PL243367B1 - Sposób krioprzechowywania nieembrionalnych, mezenchymalnych komórek macierzystych z dziąsła - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy sposobu pozyskiwania nieembrionalnych komórek macierzystych i egzosomów z tkanki dziąsła i ich przechowywania w oparach wrzącego ciekłego azotu. Uwolnione komórki macierzyste po namnożeniu in vitro, lub całe fragmenty dziąseł pozyskiwanych w trakcie ekstrakcji zęba z powodów stomatologicznych lub ortodoncji są przechowywane w nieograniczonym czasie w oparach wrzącego płynnego azotu o temperaturze -196°C. Multipotentne komórki macierzyńskie pozyskane z dziąsła po namnożeniu mogą być w różnorakich kompozycjach wykorzystywane w leczeniu i rekonstrukcji tkanki zębów, jamy ustnej,  zaś egzosomy wykorzystane do przenoszenia materiału biologicznego do innych komórek, między innymi w procesach leczenia.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób krioprzechowywania nieembrionalnych, mezenchymalnych komórek macierzystych z dziąsła.

Niniejszy wynalazek należy do dziedziny biologii molekularnej, cytologii, a w szczególności dotyczy inżynierii tkankowej z zastosowaniem w medycynie regeneracyjnej, onkologii i w procedurach kosmetycznych i estetycznych. Dotyczy pozyskiwania nieembrionalnych, mezenchymalnych komórek macierzystych z odsłoniętego dziąsła, po ekstrakcji zęba w trakcie zabiegów stomatologicznych lub w trakcie odsłaniania płatów dziąseł zamykających implant.

Rozwiązanie według wynalazku umożliwia przechowywanie przez nieograniczony czas komórek macierzystych wyekstrahowanych z dziąsła, zabezpieczonych jego fragmentów do wykorzystania w hodowli w późniejszym okresie oraz egzosomów wypreparowanych z tego dziąsła.

Komórki macierzyste to samoodnawiające się komórki, które dzielą się, dając początek komórce o identycznym potencjale rozwojowym i/lub o bardziej ograniczonym potencjale rozwojowym. Komórka macierzysta ma zdolność dzielenia się przez nieokreślony czas, przynajmniej przez wiele cykli, a często przez całe życie organizmu. Biorąc pod uwagę określone sygnały w rozwoju organizmu, komórki macierzyste mogą różnicować się w wiele różnych typów komórek tworzących organizm. Oznacza to, że komórki macierzyste mają potencjał, aby rozwinąć się w dojrzałe komórki o charakterystycznych kształtach i wyspecjalizowanych funkcjach, takich jak komórki kości, komórki mięśniowe, komórki skóry lub komórki nerwowe. Wyczerpujące dane dotyczące technologii pozyskiwania, hodowli i zastosowań zawarto w szeregu publikacjach, w tym w: Watt F.M. i wsp., „Out of Eden; Stem Cells and their Niches”, Science, American Association for the Advancement of Science, US, 2000, vol.287, no.5457, 1472-1430 w Jiang Y i wsp., „Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow”, Nature, 2002, tom 418, str. 41-47 i Sadiq T.S., Gerber D.A. „Stem cells in modern medicine: reality or myth?” J. Surg. Res., 2004; Vol.122, 280-291.

Pluripotencjalne komórki macierzyste mogą dać początek komórkom, które mogą tworzyć szeroki zakres typów komórek, takich jak mezoderma, endoderma i ektoderma zarodka, dlatego też w przeszłości poświęcano im tak wiele uwagi. Pojawiły się jednak wątpliwości natury etycznej dotyczące wykorzystania embrionalnych komórek macierzystych. Dlatego też izolowane nieembrionalne komórki macierzyste, somatyczne komórki macierzyste, „dorosłe komórki macierzyste” mają obecnie coraz większe znaczenie dla opracowywania innowacyjnych strategii terapeutycznych i estetycznych.

Pluripotencjalne i multipotencjalne są niezależne i nie są przypisane do określonej linii komórkowej, charakteryzują się samoodnową, nie mają ograniczeń co do potencjalnej liczby podziałów. Same zaś przyczyniają się do różnicowania i powstawania różnych typów komórek organizmu.

Obecnie szczególne znaczenie w stomatologii, ortodoncji i różnych schorzeniach jamy ustnej przypisuje się dużą rolę mezenchymalnym komórkom macierzystym z miazgi zęba i z dziąsła. Są one, co najmniej multipotencjalne, łatwe w pozyskaniu, hodowli i przechowywaniu. W oparciu o niniejszy wynalazek mogą mieć szeroki zakres zastosowań w leczeniu i rekonstrukcji tkanki zębów i nie tylko teraz, ale w przyszłości.

Szczególne zainteresowanie nieembrionalnymi komórkami macierzystymi z tkanki dziąsła, przekłada się na opracowanie metod ich pozyskiwania, hodowli i zastosowan ia terapeutycznego i estetycznego.

