PL241130B1

PL241130B1 - Szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii Escherichia coli oraz ich zastosowanie do wytwarzania preparatów przeciwbakteryjnych

Info

Publication number: PL241130B1
Application number: PL430175A
Authority: PL
Inventors: Marta Kuźmińska-Bajor; Maciej Kuczkowski
Original assignee: Wrocław University Of Environmental And Life Sciences
Priority date: 2019-06-07
Filing date: 2019-06-07
Publication date: 2022-08-08
Also published as: PL430175A1

Abstract

Wynalazek dotyczy nowego szczepu bakteriofaga specyficznego wobec bakterii należących do gatunku Escherichia coli, wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00119, F/00120, F/00121, F/00122. Wynalazek dotyczy także zastosowanie szczepu bakteriofaga, wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod wskazanymi numerami, do wytwarzania preparatów przeciwbakteryjnych, służących do zwalczania bakterii Escherichia coli.

Description

PL 241 130 B1

Opis wynalazku

Bakterie Escherichia coli należą do Gram-ujemnych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae i stanowią powszechny czynnik etiologiczny zachorowań ludzi i zwierząt na całym świecie. Pałeczki E. coli charakteryzują się dużym zróżnicowaniem genetycznym i właściwościami, w tym zdolnością do zajmowania różnych środowisk. Gatunek E. coli obejmuje zarówno szczepy komensalne stanowiące prawidłową mikroflorę jelitową zarówno ludzi, jak i zwierząt stałocieplnych oraz szczepy patogenne [1]. Do czynników będącym jednym z największych zagrożeń chorobotwórczych u ludzi zdrowia u ludzi zalicza się enterokrwotoczne szczepy E. coli (ang. enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC), wywołujące biegunki krwotoczne, z dużym ryzykiem wystąpienia komplikacji w postaci zespołu hemolitycznomocznicowego (ang. haemolytic-uraemic syndrome, HUS), który prowadzi do uszkodzenia nerek [2]. Bakterie te zaliczane są do bezwzględnych patogenów jelitowych. W przeciwieństwie do nich, patogeny pozajelitowe ExPEC (ang. extraintestinal pathogenic E. coli) są fakultatywnymi patogenami, które wchodzą w skład prawidłowej flory jelitowej pewnej części zdrowej populacji organizmów gospodarzy jako mikroflora komensalna [3]. ExPEC związane są z wieloma chorobami zakaźnymi ludzi i zwierząt, powodując infekcje o różnym przebiegu, zarówno uogólnionym lub narządowym. Pozajelitowe patogenne szczepy E. coli są heterogenną grupą bakterii patogennych i obejmują zarówno szczepy uropatogenne E. coli (ang. uropathogenic E. coli, UPEC), które są czynnikiem etiologicznym infekcji układu moczowego u ludzi; E. coli wywołujące zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u niemowląt (ang. neonatal menigitidis E. coli, NMEC); E. coli powodujące sepsę oraz E. coli wywołujące u ptactwa chorobę o uogólnionym przebiegu - kolibakteriozę (ang. avian pathogenic E. coli, APEC).

