PL236059B1 - Grupa peptydów przeciwdrobnoustrojowych opartych o strukturę amidu Nε-L-lizyno-L-lizylo-L-arginylo-L-arginylo-L-argininy modyfikowaną kwasami karboksylowymi - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są nowe związki o wzorze ogólnym 1 przedstawionym na rysunku, gdzie podstawnikami związku A są odpowiednio grupy R1 - C6H5, R2 - C6H5, R3 - C6H5 podstawnikami związku B są odpowiednio grupy R1 - C6H5, R2 - C6H5, R3 - CH3, a podstawnikami związku C są odpowiednio grupy R1 - CH = CH - C6H5, R2 - CH = CH - C6H5 R3 - CH = CH - C6H5. Zgłoszenie obejmuje też sposób otrzymywania przedmiotowych związków, który prowadzony jest w całości w fazie stałej. Ponadto przedmiotem zgłoszenia jest również zastosowanie przedmiotowych związków jako środka antybakteryjnego i przeciwgrzybiczego.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe związki oparte o strukturę amidu N^L-lizylo-L-lizylo-L-arginylo-L-arginylo-L-argininy, gdzie grupy a- i ε-aminowe reszt lizyny są związane wiązaniem amidowym z kwasami karboksylowymi, w tym z aromatycznymi kwasami karboksylowymi. Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nowych związków oraz ich zastosowanie jako środek antybakteryjny, i środek przeciwgrzybiczy.

Peptydy o charakterze amfifilowym i wypadkowym ładunku dodatnim, wykazują często aktywność przeciwdrobnoustrojową, która jest efektem oddziaływań elektrostatycznych z ujemnie naładowaną błoną komórkową i prowadzi do jej permeabilizacji i utraty potencjału błonowego. Peptydy przeciwdrobnoustrojowe, w tym lipopeptydy, często wykazują także wysoką toksyczność względem ludzkich linii komórkowych oraz erytrocytów. ε-poli-L-lizyna jest produktem biosyntezy szczepu Streptomyces albulus złożonym z 25-30 reszt aminokwasowych i wykazującym szerokie spektrum aktywności przeciwdrobnoustrojowej. W niektórych krajach znajduje ona zastosowanie w konserwacji żywności. Jest obiektem badań ze względu na potencjalne jej wykorzystanie jako nośnika leków, biodegradowalnego biomateriału czy też hydrożelu. Ponadto nie wywołuje ona efektu toksycznego u ludzi. Wynalazek w istotnym stopniu opiera się o strukturę łańcucha złożonego z ε-poli-L-lizyny, ale jego kluczowym elementem są reszty kwasowe przyłączone do odpowiednich ugrupowań aminowych stanowiące o hydrofobowości tego fragmentu cząsteczki peptydu, a co za tym idzie jego aktywności biologicznej. Struktury te nie są więc ścisłym odwzorowaniem naturalnie występujących peptydów. Wykorzystanie ugrupowania ε-aminowego w reakcji kondensacji z grupą a-karboksylową lizyny oraz przyłączenie hydrofobowych kwasów karboksylowych do pozostałych wolnych grup aminowych reszt lizyny prowadzi do otrzymania związków o elastycznym i lipofilowym łańcuchu (udział alkilowego łańcucha bocznego lizyny). Znane są doniesienia o krótkich peptydach (4 reszty aminokwasowe) zawierających reszty kwasów aromatycznych i będących aktywnymi w stosunku do biofilmu przy jednocześnie niskiej toksyczności, co dodatkowo uzasadnia stosowanie proponowanej koncepcji.