Dane dotyczące właściwości, technologii pozyskiwania, hodowli i ich zastosowań zawarto w szeregu publikacjach i opisach patentowych, z których, jako szczególnie istotną, można wymienić: Kawashima N. i wsp., „Properties of Dental Pulp-derived Mesenchymal Stem Cells and the Effects of Culture Conditions”, J. Endod. 2017 Sep;43(9S), 31-34. Dotyczy ona jednak tylko komórek miazgi zęba, pomijając komórki dziąsła.

Dane dotyczące komórek lub danych w zgłoszeniach patentowych rosną w świecie lawinowo, z których niektóre europejskie patenty EPO są walidowane w Polsce - PL/EP 2951288 i PL/EP 1773987. Wymienione patenty EPO dotyczą sposobów otrzymywania i stosowania komórek macierzystych od dorosłej osoby lub komórek z mieszków włosowych. Przytoczone patenty EPO nie dotyczą sposobów przechowywania komórek w niskich temperaturach i sposobów ich dalszego wykorzystania.

W naukowych publikacjach między innymi: Gronthos S. i wsp. „Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo”, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2000, vol.97, no.25,13625-13630 i Noriaki i in., „Evaluation of Pluripotency in Human Dental Pulp Cells”, J. Oral Maxillofac Surg, 2009, vol. 67, no. 501-506 opisują szereg właściwości mezenchymalnych komórek macierzystych z miazgi zęba.

W zgłoszeniu PCT WO 02/07676 A2 opisano sposób regeneracji ludzkiej zębiny i miazgi z wykorzystaniem hodowanych „dorosłych komórek macierzystych” pochodzących z miazgi zębowej. Nieembrionalne komórki macierzyste z miazgi są już w zaawansowanym stadium rozwoju, nie są one multipotencjalne, a jedynie różnicują się w wyspecjalizowany typ komórki, tkanki, z której zostały wyizolowane.

Wszystkie przytoczone wyżej rozwiązania obejmują sposoby pozyskiwania komórek z miazgi zębów, zarówno tzw. mlecznych i ósemek tzw. zębów mądrości i ich zastosowań w leczeniu różnych części jamy ustnej, oraz tkanki nerwowej pomijając istotny etap przechowywania komórek lub fragmentów zębów w warunkach umożliwiających ich dalsze, po pewnym czasie wykorzystanie w leczeniu lub regeneracji uzębienia.

Opis patentowy CN106359368 A ujawnia wynalazek dotyczący płynu do zamrażania dziąsłowych mezenchymalnych komórek macierzystych oraz metody ich zamrażania, która obejmuje wstępne schłodzenie w 4°C, umieszczenie w niskiej temperaturze -80°C na 2-3 dni i przechowywanie w ciekłym azocie.

Opis patentowy US2009022693 A1 ujawnia metodę izolacji multipotencjalnych komórek macierzystych z tkanki zęba, w której komórki macierzyste są ekstrahowane ze struktury tkanki, a następnie hodowane. Metoda obejmuje kriokonserwację w temperaturze -80°C, a potem w temperaturze -196°C. Jej zaletą jest możliwość długotrwałego przechowywania komórek i ich dostępność do celów terapeutycznych. Opis patentowy WO2011141789 A2 ujawnia metodę kriokonserwacji miazgi izolowanego zęba, obejmującą etap zamrażania w temperaturze od -15°C do -196°C.

Opis patentowy EP3296392 A1 ujawnia sposób wytwarzania zamrożonych komórek mezenchymalnych, obejmujący m.in. etap kriokonserwacji komórek mezenchymalnych. Komórkami tymi mogą być m.in. komórki miazgi zęba. Komórki mrożono w temperaturze -80°C, a następnie w temperaturze -150°C.

Komórki przechowywane w temperaturze oparów ciekłego azotu, rozmnożone, wyizolowane, poddane hodowli i namnożeniu, jak również komórki macierzyste wyizolowane z miazgi zamrożonych i przechowywanych w temperaturze -196°C fragmentów zębów, wyizolowane, poddane hodowli i namnożeniu, oraz każda hodowla komórkowa, struktura komórkowa lub kompozycje farmaceutyczne zawierające te komórki mogą być stosowane do naprawy lub zastępowania uszkodzonej lub zniszczonej tkanki in vivo. Podobnie mogą być one stosowane do uzyskiwania zróżnicowanych komórek lub tkanek twarzoczaszki, w tym również komórek lub tkanek układu stomatognatycznego, do uzyskiwania zróżnicowanych neuronów lub innych komórek nerwowych [Arthur A. i wsp. „Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues”. Stem Cells. 2008, 26(7): 1787-1795] i/lub do zastępowania lub naprawy tkanki ektomezenchymalnej.

Wyniki badań pokazują, że macierzyste komórki po hodowli i zamrożeniu do -196°C lub po pozyskaniu/izolowaniu z zamrożonej tkanki po kriokonserwacji reagują na stymulację komórek. Według niektórych odpowiedź komórek po kriokonserwacji jest silniejsza niż bez kriokonserwacji US2009022693.