Ptasie patogenne szczepy E. coli APEC stanowią poważny problem w przemyśle drobiarskim, a infekcje powodowane przez nie są przyczyną znacznych strat ekonomicznych [4; 5; 6]. Infekcje wywołane przez APEC mogą pojawić się u kurcząt i indyków rzeźnych oraz u kur niosek. We wszystkich przypadkach, niezależnie od wieku ptactwa, infekcje powodowane przez APEC dają wyraźne objawy chorobowe. W przypadku brojlerów zakażenie tymi bakteriami prowadzi do kolibakteriozy, a do symptomów zalicza się infekcje dróg oddechowych, stanem zapalnym objęte są worki powietrzne i osierdzie, a do innych objawów zaliczyć można utratę apetytu, osowienie, biegunki, zahamowanie wzrostu, niedokrwistość i utrudnione poruszanie się, zapalenie wątroby, powiększenie śledziony oraz syndrom obrzęku głowy u kur. W przypadku zakażenia kur niosek zmiany zapalne dotyczą układu rozrodczego [7]. Ptasie patogenne szczepy E. coli wymieniane są jako jeden z najpoważniejszych czynników infekcyjnych w intensywnej produkcji drobiarskiej, a zwiększająca się częstotliwość tego typu infekcji odzwierciedla spadek stosowania czynników antybakteryjnych, głównie antybiotyków, w hodowli drobiu. Co więcej, bliskie pokrewieństwo pomiędzy APEC a pozostałymi przedstawicielami pozajelitowych patogennych E. coli związanymi z zachorowaniami u ludzi wpływa na zdolność do transmisji czynników wirulencji pomiędzy tymi szczepami. Prowadzi to do obaw, że stanowią one ryzyko chorób zoonotycznych [7]. Dodatkowo ptasie patogenne szczepy E. coli izolowane od drobiu często charakteryzują się opornością na antybiotyki i w związku z tym infekcje powodowane przez nie są trudne do leczenia, co z jednej strony pogłębia straty hodowców [8], z drugiej natomiast jedną z głównych przyczyn pojawienia się opornych szczepów. Dodatkowo, od kurcząt rzeźnych, niosek towarowych oraz indyków rzeźnych izolowano szczepy E. coli oporne na kolistynę, lek „ostatniej szansy” stosowany w medycynie ludzkiej w przypadku trudno leczących się infekcji. W analizie oporności szczepów E. coli izolowanych od drobiu, najwyższy odsetek opornych szczepów był izolowany od kurcząt rzeźnych i oporność na takie antybiotyki jak ciprofloksacyna, kwas nalidyksowy, ampicylina, sulfametoksazol i tetracyklina wykazana została dla ponad połowy z izolowanych szczepów [9].

Narastająca lekooporność stwarza problem w doborze efektywnej terapii antybakteryjnej zarówno u zwierząt, jak i u ludzi. Dodatkowo, szczepy oporne mogą być transmitowane poprzez żywność pochodzenia zwierzęcego na ludzi. Warto podkreślić, że w produkcji drobiarskiej oraz medycynie ludzkiej wykorzystywane są te same grupy chemioterapeutyków (fluorochinolony, tetracykliny, aminoglikozydy), co dodatkowo stwarza zagrożenie dla zdrowia publicznego. Niepowodzenia antybiotykoterapii i chemioterapii jako następstwo pojawienia się szczepów bakteryjnych o wysokiej oporności, a nawet szczepów niewrażliwych na stosowane dotąd leki zmusza do poszukiwań innych metod zapobiegania i leczenia infekcji bakteryjnych. Wśród alternatywnych wobec antybiotyków i chemioterapeutyków sposobów zwalczania tego typu infekcji, w tym zakażeń szczepami wieloopornymi, w medycynie ludzkiej i weterynarii, coraz częściej wymienia się terapię z użyciem bakteriofagów [10, 11].

