PL233276B1 - Fosforoorganiczne pochodne peptydowe będące analogami N-końcowej sekwencji białka Smac, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie - Google Patents
Fosforoorganiczne pochodne peptydowe będące analogami N-końcowej sekwencji białka Smac, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanieInfo
- Publication number
- PL233276B1 PL233276B1 PL427190A PL42719018A PL233276B1 PL 233276 B1 PL233276 B1 PL 233276B1 PL 427190 A PL427190 A PL 427190A PL 42719018 A PL42719018 A PL 42719018A PL 233276 B1 PL233276 B1 PL 233276B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- ch2ch3
- organophosphorus
- protein
- peptide derivatives
- pro
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 101710156605 Diablo homolog, mitochondrial Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims abstract description 5
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 32
- -1 diaryl ester Chemical class 0.000 claims description 19
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 11
- 108091007065 BIRCs Proteins 0.000 claims description 9
- 102000055031 Inhibitor of Apoptosis Proteins Human genes 0.000 claims description 9
- 108700031544 X-Linked Inhibitor of Apoptosis Proteins 0.000 claims description 9
- 102000050257 X-Linked Inhibitor of Apoptosis Human genes 0.000 claims description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 7
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 6
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims description 6
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims description 5
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims description 5
- 150000002903 organophosphorus compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 4
- 150000003004 phosphinoxides Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 102100033189 Diablo IAP-binding mitochondrial protein Human genes 0.000 claims description 3
- 101710101225 Diablo IAP-binding mitochondrial protein Proteins 0.000 claims description 3
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 21
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 19
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfoxide Natural products CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UFPFGVNKHCLJJO-SSKFGXFMSA-N (2s)-n-[(1s)-1-cyclohexyl-2-[(2s)-2-[4-(4-fluorobenzoyl)-1,3-thiazol-2-yl]pyrrolidin-1-yl]-2-oxoethyl]-2-(methylamino)propanamide Chemical compound C1([C@H](NC(=O)[C@H](C)NC)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C=2SC=C(N=2)C(=O)C=2C=CC(F)=CC=2)CCCCC1 UFPFGVNKHCLJJO-SSKFGXFMSA-N 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- WZRFLSDVFPIXOV-LRQRDZAKSA-N (2s)-1-[(2s)-2-cyclohexyl-2-[[(2s)-2-(methylamino)propanoyl]amino]acetyl]-n-(4-phenylthiadiazol-5-yl)pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound C1([C@H](NC(=O)[C@H](C)NC)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)NC2=C(N=NS2)C=2C=CC=CC=2)CCCCC1 WZRFLSDVFPIXOV-LRQRDZAKSA-N 0.000 description 2
- HSHPBORBOJIXSQ-HARLFGEKSA-N (2s)-1-[(2s)-2-cyclohexyl-2-[[(2s)-2-(methylamino)propanoyl]amino]acetyl]-n-[2-(1,3-oxazol-2-yl)-4-phenyl-1,3-thiazol-5-yl]pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound C1([C@H](NC(=O)[C@H](C)NC)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)NC2=C(N=C(S2)C=2OC=CN=2)C=2C=CC=CC=2)CCCCC1 HSHPBORBOJIXSQ-HARLFGEKSA-N 0.000 description 2
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HXDOZKJGKXYMEW-UHFFFAOYSA-N 4-ethylphenol Chemical compound CCC1=CC=C(O)C=C1 HXDOZKJGKXYMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 2
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 2
- PUJDIJCNWFYVJX-UHFFFAOYSA-N benzyl carbamate Chemical compound NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 PUJDIJCNWFYVJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012230 colorless oil Substances 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- DTUQWGWMVIHBKE-UHFFFAOYSA-N phenylacetaldehyde Chemical compound O=CCC1=CC=CC=C1 DTUQWGWMVIHBKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N phosphoryl trichloride Chemical compound ClP(Cl)(Cl)=O XHXFXVLFKHQFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 229940076372 protein antagonist Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- VLJNHYLEOZPXFW-UHFFFAOYSA-N pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound NC(=O)C1CCCN1 VLJNHYLEOZPXFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- ZPGDWQNBZYOZTI-SFHVURJKSA-N (2s)-1-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl)pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical group OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ZPGDWQNBZYOZTI-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- LSXUTRRVVSPWDZ-MKKUMYSQSA-N (5s,8s,10ar)-n-benzhydryl-5-[[(2s)-2-(methylamino)propanoyl]amino]-3-(3-methylbutanoyl)-6-oxo-1,2,4,5,8,9,10,10a-octahydropyrrolo[1,2-a][1,5]diazocine-8-carboxamide Chemical compound O=C([C@@H]1CC[C@@H]2CCN(C[C@@H](C(N21)=O)NC(=O)[C@H](C)NC)C(=O)CC(C)C)NC(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 LSXUTRRVVSPWDZ-MKKUMYSQSA-N 0.000 description 1
- KMWSGKPLIWNTEF-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-1,3,2$l^{5}-benzodioxaphosphole 2-oxide Chemical compound C1=CC=C2OP(Cl)(=O)OC2=C1 KMWSGKPLIWNTEF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUMCWFMHZOUPDA-UHFFFAOYSA-N 2-ethylsulfanyl-1,3-benzothiazol-6-amine Chemical compound C1=C(N)C=C2SC(SCC)=NC2=C1 TUMCWFMHZOUPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYLNFGJYRKJXQE-UHFFFAOYSA-N 2-tert-butylphosphonoyl-2-methylpropane Chemical compound CC(C)(C)P(=O)C(C)(C)C RYLNFGJYRKJXQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYFCZWSWFGJODV-MIANJLSGSA-N 4-[[(1s)-2-[(e)-3-[3-chloro-2-fluoro-6-(tetrazol-1-yl)phenyl]prop-2-enoyl]-5-(4-methyl-2-oxopiperazin-1-yl)-3,4-dihydro-1h-isoquinoline-1-carbonyl]amino]benzoic acid Chemical compound O=C1CN(C)CCN1C1=CC=CC2=C1CCN(C(=O)\C=C\C=1C(=CC=C(Cl)C=1F)N1N=NN=C1)[C@@H]2C(=O)NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WYFCZWSWFGJODV-MIANJLSGSA-N 0.000 description 1
