PL234234B1

PL234234B1 - Proteza z rdzeniem chitozanowym do regeneracji nerwów i sposób jej wytwarzania

Info

Publication number: PL234234B1
Application number: PL419943A
Authority: PL
Inventors: Wiesław Marcol; Adam Właszczuk; Joanna LEWIN-KOWALIK; Dariusz Wawro; Magdalena Kucharska
Original assignee: Inst Biopolimerow I Wlokien Chemicznych; Slaski Univ Medyczny W Katowicach
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2020-01-31
Also published as: PL419943A1; EP3338817A1; EP3338817B1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest proteza do regeneracji nerwów składająca się z rdzenia wykonanego z chitozanu, umieszczonego w tulei o kształcie walca wytworzonej z kopolimeru DL-laktyd/glikolid oraz sposób wytwarzania takiej protezy.

Uszkodzenia nerwów są następstwem nieszczęśliwych wypadków, resekcji guza lub niepożądanego działania operacji chirurgicznych. Efektem tych uszkodzeń jest utrata zdolności motorycznych i zanik odnerwionych mięśni. Uszkodzeniu nerwów towarzyszy często ból neuropatyczny odporny na leczenie farmakologiczne. Bez żadnego zabezpieczenia, włókna nerwowe znajdujące się w odcinku proksymalnym przerwanego nerwu spontanicznie i chaotycznie odrastają tworząc nerwiaki lub mikronerwiaki. Konieczne jest więc zabezpieczenie powstałego kikuta nerwu, przy czym idealne byłoby połączenie odtwarzające pierwotną drogę nerwową.

Do leczenia chirurgicznego uszkodzonych nerwów wykorzystywane są trzy metody: bezpośrednie połączenie końców przerwanego nerwu, autoprzeszczep oraz wykorzystanie protez do regeneracji nerwów wytworzonych z materiałów syntetycznych lub naturalnych.

Pierwszy sposób rekonstrukcji można stosować tylko do ubytków krótszych niż 1 cm, przy czym rekonstrukcja i gojenie, winny przebiegać bez napięcia nerwu oraz tkanek otaczających nerw. Przy dłuższych ubytkach wykorzystuje się autoprzeszczepy. W tym przypadku w celu uzupełnienia ubytku stosuje się tzw. „mostkowanie” fragmentem nerwu pobranego z innego miejsca ciała. Metoda ta powoduje jednak dodatkowe okaleczenie pacjenta i dlatego obecnie opracowywane są alternatywne metody leczenia np. z wykorzystaniem protez do regeneracji nerwów. Do budowy takich protez najczęściej stosowane są biomateriały resorbowalne w organizmie, np. białka i polisacharydy oraz kopolimery kwasu mlekowego w formie włókien, folii i gąbek.

Z publikacji Preparation of chitosan nanofiber tube by electrospinning. J Nanosci Nanotechnol. 2007 Mar; 7(3):852-5 znane są protezy nerwów wytworzone z nanowłókien chitozanowych pokrytych warstwą chitozanu. Nano włókna chitozanowe okazały się lepszym podłożem niż folia chitozanowa dla wzrastających komórek i mogą być wykorzystywane do produkcji tuneli wspomagających regenerację nerwów.

Z publikacji Enhanced nerve regeneration through a bilayered chitosan tube: the effect of introduction of glycine spacer into the CYIGSR sequence. J Biomed Mater Res A. 2008 Jun 15; 85(4):919-28 znane są protezy nerwów wytworzone w postaci dwuwarstwowego tunelu, składającego się z folii chitozanowej (od zewnątrz) i nanowłókien chitozanowych (wewnątrz). Z warstwą nanowłókien połączono peptydy lamininy wydłużone o fragment składający się z wielu cząsteczek glicyny. Porównując protezy złożone z samych nanowłókien o stopniu deacetylacji 78 i 93%, z folii chitozanowej o stopniu deacetylacji 93% jak i protezy dwuwa rstwowe (nanowłókna o stopniu deacetylacji 78% i 93% i folia - 93%) badacze zaobserwowali, że chociaż powrót funkcji motorycznych był opóźniony we wszystkich grupach, to funkcje sensoryczne powróciły jako pierwsze u szczurów, którym wszczepiono protezę z nanowłókien o stopniu deacetylacji 93%, zaraz po grupie u której zastosowano przeszczepy autologiczne.

Z publikacji Brain Res., Vol.128, 2005, str.1897-1910 i Microsur., 2008, str. 238-242 i str.471-479 znane są protezy w postaci rurki z chitozanu i polikwasu glikolidowego.

