PL232906B1 - Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL4 - Google Patents
Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL4Info
- Publication number
- PL232906B1 PL232906B1 PL415947A PL41594716A PL232906B1 PL 232906 B1 PL232906 B1 PL 232906B1 PL 415947 A PL415947 A PL 415947A PL 41594716 A PL41594716 A PL 41594716A PL 232906 B1 PL232906 B1 PL 232906B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- strain
- lactobacillus plantarum
- plantarum
- lactobacillus
- atcc
- Prior art date
Links
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 title claims description 131
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 title claims description 106
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 title claims description 106
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title description 21
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 47
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 37
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 22
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 20
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 17
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 14
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 13
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 13
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 12
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 11
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 11
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 10
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 10
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 9
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 9
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 8
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 7
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 7
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 7
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 102000003940 Occludin Human genes 0.000 description 6
- 108090000304 Occludin Proteins 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 241000273265 Clostridioides difficile ATCC 9689 = DSM 1296 Species 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102100025255 Haptoglobin Human genes 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 5
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 5
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 5
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O vancomycin(1+) Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C([O-])=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)[NH2+]C)[C@H]1C[C@](C)([NH3+])[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-O 0.000 description 5
- 108010027843 zonulin Proteins 0.000 description 5
- 241000943303 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Species 0.000 description 4
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 4
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 4
- HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N meso ribitol Natural products OCC(O)C(O)C(O)CO HEBKCHPVOIAQTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000282 metronidazole Drugs 0.000 description 4
- VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N metronidazole Chemical compound CC1=NC=C([N+]([O-])=O)N1CCO VAOCPAMSLUNLGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 4
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 4
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PKYCWFICOKSIHZ-UHFFFAOYSA-N 1-(3,7-dihydroxyphenoxazin-10-yl)ethanone Chemical compound OC1=CC=C2N(C(=O)C)C3=CC=C(O)C=C3OC2=C1 PKYCWFICOKSIHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-n-(5-methyl-1,2-oxazol-3-yl)benzenesulfonamide;5-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methyl]pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound O1C(C)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1.COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241001360526 Escherichia coli ATCC 25922 Species 0.000 description 3
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 201000009840 acute diarrhea Diseases 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 229960005361 cefaclor Drugs 0.000 description 3
- QYIYFLOTGYLRGG-GPCCPHFNSA-N cefaclor Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3C(=C(Cl)CS[C@@H]32)C(O)=O)=O)N)=CC=CC=C1 QYIYFLOTGYLRGG-GPCCPHFNSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 208000019902 chronic diarrheal disease Diseases 0.000 description 3
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 3
- KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N clindamycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@H](C)Cl)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 KDLRVYVGXIQJDK-AWPVFWJPSA-N 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 3
- 230000007358 intestinal barrier function Effects 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 description 3
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 3
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 3
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 3
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 2
- 238000008998 Catalase assay kit Methods 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000021028 berry Nutrition 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 229960002227 clindamycin Drugs 0.000 description 2
- 229940047766 co-trimoxazole Drugs 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002828 disc diffusion antibiotic sensitivity testing Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 208000024386 fungal infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N hydroquinone O-beta-D-glucopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-RMPHRYRLSA-N 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 210000005027 intestinal barrier Anatomy 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUCIJNAGGSZNQT-JHSLDZJXSA-N (R)-amygdalin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H](C#N)C=2C=CC=CC=2)O1 XUCIJNAGGSZNQT-JHSLDZJXSA-N 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VBUYCZFBVCCYFD-JJYYJPOSSA-N 2-dehydro-D-gluconic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(=O)C(O)=O VBUYCZFBVCCYFD-JJYYJPOSSA-N 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 206010004016 Bacterial diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N Beta-Lactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N D-Arabitol Natural products OC[C@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-NGQZWQHPSA-N 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N D-Fructose Natural products OC[C@H]1OC(O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-VRPWFDPXSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N D-arabinitol Chemical compound OC[C@@H](O)C(O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-SOOFDHNKSA-N D-ribopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 206010017964 Gastrointestinal infection Diseases 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 1
