PL240449B1

PL240449B1 - Pochodna terpenoidowa do zastosowania w chemoprewencji i wspomaganiu chemioterapii nowotworów

Info

Publication number: PL240449B1
Application number: PL429790A
Authority: PL
Inventors: Agata Kozioł; Kamila Środa-Pomianek; Anna Palko-Łabuz; Krystyna MICHALAK; Krystyna Michalak; Mirosława FERENS-SIECZKOWSKA; Mirosława Ferens-Sieczkowska
Original assignee: Univ Medyczny Im Piastow Slaskich We Wroclawiu
Priority date: 2019-05-06
Filing date: 2019-05-06
Publication date: 2022-04-04
Also published as: WO2020226520A1; PL429790A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest pochodna terpenoidowa do zastosowania w chemoprewencji i wspomaganiu chemioterapii nowotworów, zwłaszcza nowotworu jelita grubego.

Nowotwory stanowią jedne z najpowszechniejszych chorób na świecie. Częstość ich występowania stale rośnie i jest na tyle wysoka, że zaliczane są do głównych chorób cywilizacyjnych. Różnorodność linii komórek nowotworowych oraz indywidualne predyspozycje pacjenta pociągają za sobą konieczność poszukiwania nowych rozwiązań terapeutycznych w aspekcie stosowanego leczenia. Terpenoidy to jedna z najliczniejszych i najbardziej zróżnicowanych grup substancji chemicznych pochodzenia naturalnego, stanowiąca bogaty rezerwuar związków o aktywności biologicznej, w tym również aktywności przeciwnowotworowej.

Ze stanu techniki znane są monoterpeny do leczenia zespołu suchego oka (WO2019040772). Zgłoszenie US2018153851 ujawnia monoterpeny wykorzystywane do leczenia chorób przewlekłych układu oddechowego. US2018360792 dostarcza monoterpenoidy skuteczne w leczeniu łysienia plackowatego oraz kompozycje do stosowania na skórę. Publikacja JP2011074092 ujawnia kompozycję zawierającą monocykliczny monoterpenoid do podawania doocznie. CN107411083 zapewnia kompozycję zawierającą monoterpenoidy uzyskane z gardenii jaśminowatej do stosowania w procesie poprawy pamięci i zaburzeniach snu. NEO218 (3-bromo-2-oxo-propionic acid 4-isopropenyl-cyclohex-1-enylmethyl ester) ujawniony w publikacji WO2018102412 jest nowym związkiem utworzonym w wyniku wiązania kowalencyjnego dwóch związków 3-bromopirogronianu (3-BF), środka alkilującego hamującego metabolizm komórek nowotworowych, oraz alkoholu perylowego (POH), naturalnego monoterpenu o własnościach przeciwrakowych. JP2014224148 dostarcza kompozycję farmaceutyczną indukującą hamowanie angiogenezy, aktywującą proces apoptozy komórek a także spowalniającą wzrost komórek nowotworowych. Kompozycja zawiera monoterpenoidy uzyskane z ekstraktu z jodły syberyjskiej. Dodatkowo formulacja ma zastosowanie w leczeniu chorób związanych z procesem angiogenezy takich jak retinopatia, chroniczne i ostre zapalenie nerek, łuszczyca, chroniczna astma, endometrioza i inne. US2011294752 ujawnia nowe mieszaniny saponin i związki wyizolowane z akacji (Acacia victoriae) zawierające resztę triterpenową, do której dołączone są reszty oligosacharydowe i monoterpenoidowe. Mieszaniny i związki mają własności regulujące apoptozę i cytotoksyczność komórek i wykazują potencjał przeciwnowotworowy wobec różnego typu komórek rakowych.

Głównym celem współczesnych badań nad nowotworami z wykorzystaniem terpenoidów jest identyfikacja substancji o pożądanych właściwościach oraz ustalenie molekularnych mechanizmów ich działania na poziomie in vitro oraz in vivo. Niezwykle istotne jest też uzyskanie nowych pochodnych, o ściśle określonych modyfikacjach w strukturze cząsteczki, które pozwolą na zwiększenie efektywności działania chemoprewencyjnego związku lub zastosowania go jako czynnika modulującego farmakokinetykę standardowych leków przeciwnowotworowych.

Celem wynalazku jest dostarczenie skutecznego środka o własnościach chemoprewencyjnych i wspierającego chemioterapię nowotworów.

Przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze 1 do zastosowania w chemoprewencji i wspomaganiu chemioterapii nowotworów, zwłaszcza nowotworu jelita grubego.