Z patentu US 7,135,040 znane są protezy do rekonstrukcji nerwów obwodowych w postaci plecionych, biodegradowalnych rurek z kopolimeru kwasu L-mlekowego i glikolidu (10:90) oraz chitozanu.

Z patentu US 6,090,117 znane są czasowe połączenia nerwów w postaci rurek wytworzonych z kopolimerów kwasu mlekowego wypełnionych żelem kolagenowym z dodatkiem lamininy i czynnika wzrostu, w którym z kolei zanurzone są dodatkowo włókna kolagenu.

Z patentu PL 218618 IBWCh/SUM znane są protezy do rekonstrukcji nerwów obwodowych składające się z rdzenia w kształcie walca wykonanego z mikrokrystalicznego chitozanu posiadającego 7-13 przelotowych kanałów równoległych do osi rdzenia. Rdzeń umieszczony jest w tulei wykonanej z kopolimeru DL-laktyd/glikolid lub z mikrokrystalicznego chitozanu.

Pomimo intensywnych badań nad opracowaniem protez wspomagających regenerację nerwów, nadal istnieje problem z zapewnieniem optymalnej ścieżki przez strukturę protezy dla odradzających się włókien nerwowych i co za tym idzie problem z uzyskaniem dobrej skuteczności regeneracji nerwów.

PL 234 234 B1

W związku z powyższym, celem wynalazku było opracowanie protezy do regeneracji nerwów, która umożliwiałaby szybkie i skuteczne połączenie kikutów nerwowych, zapewniając dobrą skuteczność regeneracji z jednoczesnym ograniczeniem tworzenia się mikronerwiaków, których wynikiem jest występowanie bólu neuropatycznego.

Proteza do regeneracji nerwów według wynalazku składa się z rdzenia o długości 5-50 mm umieszczonego w tulei o kształcie walca o grubości ścianki 0,04-1,0 mm i średnicy wewnętrznej 1-10 mm. Tuleja wykonana jest z kopolimeru DL-laktyd/glikolid o stosunku molowym 75/25, a rdzeń wykonany jest z chitozanu o średnim ciężarze cząsteczkowym 100-500 kDa i stopniu deacetylacji 80-98%, przy czym chitozan ma postać pełnych w środku włókien o średnicy 20-40 μm. Włókna chitozanowe stanowiące rdzeń są umieszczone w tulei równolegle do jej osi i znajdują się w stanie naprężenia, a ich ilość wynosi od 150-22500.

Ponadto rdzeń umieszczony jest w tulei tak, że tuleja wystaje poza oba końce rdzenia.

Sposób wytwarzania protezy do regeneracji nerwów obejmuje następujące etapy:

a) wytworzenie folii z kopolimeru DL-laktyd/glikolid poprzez:

- wylanie roztworu kopolimeru DL-laktyd/glikolid o stosunku molowym 75/25 w 1,4-dioksanie o stężeniu 3 % wag. na formę teflonową;

- pozostawienie wylanego roztworu w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, a następnie suszenie go w temperaturze 50°C pod ciśnieniem 0,07 MPa przez 4 doby z wytworzeniem folii;

- przepłukanie wytworzonej folii kilkukrotnie demineralizowaną wodą z gliceryną;

- liofilizowanie folii przez 24 godziny w temperaturze -25°C pod ciśnieniem 0,1 milibara;

b) wytworzenie z folii otrzymanej w etapie a) tulei o kształcie walca o grubości ścianki 0,04-1,0 mm i średnicy wewnętrznej 1-10 mm;

c) wytworzenie rdzenia protezy poprzez umieszczenie w tulei wytworzonej w etapie b) od 150 do 22500 włókien chitozanowych pełnych w środku, o średnim ciężarze cząsteczkowym 100-500 kDa, stopniu deacetylacji 80-98% i o średnicy 20-40 μm, przy czym włókna umieszcza się w stanie naprężenia i równolegle do osi tulei, a wytworzony rdzeń ma długość 5-50 mm i tuleja wystaje poza oba końce rdzenia.

Włókna chitozanowe zastosowane jako rdzeń w protezach według wynalazku pełnią funkcję rusztowania, po którym regenerujące się włókna nerwowe prawidłowo odrastają w stronę kikuta dystalnego. Zasadnicze znaczenie ma duża liczba włókien chitozanowych stanowiących rdzeń i duża ilość wolnej przestrzeni między nimi. Takie rozwiązanie daje włóknom nerwowym możliwość wyboru najdogodniejszej ścieżki przez strukturę rdzenia protezy, aż do połączenia z kikutem dystalnym. Wielkość przestrzeni, jaką mają do dyspozycji odrastające włókna nerwowe ma korzystny wpływ na skuteczność regeneracji, co potwierdziły przeprowadzone badania.