- 125000004860 4-ethylphenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- LIWMQSWFLXEGMA-WDSKDSINSA-N Ala-Val Chemical class CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N LIWMQSWFLXEGMA-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100111638 Arabidopsis thaliana BIR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700003785 Baculoviral IAP Repeat-Containing 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100021662 Baculoviral IAP repeat-containing protein 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100027522 Baculoviral IAP repeat-containing protein 7 Human genes 0.000 description 1
- PKWRMUKBEYJEIX-DXXQBUJASA-N Birinapant Chemical compound CN[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC)C(=O)N1C[C@@H](O)C[C@H]1CC1=C(C2=C(C3=CC=C(F)C=C3N2)C[C@H]2N(C[C@@H](O)C2)C(=O)[C@H](CC)NC(=O)[C@H](C)NC)NC2=CC(F)=CC=C12 PKWRMUKBEYJEIX-DXXQBUJASA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000567 Caspase 7 Proteins 0.000 description 1
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100038902 Caspase-7 Human genes 0.000 description 1
- 102100026550 Caspase-9 Human genes 0.000 description 1
- 108090000566 Caspase-9 Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101000936083 Homo sapiens Baculoviral IAP repeat-containing protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 102000040104 IAP family Human genes 0.000 description 1
- 108091069885 IAP family Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 238000006751 Mitsunobu reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019213 POCl3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical compound OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- HOPRXXXSABQWAV-UHFFFAOYSA-N anhydrous collidine Natural products CC1=CC=NC(C)=C1C HOPRXXXSABQWAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000009045 body homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000033366 cell cycle process Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- UTBIMNXEDGNJFE-UHFFFAOYSA-N collidine Natural products CC1=CC=C(C)C(C)=N1 UTBIMNXEDGNJFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- MCRSZLVSRGTMIH-UHFFFAOYSA-N ditert-butyl(chloro)phosphane Chemical compound CC(C)(C)P(Cl)C(C)(C)C MCRSZLVSRGTMIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- YCWSUKQGVSGXJO-NTUHNPAUSA-N nifuroxazide Chemical group C1=CC(O)=CC=C1C(=O)N\N=C\C1=CC=C([N+]([O-])=O)O1 YCWSUKQGVSGXJO-NTUHNPAUSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007557 optical granulometry Methods 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 150000002994 phenylalanines Chemical class 0.000 description 1
- FAIAAWCVCHQXDN-UHFFFAOYSA-N phosphorus trichloride Chemical compound ClP(Cl)Cl FAIAAWCVCHQXDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000000861 pro-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- VVWRJUBEIPHGQF-MDZDMXLPSA-N propan-2-yl (ne)-n-propan-2-yloxycarbonyliminocarbamate Chemical compound CC(C)OC(=O)\N=N\C(=O)OC(C)C VVWRJUBEIPHGQF-MDZDMXLPSA-N 0.000 description 1
- GAFKHTBZIUDDOJ-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-1-ylphosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)N1CCCC1 GAFKHTBZIUDDOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000025915 regulation of apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N sym-collidine Natural products CC1=CN=C(C)C(C)=C1 GFYHSKONPJXCDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- BZVJOYBTLHNRDW-UHFFFAOYSA-N triphenylmethanamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(N)C1=CC=CC=C1 BZVJOYBTLHNRDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JBWKIWSBJXDJDT-UHFFFAOYSA-N triphenylmethyl chloride Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(Cl)C1=CC=CC=C1 JBWKIWSBJXDJDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHJHYSFNEQGOTQ-UHFFFAOYSA-N tris(4-ethylphenyl) phosphite Chemical compound C1=CC(CC)=CC=C1OP(OC=1C=CC(CC)=CC=1)OC1=CC=C(CC)C=C1 DHJHYSFNEQGOTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
- C07F9/50—Organo-phosphines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4747—Apoptosis related proteins
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia są fosforoorganiczne pochodne peptydowe będące analogami N-końcowej sekwencji białka Smac o wzorze ogólnym 1. Zgłoszenie dotyczy również sposobu ich wytwarzania oraz zastosowania jako środków przeciwnowotworowych.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są fosforoorganiczne pochodne peptydowe będące analogami N-końcowej sekwencji białka Smac (ang. second mitochondria-derived activator of caspases) - czyli tetrapeptydu AVPI. Przedmiotem wynalazku jest również sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie w medycynie, zwłaszcza w terapii przeciwnowotworowej.
Proces apoptozy, stanowiący jeden z mechanizmów programowanej śmierci komórki, odpowiada za utrzymanie homeostazy organizmu. Jego aktywacja jest szczególnie istotna w przypadku komórek nowotworowych, które wykazują zwiększony poziom ekspresji białek inhibitorowych hamujących apoptozę (IAP, ang. inhibitor of apoptosis proteins). Choć w zależności od źródła sygnału wyróżnia się dwie ścieżki indukcji apoptozy (zewnątrzkomórkową oraz mitochondrialną), oba szlaki prowadzą do aktywacji enzymów wykonawczych apoptozy - kaspaz. Jedną ze strategii terapii przeciwnowotworowej jest projektowanie związków uwalniających apoptozę spod wpływu inhibitorów m.in. poprzez blokowanie oddziaływań domen BIR2 czy BIR3 białek inhibitorowych z kaspazą 3, 7 i 9. Spośród ośmiu białek należących do rodziny IAP, cztery są bezpośrednio zaangażowane w proces regulacji apoptozy (c-IAP1, c-IAP2, ML-IAP oraz XIAP), natomiast pozostałe są odpowiedzialne za regulację cyklu komórkowego i procesy zapalne.
