PL235287B1 - Sposób wytwarzania androst-1,4-dien-3,17-dionu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania androst-1,4-dien- 3,17-dionu.

Metoda, według wynalazku może znaleźć zastosowanie w przemyśle chemicznym i farmaceutycznym do wytwarzania leku stosowanego w terapii hormonalnej (A.S. Clark, E.V. Harrold, A.S. Fast; Anabolic - androgenic steroid effects on the sexual behavior of intact male rats. Horm Behav 31, 1997, 35-46).

Leki steroidowe są po antybiotykach drugą co do wielkości grupą leków, odgrywającą ważną rolę w leczeniu i zapobieganiu różnym chorobom (Zhang WQ, Shao ML, Rao ZM, Xu MJ, Zhang X, Yang TW, Li H, Xu ZH (2013) Bioconversion of 4-androstene-3,17-dione to androst-1,4-diene-3,17-dione by recombinant Bacillus subtilis expressing ksdd gene encoding 3-ketosteroid-A1 -dehydrogenase from Mycobacterium neoaurum JC-12. J Steroid Biochem Mol Biol 135:36-42).

Biotransformacje są ekologiczną alternatywą klasycznej syntezy chemicznej w uzyskiwaniu aktywnych związków i są coraz częściej stosowane w przemyśle biofarmaceutycznym, zwłaszcza do produkcji leków steroidowych (M.-M. Chen, F.-Q. Wang, L.-C. Lin, K. Yao, D.-Z. Wei; Characterization and application of fusidane antibiotic biosynethsis enzyme 3-ketosteroid-A¹-dehydrogenase in steroid transformation. Appl Microbiol Biotechnol 96, 2012 133-142). Wprowadzenie wiązania podwójnego między pierwszym i drugim atomem węgla w pierścieniu A związku steroidowego może zwiększyć aktywność biologiczną nowo powstałego związku. Chemiczne metody otrzymywania 1-en-steroidów są wielostopniowe i mogą prowadzić do spontanicznej aromatyzacji pierścienia A (Y. Li, F. Lu, T. Sun, L. Du; Expression of ksdD gene encoding 3-ketosteroid-A¹-dehydrogenase from Arthrobacter simplex in Bacillus subtilis. Lett Appl Microbiol, 44, 2007, 563-568).

Znane są mikrobiologiczne metody uzyskiwania androst-1,4-dien-3,17-dionu z androst-4-en3,17-dionu w wyniku zastosowania szczepów bakterii z rodzaju: Mycobacterium, Rhodococcus, Nocardia, Arthrobacter (L.F. de las Heras, R. van der Geize, O. Drzyzga, J. Perera, J.M.N. Llorens, Molecular characterization of three 3-ketosteroid-A1-dehydrogenase isoenzymes of Rhodococcus ruber strain Chol-4, Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 132 (2012) 271-281; M. Kisiela, A. Skarka, B. Ebert, E. Master, Hydroxysteroid dehydrogenases (HSDs) in bacteria - a bioinformatic perspective, Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 129 (1-2) (2012) 31-46).

Znana jest metoda uzyskania androst-1,4-dien-3,17-dionu z 3β- hydroksyandrost-5-en-17-onu z zastosowaniem szczepu grzyba strzępkowego Fusarium oxysporum SC 1301, jednak w metodzie tej androst1,4-dien-3,17-dion jest produktem pośrednim i ulega dalszemu przekształceniu do testolaktonu (H. Zhang, J. Ren, Y. Wang, C. Sheng, Q. Wu, A. Diao, D. Zhu. Effective multi-step functional biotransformations of steroids by a newly isolated Fusarium oxysporum SC1301. Tetrahedron 69 (2013) 184-189).

Istota wynalazku polega na tym, że regioselektywne wprowadzenie podwójnego wiązania między pierwszym i drugim atomem węgla jest poprzedzone utlenieniem grupy hydroksylowej przy trzecim atomie węgla i izomeryzacją wiązania podwójnego z 5-en do 4-en w substracie, którym jest 3β-hydroksyandrost-5-en-17-on (DHEA), w wyniku tych przekształceń otrzymuje się androst-1,4-dien-3,17-dion, proces prowadzi się w wodnej kulturze szczepu Aspergillus versicolor KCh TJ1.

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Aspergillus versicolor KCh TJ1. Po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 3β-hydroksyandrost-5-en-17-on o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 96 godzin. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 144 godziny.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Aspergillus versicolor KCh TJ1, następuje regioselektywne wprowadzenie podwójnego wiązania miedzy pierwszym i drugim atomem węgla poprzedzone utlenieniem grupy hydroksylowej przy trzecim atomie węgla i izomeryzacją wiązania podwójnego z 5-en do 4-en. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (chloroform).