Zaletą wynalazku jest również zastosowanie do wytwarzania protez biokompatybilnych i resorbowalnych w organizmie materiałów.

Proteza według wynalazku jest zilustrowana schematycznie na figurze, która przedstawia jej widok perspektywiczny.

Wynalazek ilustrują podane poniżej przykłady.

P r z y k ł a d I

Proteza do regeneracji nerwów zilustrowana schematycznie na figurze składa się z rdzenia o długości 7 mm umieszczonego w tulei (B) o kształcie walca o grubości 0,045 mm i średnicy wewnętrznej 2 mm. Tuleja (B) wykonana jest z kopolimeru DL-laktyd/glikolid o stosunku molowym 75/25, a rdzeń wykonany jest z chitozanu o średnim ciężarze cząsteczkowym 320 kDa i stopniu deacetylacji 82%, przy czym chitozan ma postać pełnych w środku włókien (A) o średnicy 25 μm. Włókna chitozanowe (A) stanowiące rdzeń są umieszczone w tulei (B) w stanie naprężenia i równolegle do jej osi w ilości 900. Ponadto rdzeń umieszczony jest w tulei (B) tak, że tuleja (B) wystaje poza oba końce rdzenia. Pomiędzy włóknami chitozanowymi (A) znajdują się przestrzenie (C) dla wzrastających włókien nerwowych.

W innych przykładach wykonania, proteza według wynalazku składa się z tulei o średnicy wewnętrznej równej 7 mm, w której znajduje się 11000 włókien chitozanowych, lub tulei o średnicy wewnętrznej równej 10 mm, w której znajduje się 22500 włókien chitozanowych.

P r z y k ł a d II

Do wytworzenia włókien zastosowano chitozan o Mw=320 kDa i stopniu deacetylacji 82%. Chitozan rozpuszczono w 3% kwasie octowym z dodatkiem gliceryny. Włókna chitozanowe formowano w postaci ciągłej 300-włókienkowej przędzy stosując alkaliczną kąpiel koagulacyjną, kąpiele wodne, sekcje suszące, a przędzę odbierano na szpuli.

PL 234 234 B1

Przędza chitozanowa stosowana do budowy protezy charakteryzowała się równoległym ułożeniem elementarnych włókien, wytrzymałością równą 14,5 cN/tex, wydłużeniem 12%, stopniem krystaliczności 38% i zawartością popiołu 0,4%.

Roztwór kopolimeru DL-laktyd/glikolid o stosunku molowym 75/25, w 1,4-dioksanie o stężeniu 3% wag., wylano na teflonową formę i pozostawiono w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, a następnie suszono w temperaturze 50°C pod ciśnieniem 0,07 MPa przez 4 doby. Następnie błonę wielokrotnie płukano demineralizowaną wodą z gliceryną i liofilizowano przez 24 godziny w temperaturze - 25°C przy ciśnieniu 0,1 milibara. Otrzymano transparentną folię o grubości 45 μm. Następnie folię zawijano 1,5 krotnie na pręcie o średnicy odpowiadającej wewnętrznej średnicy tulei protezy, tj. 2 mm i następnie sklejano termicznie. W ten sposób otrzymano tuleję o średnicy wewnętrznej 2 mm i o długości 13 mm. Po wyschnięciu i ostudzeniu miejsca łączenia, do wnętrza tulei wsuwano pęczek włókien chitozanowych (rdzeń) o średnicy 2 mm i przycięty na odpowiednią długość, tj. 7 mm. Wspomniany pęczek składał się z 900 pełnych w środku włókien, z których każde miało średnicę 25 μm. Takie umieszczenie rdzenia było możliwe, ponieważ pęczek włókien był wystarczająco sztywny. Wystarczającą sztywność uzyskuje się z kolei dzięki procesowi formowania włókien podczas którego otrzymuje się włókna elementarne ułożone równolegle, które trzymają się razem podczas suszenia.

W ten sposób otrzymano protezę składającą się z tulei o kształcie walca o grubości ścianki 45 μm i średnicy wewnętrznej 2 mm i długości 13 mm oraz z rdzenia o długości 7 mm i średnicy 2 mm. Rdzeń umieszczony był w tulei tak, że tuleja wystawała poza oba końce rdzenia, a włókna chitozanowe stanowiące rdzeń zostały umieszczone w stanie naprężenia i równolegle do osi tulei.

Protezy poddawane były naświetlaniu promieniami UV przez 12 godzin w celu sterylizacji.