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-IMJSIDKUSA-N L-arabinitol Chemical compound OC[C@H](O)C(O)[C@@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N L-ribopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-OWMBCFKOSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- IABBAGAOMDWOCW-UHFFFAOYSA-N Nicametate citrate Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=CN=C1 IABBAGAOMDWOCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DKXNBNKWCZZMJT-UHFFFAOYSA-N O4-alpha-D-Mannopyranosyl-D-mannose Natural products O=CC(O)C(O)C(C(O)CO)OC1OC(CO)C(O)C(O)C1O DKXNBNKWCZZMJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HLCFGWHYROZGBI-JJKGCWMISA-M Potassium gluconate Chemical compound [K+].OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O HLCFGWHYROZGBI-JJKGCWMISA-M 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N Salicin Natural products O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1)c1c(CO)cccc1 NGFMICBWJRZIBI-JZRPKSSGSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N Xylitol Natural products OCCC(O)C(O)C(O)CCO TVXBFESIOXBWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WISUUJSJSA-N aldehydo-L-xylose Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N alpha-salicin Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940089837 amygdalin Drugs 0.000 description 1
- YZLOSXFCSIDECK-UHFFFAOYSA-N amygdalin Natural products OCC1OC(OCC2OC(O)C(O)C(O)C2O)C(O)C(O)C1OC(C#N)c3ccccc3 YZLOSXFCSIDECK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940040526 anhydrous sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229960000271 arbutin Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940015062 campylobacter jejuni Drugs 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N doxycycline monohydrate Chemical compound O.O=C1C2=C(O)C=CC=C2[C@H](C)[C@@H]2C1=C(O)[C@]1(O)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@H](N(C)C)[C@@H]1[C@H]2O XQTWDDCIUJNLTR-CVHRZJFOSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- YGHHWSRCTPQFFC-UHFFFAOYSA-N eucalyptosin A Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(OC(C#N)C=2C=CC=CC=2)OC(CO)C(O)C1O YGHHWSRCTPQFFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 210000005095 gastrointestinal system Anatomy 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 1
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 1
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960002160 maltose Drugs 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-ZFYZTMLRSA-N methyl alpha-D-glucopyranoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HOVAGTYPODGVJG-ZFYZTMLRSA-N 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N methyl beta-galactoside Natural products COC1OC(CO)C(O)C(O)C1O HOVAGTYPODGVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- BJRNKVDFDLYUGJ-UHFFFAOYSA-N p-hydroxyphenyl beta-D-alloside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CC=C(O)C=C1 BJRNKVDFDLYUGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229960003975 potassium Drugs 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004224 potassium gluconate Substances 0.000 description 1
- 235000013926 potassium gluconate Nutrition 0.000 description 1
- 229960003189 potassium gluconate Drugs 0.000 description 1
- GSFHMOMWXNDPMM-YMDUGQBDSA-M potassium;(2r,3s,4s)-2,3,4,6-tetrahydroxy-5-oxohexanoate Chemical compound [K+].OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O GSFHMOMWXNDPMM-YMDUGQBDSA-M 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N ribitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-ZXFHETKHSA-N 0.000 description 1
- NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N salicin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1CO NGFMICBWJRZIBI-UJPOAAIJSA-N 0.000 description 1
- 229940120668 salicin Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 238000009003 standardized kity Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 108010038851 tannase Proteins 0.000 description 1
- 238000013334 tissue model Methods 0.000 description 1
- RULSWEULPANCDV-PIXUTMIVSA-N turanose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(=O)CO)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O RULSWEULPANCDV-PIXUTMIVSA-N 0.000 description 1
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000811 xylitol Substances 0.000 description 1
- 235000010447 xylitol Nutrition 0.000 description 1
- HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N xylitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO HEBKCHPVOIAQTA-SCDXWVJYSA-N 0.000 description 1
- 229960002675 xylitol Drugs 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus plantarum PL4.
Jedną z podstawowych grup bakterii zasiedlających ludzki, przewód pokarmowy są bakterie z rodzaju Lactobacillus. Szczególnie wyróżniają się wśród nich szczepy należące do gatunku Lactobacillus plantarum, niektóre z nich stosowane są jako probiotyki.
Znane jest z opisu patentowego PL203824 zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum zapewniającego zwiększoną ilość kwasu propionowego lub kwasu octowego w okrężnicy do wytwarzania leku zmniejszającego jeden lub większą ilość czynników ryzyka związanego z zespołem metabolicznym. Szczep ujawniony w wynalazku to Lactobacillus plantarum 299v, który wykazuje zdolność do wiązania się z błoną śluzową jelit.
Znana jest z opisu patentowego USRE 44400, kompozycja, zawierająca jeden lub więcej szczepów Lactobacillus plantarum wytwarzających tanazę, enzym degradujący taninę, w połączeniu z samą taniną i farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Szczepy wchodzące w skład kompozycji są to nowe szczepy Lactobacillus plantarum wyizolowane z błony śluzowej okrężnicy człowieka. Kompozycja wykazuje właściwości przeciwzapalne dzięki działaniu produktów rozkładu taniny. Kompozycja przeznaczona jest do wytwarzania leku do leczenia chorób układu pokarmowego i układu naczyniowo-sercowego.
Znany jest z opisu patentowego US 20120200943 szczep Lactobacillus plantarum CMU995 który posiada doskonałą zdolność do przylegania do komórek przewodu pokarmowego i dróg oddechowych. Ta właściwość szczepu Lactobacillus plantarum CMU995 zgodnie z wynalazkiem, powoduje hamowanie przylegania patogenów do nabłonka przewodu pokarmowego i moczowego.
Znana jest z opisu patentowego EP 2311473 kompozycja zawierająca skuteczną ilość co najmniej jednego ze szczepów Lactobacillus plantarum CECT 7527, Lactobacillus plantarum CECT 7528, Lactobacillus plantarum CECT 7529 lub ich mutantów do stosowania w celu obniżenia cholesterolu.
Znany jest z opisu patentowego US 5895758 Lactobacillus plantarum OMATCC5598 o aktywności proteolitycznej. Szczep ten przeznaczony jest do wytwarzania środka antynowotworowego.
