PL241536B1

PL241536B1 - Sposób wytwarzania 9α-hydroksyoksandrolonu

Info

Publication number: PL241536B1
Application number: PL434396A
Authority: PL
Inventors: Alina Świzdor; Paulina Łyczko; Anna Panek
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2022-10-17
Also published as: PL434396A1

Abstract

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania 9α-hydroksyoksandrolonu, o wzorze 2, na drodze mikrobiologicznej hydroksylacji, w której jako substrat stosuje się oksandrolon, o wzorze 1, przy użyciu systemu enzymatycznego grzyba strzępkowego Mortierella isabellina AM212.

Description

PL 241 536 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 9a-hydroksyoksandrolonu, o wzorze 2, przedstawionym na rysunku.

Sposobem, według wynalazku, można uzyskać hydroksylowy analog biologicznie aktywnego oksandrolonu. Otrzymana pochodna może znaleźć zastosowanie w wytwarzaniu nowych związków steroidowych o potencjale terapeutycznym.

Oksandrolon jest syntetycznym steroidowym A-laktonem stymulującym syntezę białek, który w porównaniu do testosteronu i wielu innych steroidów anaboliczno-androgennych charakteryzuje się dużo niższą aktywnością androgenną. Ze względu na niewielkie efekty uboczne jego stosowania oraz stosunkowo niską hepatotoksyczność, uznawany jest on za jeden z najbezpieczniejszych steroidów (Choudhary M.l, et al., Steroids, 2009, 74, 1040-1044). Związek ten znajduje zastosowanie w terapii osób, u których doszło do znacznego ubytku masy ciała, np. na skutek rozległych oparzeń, znacznych urazów fizycznych czy amputacji, w terapii AIDS, w łagodzeniu bólu kości w osteoporozie czy leczeniu alkoholowego zapalenia wątroby. (Kratena N, et al., Tetrahedron Letters, 2017, 58, 1316-1318; Hamblin, M. R., Expert Opin. Pharmacother., 2019, 20, 305-321; Grunfeld C. et al., J. Acquir. Immune. Defic, Syndr., 2006, 41,304-314; Asehnoune K. et al., Crit. Care Clin., 2019, 35, 201-211).

Wprowadzenie grupy hydroksylowej do cząsteczki steroidowej może skutkować wzmocnieniem lub zmianą aktywności biologicznej cząsteczki (Donova M.V., Egorova O.V., App. Microbiol. Biotechnol., 2012, 94, 1423-1447; El Kihel L., Steroids, 2012, 77, 10-26). Jednocześnie obecność grupy hydroksylowej zwiększa polarność związku a także umożliwia przeprowadzanie kolejnych przemian strukturalnych cząsteczki. Ułatwia to tym samym rozwój badań w kierunku poszukiwania substancji o potencjalnym działaniu leczniczym. Przykładowo, pochodne steroidów zawierające grupę hydroksylową w pozycji 9α- są prekursorami wykorzystywanymi w syntezie 9a-halogenokortykoidów m.in. deksametazonu leku o wielokrotnie wyższej aktywności przeciwzapalnej, przeciwalergicznej i immunosupresyjnej w porównaniu do hydrokortyzonu. (Zhang X. et al., Molecules, 2019, 24, 1-13).

Chemiczna synteza leków steroidowych wymaga zwykle przeprowadzania licznych operacji technologicznych, związanych m.in. z koniecznością osłaniania niektórych grup funkcyjnych przed niespecyficznymi co do miejsca i konformacji reakcjami chemicznymi. W przeciwieństwie do metod chemicznych, transformacje mikrobiologiczne pozwalają modyfikować strukturę cząsteczek jednoetapowo, umożliwiając wysoką regio- oraz stereoselektywność reakcji przy zachowaniu łagodnych warunków procesu.

Znany jest sposób otrzymywania 9a-hydroksyoksandrolonu w wyniku mikrobiologicznej transformacji oksandrolonu przez szczep Rhizopus stolonifer NRLL 1392 (Choudhary M.l. et al., Steroids, 2009, 74, 1040-1044). Wydajność, z jaką uzyskano produkt w tej reakcji wynosi 8%, a czas prowadzenia procesu - 10 dni. Nie jest znany sposób otrzymywania 9a-hydroksyoksandrolonu metodą chemiczną.

