
PL245869B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o obniżonej tolerancji na cynk i kadm
PL245524B1 (pl) Sekwencje starterów pozwalające na analizę poziomu ekspresji genów w korzeniach jęczmienia oraz sposób identyfikacji genotypów jęczmienia o podwyższonej tolerancji na cynk