Wśród związków o charakterze antagonistów białek IAP wyróżnia się monowalentne oraz biwalentne związki będące analogami motywu wiążącego AVPI wywodzącego się z N-końcowego rejonu białka SMAC. Niektóre związki o charakterze antagonistów jak LCL-161, AT 406/DEBIO 1143, GDC0917/CUDC-427 (monowalentne) czy TL-32711 (biwalentny) były przedmiotem badań klinicznych jako związki przeciwnowotworowe lub wspomagające terapię w połączeniu z innymi substancjami o aktywności przeciwnowotworowej.
Dotychczas nie opisano związków zawierających w swojej strukturze ugrupowanie fosforoorganiczne i wykazujących charakter antagonistyczny względem białek IAP.
Istotą wynalazku są fosforoorganiczne pochodne peptydowe będące analogami N-końcowej sekwencji białka Smac o wzorze ogólnym 1, w którym Ri oznacza -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, R2 oznacza -H, -CH3, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2(C6H5), -C6H4N, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH2CH2SCH3, -CH2CH2(C6H5), R3 oznacza -C(CH3)3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, -C6H5, -C6H4-3-CH3, -C6H4-5-CH3, -C6H3-2,4-(CH3)2, -O(C6H4)CH2CH3, -O(C6H4)CH(CH3)2, -O(C6H4)C(CH3)3, -O(C6H5),-O(C6H4)-5-OH, R4 oznacza -C(CH3)3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, -C6H5, -C6H4-3-CH3, -C6H4-5-CH3, -C6H3-2,4-(CH3)2; -O(C6H4)-CH2CH3; -O(C6H4)CH(CH3)2, -O(C6H4)C(CH3)3, -O(C6H5), O(C6H4)-5-OH, -OH.
W/w związki według wynalazku wykazują zdolność do oddziaływania z domeną BIR3 białka XIAP. Pochodne zawierające w swojej strukturze fosforoorganiczną pochodną fenyloalaniny charakteryzują się równocześnie parametrami kinetycznymi zbliżonymi do związków referencyjnych (GDC-0152 czy LCL-161). Pochodne te wykazują także zdolność do indukcji autoubikwitynylacji, a następnie degradacji białek cIAP1 w komórkach raka piersi MDA-MB-231.
Sposób wytwarzania fosforoorganicznych pochodnych peptydowych będących analogam i N-końcowej sekwencji białka Smac o wzorze ogólnym 1, w którym Ri oznacza -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, R2 oznacza -H, -CH3, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2(C6H5), -C6H4N, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2,
-CH2CH2SCH3, -CH2CH2(C6H5), R3 oznacza -C(CH3)3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, -C6H5, -C6H4-3-CH3, -C6H4-5-CH3, -C6H3-2,4-(CH3)2, -O(C6H4)CH2CH3, -O(C6H4)CH(CH3)2, -O(C6H4)C(CH3)3, -O(C6H5),
O(C6H4)-5-OH, R4 oznacza -C(CH3)3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, C6H5, -C6H4-3-CH3, -C6H4-5-CH3, -C6H3-2,4-(CH3)2, -O(C6H4)CH2CH3, -O(C6H4)CH(CH3)2, -O(C6H4)C(CH3)3, -O(C6H5), O(C6H4)-5-OH, -OH polega na tym, że w pierwszym etapie prowadzi się syntezę tripeptydów o sekwencji NH2-Ala-Val-Pro-OH lub NH2-Ala-Chg-Pro-OH na podłożu stałym z wykorzystaniem strategii Fmoc, następnie przeprowadza się metylację grupy α-aminowej metodą Mistunobu. Otrzymany tripeptyd NH2-Ala-Val-Pro-OH lub NH2Ala-Chg-Pro-OH rozpuszcza się w acetonitrylu lub w CH3CN i dodaje się odczynnik sprzęgający HBTU, a następnie dodaje się odpowiedni związek fosforoorganiczny zawierający wolną grupę aminową: fosfinotlenek, ester diarylowy kwasu α-aminoaralkilofosfonowego lub monoester arylowy kwasu a-aminoaralkilofosfonowego, przy czym pH ustala się na poziomie 9 z wykorzystaniem DIPEA, a reakcję prowadzi się przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie usuwa się lotne składniki mieszaniny pod zmniejszonym ciśnieniem.
Fosforoorganiczne pochodne peptydowe będące analogami N-końcowej sekwencji białka Smac o wzorze ogólnym 1, w którym Ri oznacza -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, R2 oznacza -H, -CH3,
-CH(CH3)CH2CH3, -CH2(C6H5), -C6H4N, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH2CH2SCH3,
PL 233 276 B1
-CH2CH2(C6H5), R3 oznacza -C(CH3)3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, -CeHs, -C6H4-3-CH3, -C6H4-5-CH3, -C6H3-2,4-(CH3)2, -O(C6H4)CH2CH3, -O(C6H4)CH(CH3)2, -O(C6H4)C(CH3)3, -O(C6H5), -O(C6H4)-5-OH,
R4 oznacza -C(CH3)3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, -C6H5, -C6H4-3-CH3, -C6H4-5-CH3, -C6H3-2,4-(CH3)2, -O(C6H4)CH2CH3, -O(C6H4)CH(CH3)2, -O(C6H4)C(CH3)3, -O(C6H5), -O(C6H4)-5-OH, -OH do zastosowania jako środki przeciwnowotworowe.
Zdolność związków będących przedmiotem wynalazku do oddziaływania z domeną BIR3 białka XIAP określono w teście polaryzacji fluorescencji. Efekt działania proapoptotycznego pochodnych fosforoorganicznych prowadzący do autoubikwitynylacji a następnie degradacji białka cIAP1 w komórkach raka piersi MDA-MB-231 potwierdzono w teście Western blot.
Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonania, nie ograniczając jego zakresu oraz na rysunku na którym na:
fig. 1 przedstawiono schemat otrzymywania N-metylowych pochodnych tripeptydów Ala-Val/ChgPro: (a) 20% piperydyna w DMF, 22°C; (b) o-NBS-Cl, kolidyna, NMP, 22°C; (c) Ph3P, MeOH, DIAD, THF, 22°C; (d) β-ME, DBU, NMP, 22°C; (e) TFA, 22°C; R=CH(CH3)2 lub CH(CH2)5, fig. 2 przedstawiono schemat otrzymywania fosfinotlenków aromatycznych i alifatycznych, (a) PCl3, acetonitryl, 4 godz., reflux, (b) Cbz-NH2, R2-CHO, AcOH, reflux, 4 godz., (c) 33% HBr/AcOH, 2 godz., temp. pok., (d) TFA, 2 godz., temp. pok. lub 10 ekw. mol. HCl/MeOH, 30 min., reflux, fig. 3 przedstawiono schemat syntezy estrów diarylowych kwasów a-aminoalkilofosfonowych i a-aminoarylofosfonowych. (a) PCI3, acetonitryl, 4 godz., reflux, (b) Cbz-NH2, R2-CHO, AcOH, reflux, 4 godz., (c) 33% HBr/AcOH, 2 godz., temp. pok., fig. 4 przedstawiono schemat syntezy monoestru kwasu a-amino-metylofenylo-fosfonowego. (a) toluen, 5 godz., reflux; (b) 33% HBr/AcOH, 2 godz., temp. pok., fig. 5 przedstawiono zdjęcie - analiza zdolności otrzymanych związków fosforoorganicznych do indukcji autoubikwitynylacji i degradacji białka cIAP1 w liniach komórek MDA-MB-231. C - kontrola DMSO (0.1%), G - kontrola z wykorzystaniem związku GDC-0152 (10 μM), F - kontrola z wykorzystaniem związku LCL-161 (10 μM), 17, 18, 50 oraz 51 (10 μM) - wybrane pochodne fosforoorganiczne; a - próbki pobrane po 15 min. inkubacji, b - próbki pobrane po 120 min. inkubacji.
P r z y k ł a d 1. Otrzymywanie tripeptydów NH2-Ala-Val-Pro-OH oraz NH2-Ala-Chg-Pro-OH oraz metylacja N-końcowej grupy aminowej (fig. 1).
N-metylowane pochodne dwóch tripeptydów o sekwencjach: N-Me-Ala-Val-Pro-OH (1) oraz N-Me-Ala-Chg-Pro-OH (2) przeznaczonych do dalszej modyfikacji w celu otrzymania pochodnych fosforoorganicznych otrzymano techniką syntezy peptydów na podłożu stałym z wykorzystaniem strategii Fmoc. W pierwszym etapie, żywicę 2-Cl-Trt zmodyfikowano Fmoc-Pro-OH stosując 1,2-krotny nadmiar molowy aminokwasu. Po zablokowaniu wolnych miejsc wiążących (MeOH, 2 x 30 min.) określono stopień obsadzenia żywicy (0,88 mmol/g). Grupę Fmoc za każdym razem odblokowywano z użyciem 20% roztworu piperydyny w MeOH. Aminokwasy sprzęgano z wykorzystaniem HBTU jako odczynnika sprzęgającego (3 równoważniki molowe) oraz DIPEA (6 równoważników molowych) w DMF. Reakcje sprzęgania monitorowano stosując test Keisera. Po zakończonej syntezie zmodyfikowano N-końcową grupę aminową Ala poprzez przyłączenie grupy metylowej stosując reakcję Mitsunobu. Modyfikacja wymagała zamiany grupy blokującej Fmoc z N-końca Ala, na o-NBS, a następnie metylację drugorzędowej aminy z wykorzystaniem MeOH jako donora grupy metylowej. Ostatnim etapem było odblokowanie grupy o-NBS. Schemat reakcji wykonanych w procesie metylacji przedstawia Schemat na fig. 1. Po zakończonej syntezie produkt odcięto od żywicy (2 godz., temp. pok., TFA), a następnie oczyszczono z wykorzystaniem techniki HPLC, zliofilizowano i przechowywano w -20°C. Obecność peptydów potwierdzono wykonując HRMS (1: m/z 300.1923/300.1911 (M+H)+; 2: m/z 340.2236/340.2239 (M+H)+).
P r z y k ł a d 2. Sposób wytwarzania (S)-N-((di-tert-butylofosforylo)metylo)-1-((S)-3-metylo-2-((S)-2-(metylamino)propanamido)butanoylo)pirolidyno-2-karboksyamidu (związek nr 3, fig. 2).
Etap 1. Otrzymywanie trytyloaminy. Do schłodzonego (0°C) roztworu chlorku amonu (0.2 mola) w 25% wodnym amoniaku wkrapla się chlorek trytylu rozpuszczony w 200 ml toluenu (2 godziny). Po wkropleniu chłodzi się mieszaninę reakcyjną przez godzinę (0°C) a następnie prowadzi przez noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia przeprowadzi się ekstrakcję wodą (do zobojętnienia pH), a frakcję organiczną suszy nad siarczanem sodu, odparowuje na wyparce rotacyjnej, a następnie prowadzi krystalizację w heksanie. Otrzymany osad odsącza się pod próżnią i osusza.
Etap 2. Otrzymywanie trytyloiminy. Aminę (przygotowanie opisane w Etapie 1 (0.1 mola) i formaldehyd (0.4 mola) zalewa się toluenem (200 ml) i pozostawia na mieszadle magnetycznym przez noc.
PL 233 276 B1
Następnie, mieszaninę poddaje się ekstrakcji, suszy nad siarczanem sodu, a następnie odparowuje się lotne składniki na wyparce obrotowej. Osad sączy się przemywając eterem naftowym.
Etap 3. Otrzymywanie fosfinotlenku di-tertbutylowego. W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 0,3 g (0.1661 mmol) di-tertbutylochlorofosfiny i 50 ml schłodzonego wodnego roztworu HCl (1 M). Reakcję prowadzi się przez noc w temperaturze pokojowej. Po 24 godzinach usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt przemywa się toluenem, a następnie bez oczyszczania używa do dalszych etapów syntezy.