Przedmiotem wynalazku jest grupa peptydów opartych o strukturę amidu N -L-lizylo-L-lizylo-L-arginylo-L-arginylo-L-argininy modyfikowaną kwasami karboksylowymi przy wykorzystaniu grupy a- i ε-aminowej reszt lizyny. Struktura realizowana jest poprzez wytworzenie wiązania peptydowego pomiędzy grupą ε-aminową lizyny znajdującej się na N-końcu sekwencji a grupą a-karboksylową przyłączanej reszty lizyny. Przy wykorzystaniu pochodnej Fmoc-Lys(Boc)-OH oraz żywicy amidowej (Fmoc-Rink Amide Resin) możliwe jest takie przeprowadzenie reakcji, które umożliwia otrzymanie peptydu zawierającego wiele reszt kwasu tłuszczowego, aromatycznego lub dowolnej innej struktury, która może wiązać się kowalencyjnie z ugrupowaniem aminowym. Rozwiązanie to może znaleźć zastosowanie do syntezy związków biologicznie czynnych. Jedną z możliwości jest otrzymanie peptydów przeciwdrobnoustrojowych o budowie amfifilowej. Przykładem są krótkie kationowe lipopeptydy wykazujące wysoką aktywność bakteriobójczą, grzybobójczą oraz przeciwnowotworową. Grupą lipopeptydów o wysokiej aktywności przeciwdrobnoustrojowej są te zawierające kilka reszt kwasu tłuszczowego. Fakt ten podkreśla istotę wynalazku, gdyż może on bezpośrednio posłużyć do otrzymywania peptydów tego typu.

Związki będące przedmiotem wynalazku oparte są o strukturę amidu N^L-lizylo-L-lizylo-L-arginylo-L-arginylo-L-argininy modyfikowaną kwasami karboksylowymi (w tym aromatycznymi kwasami karboksylowymi) przy wykorzystaniu grupy a- i ε-aminowej reszt lizyny.

PL 236 059 Β1

gdzie:

związek A, posiada Ri = -CeHs; R2 = -CeHs; R3 = -CeHs związek B, posiada R1 = -CeHs; R2 = -CeHs; R3 = -CH3 związek C, posiada R1 = -CH=CH-C6H5; R2 = -CH=CH-C6H5; Rs ⁼ -CH=CH-C6H5

Sposób otrzymywania nowych związków zdefiniowanych powyżej, który posiada następujące etapy:

a) deprotekcja Fmoc w 20% roztworze piperydyny (Fmoc-Rink Amidę Resin); 20 minut z wytrząsaniem,

b) przemywanie żywicy rozpuszczalnikami - dwukrotnie DMF, dwukrotnie DMF:DCM (1:1, v/v), dwukrotnie DCM,

c) wykonanie testu chloranilowego,

d) reakcja kondensacji, gdzie stosowano trzykrotny nadmiar reagentów (w odniesieniu do żywicy; osadzenie 0,9 mmol/g) - Fmoc-AA-OH:DIC:HOBt (stosunek równomolowy);

e) przemywanie żywicy oraz test chloranilowy,

f) w ten sam sposób przyłączono kolejne aminokwasy, gdzie po przyłączeniu trzech reszt L-argininy (Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH), i jednej reszty L-lizyny (Fmoc-L-Lys(Boc)-OH), otrzymano następujący półprodukt - Fmoc-L-Lys(Boc)-[L-Arg(Pbf)-]3-linker-żywica,

g) następnie za pomocą roztworu piperydyny przeprowadzono deprotekcję grupy a-aminowej N-końcowego aminokwasu (usunięcie Fmoc), przemyto żywicę i wykonano test chloranilowy,

h) przeprowadzono reakcję kondensacji:

- dla związków A i B) z kwasem benzoesowym - kwas benzoesowy:DIC:HOBt (stosunek równomolowy) - stosując trzykrotny nadmiar reagentów, a następnie tak jak w pkt. b) i c);

- dla związku C) przeprowadzono reakcję kondensacji z kwasem cynamonowym - kwas cynamonowy:DIC:HOBt (stosunek równomolowy) - stosując trzykrotny nadmiar reagentów, a następnie tak jak w pkt. b) i c).

i) przeprowadzono deprotekcję grupy N^e-aminowej lizyny (ugrupowanie Boc) umieszczając peptydylo-żywicę w 10% roztworze TFA w DCM na 30 minut z wytrząsaniem, a następnie postępowano analogicznie jak po etapie deprotekcji pkt. b) i c),

j) do wolnej grupy ε-aminowej przyłączano kolejną resztę Fmoc-L-Lys(Boc)-OH i wykonano czynności z pkt. b) i c),

k) przeprowadzono deprotekcję ugrupowania N“-aminowego za pomocą roztworu piperydyny, a następnie kondensację z wykorzystaniem, dla związku A i B) kwasu benzoesowego, a dla związku C) kwasu cynamonowego; a następnie wykonano czynności z pkt. b) i c),