PL 241 130 B1

Bakteriofagi (fagi) są wirusami specyficznymi w stosunku do bakterii i używane są do ich zwalczania od momentu odkrycia na początku XX wieku. Niedługo po odkryciu tych bytów biologicznych bakteriofagi stały się kluczowym środkiem w walce z patogenami. Wynalezienie penicyliny i gwałtowny rozwój antybiotykoterapii sprawiły, że leczenie bakteriofagami zostało prawie całkowicie zastąpione leczeniem z użyciem antybiotyków, szczególnie w zachodniej Europie i Stanach Zjednoczonych. Wobec narastającego problemu lekooporności bakterii i kryzysu antybiotykoterapii, poszukiwanie skutecznych środków przeciwbakteryjnych stało się jednym z głównych obszarów badań współczesnej biotechnologii i medycyny, a jako jedną z najbardziej atrakcyjnych alternatyw do leczenia antybiotykami wskazywana jest terapia bakteriofagami. Bakteriofagi infekują komórkę bakteryjną, namnażają się w niej a następnie powodują jej rozpad i uwalnianie wirusów potomnych. Co ciekawe, charakteryzują się zdolnością do namnażania tylko w miejscu infekcji, gdzie zlokalizowane są bakterie wrażliwe na konkretnego wirusa. W momencie gdy wszystkie komórki bakteryjne zostaną zainfekowane, cała populacja zostaje wyeliminowana, a wraz z nią wirus, który traci swego gospodarza. Innymi cechami przyczyniającymi się do faktu, że bakteriofagi są doskonałym środkiem do walki z zakażeniami bakteryjnymi jest niska toksyczność, brak interakcji z komórkami ludzkimi i zwierzęcymi, brak powiązania z opornością na antybiotyki oraz istnienie różnych form aplikacji jako terapeutyków [12]. Bakteriofagi charakteryzują się wysoką specyficznością w stosunku do gospodarza, co w praktyce oznacza, że są zdolne zakażać pojedynczy gatunek bakterii lub nawet serotyp występujący w ramach gatunku [13] i są obojętne dla pozostałej mikroflory.

Dostępne dane literaturowe na temat bakteriofagów specyficznych względem pałeczek Escherichia coli wskazują na efektywne działanie bakteriofagów w terapii i prewencji zakażeń tymi bakteriami APEC u drobiu [8, 14, 15, 16, 17, 18]. Celem wynalazku było uzyskanie preparatów fagowych, które mogłyby być skutecznie wykorzystane do zapobiegania zakażeniom bakteryjnym jak i w leczeniu infekcji powodowanych pałeczkami Escherichia coli.

Celem wynalazku było uzyskanie preparatów fagowych, które mogłyby być skutecznie w ykorzystane do zapobiegania zakażeniom bakteryjnym jak i w leczeniu infekcji powodowanych przez pałeczki Escherichia coli.

Wynalazek dotyczy nowego szczepu bakteriofagowego specyficznego wobec bakterii należących do gatunku Escherichia coli, wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00119, F/00120, F/00121, F/00122.

Istotą wynalazku jest również szczep bakteriofaga, wybrany ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00119, F/00120, F/00121, F/00122, do zastosowania jako preparat przeciwbakteryjny, służący do zwalczania bakterii Escherichia coli, korzystnie klasyfikowanych jako patogenne dla drobiu Escherichia coli (APEC).

Korzystnie jest, gdy do wytwarzania preparatów przeciwbakteryjnych wykorzystuje się całe wiriony bakteriofaga wirulentnego w preparatach zawierających jednego faga, jak i w postaci mieszaniny, w skład której może wchodzić kilka lub kilkanaście aktywnych bakteriofagów.

Dodatkowo wynalazek dotyczy wykorzystania oczyszczonych fagowych białek, strukturalnych, jak i enzymatycznych, zwłaszcza enzymów litycznych w postaci lizozymu albo endolizyny, albo egzopolisacharydazy.

Korzystnie jest, gdy preparatami przeciwbakteryjnymi, są preparaty służące do leczenia zakażeń wywołanych przez pałeczki Escherichia coli.

Korzystnie także jest, gdy preparatami przeciwbakteryjnymi, są preparaty służące do zapobiegania zakażeniom wywołanym przez pałeczki Escherichia coli.

Korzystnie również jest, gdy preparatami przeciwbakteryjnymi, są preparaty służące do eliminowania pałeczek Escherichia coli z powierzchni biotycznych albo abiotycznych.