Dotychczas znane szczepy Lactobacillus plantarum za względu na poznane, swoiste właściwości stosowane były selektywnie. Pożądane jest zatem wyselekcjonowanie nowych ulepszonych szczepów probiotycznych, o kilku dominujących cechach, mających szerokie zastosowanie.
Celem wynalazku było wyselekcjonowanie z kolekcji szczepów bakterii z rodzaju Lactobacillus, takiego nowego szczepu, który oprócz cech charakterystycznych dla tego gatunku i właściwości probiotycznych, byłby zdolny do korzystnego wpływania na funkcjonowanie komórek błony śluzowej jelita w kierunku jej uszczelniania i wygaszania stanów zapalnych, przy zachowaniu cech umożliwiających przyleganie do nabłonka, kolonizację błony śluzowej i eliminację czynników patogennych.
Istotą wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus plantarum oznaczony symbolem PL4 zdeponowany, zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu, drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PGM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu (53-114 Wrocław, ul. Rudolfa Weigla 12). Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL4 został zdeponowany w dniu 18 listopada 2015 i otrzymał numer B/00104.
I. Pochodzenie szczepu.
Szczep Lactobacillus.plantarum PL4 został wyizolowany z próbki kału pochodzącego od zdrowego noworodka karmionego mlekiem matki w drugim tygodniu po urodzeniu. Materiał po pobraniu natychmiast przetransportowano do Laboratorium Mikrobiologicznego firmy Prolab, gdzie został opracowany, a wyizolowane szczepy bakterii zostały szczegółowo scharakteryzowane w oparciu o metody genotypowe oraz fenotypowe. Jednym z uzyskanych na tej drodze szczepów był szczep Lactobacillus plantarum PL4.
Zatem Lactobacillus plantarum PL4 jest to nowy szczep, który w naturalny sposób kolonizuje przewód pokarmowy. Dzięki temu oraz specyficznym cechom indywidualnym szczep Lactobacillus plantarum PL4 jest szczególnie predysponowany do wygaszania stanów zapalnych i uszczelniania nabłonka oraz zapobiegania leczenia zakażeń grzybiczych i bakteryjnych przewodu pokarmowego.
Dzięki dokładnej charakterystyce szczepu Lactobacillus plantarum FL4 można było przypisać mu wybitną zdolność do:
• stymulacji produkcji białek uszczelniających jelito przez komórki ludzkiego nabłonka jelitowego,
PL 232 906 Β1 • produkcji enzymów antyoksydacyjnych, • hamowania populacji grzybów i bakterii, • adherencji do komórek ludzkiego nabłonka jelitowego.
Ponadto potwierdzono przeprowadzono pełną identyfikację w celu ustalenia przynależności szczepu Lactobacillus plantarum PL4 do tego gatunku.
Niniejszy wynalazek przedstawiono na załączonym rysunku, na którym:
Fig. 1. przedstawia wynik testu API 50 CH dla szczepu PL4.
Fig. 2. przedstawia zdjęcie produktów reakcji PCR zgodnych z gatunkiem Lactobacillus plantarum; ścieżki: 1 (szczep PL4); 2 kontrola negatywna; 3 kontrola pozytywna (wzorcowy szczep Lactobacillus plantarum AT CC 8014); M marker wielkości.
Fig. 3. przedstawia produkcję nadtlenku wodoru przez szczep Lactobacillus plantarum.
Fig. 4. przedstawia przykładowy obraz uzyskany w mikroskopie fluorescencyjnym dla Lactobacillus plantarum PL4 - powiększenie 400x, okludyna +++, tkanka: Caco-2.
Fig. 5. przedstawia przykładowy obraz adherencji szczepu Lactobacillus plantarum PL4 do linii tkankowej Caco-2. Mikroskop świetlny powiększenie 400x.
Fig. 6. przedstawia przykładowe działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL4 wobec bakteryjnych czynników etiologicznych - metoda półilościowa.
Od lewej: Escherichia coli
Od prawej: Enterococcus faecalis
Od góry: L. plantarum ATCC 8014
Od dołu: L. plantarum PL4
Fig. 7. przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL4 wobec wybranych gatunków bakterii chorobotwórczych z wykorzystaniem metody ilościowej.
Fig. 8. przedstawia antagonistyczne działanie szczepu L. plantarum PL4 na wzrost grzyba drożdżopodobnego, wykazane za pomocą metody słupkowej.
Fig. 9. przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL4 wobec Candida albicans z wykorzystaniem metody ilościowej.
Fig. 10. przedstawia oporność szczepu Lactobacillus plantarum PL4 na sole żółci w stężeniach: 1,2, 5,10,20 g/l.
II. Fenotypowa identyfikacja szczepu Lactobacillus plantarum PL4 z wykorzystaniem zestawu API50 CH firmy bioMerieux
Identyfikację fenotypową przeprowadzono za pomocą zestawu API 50 CH zgodnie z zaleceniami producenta. Jest to wystandaryzowany zestaw zawierający 50 testów biochemicznych do badania sposobu metabolizmu węglowodanów przez drobnoustroje. API 50 CH firmy bioMerieux wykorzystuje się do identyfikacji bakterii z rodzaju Lactobacillus i rodzajów spokrewnionych w połączeniu z API 50 CHL Medium (bioMerieux; USA).