O ch₃

WZÓR 1

Opis figur

Fig. 1 Zależność przeżywalności komórek linii LoVo/Dx i HT/29/Dx od stężenia TMPE.

Istotność statystyczną wyznaczano przy zastosowaniu testu t-Studenta (* P < 0,05).

Fig 2. Elektroforegram przedstawiający całkowity DNA, izolowany z komórek LoVo/Dx i HT29/Dx po inkubacji TMPE. M - marker Fast Ruler Low Rangę.

PL 240 449 Β1

Fig. 3A. Zależność przeżywaIności komórek linii LoVo/Dx od stężenia doksorubicyny w obecności TMPE. Istotność statystyczną wyznaczano przy zastosowaniu testu t-Studenta (* P < 0,05).

Fig. 3B. Zależność przeżywałności komórek linii HT29/Dx od stężenia doksorubicyny w obecności TMPE. Istotność statystyczną wyznaczano przy zastosowaniu testu t-Studenta (* P < 0,05).

Fig. 4. Akumulacja doksorubicyny w komórkach LoVo i LoVo/Dx w obecności nowo zsyntezowanej pochodnej TMPE. Istotność statystyczną wyznaczano przy zastosowaniu testu t-Studenta (* P < 0,05). Kontrola - akumulacja doksorubicyny w komórkach bez TMPE.

Fig. 5. Akumulacja doksorubicyny w komórkach HT i HT29/Dx w obecności nowo zsyntezowanej pochodnej TMPE. Istotność statystyczną wyznaczano przy zastosowaniu testu t-Studenta (* P < 0,05). Kontrola - akumulacja doksorubicyny w komórkach bez TMPE.

Przykład 1

Charakterystyka i otrzymywanie 3-(2,6,6-Trimetylocykloheks-1-en-1-ylo)prop-2-enianu etylu

Wzór sumaryczny: C14H22O2; Masa molowa: 222,32

HRMS: (TOFMS ES+) obliczone dla: [C14H22O2] 223.1698, znaleziono [M+] 223.1699

Ή NMR (600 MHz, CDCh, δ, ppm) 1.03-1.06 (m, 3H, przy C-13 i C-14), 1.39-1.42 (m, 3H, przy C-11), 1.60-1.63 (m, 2H, przy C-5), 1.68-1.72 (m, 3H, przy C-12), 1.95 (t, J = 6.4 Hz, 2H, przy C-4), 2.05 (m, 2H, przy C-3), 4.10-4.18 (m, 2H, przy C-10), 5.94 (s, 1H, przy C-8), 7.29 (s, 1H, przy C-7).

¹³C NMR (150 MHz, CDCh, δ, ppm) 15.96 (C-15), 20.72 (C-4), 21.44 (C-12), 28.48 (C-13), 28.56 (C-14), 33.72 (C-3), 34.61 (C-6), 35.64 (C-5), 61.54 (C-10), 107.77 (C-8), 124.06 (C-1), 134.70 (C-11), 148.51 (C-7), 174.02 (C-9).

Sposób wytwarzania 3-(2,6,6-Trimetylocykloheks-1-en-1-ylo)prop-2-enianu etylu polega na reakcji Hornera-Wadswortha-Emmonsa. 3-(2,6,6-trimetylocykloheks-1-en-1-ylo)prop-2-enianem etylu został otrzymany w wyniku reakcji β-cyklocitralu z fosfonooctanu trietylu wobec wodorku sodu i tetra hydrofuranu jako środowiska reakcji.

Do dwuszyjnej kolby okrągłodennej umieszczonej w łaźni lodowej, zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne, chłodnicę zwrotną i zabezpieczonej przed dostępem wilgoci, dodano 0.45 g (19 mmol) wodorku sodu oraz wkroplono, przy jednoczesnym mieszaniu, 10 ml tetrahydrofuranu. Następnie, dodano 1,5 g (2,0 mmol) fosfonooctanu trietylu w 10 ml tetrahydrofuranu i całość mieszano przez 15 minut. Po tym czasie wkroplono, przy jednoczesnym mieszaniu, roztwór 0,5 g aldehydu, β-cyklocitralu w 20 ml tetrahydrofuranu. Po odczekaniu 30 minut od zakończenia wkraplania, łaźnia lodowa została zdjęta. Reakcja przebiegała według schematu.

Mechanizm reakcji polega na tym, że grupa karbonylowa ketonu reaguję z α-metalicznym fosfonianem, w tym przypadku fosfonooctanem trietylu dając alken w postaci olefin oraz łatwo rozpuszczalne estry w rozpuszczalnikach organicznych lub kwasy fosforowe. Reakcja Hornera-Wadswortha-Emmonsa rozpoczyna się od deprotonowania fosfonianu z wytworzeniem karboanionu fosfonianowego. Nukleofilowy reagent przyłącza się do aldehydu (lub ketonu), przy czym etap ten wpływa na szybkość reakcji. Końcowa eliminacja prowadzi do powstania związku: (E)-alken i (Z)-alken.