I) przeprowadzono deprotekcję ugrupowania N^e-aminowego N-końcowej reszty lizyny umieszczając peptydylo-żywicę w 10% TFA w DCM na 30 minut z wytrząsaniem, a następnie postępowano analogicznie jak po etapie deprotekcji pkt. b) i c),

m) do wolnej grupy N^e-aminowej przyłączano kolejną resztę:

- dla związku A) resztę kwasu benzoesowego;

PL 236 059 B1

- dla związku B) resztę kwasu octowego stosując bezwodnik octowy, reakcja ta była prowadzona przez 1 h, gdzie na 1 gram żywicy (osadzenie 0,9 mmol/g) przygotowywano 1 ml bezwodnika kwasu octowego i 1 ml DIPEA w 18 ml DCM;

- dla związku C) resztę kwasu cynamonowego, i dalej wykonano czynności z pkt. b) i c), n) peptyd odszczepiono od żywicy stosując - TFA:TIS:woda (96:2:2, v/v), z jednoczesnym mieszaniem przez 1,5 h,

o) surowy peptyd wytrącono za pomocą schłodzonego eteru dietylowego i odwirowano, supernatant zlano, zaś peptyd poddano liofilizacji,

p) peptyd został oczyszczony z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych, gdzie jako fazę ruchomą zastosowano acetonitryl i wodę dejonizowaną zawierające 0,1% TFA.

Sposób gdzie reakcję kondensacji przeprowadza się przez 1,5 h w DCM:DMF (1:1, v/v) z wytrząsaniem.

Sposób gdzie w celu selektywnej deprotekcji ugrupowania ε-aminowego łańcucha bocznego lizyny zastosowano środowisko kwaśne.

Nowe związki zdefiniowane powyżej do zastosowania jako środek antybakteryjny. Nowe związki zdefiniowane powyżej do zastosowania jako środek przeciwgrzybiczy.

Opis figur:

Fig. 1 - przedstawia wyniki analizy chromatograficznej dla peptydu A (Kolumna: Waters, XBridge Shield RP 18, 3,5 um, 4,6 x 150 mm. Metoda: 20-80% ACN, 10 minut, przepływ - 1,2 ml/min, detektor UV-Vis, λ = 214 nm).

Fig. 2 - przedstawia wyniki analizy chromatograficznej dla peptydu B (Kolumna: Waters, XBridge Shield RP 18, 3,5 um, 4,6 x 150 mm. Metoda: 20-80% ACN, 10 minut, przepływ - 1,2 ml/min, detektor UV-Vis, λ = 214 nm).

Fig. 3 - przedstawia wyniki analizy chromatograficznej dla peptydu C (Kolumna: Waters, XBridge Shield RP 18, 3,5 um, 4,6 x 150 mm. Metoda: 20-80% ACN, 10 minut, przepływ - 1,2 ml/min, detektor UV-Vis, λ = 214 nm).

Fig. 4 - przedstawia widmo masowe peptydu A (związek A).

Fig. 5 - przedstawia widmo masowe peptydu B (związek B).

Fig. 6 - przedstawia widmo masowe peptydu C (związek C).

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia:

P r z v k ł a d 1

Syntezę przeprowadzono na nośniku stałym z zastosowaniem metody Fmoc/tBu. Wykorzystano żywicę amidową - Fmoc-Rink Amide (osadzenie 0,9 mmol/g, Amide AM Resin; ORPEGEN Peptide Chemicals GmbH, Heidelberg, Niemcy). Przed przystąpieniem do syntezy żywicę umieszczano w DCM (Chempur, Piekary Śląskie, Polska) na 1 h w celu jej spęcznienia. Synteza obejmowała następujące po sobie etapy:

1. Deprotekcja (usunięcie grupy ochronnej - Fmoc) w 20% roztworze piperydyny (Merck Millipore, Darmstadt, Niemcy) w DMF (Sigma Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy).