Istota wynalazku została zilustrowana poniższymi przykładami wykonania:

P r z y k ł a d 1: Fag Escherichia coli UPWr/E1

Bakteriofag wirulentny był izolowany ze ścieków z rowu melioracyjnego z okolic Taczanowa w województwie Wielkopolskim. Bakteriofaga izolowano bezpośrednio z płynnej próby środowiskowej, którą poddano filtracji przy użyciu filtra o średnicy porów 0,22 μm, a następnie analizowano w teście kroplowym (ang. spot on). W tym celu 18-sto godzinna hodowla bakteryjna szczepu Escherichia coli (E. coli) 158B prowadzona w 5 ml podłoża LB rozprowadzona została po powierzchni szalki Petriego z zestalonym podłożem LB i pozostawiona do wysuszenia powierzchni. Równocześnie przygotowano szereg rozcieńczeń dziesiętnych filtratu próby środowiskowej, które nakropiono na powierzchnię płytki Petriego z hodowlą E. coli 158B i inkubowano kolejne 18 godzin w temperaturze 37°C. Po uzyskaniu

PL 241 130 B1 pozytywnego wyniku, jakim jest całkowita liza bakterii w miejscu nakropienia filtratu i jego rozcieńczeń lub obecność pojedynczych łysinek bakteriofagowych na murawie bakteryjnej, wyprowadzono czysty szczep bakteriofagowy z pojedynczej łysinki, którą pobierano za pomocą sterylnej igły. Igłę umieszczano w 1 ml pożywki LB i inkubowano przez 10 minut z łagodnym wytrząsaniem. Następnie próbkę dodawano do 5 ml 5-cio godzinnej hodowli E. coli 158B i inkubowano 18 godzin w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 180 rpm, wirowano i filtrowano przy użyciu filtra o średnicy 0,22 μm. Tak uzyskany filtrat wykorzystany został do kolejnej izolacji faga z pojedynczej łysinki. Reizolację powtórzono 4 krotnie.

W celu charakterystyki faga określono jego spektrum lityczne wobec wybranych izolatów pałeczek Escherichia coli, pochodzących z kolekcji szczepów Katedry Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Wrażliwość bakterii na faga, analizowano w teście kroplowym. Na 111 przebadanych szczepów Escherichia coli, dodatnie reakcje lityczne obserwowano dla 48 szczepów, które klasyfikowanych jako APEC.

Szczep bakteriofaga UPWr/E1 został zdeponowany 31-05-2019 roku w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów posiadającej status międzynarodowego ośrodka depozytowego do celów patentowych. Depozytowi nadano numer F/00119.

P r z y k ł a d 2: Fag Escherichia coli UPWr/E2

Bakteriofag wirulentny izolowany ze ścieków z Wrocławskiej Oczyszczalni ścieków Janówek. Bakteriofaga izolowano bezpośrednio z płynnej próby środowiskowej, którą poddano filtracji przy użyciu filtra o średnicy porów 0,22 μm, a następnie analizowano w teście kroplowym (ang. spot on). W tym celu 18-sto godzinna hodowla bakteryjna szczepu Escherichia coli (E. coli) 158B prowadzona w 5 ml podłoża LB rozprowadzona została po powierzchni szalki Petriego z zestalonym podłożem LB i pozostawiona do wysuszenia powierzchni. Równocześnie przygotowano szereg rozcieńczeń dziesiętnych filtratu próby środowiskowej, które nakropiono na powierzchnię płytki Petriego z hodowlą E. coli 158B i inkubowano kolejne 18 godzin w temperaturze 37°C. Po uzyskaniu pozytywnego wyniku, jakim jest całkowita liza bakterii w miejscu nakropienia filtratu i jego rozcieńczeń lub obecność pojedynczych łysinek bakteriofagowych na murawie bakteryjnej, wyprowadzono czysty szczep bakteriofagowy z pojedynczej łysinki, którą pobierano za pomocą sterylnej igły. Igłę umieszczano w 1 ml pożywki LB i inkubowano przez 10 minut z łagodnym wytrząsaniem. Następnie próbkę dodawano do 5 ml 5-cio godzinnej hodowli E. coli 158B i inkubowano 18 godzin w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 180 rpm, wirowano i filtrowano przy użyciu filtra o średnicy 0,22 μm. Tak uzyskany filtrat wykorzystany został do kolejnej izolacji faga z pojedynczej łysinki. Reizolację powtórzono 4 krotnie.