Mikropęcherzyki pochodzenia komórkowego są strukturami uwalnianymi z komórek, w tym przypadku z komórek macierzystych, które zawierają antygeny komórek, z których się wywodzą. Niosą błonowe i cytoplazmatyczne składniki, między innymi mRNA, jako nośnik materiału genetycznego, [EP2542250], który może przeprogramować docelowe różnicowanie się komórek macierzystych w różnego rodzaju komórki. (Deregibus M.C. i wsp. „Endothelial progenitor cell derived microvesicles activate an angiogenic program in endothelial cells by a horizontal transfer of mRNA”, Blood. 2007; 110(7): 2440-2448); (Bruno S. i wsp. „Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury”, J Am Soc Nephrol. 2009; vol.20, No5, 1053-1067); (Herrera M.B. i wsp. „Human liver stem cell-derived microvesicles accelerate hepatic regeneration in hepatectomized rats”, J .Cell. Mol Med., 2009 Vol.24) i przyczyniać się do regeneracji i naprawy tkanek. W Polsce w procesie walidacji zarejestrowano patenty EPO dotyczące tego zagadnienia: PL/EP2542250, PL/EP2736600, PL/EP2254583. Istotne są również publikacje dotyczące metod postępowania z egzosomami np. Vella L.J. i wsp., „A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue”, J. Extracell Vesicles,. 2017, vol. 26, No 6(1) I Perez-Gonzalez R., „A Method for Isolation of Extracellular Vesicles and Characterization of Exosomes from Brain Extracellular Space”, Methods Mol. Biol. 2017, vol. 1545, 139-151.

W związku z tym, że mezenchymalne komórki macierzyste z dziąsła są co najmniej multipotencjalne, ale jednocześnie łatwe w pozyskaniu i hodowli w oparciu o niniejszy wynalazek mogą mieć szeroki zakres zastosowań w leczeniu i rekonstrukcji tkanki zębów i nie tylko.

Istota wynalazku dotyczy zastosowania technologii pozyskiwania i przechowywania multipotencjalnych komórek macierzystych pozyskanych z dziąsła zęba.

Sposób krioprzechowywania multipotencjalnych, nieembrionalnych, mezenchymalnych komórek macierzystych z dziąsła, wykorzystujący zamrażanie w medium krioprotekcyjnym, charakteryzuje się tym, że pobraną tkankę z dziąsła rozdrabnia się w roztworze medium DMEM z mieszanką enzymów kolagenaza typu I - 2 mg/ml, dyspaza -1 mg/ml, z dodatkiem mieszaniny antybiotyków - penicylina/streptomycyna w ilości 2% i inkubuje się w jałowych warunkach przez 24 godziny w te mperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2, następnie namnaża się komórki w medium hodowlanym o składzie: α-MEM-baza, 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1% chloramfenikolu i 2% penicyliny-streptomycyny, zaś medium krioprotekcyjne do przechowywania komórek składa się z medium DMEM i 10% DMSO o temperaturze 1-0°C, a zamrażanie komórek do temperatury 75-80°C odbywa się w tempie -1°C/minutę przez 24 godziny, przy czym komórki przechowuje się długotrwale w oparach ciekłego azotu w temperaturze -196°C.

Uzyskane po rozmrożeniu fragmenty dziąsła służą do pozyskania żywych, multipotencjalnych, nieembrionalnych komórek macierzystych.

Korzystnie komórki macierzyste z dziąseł pozyskuje się z tkanki po ekstrakcji zęba lub z fragmentów odsłoniętych dziąseł w trakcie odsłaniania śruby zamykającej implant po sterylizacji okolic zęba lub jego fragmentów alkoholem etylowym.

W przypadku gdy fragmenty dziąseł do analizy wymagają transportu, zabezpiecza się je w roztworze medium o składzie: DMEM-baza, 1% chloramfenikol, 2% roztwór penicyliny i streptomycyny i 10 U/ml nystatyny o temperaturze 4-0°C.

Komórki po hodowli przed zamrożeniem są analizowane pod kątem macierzystości i żywotności. Nieembrionalne komórki macierzyste z dziąseł zębów są komórkami ssaka, korzystnie ludzkimi. Cel wynalazku zostaje osiągnięty dzięki metodzie izolowania i identyfikacji nieembrionalnych komórek macierzystych z dziąsła, która obejmuje etapy: pozyskania, identyfikacji cytologicznej komórek, analizy genetycznej z użyciem wyselekcjonowanych markerów oraz przestrzeganiu procedur przechowywania komórek według wynalazku.

Sposób według wynalazku dotyczący przechowywania nieembrionalnych komórek macierzystych został przedstawiony w przykładach wykonania i na rysunku, który przedstawia przykładowe wyniki analizy cytogenetycznej z cytometru przepływowego. Rysunek przedstawia wyniki analizy cytometrycznej reprezentatywnej hodowli komórek wyizolowanych z tkanki dziąsła. Komórki te wykazują ekspresję antygenów CD44, CD 105 i CD90, uznawanych za markery macierzystości, zgodnie z kryteriami International Society for Cellular Therapy.

