PL238973B1

PL238973B1 - Sposób wytwarzania 12β-hydroksyoksandrolonu

Info

Publication number: PL238973B1
Application number: PL431196A
Authority: PL
Inventors: Alina Świzdor; Paulina Łyczko; Anna Panek
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2019-09-18
Filing date: 2019-09-18
Publication date: 2021-10-25
Also published as: PL431196A1

Abstract

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania 12ß-hydroksyoksandrolonu, o wzorze 2, na drodze mikrobiologicznej hydroksylacji, w której jako substrat stosuje się oksandrolon, o wzorze 1, przy użyciu systemu enzymatycznego grzyba strzępkowego Fusarium culmorum AM282.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 12e-hydroksyoksandrolonu, o wzorze 2, przedstawionym na rysunku.

Sposobem, według wynalazku, można otrzymać utlenioną pochodną biologicznie aktywnego oksandrolonu, która może znaleźć zastosowanie w wytwarzaniu nowych steroidowych terapeutyków wspomagających leczenie chorób nerwowo-mięśniowych i zaburzeń metabolicznych m.in. przejawiających się niedoborem masy ciała.

Oksandrolon jest syntetyczną pochodną dihydrotestosteronu o znacznie niższej od niego aktywności androgennej. Nie wpływa w znaczący sposób na produkcję testosteronu, a także nie ulega aromatyzacji, przez co jest uważany za bezpieczny steroid (Choudhary M.l et al., Steroids, 2009, 74, 10401044). Związek ten wykorzystuje się w leczeniu genetycznych zaburzeń wzrostu, a także u osób po znacznych urazach fizycznych i operacjach oraz w leczeniu pacjentów z AIDS, u których nastąpił duży ubytek masy ciała (Sheanon N. M., Backeljauw P. F., Int. J. Pediatr. Endocrinol. 2015, 18, 1-8; Hamblin, M. R., Expert Opin. Pharmacother. 2019, 20, 305-321; Grunfeld C. et al., J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 2006, 41, 304-314). Stosowany jest również w terapii oparzeń, osteoporozy i choroby Kennedy’ego (Asehnoune K. et al., Crit. Care Clin. 2018, 35, 201-211; Patent WO 2019/084365 A1 2019; Real D. et al., Acta Cir. Bras. 2014, 29, 68-76).

Wprowadzenie grupy hydroksylowej do cząsteczki steroidowej może zwiększać lub zmieniać jej aktywność biologiczną. (Sedlaczek L, Smith L. L, Crit. Rev. Biotechnol. 1988, 7, 187-236; Donova M.V., Egorova O. V., App Microbiol Biotechnol, 2012, 94, 1423-1447; El Kihel L., Steroids 2012, 77, 10-26). Obecność grupy hydroksylowej wpływa na polarność związku, a także stwarza możliwość różnorodnych modyfikacji strukturalnych w kierunku poszukiwania nowych substancji o działaniu leczniczym.

Wykorzystanie transformacji mikrobiologicznej, w przeciwieństwie do syntezy chemicznej, pozwala na jednoetapową, regio- i stereoselektywą hydroksylację związku organicznego w łagodnych warunków reakcji.

Znany jest sposób otrzymywania 12e-hydroksyoksandrolonu w wyniku mikrobiologicznej transformacji oksandrolonu przez szczep Cunninghamella blakesleeana ATcC 8688A (Smith C. et al., Steroids, 2015, 102, 39-45). Wydajność, z jaką uzyskano produkt w tej reakcji jest niska i wynosi 0,8%, a czas prowadzenia procesu 19 dni. Nie jest znany sposób otrzymywania 12e-hydroksyoksandrolonu metodą syntezy chemicznej.

Szczep Fusarium culmorum AM 282 był wcześniej ujawniony w literaturze. Znane są jego hydroksylujące właściwości wobec szeregu androstanów i pregnanów. (Kołek, T, Świzdor A., J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1998, 67, 63-69; Kołek, T, J. Steroid Biochem. Mol. Biol., 1999, 71,83-90; Świzdor A., Kołek, T, Steroids, 2005, 70, 817-824; Świzdor A., Kołek T., Szpineter A., Z Naturforsch C, 2006, 61c, 809-814). Opis patentowy PL178585 ujawnia zdolności katalityczne, które polegają na wprowadzeniu grupy hydroksylowej w położenie 15α- do cząsteczki 3-okso-4-en steroidowej, cząsteczki B-nor 3e-hydroksy-5-en steroidowej ujawnia opis PL195306, 3e-hydroksy-5a-dihydro steroidowej opis PL215785, zaś grupy hydroksylowej 7α- do układu 3e-hydroksy-5-en steroidowego - PL185481 oraz grupy hydroksylowej 1 α- do 7-keto-5-en steroidu - opis patentowy PL191541.