Etap 4. Otrzymywanie N-((di-tert-butylofosforylo)metylo)-1,1,1-trifenylometano aminy. Fosfinotlenek którego sposób przygotowania opisano w Etapie 3 (1 mmol) oraz trytyloiminę opisaną w Etapie 2 (1 mmol) rozpuszcza się w toluenie (50 ml). Mieszaninę ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną przez 8 h, a następnie usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej.
Etap 5. Otrzymywanie (di-tert-butylfosforylo)metano aminy. Związek otrzymany w etapie 4 (0.3 mmol) umieszcza się w kolbie okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne, a następnie zalewa się roztworem HCl (3 mmol) w MeOH. Mieszaninę ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną przez 30 minut, a następnie usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Otrzymany surowy produkt używa się w kolejnym etapie.
Etap 6. Otrzymywanie (S)-N-((di-tert-butylofosforylo)metylo)-1-((S)-3-metylo-2-((S)-2-(metyloamino)propanamido)butanoylo)pirolidyno-2-karboksyamidu. Tripeptyd N-Me-Ala-Val-Pro (0.033 mmol) umieszcza się w szklanej buteleczce wyposażonej w mieszadło magnetyczne i rozpuszcza w CH3CN (2 ml). Do rozpuszczonego peptydu dodaje się odczynnik sprzęgający HBTU (0.035 mmol) a następnie (di-tertbutylofosforylo)metanoaminę (0.04 mmol). Następnie ustala się pH na poziomie 9 z wykorzystaniem DIPEA. Reakcję prowadzi się przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Produkt oczyszcza się z wykorzystaniem techniki HPLC w układzie woda/acetonitryl, 0.05% TFA (gradient 0-100% acetonitrylu, 15 min., Rt = 10.087 min.). Obecność produktu potwierdzono techniką spektroskopii mas (Mcalcd ([M+H]+)/Mfound: 473.3251/473.3247).
W sposób analogiczny, przy użyciu odpowiednich aldehydów, otrzymuje się związki o symbolach 4-10.
Pochodne fosfinotlenków opisane symbolami 11-31 przygotowano w sposób analogiczny, jedyną różnicą w syntezie był Etap 5, który przeprowadzono prowadząc reakcję z kwasem trifluoorooctowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
P r z y k ł a d 3. Sposób wytwarzania fosfonianu bis(4-etylofenylo) 1-((S)-1-((S)-3-metylo-2-((S)-2-(metyloamino)propanamido)butanoylo)pirolidyno-2-karboksyamido)etylowego (związek nr 32, fig. 3).
Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój(4-etylofenylowego). Do kolby okrągłodennej odważa się 4-etylofenol (30 mmol) i rozpuszcza się go w acetonitrylu (50 ml), a następnie dodaje POCl3 (10 mmol). Całość ogrzewa się w temperaturze wrzenia przez 6 h, po czym lotne składniki mieszaniny usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany produkt w postaci bezbarwnego oleju używa się w kolejnym etapie bez oczyszczania.
Etap 2. Otrzymywanie karbaminianu benzylo (1-(bis(4-etylofenoksy)fosforylo)etylowego. Do kolby okrągłodennej odważa się aldehyd octowy (10 mmol), karbaminian benzylu (10 mmol) oraz otrzymany w etapie 1 fosforyn. Całość rozpuszcza się w lodowatym kwasie octowym i ogrzewa się w temperaturze 80°C przez 2 godziny, po czym lotne składniki mieszaniny usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany produkt w postaci bezbarwnego oleju rozpuszcza się w metanolu i pozostawia do krystalizacji w temperaturze -20°C. Końcowy produkt w postaci białego osadu odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi, po czym używa się w następnym etapie.
Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku fosfonianu bis(4-etylofenylo) (1-amino)etylowego. Produkt uzyskany w etapie 2 (5 mmol) rozpuszcza się w 33% roztworze kwasu bromowodorowego w kwasie octowym (5 ml) i reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 h. Lotne składniki mieszaniny usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymany olej zalewa się eterem dietylowym i pozostawia w temperaturze 4°C w celu krystalizacji. Otrzymany produkt w postaci białego osadu suszy się na powietrzu do stałej wagi i używa w kolejnym etapie.
Etap 4. Otrzymywanie fosfonianu bis(4-etylofenylo) 1-((S)-1-((S)-3-metylo-2-((S)-2-(metyloamino)propanamido)butanoylo)pirolidyno-2-karboksyamido)etylowego. Tripeptyd N-Me-Ala-Val-Pro (0.15 mmol) umieszcza się w szklanym naczyniu wyposażonym w dipol magnetyczny i rozpuszcza w acetonitrylu (4 ml). Do rozpuszczonego peptydu dodaje się odczynnik sprzęgający HBTU (0.18 mmol), a następnie produkt otrzymany w etapie 3 (0.18 mmol). Następnie ustala się pH na poziomie 9 z wykorzystaniem DIPEA. Reakcję prowadzi się przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie usuwa się
PL 233 276 B1 lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Produkt oczyszcza się z wykorzystaniem techniki HPLC w układzie woda/acetonitryl, 0.05% TFA (gradient 0-100% acetonitrylu, 15 min., Rt = 13.6 min.). Obecność produktu potwierdza się techniką spektroskopii mas (Mteoretyczna ([M+H]+)/Mobserwowana: 615.33 11/615.5).
Analogicznie prowadzono syntezę związków 33-53.
P r z y k ł a d 4. Sposób wytwarzania fosfonianu 2-hydroksyfenylo wodoro (1-((S)-1-(metylo-L-alanyloL-walilo)pirolidyno-2-karboksyamido)-2-fenyloetylowego (związek nr 54)
Etap 1. Synteza karbaminianu benzylo 1-(hydroksy(2-hydroksyfenoksy)fosforylo)-2-fenyloetylowego. W suchym toluenie rozpuszcza się karbaminian benzylu (5.75 mmol) oraz o-fenylenochlorofosforan (5.75 mmol). Następnie wkrapla się aldehyd fenylooctowy (5.75 mmol) w czasie 10 min. Reakcję prowadzi się przez 5 godzin ogrzewając mieszaninę pod chłodnicą zwrotną w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika. Następnie mieszaninę studzi się i usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej, a otrzymany surowy produkt używa się w następnym etapie.