W tabeli podano zestawienie używanych skrótów oraz producentów odczynników i używanej aparatury. Jeżeli nie zdefiniowano inaczej, wszystkie określenia techniczne i naukowe stosowane w niniejszym opisie mają znaczenie jako powszechnie rozumiane przez specjalistów z dziedziny, do której wynalazek należy.

Przykład nr 1

Komórki macierzyste z dziąsła otrzymuje się pobierając fragment dziąsła w trakcie ekstrakcji zęba w warunkach możliwie sterylnych.

Fragmenty dziąsła sterylizuje się 70% alkoholem etylowym i umieszcza w pojemniku transportowym. Bezpieczeństwo biologiczne jest określane na podstawie wyników badań mikrobiologicznych na obecność bakterii tlenowych, beztlenowych i grzybów w hodowli in vitro, a także poprzez zestaw badań, które pacjent ma obowiązek wykonać przed donacją tkanki (Anty-HIV-1 i 2, HBsAg i Anty HBc, Anty-HCV oraz kiła).

Pojemnik do transportu materiału stanowi buteleczka o pojemności 30 ml, wykonana z PPCO, z polipropylenową nakrętką, umożliwiającą szczelne zakręcenie pojemnika. Pojemnik nadaje się do sterylizacji w autoklawie i wykazuje odporność na temperaturę do 121°C.

Materiał biologiczny jest zabezpieczany, tzn. umieszczany w sposób jałowy w medium do transportu o składzie: DMEM z dodatkiem 1% chloramfenikolu, 2% antybiotyków, penicyliny-streptomycyny oraz 100 U/ml nystatyny, w objętości 10 ml.

Dziąsła i usuwany ząb nie mogą posiadać objawów zapalenia, oznak próchnicy, muszą być zębami żywymi, a ich struktura musi być zachowana w całości podczas zabiegu usuwania.

Zabieg pobrania tkanki jest skuteczny, jeśli tkanka została pobrana w formie nienaruszonej. Materiał biologiczny w pojemniku i w medium transportowym umieszczano następnie w styropianowym pojemniku wyposażonym we wkłady chłodzące, aby zachować temperaturę transportu do 4°C. Powyższy pojemnik jest odbierany przez pracownika firmy kurierskiej i natychmiastowo transportowany do siedziby laboratorium Banku Komórek i Tkanek wraz z niezbędną dokumentacją.

Procedura przechowywania i późniejszego wykorzystywania komórek macierzystych z dziąsła składa się z etapów, gdzie etap pozyskiwania i przechowywania komórek oraz uruchamiania hodowli po okresie zamrożenia jest istotą tego wynalazku. Procedura składa się z:

- pozyskiwania materiału biologicznego z dziąsła po ekstrakcji zębów,

- pozyskiwania komórek macierzystych,

- identyfikacji komórek,

- hodowli komórek macierzystych,

- przechowywania komórek macierzystych w stadium zamrożenia, kriobanking,

- uruchamiania hodowli po rozmrożeniu komórek.

Zgodnie z przedstawionymi etapami, postępowanie przebiega według ww. schematu.

Z przechowywanego w warunkach sterylnych dziąsła lub jego fragmentów wyodrębnia się pod komorą laminarną komórki macierzyste. Tkankę umieszcza się na szalce Petriego i mechanicznie rozdrabnia z wykorzystaniem sterylnego skalpela. Rozdrobnioną tkankę umieszcza się w probówce stożkowej, zawierającej roztwór medium DMEM, (Sigma, Aldrich) z mieszanką enzymów o stężeniach, kolagenaza typu I - 2 mg/ml, dyspaza - 1 mg/ml, z dodatkiem mieszaniny antybiotyków - penicylina/streptomycyna w ilości 2%. Zawieszoną rozdrobnioną tkankę inkubuje przez 24 godz. w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2.

Po upływie czasu inkubacji zawiesina jest wirowana w temperaturze pokojowej przy 300 g przez 8 minut. Supernatant jest usuwany, a osad komórkowy zawieszany w medium hodowlanym składającym się z α-MEM (Sigma, Aldrich) wzbogaconym w 10% FBS (Sigma), z dodatkiem 2 mM L-glutaminy, 1% chloramfenikolu i 2% penicyliny-streptomycyny. Zawiesina komórkowa wysiewana jest do naczynia hodowlanego i inkubowana przez 24 godz. w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2.

Po upływie 24 godz. medium hodowlane o składzie wymienionym wyżej jest wymieniane.