Wynik testu API 50 CH dla badanego szczepu z rodzaju Lactobacillus przedstawia Tabela 1.
Tabela 1
Wynik testu API dla szczepu Lactobacillus plantarum PL4
| Probówka | TEST | Wynik |
| Szczep PL4 | ||
| 0 | KONTROLA | - |
| 1 | Glicerol | - |
| 2 | Erytrotol | - |
| 3 | D-arabinoza | - |
| 4 | L-arabinoza | - |
| 5 | D-ryboza | .+ |
| 6 | D-ksyloza | - |
| 7 | L-ksyloza | - |
PL 232 906 Β1
| 8 | D-adonitol _ | - |
| 9 | Metylo-[SD-ksylopiranozyd | - |
| 10 | D-galaktoza | + |
| 11 | D-glukoza | + |
| 12 | D-fruktoza | |
| 13 | D-mannoza | + |
| 14 | L-sorboza | - |
| 15 | I.-ram noża | - |
| 16 | Dukytol | - |
| 17 | Inozytol | |
| 18 | D-mannitol | + |
| 19 | D-sorbitol | + |
| 20 | Metylo-oD-mannopiranozyd | - |
| 21 | Metylo-aD-glukopiranozyd | - |
| 22 | N-acetylo-glukozamina | + |
| 23 | Amigdalina | + |
| 24 | Arbutyna | |
| 25 | Eskulina Cytrynian żelaza | ł- |
| 26 | Salicyna | + |
| 27 | D-celobioza | 4- |
| 28 | D-maltoza | + |
| 29 | D-laktoza (wołowa) | + |
| 30 | D-melibioza | + |
| 31 | D-sacharoza | + |
| 32 | D-trehaloza | |
| J3 | Inulina | - |
| 34 | D-melezytoza | - |
| 35 | D-rafinoza | - |
| 36 | Skrobia | - |
PL 232 906 Β1
| 37 | Glikogen | - |
| 38 | Ksylitol | - |
| 39 | Gencjobioza | + |
| 40 | D-turanoza | ł- |
| 41 | D-liksoza | - |
| 42 | D-tagatoza | - |
| 43 | D-fu koza | - |
| 44 | I.-fukoza | - |
| 45 | D-arabitol | - |
| 46 | L-arabitol | - |
| 47 | Glukonian potasu | - |
| 48 | 2-ketoglukonian potasu | - |
| 49 | 5-ketoglukonian potasu | - |
Na podstawie otrzymanego profilu biochemicznego program apiWeb zidentyfikował szczep PL4 jako Lactobacillus plantarum (% ID=98 - Bardzo dobra identyfikacja).
Wynik testu API 50 CH dla szczepu Lactobacillus plantarum PL4 przedstawiono na Fig. 1.
III. Identyfikacja genotypowa szczepu Lactobacillus plantarum PL4 z wykorzystaniem metody PCR (ang. Polymerase Chain Reaction)
III. 1. Izolacja genomowego DNA bakterii:
Do izolacji genomowego DNA zastosowano zestaw DNA GeneMATRIX Basic DNA Purification Kit (EURx) wykorzystujący zdolność wiązania się DNA do złóż krzemionkowych w wysokich, stężeniach soli chaotropowych. Procedura izolacji DNA przebiegała w następujący sposób:
1. 24-godzinną hodowlę komórek bakteryjnych prowadzoną w podłożu MRS (Oxoid) odwirowywano w objętości 1 ml (2 min., 12 000 rpm).
2. Supernatant usuwano, a osad .dokładnie zawieszano w 250 μΙ buforu do zawieszania Celi R (w zestawie) z dodatkiem 200 μΙ niebieskiego buforu lizującego Lysis Blue (w zestawie), aż do uzyskania jednolitej, niebieskiej zawiesiny.
3. Do zawiesiny komórek dodawano 350 μΙ buforu neutralizującego Neutral B (w zestawie). Dokładnie i powoli mieszano zawartość probówek przez kilkukrotne odwracanie, aż do całkowitego zaniku niebieskiej barwy zawiesiny.
4. Po zakończeniu lizy mieszaninę odwirowywano (7 min., 12 000 rpm), a przesącz nakładano na minikolumnę ze specjalnym złożem krzemionkowym i ponownie wirowano (1 min., 12 000 rpm).
5. Złoże dwukrotnie przepłukiwano: najpierw 500 μΙ buforu płuczącego Wash UX1, a następnie 650 μΙ buforu płuczącego Wash UX2 (w zestawie).
6. Oczyszczone DNA eluowano ze złoża za pomocą 50 μΙ buforu Elution (w zestawie), ogrzanego do temperatury 80°C.
7. Wyizolowane DNA przechowywano w probówce typu Eppendorf w temperaturze 4°C do czasu dalszych analiz.
III. 2. Łańcuchowa reakcja polimerazy (PCR):
W Tabeli 2 przedstawiono sekwencje użytych starterów oraz wielkość amplikonów.