Etap 2. Synteza fosfonianu 2-hydroksyfenylo wodoru 1-amino-2-fenyloetylowego. W kolbie umieszcza się surowy produkt otrzymany w etapie 1 i dodaje 33% roztwór kwasu bromowodorowego w kwasie octowym (15 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a następnie usuwa się lotne składniki mieszaniny pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskany produkt w postaci oleju rozpuszcza się w eterze dietylowym i pozostawia do krystalizacji w temperaturze 4°C.
Etap 3. Otrzymywanie fosfonianu 2-hydroksyfenylo wodoro (1-((S)-1-(metylo-L-alanylo-L-walilo)pirolidyno-2-karboksyamido)-2-fenyloetylowego. Tripeptyd V-Me-Ala-Val-Pro (0.034 mmol) umieszcza się w szklanym naczyniu wyposażonym w dipol magnetyczny i rozpuszcza w acetonitrylu (2 ml). Do rozpuszczonego peptydu dodaje się odczynnik sprzęgający HBTU (0.040 mmol), a następnie dodaje związek otrzymany w etapie 2 (0.040 mmol). Następnie ustala się pH na poziomie 9 z wykorzystaniem DIPEA. Reakcję prowadzi się przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie usuwa się lotne składniki mieszaniny pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt oczyszcza się z wykorzystaniem techniki HPLC w układzie woda/acetonitryl, 0.05% TFA (gradient 0-100% acetonitrylu, 15 min., Rt = 10.3 min.). Obecność produktu potwierdzono techniką spektroskopii mas (Mteoretyczna ([M+H]+)/Mobserwowana: 575.2629/575.2625).
W sposób analogiczny otrzymuje się związek 55 stosując w etapie 3 tripeptyd Me-Ala-Chg-Pro-OH. P r z y k ł a d 5. Analiza oddziaływań otrzymanych fosforoorganicznych pochodnych peptydowych z domeną BIR3 białka XIAP.
Potencjał związków fosforoorganicznych stanowiących istotę wynalazku jako antagonistów białek inhibitorowych apoptozy analizowano z zastosowaniem techniki polaryzacji fluorescencji, umożliwiającej analizę oddziaływań białko-ligand poprzez pomiar intensywności polaryzacji światła emitowanego przez ligand zmodyfikowany kowalencyjnie fluoroforem (sonda molekularna o sekwencji H2N-Ala-ValPro-Dpm-Ala-Lys(FL)-Lys-CONH2, Xex = 485 nm, Xem = 530 nm). W wyniku oddziaływania z miejscem wiążącym białka sonda wykazuje mniejszą możliwość rotacji grupy fluoroforu, dlatego emitowane światło jest w większym stopniu spolaryzowane niż w przypadku pomiaru dla wolnej sondy w roztworze lub sondy w układzie białko-antagonista współzawodniczący o miejsce wiążące.
W pierwszym etapie testów, wyznaczono stałą dysocjacji Kd białka oraz sondy znakowanej fluorescencyjne. W tym celu, na 384-dołkowej czarnej polistyrenowej płytce przygotowano rozcieńczenia białka BIR3 XIAP (od 2.5 pM do 0.0763 nM) w buforze polaryzacyjnym (bufor fosforanowy, pH 7.5, z dodatkiem γ-globuliny (100 pg/ml) oraz NaN3 (0.02% v/v). Następnie, do studzienek dodano roztwór sondy fluorescencyjnej (końcowe stężenie 2 nM). Po 30 min. inkubacji w temperaturze pokojowej z wykorzystaniem czytnika mikropłytek odczytano wartości polaryzacji, które posłużyły do wyznaczenia wartości Kd wynoszącej 49.85 nM.
W kolejnym etapie zbadano potencjał otrzymanych pochodnych fosforoorganicznych do oddziaływania z domeną BIR3 białka XIAP. W tym celu, w studzienkach mikropłytki przygotowano rozcieńczenia otrzymanych peptydowych fosforoorganicznych funkcjonalnych analogów białka XIAP, tetrapeptydu Ala-Val-Pro-Trp jako kontroli pozytywnej oraz komercyjnie dostępnych związków o potwierdzonej zdolności do oddziaływań z domeną BIR3 w buforze polaryzacyjnym (stężenia od 50 pM do 0.0537 nM). Następnie do roztworów dodano roztwór domeny BIR3 białka XIAP w buforze polaryzacyjnym (50 nM). Po 15 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej dodano roztwór sondy fluorescencyjnej (2 nM). W teście ze względu na rozpuszczalność związków fosforoorganicznych stężenie DMSO było stałe i wynosiło 1.4% (v/v). Prowadzono inkubację przez 30 min. w temperaturze pokojowej, a następnie z wykorzystaniem czytnika mikropłytek odczytano wartości polaryzacji, które posłużyły do wyznaczenia
PL 233 276 B1 parametrów kinetycznych opisujących oddziaływanie białko-ligand (EC50 oraz Ki). Wartości polaryzacji posłużyły do określenia % inhibicji, którego zależność od stężenia związku pozwoliła na wyznaczenie wartości EC50 (do obliczeń wykorzystano model czteroparametryczny ze zmienną wartością nachylenia). Wartość Ki wyznaczono przy użyciu narzędzia sieciowego opracowanego przez Nikolovska-Coleska et al. Wartości EC50 oraz Ki wyznaczone na postawie wartości polaryzacji fluorescencji zawarto w Tabeli 1.
P r z y k ł a d 6. Zdolność wybranych pochodnych fosforoorganicznych do indukcji autoubikwitynylacji białka cIAP1.