Dodatkowo, aby uzyskać homogenną hodowlę komórek macierzystych przeprowadza się ich sortowanie z wykorzystaniem kuleczek magnetycznych MACS MicroBeads (Miltenyi Biotec) związanych z przeciwciałami skierowanymi na komórki macierzyste, takimi jak: CD44, CD90, CD73 czy CD105. W celu izolacji homogennej populacji komórek macierzystych, komórki wyizolowane z dziąsła są inkubowane z kuleczkami magnetycznymi, co skutkuje przyłączeniem się kuleczek do komórek wykazujących ekspresję markerów macierzystości.

Zawiesina komórkowa umieszczana jest w polu magnetycznym, co powoduje rozdzielenie wyznakowanych i niewyznakowanych komórek. Wyznakowane komórki pozostają w kolumnie, a niewyznakowane są wypłukiwane. Po usunięciu kolumny z pola magnetycznego docelowe komórki macierzyste są eluowane z kolumny, co umożliwia uzyskanie homogennej populacji komórek macierzystych.

Hodowlę komórek dziąsła prowadzi się do osiągnięcia przez komórki 60-80% konfluencji, zmieniając medium co 48 godz.

Identyfikację i mrożenie komórek wyizolowanych z dziąsła po hodowli rozpoczyna się od przepłukania warstwy komórek hodowanych roztworem PBS, a następnie inkubacji przez 5 minut w 37°C, w roztworze trypsyny stężeniu 0,25%. Po upływie tego czasu komórki przestają przylegać do podłoża naczynia hodowlanego, a do ich zawiesiny dodaje się jednakową objętość medium hodowlanego, w celu neutralizacji enzymu.

Zawiesinę komórkową przenosi się do stożkowej probówki i wiruje przy 300 g przez 8 minut. W przypadku przeznaczenia komórek do zamrożenia uzyskany osad komórkowy zawiesza się w roztworze z dodatkiem środka krioprotekcyjnego, w tym przypadku 10% DMSO w DMEM (Sigma, Aldrich) o temperaturze 0°C. Zawiesinę komórek w medium do mrożenia o stężeniu 10⁶/ml komórek przenosi się do kriofiolki, którą umieszcza się w pojemniku z izopropanolem i schładza do temperatury -75-80°C, zapewniając tempo zamrażania ok. -1°C/min. Następnie kriofiolki umieszczane są w naczyniu z ciekłym azotem, gdzie mogą być długotrwale przechowywane w atmosferze oparów azotu w temperaturze -196°C.

Część hodowlanej mieszaniny komórek macierzystych zawieszanych w medium hodowlanym, przeżyciowym poddaje się analizie żywotności i macierzystości komórek. Badając macierzystość komórek, komórki w liczbie 106 na próbę zawiesza się w buforze PBS/EDTA/BSA, a następnie inkubuje z przeciwciałami: CD44-FITC, CD105-PE i CD90-APC (Miltenyi Biotec) przez 10 minut w temperaturze 2-8°C w ciemności. Następnie komórki zostają przepłukane buforem PBS/EDTA/BSA i zawieszone w tym buforze. Tak przygotowane hodowlane komórki z dziąsła poddaje się analizie w cytometrze przepływowym.

Określenie macierzystości komórek wyizolowanych z dziąsła bazuje na wykorzystaniu technologii cytometrii przepływowej. Za komórki macierzyste uznawane są komórki wykazujące ekspresję antygenów: CD105, CD90, CD73 i CD44, przy jednoczesnym braku ekspresji antygenów charakterystycznych dla linii hematopoetycznych: CD45, CD34, CD 14, CD11b, CD79a, CD19 i HLA-DR.

Analizę prowadzi się na podstawie kryteriów International Society for Cellular Therapy; Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E. „Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells”. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; vol. 8, no 4, :315-317.

Przykładowe wyniki analizy cytogenetycznej z cytometru przepływowego przedstawiono na rysunku. Rysunek przedstawia wyniki analizy cytometrycznej reprezentatywnej hodowli komórek wyizolowanych z tkanki dziąsła. Komórki te wykazują ekspresję antygenów CD44, CD 105 i CD90, uznawanych za markery macierzystości, zgodnie z kryteriami International Society for Cellular Therapy.

Badając żywotność komórek, licznik (ADAM-MC - NanoEntek) segreguje komórki wybarwione wcześniej jodkiem propidyny na podstawie ich fluorescencji. Część zawiesiny komórek po okresie hodowli miesza się z dwoma roztworami zawierającymi jodek propidyny, który wybarwia DNA. W przypadku żywych komórek, barwnik nie jest w stanie dostać się do środka komórki, natomiast w przypadku martwych, jest to możliwe, dlatego tylko jądra martwych komórek zostaną zabarwione. Licznik oblicza liczbę wszystkich komórek oraz liczbę martwych i automatycznie na zasadzie proporcji oblicza przeżywalność komórek w hodowli.