Liczne grzyby strzępkowe z rodzaju Mortierella są wykorzystywane w przemyśle jako źródło wielonienasyconych kwasów tłuszczowych. Mortierella isabellina jest gatunkiem stosowanym do wydajnej produkcji kwasów γ-linolenowego i arachidonowego (Siramon P. et al., J. Pure Appl. Microbiol., 2016, 10, 865-870). Znana jest zdolność szczepu Mortierella isabellina AM212 do hydroksylacji szeregu związków izoprenoidowych - androstanów (Kołek T., et al., Org. Biomol. Chem., 2011,9, 5414-5422), cyklicznych laktonów terpenoidowych (Mazur M. et al., PLoS ONE, 2017, 12, 1-12) oraz norizoprenoidów - damaskonów (Gliszczyńska A. et al., Catal. Commun., 2016, 80, 39-43). Z opisu zgłoszenia P.392488 znane są właściwości katalityczne M. isabellina AM212 polegające na wprowadzeniu grupy hydroksylowej w położenie C-7 do cząsteczki dehydroepiandrosteronu. Z kolei w opisie P 392489, ujawniono sposób stereoselektywnej 7a-hydroksylacji epiandrosteronu.

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla wzrostu grzybów strzępkowych wprowadza się zawiesinę komórek Mortierella isabellina AM212 i inkubuje się ją przez kilka dni przy stałym wstrząsaniu w temperaturze 24-27°C. Po upływie co najmniej 48 godzin dodaje się substrat: oksandrolon, o wzorze 1, jako zawiesinę w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się przy ciągłym wstrząsaniu co najmniej przez 4 dni w warunkach typowych dla hodowli mikroorganizmu. Uzyskany roztwór transformacyjny ekstrahuje się trzykrotnie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą, osusza i odparowuje rozpuszczalnik, w wyniku czego otrzymuje się surowy produkt, który następnie oczyszcza się chromatograficznie.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,3 g : 1 L.

Korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 6 dni.

Claims

PL 241 536 B1

Korzystne jest, gdy jako ekstrahent stosuje się chloroform.

Korzystne jest także, gdy jako eluent stosuje się mieszaninę heksan:aceton, w proporcji objętościowej składników 2:1.

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 9a-hydroksyoksandrolonu z wydajnością 73%, w temperaturze pokojowej i pH bliskim obojętnemu.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Do kolby Erlenmeyera o pojemności 300 ml, w której znajduje się 100 ml sterylnej pożywki zawierającej 3 g glukozy i 1 g aminobaku, wprowadza się 2 cm³ zawiesiny komórek Mortierella isabellina AM212. Hodowlę prowadzi się przez kolejne dwa dni przy stałym wstrząsaniu w temperaturze 24-27°C, Następnie do hodowli mikroorganizmu dodaje się 30 mg oksandrolonu, o wzorze 1, w postaci zawiesiny w 0,6 cm³ acetonu. Transformację prowadzi się przy ciągłym wstrząsaniu przez sześć dni w warunkach, w których prowadzona była hodowla mikroorganizmu. Następnie uzyskany roztwór transformacyjny ekstrahuje się trzykrotnie chloroformem, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Wydajność otrzymania produktu według danych chromatograficznych (GC) wynosi 80%. Po oczyszczeniu surowego produktu - za pomocą chromatografii kolumnowej, stosując jako eluent mieszaninę heksan:aceton w proporcji objętościowej składników 2:1, otrzymuje się 22 mg 9a-hydroksyoksandrolonu (wydajność izolowana 73% mol.), o wzorze 2.

Uzyskany 9a-hydroksyoksandrolon charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi:

¹H NMR (CDCl3) δ (ppm): 0,89 (s, 3H, 18-H); 1,09 (s, 3H,‘19-H); 1,25 (s, 3H, 20-H); 2,18 (dd, J =12,8 Hz; J =18,6 Hz, 1H, 4-Hax); 2,42-2,48 (m, 1H, 5-H); 2,56 (dd, J =6,2 Hz; J =18,6 Hz, 1H, 4-Heq); 4,14 (d, J =10,6 Hz, 1H, 1-Heq); 4,53 (d, J =10,6 Hz, 1H, 1-Hax).

¹³C NMR (CDCle) δ (ppm): 11,9 (C-19); 13,0 (C-18); 23,0 (C-11); 24,2 (C-15); 26,0 (C-20); 27,0 (C-12); 27,0 (C-6); 27,3 (C-7); 32,4 (C-5); 34,0 (C-4); 38,3 (C-8); 38,7 (C-16); 39,1 (C-10); 43,4 (C-14); 45,4 (C-13); 74,2 (C-9);76,6 (C-1); 81,5 (C-17); 170,4 (C-3).

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania 9a-hydroksyoksandrolonu na drodze transformacji mikrobiologicznej, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się zawiesinę komórek Mortierella isabellina AM212, następnie po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli dodaje się oksandrolon o wzorze 1, jako zawiesinę w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 24°C do 27°C przy ciągłym wstrząsaniu co najmniej 4 dni, po czym produkt ekstrahuje się trzykrotnie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą, ekstrakt osusza i odparowuje rozpuszczalnik, otrzymuje się surowy produkt, który oczyszcza się chromatograficznie.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,3 g:1 L.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 6 dni.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako ekstrahent stosuje się chloroform.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako eluent stosuje się mieszaninę heksan:ace- ton, w proporcji objętościowej składników 2:1.