Pochodne o numerach 17, 18, 50 oraz 51 charakteryzujące się najlepszymi parametrami kinetycznymi wyznaczonymi dzięki zastosowanej technice polaryzacji fluorescencji przeanalizowano pod kątem zdolności do indukcji autoubikwitynylacji i degradacji białka cIAP1. W tym celu prowadzono hodowlę komórek linii MDA-MB-231 (ludzki nowotwór piersi) w medium RPMI-1640 z dodatkiem L-glutaminy (2 mM), pirogronianu sodu (1 mM), serum płodowego z cieląt (10%) oraz streptomycyny i penicyliny (oba antybiotyki w stężeniu 100 ąg/ml). Komórki hodowano w 37°C w wilgotnej atmosferze nasyconej 5% CO2. Komórki poddano trypsynizacji, zliczono i wysiano na 50 mm szalkach Petriego. Po całonocnej inkubacji, medium zmieniono na świeże, zawierające badane związki w stężeniu 10 mM lub 0.1% (v/v) DMSO. Następnie, komórki przemyto buforem fosforanowym i poddano lizie z wykorzystaniem bufom RIPA zawierającego inhibitory proteaz i fosfataz. Lizaty zwirowano (4°C, 15 min., 16000 g), zebrane supernatanty poddano analizie Western blot.
Lizaty komórkowe rozdzielono elektroforetycznie (SDS-PAGE, 4-12%, 25 ąg/studzienkę) w warunkach redukujących. Następnie wykonano elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową. Po zablokowaniu membrany w 5% roztworze mleka otłuszczonego w buforze fosforanowym z dodatkiem 0.05% Tween-20 (PBS-T, 1 godz., temp. pok.) membranę wypłukano trzykrotnie w buforze PBS-T (5 min., temp. pok.). Następnie membranę inkubowano z króliczymi monoklonalnymi przeciwciałami anty-cIAP1 IgG (1:1000, 0.5% mleko odtłuszczone w PBS-T) przez noc w 4°C. W kolejnym kroku, membranę ponownie trzykrotnie wypłukano i inkubowano z roztworem mysich przeciwciał anty-króliczych znakowanych peroksydazą chrzanową (1:1000, 0.5% mleko otłuszczone w PBS-T). Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej membranę wypłukano trzykrotnie w buforze PBS-T. Wizualizację wykonano po inkubacji z chemiluminescencyjnym substratem przy zastosowaniu systemu obrazowania molekularnego wyposażonego w kamerę CCD. Jako kontrolę obciążenia w teście Western blot wykorzystano przeciwciała specyficzne wobec dehydrogenazy fosforanowo-aldehydowej 3 (GAPDH). W tym celu, membranę po odpłukaniu chemiluminescencyjnego substratu buforem PBS-T inkubowano z mysimi przeciwciałami anty-GAPDH (1:1000, 0.5% mleko odtłuszczone w PBS-T). Po godzinnej inkubacji w 37°C membranę wypłukano trzykrotnie w buforze PBS-T i inkubowano z przeciwciałami anty-mysimi skoniugowanymi z peroksydazą chrzanową (1:5000, 0.5% mleko otłuszczone w PBS-T). Po wypłukaniu membrany, wizualizację przeprowadzono po dodaniu chemiluminescencyjnego substratu (Rysunek 1). Związki charakteryzują się zdolnością do indukcji autoubikwitynylacji a następnie degradacji w proteasomie białka cIAP1. Degradacja białka cIAP1 pozwala na obniżenie jego stężenia w komórce, a zatem zmniejszenie efektu inhibitorowego wobec kaspaz regulujących proces apoptozy.
Claims (5)
- Zastrzeżenia patentowe1. Fosforoorganiczne pochodne peptydowe będące analogami N-końcowej sekwencji białkaSmac o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza -CH(CH3)2, - CH(CH2)5, R2 oznacza -H, -CH3, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2(C6H5), -C6H4N, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2,-CH2CH2SCH3, -CH2CH2(C6H5), R3 oznacza -C(CH3)3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, -C6H5, -C6H4-3-CH3, -C6H4-5-CH3, -C6H3-2,4-(CH3)2, -O(C6H4)CH2CH3, -O(C6H4)CH(CH3)2, -O(C6H4)C(CH3)3, -O(C6H5), -O(C6H4)-5-OH, R4 oznacza -C(CH3)3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, -C6H5, -C6H4-3-CH3, -C6H4-5-CH3, -C6H3-2,4-(CH3)2; -O(C6H4)CH2CH3; -O(C6H4)CH(CH3)2, -O(C6H4)C(CH3)3, -O(C6H5), O(C6H4)-5-OH, -OH.
- 2. Sposób wytwarzania fosforoorganicznych pochodnych peptydowych będących analogamiW-końcowej sekwencji białka Smac o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, R2 oznacza -H, -CH3, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2(C6H5), -C6H4N, -CH2CH3,-CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH2CH2SCH3, -CH2CH2(C6H5), R3 oznacza -C(CH3)3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, -C6H5, -C6H4-3-CH3, -C6H4-5-CH3, -C6H3-2,4-(CH3)2, -O(C6H4)CH2CH3, -O(C6H4)PL 233 276 B1-CH(CH3)2, -O(C6H4)C(CH3)3, -O(C6H5), O(C6H4)-5-OH, R4 oznacza -C(CH3)3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, C6H5, -C6H4-3-CH3, -C6H4-5-CH3, -C6H3-2,4-(CH3)2, -O(C6H4)CH2CH3, -O(C6H4)-CH(CH3)2, -O(C6H4)C(CH3)3, -O(C6H5), O(C6H4)-5-OH, -OH, znamienny tym, że w pierwszym etapie prowadzi się syntezę tripeptydów o sekwencji NH2-Ala-Val-Pro-OH lub NH2-AlaChg-Pro-OH na podłożu stałym z wykorzystaniem strategii Fmoc, następnie przeprowadza się metylację grupy α-aminowej metodą Mistunobu, otrzymany tripeptyd NH2-Ala-Val-Pro-OH lub NH2-Ala-Chg-Pro-OH rozpuszcza się w acetonitrylu lub w CH3CN i dodaje się odczynnik sprzęgający HBTU, a następnie dodaje się odpowiedni związek fosforoorganiczny zawierający wolną grupę aminową: fosfinotlenek, ester diarylowy kwasu a-aminoaralkilofosfonowego lub monoester arylowy kwasu a-aminoaralkilofosfonowego, przy czym pH ustala się na poziomie 9 z wykorzystaniem DIPEA, a reakcję prowadzi się przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie usuwa się lotne składniki mieszaniny pod zmniejszonym ciśnieniem.