W przypadku mrożenia całych fragmentów dziąsła zawierających multipotencjalne mezenchymalne komórki macierzyste, fragmenty umieszcza się w warunkach sterylnych, w medium z dodatkiem środka krioprotekcyjnego, w tym przypadku 10% DMSO w DMEM o temperaturze zbliżonej do 0°C. Fragmenty dziąsła umieszcza się następnie w pojemniku z izopropanolem i schładza do temperatury około -80°C, zapewniając tempo zamrażania -1 °C/min. Następnie kriofiolki umieszczane są w naczyniu z ciekłym azotem, gdzie mogą być długotrwale przechowywane w atmosferze oparów azotu w temperaturze około -196°C, zachowując po rozmrożeniu aktywność biologiczną.

Przykład nr 2

Istota postępowania polega na tym, że komórki macierzyste z dziąsła otrzymanego w trakcie ekstrakcji zęba w warunkach możliwie sterylnych, pozyskuje się bezpośrednio z tkanek dziąsła.

Fragmenty tkanek z dziąsła sterylizuje się 70% alkoholem etylowym i umieszcza w pojemniku transportowym. Bezpieczeństwo biologiczne jest określane na podstawie wyników badań mikrobiologicznych na obecność bakterii tlenowych, beztlenowych i grzybów w hodowli in vitro, a także poprzez zestaw badań, które pacjent ma obowiązek wykonać przed donacją tkanki (Anty-HIV-1 i 2, HBsAg i Anty HBc, Anty-HCV oraz kiła).

Pojemnik do transportu materiału stanowi buteleczka o pojemności 30 ml, wykonana z PPCO, z polipropylenową nakrętką, umożliwiającą szczelne zakręcenie pojemnika. Pojemnik nadaje się do sterylizacji w autoklawie i wykazuje odporność na temperaturę do 121°C.

Materiał biologiczny jest zabezpieczany, tzn. umieszczany w sposób jałowy w medium do transportu o składzie: DMEM z dodatkiem 1% chloramfenikolu, 2% antybiotyków - penicyliny-streptomycyny oraz 100 U/ml nystatyny, w objętości 10 ml.

Dziąsło nie może mieć oznak zapalenia i jego struktura musi być zachowana.

Zabieg pobrania tkanki jest skuteczny, jeśli tkanka została pobrana w formie nienaruszonej i może być pozyskana w celu izolacji komórek macierzystych i ich mrożenia. Materiał biologiczny w pojemniku i medium transportowym umieszczano następnie w styropianowym pojemniku wyposażonym we wkłady chłodzące, aby zachować temperaturę transportu do 4°C. Powyższy pojemnik jest odbierany przez pracownika firmy kurierskiej i natychmiastowo transportowany do siedziby laboratorium Banku Komórek i Tkanek wraz z niezbędną dokumentacją.

W warunkach jałowych, fragment dziąsła przemywa się roztworem PBS i umieszcza w warunkach sterylnych - pod komorą laminarną. Komórki macierzyste z dziąsła izolowane są w warunkach sterylnych - pod komorą laminarną.

Dziąsło/fragment dziąsła umieszcza się na szalce Petriego i mechanicznie rozdrabnia z wykorzystaniem sterylnego skalpela. Rozdrobnioną tkankę umieszcza się w probówce stożk owej, zawierającej roztwór enzymów w DMEM (Sigma, Aldrich) z mieszanką enzymów o stężeniach: kolagenaza typu I - 2 mg/ml, dyspaza - 1 mg/ml z dodatkiem mieszaniny antybiotyków - penicylina-streptomycyna w ilości 2%, a następnie inkubuje przez 24 godz. w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2.

Po upływie czasu inkubacji zawiesinę wiruje się w temperaturze pokojowej przy 300 g przez 8 minut. Supernatant jest usuwany, a osad komórkowy jest zawieszany w medium hodowlanym składającym się z α-MEM, 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1% chloramfenikolu i 2% penicyliny-streptomycyny. Zawiesina komórkowa wysiewana jest do naczynia hodowlanego, a po upływie 24 godz. zmieniane jest medium hodowlane. Pozyskany materiał poddaje się hodowli/namnażaniu w medium o składzie: α-MEM, 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1% chloramfenikolu i 2% penicyliny-streptomycyny, w jałowych warunkach w inkubatorze w temperaturze 37°C w atmosferze 5% stężenia CO2.

Dodatkowo, aby uzyskać homogenną hodowlę komórek macierzystych przeprowadza się ich sortowanie z wykorzystaniem kuleczek magnetycznych MACS MicroBeads (Miltenyi Biotec) związanych z przeciwciałami skierowanymi na komórki macierzyste, takimi jak: CD44, CD90, CD73 czy CD105. W celu izolacji homogennej populacji komórek macierzystych, komórki wyizolowane z dziąsła są inkubowane z kuleczkami magnetycznymi, co skutkuje przyłączeniem się kuleczek do komórek wykazujących ekspresję markerów macierzystości. Zawiesina komórkowa umieszczana jest w polu magnetycznym, co skutkuje rozdzieleniem wyznakowanych i niewyznakowanych komórek. Wyznakowane przeciwciałami komórki pozostają w kolumnie, a niewyznakowane są wypłukiwane. Po usunięciu kolumny z pola magnetycznego docelowe komórki ulegają elucji, dzięki czemu uzyskiwana jest homogenną populacja komórek macierzystych.