W innych przykładach wykonania, zgodnie z podanym powyżej sposobem wytworzono również tuleję o średnicy wewnętrznej równej 7 mm, w której umieszczono 11000 włókien chitozanowych, oraz tuleję o średnicy wewnętrznej równej 10 mm, w której umieszczono 22500 włókien chitozanowych.

P r z y k ł a d III

Transparentną folię z kopolimeru DL-laktyd/glikolid o stosunku molowym 75/25 przygotowano jak w przykładzie I. Z folii o grubości 45 μm wykonano tuleję o średnicy wewnętrznej 2 mm i o długości 22 mm, sposobem opisanym w przykładzie I. Następnie protezę do regeneracji nerwów w kształcie walca wewnątrz pustą poddawano naświetlaniu promieniami UV przez 12 godzin w celu sterylizacji.

Proteza do regeneracji nerwów według wynalazku znajduje zastosowanie w terapii uszkodzeń nerwów u ludzi, co zostało potwierdzone w badaniach przedklinicznych prowadzonych na zwierzętach w warunkach in vivo. Badania immunohistochemiczne z użyciem mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii konfokalnej wykazały odrost regenerujących włókien nerwowych znajdujących się w rdzeniu protezy i odtworzenie brakującego fragmentu nerwu.

Analiza statystyczna uzyskanych wyników wykazała znamienną różnicę pomiędzy średnim nasileniem autotomii w grupie, w której stosowano protezy z tuleją z folii Resomer (PLGA), w której znajdował się rdzeń składający się z równolegle ułożonych włókien chitozanowych, a średnim nasileniem autotomii w grupie, w której zastosowano samą tuleję z solą fizjologiczną.

W grupie z samą tuleją z folii Resomer (PLGA) wypełnioną solą fizjologiczną średnie nasilenie autotomii było większe niż w grupie, gdzie w tulei znajdował się rdzeń składający się z równolegle ułożonych włókien chitozanowych.

Badanie nasilenia autotomii operowanych zwierząt miało na celu skorelowanie wyników analizy morfologicznej włókien nerwowych przerastających przez różne rodzaje protez z badaniem zwierząt pod względem stopnia odczuwania bólu neuropatycznego, będącego wynikiem nieprawidłowej regeneracji włókien nerwowych. Badania wykazały, że proteza według wynalazku pozwala na odtworzenie brakującego nerwu i na radykalne zmniejszenie nasilenia bólu neuropatycznego.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Proteza do regeneracji nerwów składająca się z rdzenia o długości 5-50 mm wykonanego z chitozanu o średnim ciężarze cząsteczkowym 100-500 kDa i stopniu deacetylacji 80-98% który jest umieszczony w tulei o kształcie walca o grubości ścianki 0,04-1,0 mm i średnicy wewnętrznej 1-10 mm, wykonanej z kopolimeru DL-laktyd/glikolid o stosunku molowym 75/25, przy czym tuleja wystaje poza oba końce rdzenia, znamienna tym, że rdzeń wykonany jest: z chitozanu mającego postać pełnych w środku włókien o średnicy 20-40 μm, przy czym

PL 234 234 Β1 włókna w stanie naprężenia są umieszczone w tulei równolegle do jej osi, a ich ilość wynosi od 150 do 22500.
2. Sposób wytwarzania protezy do regeneracji nerwów, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

a) wytworzenie folii z kopolimeru DL-laktyd/glikolid poprzez:

- wylanie roztworu kopolimeru DL-laktyd/glikolid o stosunku molowym 75/25 w 1,4-dioksanie o stężeniu 3 % wag. na formę teflonową;

- pozostawienie wylanego roztworu w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, a następnie suszenie go w temperaturze 50°C pod ciśnieniem 0,07 MPa przez 4 doby z wytworzeniem folii;

- przepłukanie wytworzonej folii kilkukrotnie demineralizowaną wodą z gliceryną; liofilizowanie folii przez 24 godziny w temperaturze -25°C pod ciśnieniem 0,1 milibara;

b) wytworzenie z folii otrzymanej w etapie a) tulei o kształcie walca o grubości ścianki 0,04-1,0 mm i średnicy wewnętrznej 1-10 mm;

c) wytworzenie rdzenia protezy poprzez umieszczenie w tulei wytworzonej w etapie b) od

150 do 22500 włókien chitozanowych pełnych w środku, o średnim ciężarze cząsteczkowym 100-500 kDa, stopniu deacetylacji 80-98% i o średnicy 20-40 gm, przy czym włókna umieszcza się w stanie naprężenia i równolegle do osi tulei, a wytworzony rdzeń ma długość 5-50 mm i tuleja wystaje poza oba końce rdzenia.