2. Przemywanie żywicy rozpuszczalnikami w następującej serii - dwukrotnie DMF, dwukrotnie DMF:DCM (1:1, M/M), dwukrotnie DCM.

3. Wykonanie testu chloranilowego.

4. Reakcja kondensacji - sprzęganie. Stosowano trzykrotny nadmiar reagentów - Fmoc-AAOH:DIC:HOBt (stosunek równomolowy). Reakcję prowadzono przez 1,5 h w DCM:DMF (1:1, M/M) Z wytrząsaniem (DIC - Iris Biotech, Marktredwitz, Niemcy; HOBt - ORPEGEN Peptide Chemicals GmbH, Heidelberg, Niemcy).

5. Przemywanie żywicy oraz test chloranilowy - tak jak w pkt. 2 i 3.

Po przyłączeniu aminokwasu i wykonaniu testu chloranilowego następowało ponowne rozpoczęcie cyklu powyżej opisanych czynności (pkt. 1-5) w celu przyłączenia kolejnego aminokwasu. Po przyłączeniu trzech reszt L-argininy (Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH, ORPEGEN Peptide Chemicals GmbH, Heidelberg, Niemcy) i jednej reszty L-lizyny (Fmoc-L-Lys(Boc)-OH, ORPEGEN Peptide Chemicals GmbH, Heidelberg, Niemcy) otrzymano następujący półprodukt - Fmoc-L-Lys(Boc)-[L-Arg(Pbf)-]3-linker-żywica. Następnie przeprowadzono deprotekcję grupy α-aminowej N-końcowego aminokwasu (usunięcie Fmoc), przemyto żywicę i wykonano test chloranilowy. Przeprowadzono reakcję kondensacji z kwasem benzoesowym (Sigma Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy) - kwas benzoesowy:DIC:HOBt (stosunek równomolowy) - stosując trzykrotny nadmiar reagentów, a następnie tak jak

PL 236 059 Β1 w pkt. 2 i 3. W celu selektywnej deprotekcji ugrupowania ε-aminowego łańcucha bocznego lizyny zastosowano środowisko kwaśne. Umieszczano peptydylo-żywicę w 10% TFA (Apollo Scientific, Bredbury, Wielka Brytania) w DCM na 30 minut z wytrząsaniem, a następnie postępowano analogicznie jak po etapie deprotekcji (pkt. 2 i 3). W warunkach tych nie dochodzi do odszczepienia peptydu od żywicy, ani do deprotekcji ugrupowania guanidynowego łańcuchów bocznych argininy chronionego Pbf. Do wolnej grupy ε-aminowej przyłączano zgodnie z opisaną procedurą kolejną resztę Fmoc-L-Lys(Boc)-OH. Przeprowadzono deprotekcję za pomocą roztworu piperydyny, a następnie kondensację z wykorzystaniem kwasu benzoesowego pamiętając o wykonaniu czynności z pkt. 2 i 3. Dokonano deprotekcji grupy ε-aminowej oraz przyłączono resztę kwasu benzoesowego analogicznie względem opisanych powyżej czynności. Peptyd odszczepiono od żywicy stosując - TFA:TIS:woda (96:2:2, v/v), z jednoczesnym mieszaniem przez 1,5 h (TIS; Iris Biotech, Marktredwitz, Niemcy). Surowy peptyd wytrącono za pomocą schłodzonego eteru dietylowego (Chempur, Piekary Śląskie, Polska) i odwirowano. Supernatant zlano, zaś peptyd poddano liofilizacji. Peptyd został oczyszczony z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych (RP-HPLC). Jako fazę ruchomą zastosowano acetonitryl (Sigma Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy) i wodę dejonizowaną zawierające 0,1% TFA. Czystość i tożsamość związku potwierdzono przeprowadzając analizę chromatograficzną (RP-HPLC) oraz wykorzystując spektrometrię mas (ESI-MS). Poniżej (ryc. 2) przedstawiono wzór strukturalny otrzymanego związku (A).

Ryc. 1. Związek (A) z przykładu 1.