W celu charakterystyki faga określono jego spektrum lityczne wobec wybranych izolatów pałeczek Escherichia coli, pochodzących z kolekcji szczepów Katedry Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Wrażliwość bakterii na faga, analizowano w teście kroplowym. Na 111 przebadanych szczepów Escherichia coli, dodatnie reakcje lityczne obserwowano dla 31 szczepów, które klasyfikowanych jako APEC.

Szczep bakteriofaga UPWr/E2 został zdeponowany 31-05-2019 roku w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów posiadającej status międzynarodowego ośrodka depozytowego do celów patentowych. Depozytowi nadano numer F/00120.

P r z y k ł a d 3: Fag Escherichia coli UPWr/E3

Bakteriofag wirulentny izolowany ze ścieków z Wrocławskiej Oczyszczalni ścieków Janówek. Bakteriofaga izolowano bezpośrednio z płynnej próby środowiskowej, którą poddano filtracji przy użyciu filtra o średnicy porów 0,22 μm, a następnie analizowano w teście kroplowym (ang. spot on). W tym celu 18-sto godzinna hodowla bakteryjna szczepu Escherichia coli (E. coli) 258 prowadzona w 5 ml podłoża LB rozprowadzona została po powierzchni szalki Petriego z zestalonym podłożem LB i pozostawiona do wysuszenia powierzchni. Równocześnie przygotowano szereg rozcieńczeń dziesiętnych filtratu próby środowiskowej, które nakropiono na powierzchnię płytki Petriego z hodowlą E. coli 258 i inkubowano kolejne 18 godzin w temperaturze 37°C. Po uzyskaniu pozytywnego wyniku, jakim jest całkowita liza bakterii w miejscu nakropienia filtratu i jego rozcieńczeń lub obecność pojedynczych łysinek bakteriofagowych na murawie bakteryjnej, wyprowadzono czysty szczep bakteriofagowy z pojedynczej łysinki, którą pobierano za pomocą sterylnej igły. Igłę umieszczano w 1 ml pożywki LB i inkubowano przez 10 minut z łagodnym wytrząsaniem. Następnie próbkę dodawano do 5 ml 5-cio godzinnej hodowli E. coli 258 i inkubowano 18 godzin w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 180 rpm, wirowano i filtrowano przy użyciu filtra o średnicy 0,22 μm. Tak uzyskany filtrat wykorzystany został do kolejnej izolacji faga z pojedynczej łysinki. Reizolację powtórzono 4 krotnie.

PL 241 130 B1

W celu charakterystyki faga określono jego spektrum lityczne wobec wybranych izolatów pałeczek Escherichia coli, pochodzących z kolekcji szczepów Katedry Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Wrażliwość bakterii na faga, analizowano w teście kroplowym. Na 111 przebadanych szczepów Escherichia coli, dodatnie reakcje lityczne obserwowano dla 17 szczepów, klasyfikowanych jako APEC.

Szczep bakteriofaga UPWr/E3 został zdeponowany 31-05-2019 roku w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów posiadającej status międzynarodowego ośrodka depozytowego do celów patentowych. Depozytowi nadano numer F/00121.