- 3. Fosforoorganiczne pochodne peptydowe będące analogami W-końcowej sekwencji białkaSmac o wzorze ogólnym 1, w którym R1 oznacza -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, R2 oznacza -H, -CH3, -CH(CH3)CH2CH3, -CH2(C6H5), -C6H4N, -CH2CH3, -CH(CH3)2, -CH2CH(CH3)2, -CH2CH2SCH3, -CH2CH2(C6H5), R3 oznacza -C(CH3)3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, -C6H5, -C6H4-3-CH3, -C6H4-5-CH3, -C6H3-2,4-(CH3)2, -O(C6H4)CH2CH3, -O(C6H4)CH(CH3)2, -O(C6H4)C(CH3)3, -O(C6H5),-O(C6H4)-5-OH, R4 oznacza -C(CH3)3, -CH(CH3)2, -CH(CH2)5, -C6H5, -C6H4-3-CH3, -C6H4-5-CH3, -C6H3-2,4-(CH3)2, -O(C6H4)CH2CH3, -O(C6H4)CH(CH3)2, -O(C6H4)C(CH3)3, -O(C6H5),-O(C6H4)-5-OH, -OH do zastosowania jako środki przeciwnowotworowe.
- 4. Fosforoorganiczne pochodne peptydowe do zastosowania według zastrz. 3, znamienne tym, że zastosowanie jako środki przeciwnowotworowe obejmuje działanie antagonistyczne wobec domeny BIR3 białka XIAP.
- 5. Fosforoorganiczne pochodne peptydowe do zastosowania według zastrz. 3, znamienne tym, że zastosowanie jako środki przeciwnowotworowe obejmuje działanie indukujące autoubikwitynylację oraz degradację białka cIAP1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL427190A PL233276B1 (pl) | 2018-09-27 | 2018-09-27 | Fosforoorganiczne pochodne peptydowe będące analogami N-końcowej sekwencji białka Smac, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL427190A PL233276B1 (pl) | 2018-09-27 | 2018-09-27 | Fosforoorganiczne pochodne peptydowe będące analogami N-końcowej sekwencji białka Smac, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL427190A1 PL427190A1 (pl) | 2019-04-23 |
| PL233276B1 true PL233276B1 (pl) | 2019-09-30 |
Family
ID=66167901
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL427190A PL233276B1 (pl) | 2018-09-27 | 2018-09-27 | Fosforoorganiczne pochodne peptydowe będące analogami N-końcowej sekwencji białka Smac, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL233276B1 (pl) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6608026B1 (en) * | 2000-08-23 | 2003-08-19 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Apoptotic compounds |
| US6992063B2 (en) * | 2000-09-29 | 2006-01-31 | The Trustees Of Princeton University | Compositions and method for regulating apoptosis |
-
2018
- 2018-09-27 PL PL427190A patent/PL233276B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL427190A1 (pl) | 2019-04-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Barlos et al. | Efficient" one-pot" synthesis of N-tritylamino acids | |
| US4337201A (en) | Phosphinylalkanoyl substituted prolines | |
| NO171788B (no) | Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive fosfinsyrederivater | |
| JP5688826B2 (ja) | カルパイン活性検出蛍光プローブ | |
| US5750555A (en) | Bis-indolyl maleinimide or indolopyrrolo carbazole containing an amino acid as PKC inhibitors | |
| EP1259520A2 (en) | Novel purines | |
| Lukashuk et al. | Introduction of chiral 2-(aminoalkyl) substituents into 5-amino-1, 3-oxazol-4-ylphosphonic acid derivatives and their use in phosphonodipeptide synthesis | |
| Miccoli et al. | Phosphotyrosine prodrugs: design, synthesis and anti-STAT3 activity of ISS-610 aryloxy triester phosphoramidate prodrugs | |
| JP6026499B2 (ja) | 二機能性ヒドロキシ−ビスホスホン酸誘導体 | |
| IE883321L (en) | Novel derivatives of l-proline, their preparation and their biological uses | |
| AU2441701A (en) | Purine derivatives | |
| AU2002310004B2 (en) | Uronium and immonium salts for peptide coupling | |
| VanderMeijden et al. | Synthesis and application of photoproline-a photoactivatable derivative of proline | |
| AU2002310004A1 (en) | Uronium and immonium salts for peptide coupling | |
| PL233276B1 (pl) | Fosforoorganiczne pochodne peptydowe będące analogami N-końcowej sekwencji białka Smac, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie | |
| Dziełak et al. | A three-component Mannich-type condensation leading to phosphinic dipeptides—extended transition state analogue inhibitors of aminopeptidases | |
| CN110028508B (zh) | 一种抗肿瘤的重氮双环类细胞凋亡蛋白抑制剂 | |
| US4384123A (en) | Phosphinylalkanoyl substituted prolines | |
| JPS61100564A (ja) | ペプチドで置換された複素環免疫促進剤 | |
| Breuer et al. | Novel amino acid derivatives. Preparation and properties of aminoacylphosphonates and amino hydroxyimino phosphonates | |
| Garbay-Jaureguiberry et al. | Improved synthesis of [p-phosphono and p-sulfo] methylphenylalanine. Resolution of [p-phosphono-, p-sulfo-, p-car☐ y-and pN-hydroxycar☐ amido-] methylphenylalanine. | |
| De León‐Rodríguez et al. | Improved synthesis of DOTA tetraamide ligands for lanthanide (III) ions: A tool for increasing the repertoire of potential PARACEST contrast agents for MRI and/or fluorescent sensors | |
| JPH11500433A (ja) | セリンプロテアーゼ阻害剤 | |
| Robillard et al. | Solid-phase synthesis of peptide-platinum complexes using platinum-chelating building blocks derived from amino acids | |
| Jiménez-Andreu et al. | Synthesis and biological activity of dehydrophos derivatives |