PL 232 906 Β1
Tabela 2
Sekwencje starterów i wielkość amplikonów poszukiwanego gatunku bakterii
| Starter | Sekwencja 5'©3' | Gatunek | Wielkość amplikonu |
| Lfpr Piani! | GCC GCC TAA GGT GGG ACA GAT TTA CCT AAC GGT A AA TGC GA I-...—_________________________________________________________ | L. pkiniarum | 283 pz |
Program amplifikacji dla gatunku Lactobacillus prowadzony był w termocyklerze S 1000 (BioRad) i przedstawiał się następująco:
1. 92WC - 2 min
2. 95°C - 30 sek
3.55°C - 30 sek f 30x
4. 72^ - 30 sek>
5. 72°C - Ί min
Amplifikację prowadzono zgodnie z metodą Walter i wsp. Z publikacji tej pochodzą również użyte sekwencje starterów.
Po skończonej reakcji PCR produkty amplifikacji były analizowane w 1,5% żelu agarozowym z dodatkiem bromku etydyny. Próbki nakładano do kieszonek żelu w objętości 7 μΙ z dodatkiem 3 μΙ bufora obciążającego. Elektroforezę prowadzono w buforze TBE o stężeniu 0,5x, przez 1,5 godziny, pod napięciem 80V, w aparacie do elektroforezy (BioRad). Obraz żelu oglądano przy użyciu systemu GelDoc XR + (BioRad), w skład którego wchodził transiluminator UV, kamera zbierająca obraz oraz program komputerowy do dokumentacji i analizy obrazu Image Lab (BioRad). Obecność produktu PCR o odpowiedniej ilości par zasad uznawana była za pozytywny wynik reakcji. Na każdym żelu umieszczano ponadto kontrolę negatywną, którą stanowiła woda destylowana dodawana do buforu reakcyjnego zamiast genomowego DNA bakterii, kontrolę pozytywną, jaką był produkt amplifikacji otrzymany z użyciem DNA szczepu wzorcowego oraz, marker wielkości prążków (GeneRuler 100 bp, Axygen).
Fig. 2. przedstawia zdjęcie produktów reakcji PCR zgodnych z gatunkiem Lactobacillus plantarum; ścieżki: 1 (szczep PL4); 2 kontrola negatywna; 3 kontrola pozytywna (wzorcowy szczep Lactobacillus plantarum ATCC 8014); M-marker wielkości.
Tabela 3
Zestawienie wyników - identyfikacja gatunkowa przeprowadzona za pomocą testu API 50 CH oraz reakcji PCR
| Numer szczepu | Obraz mikroskopowy | Obraz makroskopowy | Test API | Test PCR |
| PL4 | L. plantarum | Kremowy | L. plantarum | L. piiiiitariim |
Przeprowadzona identyfikacja fenotypowa i genotypowa potwierdziła, że nowy szczep PL4 należy do gatunku Lactobacillus plantarum.
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady, w których opisano przeprowadzone doświadczenia dokumentujące unikalne właściwości szczepu Lactobacillus plantarum PL4.
Przykład I
Badanie właściwości antyoksydacyjnych szczepu Lactobacillus plantarum PL4.
1. Pomiar produkcji nadtlenku wodoru.
W celu dokonania pomiaru produkcji nadtlenku wodoru przez badany szczep wykorzystano test paskowy firmy Merck, który zmienia intensywność zabarwienia, w zależności od ilości nadtlenku wodoru uwalnianego do płynnych hodowli tej bakterii (od 0 do 100 mg/ml). Barwę porównywano z odpowiednią skalą kolorymetryczną pozwalającą jednocześnie na wyliczenie przybliżonej wartości wypro
PL 232 906 Β1 dukowanego nadtlenku wodoru (wynik podano w mg/L). Zdolność produkcji nadtlenku wodoru w płynnym podłożu wzrostowym przez szczep Lactobacillus plantarum FL4 badano przez zawieszenie bakterii w 2 ml płynnego podłoża MRS. Gęstość wyjściowa bakterii wyniosła średnio 1x106 c.f.u./ml. Następnie hodowlę inkubowano w warunkach tlenowych w 37°C, intensywnie wytrząsając na wytrząsarce w celu zwiększenia aeracji komórek bakteryjnych. Pomiar wykonywano dwukrotnie, tj. po upływie 4 i 24 godzin od rozpoczęcia badania:
Gęstość populacji badanych bakterii po 4 godzinach utrzymywała się na poziomie średnio 3-5 z 106 c.f.u./ml, zaś po 24 godzinach wzrosła do poziomu średnio 1x107 c.f.u./ml. Kontrolnie produkcję H2O2 mierzono również w tym samym podłożu bez bakterii. Wyniki zestawiono w Tabeli nr 4.
Tabela 4
Produkcja nadtlenku wodoru (mg/L) przez szczep Lactobacillus plantarum PL4
| Szczep | 4 godziny | 24 godziny |
| Lactobacillus plantarinn FL4 | 0 mg/L | 0 mg/L |
Fig. 3. przedstawia produkcję nadtlenku wodoru przez szczep Lactobacillus plantarum PL4.