P r z y k ł a d 4: Fag Escherichia coli UPWr/E4

Bakteriofag wirulentny izolowany ze ścieków z rowu melioracyjnego z okolic Taczanowa w województwie Wielkopolskim. Bakteriofaga izolowano bezpośrednio z płynnej próby środowiskowej, którą poddano filtracji przy użyciu filtra o średnicy porów 0,22 μm, a następnie analizowano w teście kroplowym (ang. spot on). W tym celu 18-sto godzinna hodowla bakteryjna szczepu Escherichia coli (E. coli) 158B prowadzona w 5 ml podłoża LB rozprowadzona została po powierzchni szalki Petriego z zestalonym podłożem LB i pozostawiona do wysuszenia powierzchni. Równocześnie przygotowano szereg rozcieńczeń dziesiętnych filtratu próby środowiskowej, które nakropiono na powierzchnię płytki Petriego z hodowlą E. coli 158B i inkubowano kolejne 18 godzin w temperaturze 37°C. Po uzyskaniu pozytywnego wyniku, jakim jest całkowita liza bakterii w miejscu nakropienia filtratu i jego rozcieńczeń lub obecność pojedynczych łysinek bakteriofagowych na murawie bakteryjnej, wyprowadzono czysty szczep bakteriofagowy z pojedynczej łysinki, którą pobierano za pomocą sterylnej igły. Igłę umieszczano w 1 ml pożywki LB i inkubowano przez 10 minut z łagodnym wytrząsaniem. Następnie próbkę dodawano do 5 ml 5-cio godzinnej hodowli E. coli 158B i inkubowano 18 godzin w temperaturze 37°C z wytrząsaniem 180 rpm, wirowano i filtrowano przy użyciu filtra o średnicy 0,22 μm. Tak uzyskany filtrat wykorzystany został do kolejnej izolacji faga z pojedynczej łysinki. Reizolację powtórzono 4 krotnie.

W celu charakterystyki faga określono jego spektrum lityczne wobec wybranych izolatów pałeczek Escherichia coli, pochodzących z kolekcji szczepów Katedry Epizootiologii z Kliniką Ptaków i Zwierząt Egzotycznych Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu. Wrażliwość bakterii na faga, analizowano w teście kroplowym. Na 111 przebadanych szczepów Escherichia coli, dodatnie reakcje lityczne obserwowano dla 26 szczepów, klasyfikowanych jako APEC.

Szczep bakteriofaga UPWr/E4 został zdeponowany 31-05-2019 roku w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów posiadającej status międzynarodowego ośrodka depozytowego do celów patentowych. Depozytowi nadano numer F/00122.

Literatura

1. Conway T, Cohen PS. 2015. Commensal and Pathogenic Escherichia coli Metabolism in the Gut. Microbiol. Spectr., 3.

2. Nguyen Y, Sperandio V. 2012. Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) pathogenesis. Front

Cell Infect Microbiol. 2: 90.

3. Baldy-Chudzik K, Bok E, Mazurek J. 2015. Znane i nowe warianty patogennych Esche- richia coli jako konsekwencja plastycznego genomu. Postępy Hig Med Dosw. 69: 345-361.

4. Barnes HJ, Nolan LK, Vaillancourt JP. 2008. Colibacillosis, p 691-732 In Saif YM, Fadly

AM, Glisson JR, McDougald LR, Nolan LK, Swayne DE, editors., Diseases of poultry, 12th ed. Blackwell Publishing, Ames, IA.

5. Baudry B, Savarino SJ, Vial P, Kaper JB, Levine MM. 1990. A sensitive and specific

DNA probe to identify enteroaggregative E. coli, a recently discovered diarrheal pathogen. J. Infect. Dis., 161(6), 1249-1251.

6. Nakazato G, de Campos TA, Stehling EG, Brocchi M, da Silveir WD. 2009. Virulence factors of avian pathogenic Escherichia coli (APEC). Pesquisa Veterinaria Brasileira, 29, 479-486.

7. Collingwood C, Kemmett K, Williams N, Wigley P. 2014. Is the concept of avian patho- genic Escherichia coli as a single pathotype fundamentally flawed? Front. Vet. Sci. 1: 5.

8. Oliveira A, Sereno R, Nicolau A, Azeredo J. 2009. The Influence of the mode of admini- stration in the dissemination of three coliphages in chickens. Poult. Sci. 88, 728-733.