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla wzrostu grzybów strzępkowych wprowadza się zawiesinę komórek Fusarium culmorum AM 282 i hodowlę prowadzi się przez kilka dni przy stałym wstrząsaniu w temperaturze 24-27°C. Po upływie co najmniej 48 godzin dodaje się substrat, którym jest oksandrolon, który jest rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym. Transformację prowadzi się przy ciągłym wstrząsaniu co najmniej przez 5 dni w warunkach typowych dla hodowli mikroorganizmu. Uzyskany roztwór transformacyjny ekstrahuje się trzykrotnie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą, osusza i odparowuje rozpuszczalnik, w wyniku czego otrzymuje się surowy produkt, który oczyszcza się chromatograficznie.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,25 g : 1 L.

Korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 6 dni.

Korzystne jest, gdy jako ekstrahent stosuje się chloroform.

Korzystne jest także, gdy jako eluent stosuje się mieszaninę chloroform : metanol, w proporcji objętościowej składników 70 : 6.

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 12e-hydroksyoksandrolonu z wydajnością 68%, w temperaturze pokojowej i pH bliskim obojętnemu.

PL 238 973 B1

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

Do kolby Erlenmeyera o pojemności 300 ml, w której znajduje się 100 ml sterylnej pożywki zawierającej 3 g glukozy i 1 g aminobaku, wprowadza się 2 cm³ zawiesiny komórek szczepu Fusarium culmorum AM 282. Hodowlę prowadzi się przez kolejne trzy dni przy stałym wstrząsaniu w temperaturze 24-27°C. Następnie do hodowli mikroorganizmu dodaje się 25 mg oksandrolonu, o wzorze 1, rozpuszczonego w 0,6 cm³ acetonu. Transformację prowadzi się przy ciągłym wstrząsaniu przez sześć dni w warunkach, w których prowadzona była hodowla mikroorganizmu. Następnie uzyskany roztwór transformacyjny ekstrahuje się trzykrotnie chloroformem, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Wydajność otrzymania produktu według danych chromatograficznych (GC) wynosi 73%. Po oczyszczeniu surowego produktu oczyszcza się go chromatograficznie używając jako eluentu mieszaninę chloroform : metanol, w proporcji objętościowej składników 70 : 6. Na tej drodze otrzymuje się 18 mg 12e-hydroksyoksandrolonu (wydajność izolowana 68% mol.), o wzorze 2.

Uzyskany produkt 12e-hydroksyoksandrolon charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi:

¹H NMR (CDCl3) δ (ppm): 0,93 (s, 3H, 18-H); 1,02 (s, 3H, 19-H); 1,35 (s, 3H, 20-H); 2,23 (dd, J =13,1 Hz; J =18,8 Hz, 1H, 4-He); 2,53 (dd, J = 5,8 Hz; J =18,8 Hz, 1H, 4-Ha); 3,76-3,73 (m, 1H, 12-Ha); 3,92 (d, J =10,7 Hz, 1H, 1-He); 4,21 (d, J =10,7 Hz, 1H, 1-Ha).

¹³C NMR (CDCle) δ (ppm): 8,4 (C-18); 10,1 (C-19); 23,0 (C-15); 25,6 (C-10); 27,0 (C-6); 30,2 (C-7); 31,9 (C-11); 33,8 (C-4); 34,6 (C-10); 34,7 (C-8); 38,1 (C-16); 40,3 (C-5); 48,2 (C-9); 48,9 (C-14); 49,4 (C-13); 80,7 (C-1); 73,1 (C-12); 82,0 (C-17); 170,3 (C-3).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania 12e-hydroksyoksandrolonu na drodze transformacji mikrobiologicznej, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się zawiesinę komórek Fusarium culmorum AM 282, następnie po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli dodaje się oksandrolon o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, przy czym transformację prowadzi się w temperaturze od 20°C do 27°C przy ciągłym wstrząsaniu co najmniej 5 dni, następnie produkt ekstrahuje się trzykrotnie rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą, ekstrakt osusza i odparowuje rozpuszczalnik, otrzymując surowy produkt, który oczyszcza się chromatograficznie.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,25 g : 1 L.

3. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 6 dni.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako ekstrahent stosuje się chloroform.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako eluent stosuje się mieszaninę chloroform : metanol, w proporcji objętościowej składników 70 : 6.