Przykład 2

Synteza tak jak dla związku A, z tą różnicą, że po deprotekcji ugrupowania N^e-aminowego drugiej reszty lizyny w 10% TFA w DCM przeprowadzono reakcję z bezwodnikiem kwasu octowego (Chempur, Piekary Śląskie, Polska). Reakcja ta była prowadzona przez 1 h. Na 1 gram żywicy (osadzenie 0,9 mmol/g) przygotowywano 1 ml bezwodnika kwasu octowego i 1 ml DIPEA (Iris Biotech, Marktredwitz, Niemcy) w 18 ml DCM. Następnie wykonano serię przemywać żywicy, test chloranilowy. Kolejnym etapem było odszczepianie peptydu od żywicy, wytrącanie, liofilizacja oraz oczyszczanie -takjak uprzednio opisano (przykład 1).

PL 236 059 Β1

Ryc. 2. Związek (B) z przykładu 2.

Przykład 3

Analogicznie jak dla przykładu 1, z tą różnicą, że w miejsce kwasu benzoesowego wykorzystano kwas cynamonowy (kwas (E)-3-fenyloprop-2-enowy; Sigma Aldrich, Merck, Darmstadt, Miemcy).

Ryc. 3. Związek (C) z przykładu 3.

Badania mikrobiologiczne

Badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej przeprowadzono z wykorzystaniem metody seryjnych mikrorozcieńczeń związku w pożywce płynnej na polistyrenowej płytce 96-dołkowej, zgodnie z wytycznymi CLSI. Oznaczaną aktywnością było minimalne stężenie związku powodujące całkowite zahamowanie wzrostu drobnoustroju (MIC). Gęstość zawiesiny bakteryjnej w każdym z dołków wynosiła 5 x 10⁵ CFU/ml, zaś w przypadku szczepów z rodzaju Candida było to 4 χ 10³ CFU/ml. Płytki inkubowano w 37°C przez 24 h. Oceny wzrostu dokonano za pomocą czytnika mikropłytek (Multiskan

PL 236 059 Β1

GO Thermo Scientific) mierząc absorbancję przy długości fali równej 600 nm. Aktywność wyznaczono wobec następujących szczepów referencyjnych: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 25922, Candida albicans ATCC 10231, Candida glabrata ATCC 15126, Candida tropicalis PCM 2709-FY. W przypadku szczepów bakteryjnych zastosowano pożywkę Mueller Hinton II Broth (Becton Dickinson, Le Pont de Claix Cedex, Francja), zaś w przypadku szczepów Candida było to RPMI-1640 (Sigma Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy). Wyniki przedstawiono w tabeli 1 i 2.

Badanie aktywności hemolitycznei

Krew od zdrowego dawcy została pobrana do fiolek zawierających EDTA - czynnik przeciwzakrzepowy. Krew wirowano przez 10 minut przy 500 x g, a następnie oddzielono erytrocyty. Przemyto je trzykrotnie roztworem PBS (Sigma Aldrich, Merck, Darmstadt, Niemcy) każdorazowo wirując - warunki jak wyżej. Wykonano serię rozcieńczeń badanych związków w PBS na polistyrenowej płytce 96-dołkowej, przy czym każdy związek badano trzykrotnie. Stężenie erytrocytów w każdym z dołków wynosiło 4% (v/v). Następnie płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 h. Krwinki odwirowano (10 minut, 500 x g), zaś supernatant przeniesiono na nową płytkę uważając by nie naruszyć osadu. W celu zbadania stopnia hemolizy dokonano odczytu spektrofotometrycznego za pomocą czytnika mikropłytek (Multiskan GO Thermo Scientific) przy długości fali równej 540 nm. Aktywność hemolityczna związków została odniesiona do całkowitej lizy komórek wywołanej 1% roztworem TritonuX-100 (SigmaAldrich, Darmstadt, Niemcy). Uzyskane rezultaty - HC50, przedstawiono w tabeli 2.

Wyniki badań aktywności przeciwdrobnoustrojowej i hemolitycznei

Odpowiednie dane zostały zamieszczone w tabelach poniżej (tabela 1 i 2).