Reakcja była kontrolowana za pomocą TLC i prowadzona do momentu całkowitego przereagowania substratu (72 h). Po zakończeniu reakcji do mieszaniny reakcyjnej dodano 45 ml wody destylowanej i całość ekstrahowano trzykrotnie 30 ml porcjami heksanu. Fazę organiczną wysuszono bezwodnym siarczanem magnezu i przesączono. Następnie odparowano nadmiar rozpuszczalnika. Otrzymano 0,12 g surowego produktu, który następnie oczyszczono przy użyciu kolumny chromatograficznej typu „Flash” jako eluent stosując heksan i octan etylu w stosunku 5:3. Uzyskano 0,10 g czystego produktu, co stanowi 51% wydajności.

PL 240 449 Β1

P rzykład 2

Badanie aktywności biologicznej nowej pochodnej terpenoidowej

Badania in vitro z zastosowaniem nowo zsyntezowanej pochodnej przeprowadzone zostały na liniach komórek raka jelita grubego LoVo/Dx i HT29/Dx, które wykazują oporność na lek cytostatyczny -doksorubicynę. Badane linie charakteryzują się nadekspresją transportera wielolekowego ABCB1 odpowiedzialnego za aktywne wypompowywanie leku do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, co w sposób bezpośredni przyczynia się do braku wrażliwości komórek na stosowany chemoterapeutyk.

Wpływ związku wg wynalazku na wzrost w/w komórek nowotworowych oceniono przy użyciu testu z sulforodamina B (SRB). Sulforodamina B jest barwnikiem wiążącym się z aminokwasami białek komórkowych, co pozwala na oznaczenie całkowitej ilości białka komórkowego, a co za tym idzie ilości komórek po zakończeniu eksperymentu. Metoda SRB została również wykorzystana do zbadania zmian w cytotoksyczności doksorubicyny, w obecności zsyntezowanej pochodnej. Przeprowadzone doświadczenia wykazały zależną od stężenia zdolność TMPE do hamowania wzrostu zarówno komórek linii LoVo/Dx jak i HT29/Dx (Fig. 1). ‘

Ponadto, w obecności TMPE zaobserwowano tzw. drabinkę apoptotyczną uzyskaną w wyniku konwencjonalnej elektroforezy DNA pochodzącego z komórek inkubowanych ze związkiem w stężeniu 100 μΜ (Fig. 2). Wynik ten sugeruje indukcję apoptozy w komórkach HT/29 i LoVo/Dx przez związek według wynalazku.

W badaniach wykazano, że zastosowanie niskiego (5 μΜ) nietoksycznego stężenia TMPE w połączeniu z doksorubicyną powodowało zwiększenie cytotoksyczności komórek charakteryzujących się nadekspresją P-gp (HT29/Dx (Fig. 3B) i LoVo/Dx (Fig. 3A)) w porównaniu do działania samego leku.

W badaniach spektrofluorymetrycznych polegających na pomiarze wewnątrzkomórkowej fluorescencji doksorubicyny wykorzystano, oprócz opornych na ten lek linii komórkowych, linie komórek LoVo i HT29. Wykazują one wrażliwość na doksorubicynę, a tym samym stanowiły parę linii kontrolnych w doświadczeniu. Ich wykorzystanie pozwoliło na potwierdzenie, czy TMPE wykazuje cechy modulatora oporności, uwrażliwiającego komórki na działanie leku. Badania wykazały, że zwiększona cytotoksyczność kombinacji TMPE/lek względem komórek opornych wynika z większej koncentracji leku w jądrach komórek nowotworowych w obecności zsyntezowanej pochodnej (Fig. 4 i Fig. 5).

Powyższe wyniki są dowodem na zdolność związku według wynalazku do hamowania aktywności P-gp, a tym samym do ograniczenia wypływu leku poza komórkę. Na podstawie przeprowadzonych badań można stwierdzić, że TMPE moduluje fenotyp wielolekowej oporności w linii ludzkich komórek nowotworowych raka jelita grubego. Wskazuje to, że otrzymana pochodna będzie skutecznym środkiem chemoprewencyjnym i wspomagającym chemioterapię nowotworów.

Claims

1 . Związek o wzorze 1 do zastosowania w chemoprewencji i wspomaganiu chemioterapii nowotworów, zwłaszcza nowotworu jelita grubego.