2. Pomiar kinetyki rozkładu nadtlenku wodoru przez szczep Lactobacillus plantarum PL4 w oparciu o test paskowy firmy Merck.
Do probówek zawierających 2 ml podłoża MRS dodawano po, jednym oczku ezy kalibrowanej (1 μΙ) hodowli badanego szczepu Lactobacillus plantarum PL4 (pobranego z sektora świeżej hodowli na agarze MRS). Następnie probówkę inkubowano przez 24 godziny w temp. 37°C w warunkach tlenowych. Po upływie tego czasu hodowle mieszano z czystym chemicznie nadtlenkiem wodoru, aby jego końcowe stężenie wyniosło 30 mg/L. Jako kontroli używano nieposianego podłoża MRS, do którego również dodawano po 30 mg/L nadtlenku wodoru. Pomiar kinetyki rozkładu nadtlenku wodoru przeprowadzono czterokrotnie w odpowiednich odstępach czasowych. W celu sprawdzenia liczby mikroorganizmów uzyskanych w hodowli wykonywano posiewy kontrolne na płytki z podłożem MRS (Oxoid).,Liczba komórek bakteryjnych w zawiesinie wyjściowej kształtowała się na poziomie 108 c.f.u./ml.
Wyniki pomiaru kinetyki rozkładu H2O2 w oparciu o test paskowy zestawiono w Tabeli nr 5.
Tabela 5
Oznaczenie kinetyki rozkładu nadtlenku wodoru przez szczep Lactobacillus plantarum PL4 w oparciu o metodę paskową
| Badany szczep | 0 min. | 30 min. | 60 min. | 90 120 | 150 min. | 180 min. | 210 min. | 24 godz. | |
| min. | min. | ||||||||
| Ilość nadtlenku wodom (mg/L) | |||||||||
| Lactobacillus plantarum PL4 | 30 | 30 | W | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
3. Oznaczenie, aktywności katalazy wytwarzanej przez szczep Lactobacillus plantarum PL4 z wykorzystaniem zestawu Amplex Red Catalase Assay Kit firmy Molecular Probes.
Do oznaczenia aktywności katalazy wykorzystano komercyjny zestaw Amplex Red Catalase Assay Kit firmy Molecular Probes. Katalaza przeprowadza rozkład nadtlenku wodoru (H2O2) do wody i tlenu. Zastosowany test opiera się na wiązaniu w obecności peroksydazy chrzanowej nieprzereagowanych cząsteczek H2O2 przez reagent Amplex Red w celu wytworzenia wysoce fluorescencyjnego związku, rezorufiny. Zasada oznaczania aktywności katalazy polega na pomiarze fluorescencji uwalnianej rezorufiny. Im wyższa aktywność enzymatyczna katalazy, tym słabszy sygnał fluorescencji emitowanej przez rezorufinę. Procedura przygotowania próbek do pomiaru fluorescencji była zgodna z instrukcją dostarczoną przez producenta zestawu. Pomiar wartości fluorescencji wyznaczano
PL 232 906 Β1 w trzech punktach czasowych, po 1, 4 i 20 godzinach. W czasie inkubacji badane próbki były przechowywane w temp. 37°C i chronione przed działaniem światła. Wartość emitowanej fluorescencji mierzono za pomocą fluorescencyjnego czytnika mikropłytek. Szczep L. plantarum PL4 hodowano w 5 ml bulionu MRS w 37° w warunkach beztlenowych przez 24 godziny. W celu sprawdzenia liczby mikroorganizmów uzyskanych w hodowli wykonywano posiew kontrolny na płytki z podłożem MRS (Oxoid). Liczebność komórek bakteryjnych w zawiesinie kształtowała się na poziomie 108 - 109 c.f.u./ml. Następnie przy użyciu 1 M roztworu NaOH doprowadzono wartość pH zawiesiny do wartości 7,0 ± 0,1. Do przygotowanej w ten sposób hodowli dodawano chemicznie czystego nadtlenku wodoru uzyskując jego końcowe stężenie równe 30 mg/L, a następnie hodowlę inkubowano w temp. 37°C. Odczyt stężenia nadtlenku wodoru w badanej mieszaninie wykonano w trzech czasach tj. po upływie 1,4 i 20 godzin. W tabeli nr 6 przedstawiono wyniki pomiaru kinetyki rozkładu H2O2 poprzez oznaczenie aktywności katalazy.