T a b e I a 1

Wartości MIC [pg/ml] wobec szczepów bakteryjnych.

Związek	S. aureus	5. epidermidis	E. coli
A	256	2	>512
B	512	8	>512
C	16	4	256

Tabela 2

Wartości MIC wobec szczepów grzybowych oraz wartości HC50 [pg/ml].

Związek	S. aureus	S. epidermidis	E. coli
A	256	2	>512
B	512	8	>512
C	16	4	256

Potwierdzenie tożsamości związków (ESI-MS)

W tabeli 3 zamieszczono obliczone masy monoizotopowe peptydów.

Tabela 3

Zestawienie obliczonych mas monoizotopowych peptydów

Peptyd	Peptyd A	Peptyd B	Peptyd C
Masa monoizotopowa [Da]	1053,598	991,583	1131,645

PL 236 059 Β1

W tabeli 4 zamieszczono obliczone i zmierzone wartości m/z (jonizacja dodatnia).

Tabela 4

Wynik analizy (ESI-MS).

glOOBIS
Obliczona wartość	Zmierzona wartość	Obliczona wartość BlliOiie	Zmierzona wartość	Obliczona wartość	Zmierzona wartość
1	1054,61	1054,64	992,59	992,60	1132,65	1132,72
2	527,81	528,09	496,80	497,02	566,83	567,21
3	352,21	352,45	331,54	331,73	378,22	378,48

z - ładunek

Zastosowanie wynalazku

Ze względu na wykazywaną aktywnością przeciwbakteryjną i przeciwgrzybową oraz niską toksycznością w stosunku do ludzkich erytrocytów związki będące przedmiotem niniejszego patentu mogą być potencjalnymi środkami leczniczymi. Ponadto istnieje przypuszczenie o możliwości ich wykorzystania do konserwacji kosmetyków, leków, żywności, produkcji opakowań i powlekania materiałów.

Wykaz stosowanych skrótów:

ATCC - ang. American Type Culture Collection; Amerykańska Kolekcja Hodowli Komórkowych

Boc - tert-butyloksykarbonyl

CLSI - ang. Clinical and Laboratory Standards Institute

DCM - dichlorometan

DIC - Λ/,Λ/’-diizopropylokarbodiimid

DIPEA - diizopropyloetyloamina

DMF - Λ/,Λ/’-dimetyloformamid

ESI-MS - ang. Electrospray lonisation Mass Spectrometry; Spektrometria mas z jonizacją poprzez elektrorozpylanie

Fmoc - 9-fluorenylometoksykarbonyl

Fmoc-AA-OH - aminokwas, którego grupa α-aminowa chroniona jest grupą Fmoc

HCso - ang. 50% Hemolytic Concentration; stężenie związku powodujące lizę połowy erytrocytów

HOBt - 1-hydroksybenzotriazol

MIC - ang. Minimal Inhibitory Concentration; Minimalne stężenie hamujące wzrost drobnoustrojów

Pbf - 2,2,4,6,7- pentametylodihydrobenzofuran-5-sulfonyl

PCM - ang. Polish Collection of Microorganisms; Polska kolekcja mikroorganizmów tBu - tert-butyl

TFA - kwas trifluorooctowy

TIS - triizopropylosilan

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nowe związki o wzorze ogólnym:

   gdzie:

   związek A, posiada Ri = -CeHs; R2 = -CeHs; R3 = -CeHs związek B, posiada R1 = -CeHs; R2 = -CeHs; R3 = -CH3 związek C, posiada R1 = -CH=CH-C6H5; R2 = -CH=CH-C6H5; R3 = -CH=CH-C6H5
2. 2. Sposób otrzymywania nowych związków zdefiniowanych w zastrzeżeniu 1, znamienny tym, że posiada następujące etapy:

   a) deprotekcja Fmoc w 20% roztworze piperydyny (Fmoc-Rink Amidę Resin); 20 minut z wytrząsaniem,

   b) przemywanie żywicy rozpuszczalnikami - dwukrotnie DMF, dwukrotnie DMF:DCM, (1:1, v/v), dwukrotnie DCM,