Claims

PL 241 130 B1

9. EFSA: 2018. Scientific report: The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2016.

10. Thiel K. 2004. Old dogma, new tricks--21 st Century phage therapy. Nat Biotechnol. Jan; 22(1): 31-6.

11. Dixon B. 2004. New dawn for phage therapy. Lancet Infect Dis. Mar; 4(3): 186.

12. Loc-Carrillo C., Abedon ST. 2011. Pros and Cons of Phage Therapy. Bacteriophage 1:

111-114.

13. Ackermann HW, Audurier A, Berthiaume L., Jones LA, Mayo JA, Vidaver AK. 1978. Guidelines for bacteriophage characterization. Adv. Virus Res. 23, 1-24.

14. W. E. Huff,2 G. R. Huff, N. C. Rath, and A. M. Donoghue. Evaluation of the Influence of Bacteriophage Titer on the Treatment of Colibacillosis in Broiler Chickens1.

15. Huff WE, Huff GR, Rath NC, Balog JM, Donoghue AM. 2002a. “Prevention of Escherichia coli infection in broiler chickens with a bacteriophage aerosol spray,” Poultry Science, vol. 81, no. 10, pp. 1486-1491.

16. Huff WE, Huff GR, Rath NC, Balog JM, Xie H, Moore PA Jr, Donoghue AM. 2002b. “Prevention of Escherichia coli respiratory infection in broiler chickens with bacteriophage (SPR02),” Poultry Science, vol. 81, no. 4, 437-441.

17. Huff WE, Huff GR, Rath NC, Balog JM, Donoghue AM. 2003. “Evaluation of aerosol spray and intramuscular injection of bacteriophage to treat an Escherichia coli respiratory infection” Poultry Science, vol. 82, no. 7, pp. 1108-1112, 2003.

18. Lau GL, Sieo CC, Tan WS, Hair-Bejo M, Jalila A, Ho YW. 2010. Efficacy of a bacteriophage isolated from chickens as a therapeutic agent for colibacillosis in broiler chickens. Poult Sci. Dec; 89(12): 2589-96.

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do gatunku Escherichia coli, wybrany ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00119, F/00120, F/00121, F/00122.
2. Szczep bakteriofaga, wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi: F/00119, F/00120, F/00121, F/00122, do zastosowania jako preparat przeciwbakteryjny, służący do zwalczania bakterii Escherichia coli.
3. Szczep bakteriofaga do zastosowania według zastrz. 3, znamienny tym, że zwalczane bakterie klasyfikowane są jako patogenne dla drobiu Escherichia coli (APEC).
4. Szczep bakteriofaga do zastosowania według zastrz. 2, znamienny tym, że do wytwarzania preparatów przeciwbakteryjnych wykorzystuje się całe wiriony bakteriofaga wirulentnego w preparatach zawierających jednego faga.
5. Szczep bakteriofaga do zastosowania według zastrz. 2, znamienny tym, że do wytwarzania preparatów przeciwbakteryjnych wykorzystuje się koktajl zawierający kilka lub kilkanaście aktywnych bakteriofagów.
6. Szczep bakteriofaga do zastosowania według zastrz. 2, znamienny tym, że do wytwarzania preparatów przeciwbakteryjnych wykorzystuje się oczyszczone fagowe białka strukturalne, jak i enzymatyczne, zwłaszcza enzymy lityczne w postaci lizozymu albo endolizyny, albo egzopolisacharydazy.
7. Szczep bakteriofaga do zastosowania według zastrz. 2, znamienny tym, że preparatami przeciwbakteryjnymi, są preparaty służące do leczenia zakażeń wywołanych przez pałeczki Escherichia coli.
8. Szczep bakteriofaga do zastosowania według zastrz. 2, znamienny tym, że preparatami przeciwbakteryjnymi, są preparaty służące do zapobiegania zakażeniom wywołanym przez pałeczki Escherichia coli.
9. Szczep bakteriofaga do zastosowania według zastrz. 2, znamienny tym, że preparatami przeciwbakteryjnymi, są preparaty służące do eliminowania pałeczek Escherichia coli z powierzchni biotycznych albo abiotycznych.