Część hodowlanej mieszaniny komórek macierzystych zawiesza się w buforze PBS/EDTA/BSA i poddaje analizie na żywotności i macierzystość komórek.

Badając macierzystość, komórki w liczbie 106 na próbę zawieszone w buforze PBS/EDTA/BSA inkubuje się z przeciwciałami: CD44-FITC, CD105-PE i CD90-APC (Miltenyi Biotec) przez 10 minut w temperaturze 2-8°C w ciemności. Następnie komórki zostają przepłukane i zawieszone w roztworze PBS/EDTA/BSA. Tak przygotowane hodowlane komórki z dziąsła poddaje się analizie w cytometrze przepływowym.

Badając żywotność komórek segreguje się komórki na podstawie fluorescencji komórek wybarwionych jodkiem propidyny. Część zawiesiny komórek po hodowli miesza się z roztworem jodku propidyny, który wybarwia DNA. W przypadku żywych komórek, barwnik nie jest w stanie dostać się do środka komórki, natomiast w przypadku martwych jest to możliwe, dlatego tylko jądra martwych komórek zostaną zabarwione. Licznik oblicza liczbę wszystkich komórek oraz liczbę martwych i automatycznie na zasadzie proporcji oblicza przeżywalność komórek w hodowli.

Identyfikację i wykorzystanie komórek macierzystych wyizolowanych z dziąsła po hodowli rozpoczyna się od przepłukania warstwy komórek hodowanych roztworem PBS, a następnie inkubacji przez 5 minut w 37°C, w roztworze trypsyny bez wapnia w stężeniu 0,25%. Po upływie tego czasu komórki przestają przylegać do podłoża naczynia hodowlanego, a do ich zawiesiny dodaje się jednakową objętość medium hodowlanego, w celu neutralizacji enzymu.

Zawiesinę komórkową przenosi się do stożkowej probówki i wiruje przy 300 g przez 8 minut. Osad komórek macierzystych przeznaczanych do dalszych badań lub innego wykorzystania zawiesza się w roztworach wymaganych w tych postępowaniach. W przypadku przeznaczenia komórek do ponownego zamrożenia uzyskany osad komórkowy zawiesza się w roztworze z dodatkiem środka krioprotekcyjnego, w tym przypadku medium DMEM i 10% DMSO o temperaturze zbliżonej do 0°C. Zawiesinę komórek w medium do mrożenia o stężeniu 10⁶/ml komórek przenosi się do kriofiolki, którą umieszcza się w pojemniku z izopropanolem i schładza do temperatury około -80°C, zapewniając tempo zamrażania, ok. -1 °C/min. Następnie kriofiolki umieszczane są w naczyniu z ciekłym azotem, gdzie mogą być długotrwale przechowywane w atmosferze oparów azotu w temperaturze około -196°C.

W innym przypadku osad komórek zawiesza się w medium lub innych płynach wymaganych w dalszych etapach postępowania.

Po okresie przechowywania komórki są rozmrażane w medium, a następnie pozyskane z niego komórki macierzyste rozmnaża się w myśl procedury podanej w przykładzie nr 2.

Przykład nr 3

Fragment dziąsła odsłoniętego po ekstrakcji zęba sterylizuje się 70% alkoholem etylowym i umieszcza w pojemniku transportowym i natychmiastowo przesyła do siedziby laboratorium Banku Komórek i Tkanek wraz z niezbędną dokumentacją.

W warunkach jałowych, fragment dziąsła trzykrotnie przemywa się roztworem PBS z dodatkiem antybiotyków - 2% penicyliny-streptomycyny przez 10 minut, aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia i pozostałości erytrocytów i leukocytów. Fragment dziąsła umieszcza na szalce Petriego i rozdrabniana

PL 243367 BI na 1-3 mm fragmenty. Zawiesinę umieszcza się w kriofiolce, w roztworze DMEM zawierającym środek 10% DMSO w temperaturze 1-0°C.

Fiolkę z umieszczonym fragmentem dziąsła umieszcza się następnie w pojemniku z izopropanolem i schładza do temperatury -80°C, zapewniając tempo zamrażania ok. -1 °C/min. Następnie kriofiolki umieszcza się w naczyniu z ciekłym azotem, gdzie mogą być długotrwale przechowywane w atmosferze oparów wrzącego azotu w temperaturze -196°C. Po okresie przechowywania fragment dziąsła jest rozmrażany w medium hodowlanym, a pozyskane z niego komórki macierzyste rozmnaża się w myśl procedury podanej w przykładzie nr 1.