Tabela 6
Pomiar kinetyki rozkładu H2O2 przez szczep Lactobacillus plantarum PL4 poprzez oznaczenie aktywności katalazy
| Szczep | Kinetyka rozkładu H2O2 (intensywność fluorescencji przy długości fali 590nm) | ||
| 1 godz. (rozpoczęcie badania) | 4 godz. | 20 godz. (zakończenie badania) | |
| Lactobacillus plantarum PL4 | 49 619 | 14 009 | 9111 |
Przeprowadzone badania wykazały wybitną zdolność szczepu Lactobacillus plantarum PL4 do rozkładu nadtlenku wodoru, który stanowi uniwersalny przykład reaktywnych form tlenu, dzięki produkcji enzymów antyoksydacyjnych. Z drugiej strony szczep Lactobacillus plantarum PL4, w odróżnieniu od wielu innych szczepów z rodzaju Lactobacillus, sam nie produkuje nadtlenku wodoru. Zatem zgodnie z powszechnie przyjętą zasadą można, uznać, że ten szczep wykazuje silne działanie antyoksydacyjne o charakterze przeciwzapalnym. Wiadomo, że w tkankach, w których toczy się ostry lub przewlekły stan zapalny dochodzi do naruszenia równowagi pomiędzy sekrecją aktywnych form tlenu, a ich rozkładem na drodze enzymatycznej. Usunięcie nadmiaru aktywnych form tlenu prowadzi do cofnięcia się stanu zapalnego. Szczep Lactobacillus plantarum PL4, jak wynika z przytoczonych powyżej danych powodował 10-krotny spadek ilości zadanego nadtlenku wodoru, już po upływie 90 minut. Ta wyjątkowa aktywność została potwierdzona za pomocą testu mierzącego uwalnianie enzymu rozkładającego nadtlenek wodoru, w którym ilość tego enzymu wybitnie podwyższała się po 20 godzinach doświadczenia, czego dowodem była zmniejszona intensywność fluorescencji. Zatem szczep Lactobacillus plantarum PL4 wykazuje wybitną zdolność do usuwania na drodze enzymatycznej aktywnych form tlenu, a więc może być zastosowany do wygaszania procesów zapalnych toczących się w, świetle przewodu pokarmowego.
Przykład II.
Wpływ szczepu Lactobacillus plantarum PL4 na poprawę funkcji bariery jelitowej poprzez stymulację produkcji białek połączeń ścisłych, w szczególności okludyny oraz zonuliny.
W celu przeprowadzenia badania, szczep Lactobacillus plantarum PL4 hodowano w płynnym podłożu MRS (Oxoid) przez 24 godziny w 37°C w warunkach beztlenowych. Po upływie tego czasu hodowlę wirowano (10 min., 2 000 rpm), supernatant usuwano, a osad bakteryjny dwukrotnie przepłukiwano PBS. Hodowlę szczepu Lactobacillus plantarum PL4 doprowadzono do końcowej gęstości około 1x105 c.f.u. w 1 ml podłoża DMEM (bez antybiotyku) zawierającego dodatkowo 5% agaru MRS. Badanie przeprowadzono na, dwóch liniach tkankowych HT-29 i Caco-2. Obie linie hodowano przez okres 20 dni w podłożu DMEM (IITD, Wrocław) z dodatkiem 10% płodowej surowicy wołowej (FBS, Sigma) na płytkach hodowlanych, 24-dołkowych (TPP, Switzerland) w atmosferze o zwiększonej wilgotności, w atmosferze wzbogaconej 10% CO2 i w temperaturze 37°C. Po osiągnięciu zlewnego wzrostu jednowarstwowego („monolayer”) komórki przepłukiwano dwukrotnie PBS (IITD, Wrocław)
PL 232 906 Β1 i przeprowadzono badanie tworzenia białek połączeń ścisłych pomiędzy komórkami obu linii. Do każdego dołka zawierającego wyhodowaną tkankę o średniej gęstości 1x106 komórek/ml dodawano po 900 μΙ świeżego podłoża DMEM bez antybiotyku oraz 100 μΙ odpowiednio przygotowanej hodowli badanego szczepu (z dodatkiem 5% agar MRS). Gęstość badanego szczepu Lactobacillus plantarum PL4 podano w Tabeli nr 7. Dzięki zawartości 5% agar MRS badany szczep ściśle przylegał do powierzchni hodowli tkankowej HT-29 lub Caco-2.
Całość ponownie inkubowano przez 24 godziny w atmosferze o zwiększonej wilgotności, wzbogaconej 10% CO: i w temperaturze 37°C (komora Memmert).
Po upływie tego czasu hodowlę tkankową przepłukiwano 3x buforem PBS i utrwalano metanolem w temp. -20°C przez 2 min. Następnie na powierzchnię każdego szkiełka podstawowego (umieszczonego w dołku hodowlanym) nanoszono po 100 μΙ monoklonalnych przeciwciał znakowanych FITC wykrywających białka połączeń ścisłych tj. okludynę lub zonulinę (ZO-1) (lnvitrogen-Corporation).
Dzięki temu, iż przeciwciała łączące się z białkami połączeń ścisłych były wybarwione barwnikiem fluorescencyjnym FITC, istniała możliwość obserwacji intensywności świecenia tych połączeń w mikroskopie fluorescencyjnym OLYMPUS (ΒΧ51) przy długości fali wzb. 494 - emi. 520 nm, pod powiększeniem 400x. Intensywność świecenia oceniano w skali półilościowej. Ocenę przeprowadzono z pięciu pól widzenia i wynik uśredniono.