   c) wykonanie testu chloranilowego,

   d) reakcja kondensacji, gdzie stosowano trzykrotny nadmiar reagentów - Fmoc-AA-OH:DIC:HOBt (stosunek równomolowy),

   e) przemywanie żywicy oraz test chloranilowy,

   f) w ten sam sposób przyłączono kolejne aminokwasy, gdzie po przyłączeniu trzech reszt L-argininy (Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH), i jednej reszty L-lizyny (Fmoc-L-Lys(Boc)-OH), otrzymano następujący półprodukt - Fmoc-L-Lys(Boc)-[L-Arg(Pbf)-]3-linker-żywica,

   g) następnie za pomocą roztworu piperydyny przeprowadzono deprotekcję grupy «.-aminowej N-końcowego aminokwasu (usunięcie Fmoc), przemyto żywicę i wykonano test chloranilowy,

   h) przeprowadzono reakcję kondensacji:

   - dla związków A i B) z kwasem benzoesowym - kwas benzoesowy:DIC:HOBt (stosunek równomolowy) - stosując trzykrotny nadmiar reagentów, a następnie tak jak w pkt. b) i c);

   - dla związku C) przeprowadzono reakcję kondensacji z kwasem cynamonowym - kwas cynamonowy:DIC:HOBt (stosunek równomolowy) - stosując trzykrotny nadmiar reagentów, a następnie tak jak w pkt. b) i c).

   i) przeprowadzono deprotekcję grupy N^e-aminowej lizyny (ugrupowanie Boc) umieszczając peptydylo-żywicę w 10% roztworze TFA w DCM na 30 minut z wytrząsaniem, a następnie postępowano analogicznie jak po etapie deprotekcji pkt. b) i c),

   j) do wolnej grupy ε-aminowej przyłączano kolejną resztę Fmoc-L-Lys(Boc)-OH, i wykonano czynności z pkt. b) i c),

   k) przeprowadzono deprotekcję ugrupowania ISP-aminowego za pomocą roztworu piperydyny, a następnie kondensację z wykorzystaniem, dla związku A i B ) kwasu benzoesowego, a dla związku C) kwasu cynamonowego; a następnie wykonano czynności z pkt. b) i c),

   PL 236 059 B1

   l) przeprowadzono deprotekcję ugrupowania N^e-aminowego N-końcowej reszty lizyny umieszczając peptydylo-żywicę w 10% TFA w DCM na 30 minut z wytrząsaniem, a następnie postępowano analogicznie jak po etapie deprotekcji pkt. b) i c),

   m) do wolnej grupy ε-aminowej przyłączano kolejną resztę:

   - dla związku A) resztę kwasu benzoesowego;

   - dla związku B) resztę kwasu octowego stosując bezwodnik octowy, reakcja ta była prowadzona przez 1 h, gdzie na 1 gram żywicy (osadzenie 0,9 mmol/g) przygotowywano 1 ml bezwodnika kwasu octowego i 1 ml DIPEA w 18 ml DCM;

   - dla związku C) resztę kwasu cynamonowego, i dalej wykonano czynności z pkt. b) i c), n) peptyd odszczepiono od żywicy stosując - TFA:TIS:woda (96:2:2, v/v), z jednoczesnym mieszaniem przez 1,5 h,

   o) surowy peptyd wytrącono za pomocą schłodzonego eteru dietylowego i odwirowano, supernatant zlano, zaś peptyd poddano liofilizacji,

   p) peptyd został oczyszczony z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych, gdzie jako fazę ruchomą zastosowano acetonitryl i wodę dejonizowaną zawierające 0,1% TFA.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że reakcję kondensacji przeprowadza się przez 1,5 h w DCM:DMF (1:1, v/v) z wytrząsaniem.
4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w celu selektywnej deprotekcji ugrupowania ε-aminowego łańcucha bocznego lizyny zastosowano środowisko kwaśne.
5. 5. Nowe związki określone w zastrzeżeniu 1 do zastosowania jako środek antybakteryjny.
6. 6. Nowe związki określone w zastrzeżeniu 1 do zastosowania jako środek przeciwgrzybiczy.