Różne modyfikacje i odmiany opisanych sposobów według wynalazku będą oczywiste dla specjalisty w dziedzinie, bez odchodzenia od istoty wynalazku. Mimo że wynalazek został opisany w związku z określonymi korzystnymi przykładami wykonania, to należy rozumieć, że wynalazek nie powinien być ograniczony do takich specyficznych przykładów realizacji, i że w ramach niniejszego wynalazku może być dokonanych wiele ich modyfikacji i dodatków. W istocie, przyjmuje się, że różne modyfikacje opisanych sposobów realizacji wynalazku, które są oczywiste dla specjalisty w dziedzinie biologii molekularnej lub dziedzinach pokrewnych, są objęte zakresem zastrzeżeń patentowych.

Skrót	Nazwa w ,j. angielskim	Nazwa w j. polskim	Producent
DPSC	Dental pulp stem cells	Komórki macierzyste z miazgi zęba	-
MSC	Mesenchymal stem cells	Mezenchymalne komórki macierzyste	-
CNC	Cranial neural crest	Komórki czaszkowego grzebienia nerwowego	-
HFF	Humań foreskin fibroblast	Ludzkie fibroblasty z napletka	-
DPMSC	Dental pulp mesenchymal stem cells	Mezenchymalne komórki macierzyste z miazgi zęba	-
DMEM	Dulbecco’s Modified Eagle Medium	-	SigmaAldrich
Kolagenaza typu I	-	enzym	Gibco
Dyspaza	-	enzym	GIbco
Penicylinastreptomycyna	-	Antybiotyki	Gibco
a-MEM	Minimum Essential Medium Eagle a Modification	-	SigmaAldrich
FBS	Fetal bovine serum	-	SigmaAldrich
L-glutamina			Gibco
mRNA	Messenger RNA	Informacyjny RNA	-
DPBS	Dulbecco’s phosphatebuffered salinę	Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej Dulbecco	SigmaAldrich
PBS	Phosphate-buffered salinę	Zbuforowany roztwór soli fizjologicznej	SigmaAldrich
Saccomanno Fixative Solution	-	-	Morphisto
CD	Cluster of differentiation	Antygen różnicowania komórkowego
HLA-DR	Humań leukocyte antigen - DR isotype	ludzki antygen leukocytowy - izotyp DR	-

PL 243367 BI

DMSO	Dimetyl sulfoxide	dimetylosulfotlenek	SigmaAldrich
CD44-FITC	-	-	Miltenyi Biotec
CD105-PE	-	-	Miltenyi Biotec
CD90-APC	-	-	Miltenyi Biotec
EDTA	ethylenediaminetetraacet ic acid	Kwas wersenowy	SigmaAldrich
BSA	Bovine serum albumin	Surowicza albumina wolowa	SigmaAldrich
PPCO	Polypropylene copolymer	Kompolimer polipropylenowy	-
PP	Polypropylene	polipropylen	-
MACS Microbeads	-	-	Miltenyi Biotec
PD	Population doubling time	-	-
Trypsyna	-	-	Gibco

Zastrzeżenia patentowe

Claims (7)

1. Sposób krioprzechowywania multipotencjalnych, nieembrionalnych, mezenchymalnych komórek macierzystych z dziąsła, wykorzystujący zamrażanie w medium krioprotekcyjnym, znamienny tym, że pobraną tkankę z dziąsła rozdrabnia się w roztworze medium DMEM z mieszanką enzymów kolagenaza typu I - 2 mg/ml, dyspaza - 1 mg/ml, z dodatkiem mieszaniny antybiotyków - penicylina/streptomycyna w ilości 2% i inkubuje się w jałowych warunkach przez 24 godziny w temperaturze 37°C, w atmosferze zawierającej 5% CO2, następnie namnaża się komórki w medium hodowlanym o składzie: a-MEM-baza, 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 1% chloramfenikolu i 2% penicyliny-streptomycyny, zaś medium krioprotekcyjne do przechowywania komórek składa się z medium DMEM i 10% DMSO o temperaturze 1-0°C, a zamrażanie komórek do temperatury 75-80°C odbywa się w tempie -1 °C/minutę przez 24 godziny, przy czym komórki przechowuje się długotrwale w oparach ciekłego azotu w temperaturze -196°C.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórki macierzyste z dziąseł pozyskuje się z tkanki po ekstrakcji zęba.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórki macierzyste z dziąseł pozyskuje się z fragmentów odsłoniętych dziąseł w trakcie odsłaniania śruby zamykającej implant.

4. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że fragmenty dziąseł zabezpiecza się na czas transportu do analizy i namnażania w roztworze medium o składzie: DMEM-baza, 1% chloramfenikol, 2% roztwór penicyliny i streptomycyny i 10 U/ml nystatyny o temperaturze 4-0°C w warunkach sterylnych.

5. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że hodowlę komórek dziąsła prowadzi się do osiągnięcia przez komórki 60-80% konfluencji, zmieniając medium co 48 godzin.

6. Sposób wg zastrz. 1, znamienny tym, że uzyskane po rozmrożeniu fragmenty dziąsła służą do pozyskania żywych, multipotencjalnych, nieembrionalnych komórek macierzystych.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nieembrionalne komórki macierzyste z dziąseł zębów są komórkami ssaka, korzystnie ludzkimi.