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie androst-1,4-dien-3,17-dionu z wydajnością izolowaną na poziomie 48% (według GC > 56%), w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

PL 235 287 Β1

Metoda izolowania szczepu Aspergillus yersicolor KCh TJ1

Próbkę powietrza pobraną z pokoju autoklawowego Katedry Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, ul. C.K. Norwida 25, 50-375 Wrocław w warunkach aseptycznych zaszczepiono płytki agarowe (sterylne plastikowe płytki z 20 ml pożywki stałej o składzie: glukoza 3%, aminobak 1%, agar 0,8%). Wyodrębniono czystą kulturę szczepu Aspergillus versicolor KCh TJ1, który wykorzystano do biotransformacji. Wyodrębniony szczep przechowywany jest na skosach agarowych w temperaturze +4°C w kolekcji Katedry Chemii Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu, ul. C.K. Norwida 25, 50375 Wrocław. Szczep dostępny jest również w Katedrze Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, ul. J. Chełmońskiego 37, 51-630 Wrocław.

Przykład

Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 5 g aminobaku i 15 g glukozy, wprowadza się szczep Aspergillus versicolor KCh TJ1 o sekwencji 1. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 100 mg 33-hydroksyandrost-5-en-17-onu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ tetrahydrofuranu. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 6 dni. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie chloroformem, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny heksanu i acetonu w stosunku objętościowym 2:1.

Na tej drodze otrzymuje się 48,0 mg androst-1,4-dien-3,17-dionu (wydajność 48%, według GC > 56%).

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi:

¹H NMR (600MHz) (ppm) (CDCb) δ: 0.93 (s, 3H, 18-H); 1.06-1.16 (m, 2H, 7-Hoc, 9-H); 1.25 (s, 3H, 19-H); 1.23-1.29 (m, 2H, 12-Ha, 14-H); 1.58 (tt, 1H, J=12.4, 9.2 Hz, 15-Ηβ); 1.68 (qd, 1H, J =13.3, 4.3 Hz, 11-Ηβ); 1.80 (td, 1H, J= 11.1,3.6 Hz, 8-H); 1.82-1.88 (m,2H, 11-Ha, 12-Ηβ); 1.95 (ddd, 1H, J=12.4, 8.5, 6.2 Hz, 15-Ha); 2.04-2.12 (m, 2H, 7-Ηβ, 16-Ha); 2.41 (ddd, 1H, J= 13.2, 3.7, 3.0 Hz, 6-Ha); 2.46 (dd, 1H, J = 19.4, 9.0 Hz, 16-Ηβ); 2.50 (dt, 1H, J = 13.5, 4.9 Hz, 6-Ηβ); 6.08 (br s, 1H, 4-H); 6.23 (dd, 1H, J = 10.2, 1.2 Hz, 2-H); 7.04 (d, 1H, J=10.2 Hz, 1-H).

¹³C NMR (151MHz) (ppm) (CDCb) δ: 13,92 (C-18), 18,83 (C-19), 22,02 (C-15), 22,20 (C-11), 31,30 (C-12), 32,41 (C-7), 32,65 (C-6), 35,22 (C-8), 35,74 (C-16), 43,54 (C-10), 47,79 (C-13), 50,53 (C-4), 52,40 (C-9), 124,24 (C-4), 127,82 (02), 155,43 (C-1), 168,44 (C-5), 186,33 (C-3), 220,03 (C-17).

CGGAGGACATTACTGAGTGCGGGCTGCCTCCGGGCGCCCAACCTCCCACC CGTGAATACCTAACACTGTTGCTTCGGCGGGGAACCCCCTCGGGGGCGAG CCGCCGGGGACTACTGAACTTCATGCCTGAGAGTGATGCAGTCTGAGTCTG AATATAAAATCAGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGA TGAAGAACGCAGCGAACTGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAA TCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATG CCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCG TCGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGTGTCC GGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCGACTAGGGCCGGCCGG GCGCCAGCCGACGTCTCCAACCATTTTTCTTCAGGTTGA

Sekwencja 1

Claims (4)

1. Sposób wytwarzania androst-1,4-dien-3,17-dionu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Aspergillus versicolor KCh TJ1 o sekwencji 1, następnie po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest 3β-hydroksyandrost-5-en-17-on o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 6 dni, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,2 g : 1 L.

PL 235 287 Β1

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 6 dni.