Tabela 7
Oddziaływanie szczepu Lactobacillus plantarum PL4 na stymulację produkcji białek połączeń ścisłych okludyny i zonuliny (ZO-1) wytwarzanych pomiędzy komórkami linii tkankowych Caco-2 i HT-29
| Badany szczep | Tkanka Caco-2 | Tkanka HT-29 | ||
| Okludyna | Zonulina ZO-1 | Okludyna | Zonulina ZO-1 | |
| Litcłobiicillus plantarum PL4 | +++ | ++ | ++/-1 1 | -H- |
Intensywność świecenia według skali półilościowej:
+++ bardzo silne świecenie (bardzo wysoki poziom tworzenia białek połączeń ścisłych) ++ silne świecenie (wysoki poziom tworzenia białek połączeń ścisłych)
Tabela 8
Pomiar wartości pH hodowli tkankowej wraz ze szczepem Lactobacillus plantarum PL4 w trakcie trwania badania
| Badany szczep probiotyczny | Wyjściowa gęstość hodowli bakterii w I ml podłoża DMEM (c.f.u./ml) | Pomiar pH hodowli na początku testu | Pomiar pH hodowli na końcu testu (po upływie 24 godzin) |
| Lactobacillus plantarum PL4 | 4,0 χ 105 | 8,0 | 7,0 |
Fig. 4. przedstawia przykładowy obraz uzyskany w mikroskopie fluorescencyjnym dla Lactobacillus plantarum PL4 - powiększenie 400x, okludyna +++, tkanka: Caco-2.
Przeprowadzone badania nad stymulacją produkcji białek połączeń ścisłych przez komórki dwóch linii ludzkiego nabłonka jelitowego pod wpływem szczepu Lactobacillus plantarum PL4 wykazały jego wybitną zdolność w tym zakresie. Produkcja tych białek świadczy o uszczelnieniu nabłonka i stworzeniu bariery jelitowej, która nie dopuszcza do przenikania przez błonę śluzową jelita makro
PL 232 906 Β1 cząsteczek i drobnoustrojów. Zatem dzięki tym właściwościom szczep Lactobacillus plantarum PL4 działa przeciwzapalnie, gdyż uszczelniona błona śluzowa jelita nie przepuszcza od strony światła jelita białek i polisacharydów stymulujących stan zapalny. Ponadto ten szczep działa przeciwko stanom zapalnym jelita, bowiem przez uszczelnioną barierę jelitową nie dochodzi do penetracji czynników patogennych: bakterii i grzybów, w głąb błony śluzowej.
Ponadto wykazano w poniżej opisanych badaniach wybitne właściwości pro biotyczne szczepu Lactobacillus plantarum PL4: zdolność do przylegania do nabłonka jelita ludzkiego, antagonistyczne działanie przeciwko najczęstszym bakteryjnym i grzybowym czynnikom patogennym powodującym ostre i przewlekłe biegunki.
Przykład III
Badanie zdolności szczepu Lactobacillus plantarum PL4 do adherencji do komórek linii tkankowych jelita ludzkiego. HT-29 ΜΤΧ i Caco-2.
Adherencja szczepu Lactobacillus plantarum PL4 do nabłonka jelitowego została oceniona w odniesieniu do dwóch linii komórkowych reprezentujących nabłonek jelita ludzkiego. Jedną z nich jest standardowa linia Caco-2, przy użyciu której wykonano większość badań nad adherencją bakterii, opublikowanych w literaturze. Drugą linią jest HT-29 ΜΤΧ. Działanie metotreksatu (ΜΤΧ) indukuje tkankę HT-29 do wydzielania zwiększonej ilości śluzu, dzięki czemu ten model tkankowy bardziej przypomina naturalne właściwości jelita grubego zdrowego człowieka.
Hodowla tkankowa linii HT-29 ΜΤΧ była prowadzona przez okres 20 dni w podłożu DMEM (IITD, Wrocław) z dodatkiem 10% płodowej surowicy wołowej (FBS, Sigma) na płytkach hodowlanych, 24 dołkowych (TPP, Szwajcaria) w atmosferze o zwiększonej wilgotności, w atmosferze wzbogaconej 10% CO2 i w temperaturze 37°C. W takich samych warunkach prowadzona była hodowla tkankowa linii Caco-2; przy czym czas hodowli wyniósł 15 dni w podłożu DMEM (IITD, Wrocław) z dodatkiem 10% płodowej surowicy wołowej (FBS, Sigma) również na płytkach hodowlanych, 24 dołkowych (TPP, Switzerland). Płyny hodowlane były wymieniane co 48 godzin. Po osiągnięciu zlewnego wzrostu jednowarstwowego („monolayer”), komórki przepłukiwano dwukrotnie PBS- (IITD, Wrocław) i przeprowadzono badanie adherencji bakterii probiotycznych. Bakterie szczepu Lactobacillus plantarum PL4 hodowano w 10 ml bulionu MRS przez 24 godziny w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C. Po upływie tego czasu, sprawdzano gęstość hodowli szczepu za pomocą metody rozcieńczeń dziesiętnych. Do każdego dołka zawierającego wyhodowaną tkankę o średniej gęstości 1x106 komórek/ml dodawano po 100 μΙ płynnej hodowli bakterii i uzupełniano 900 μΙ świeżego, podłoża DMEM. Końcowa gęstość populacji badanych bakterii wynosiła w 1, ml około 1x108 c.f.u na 1x106 komórek linii HT 29. ΜΤΧ lub Caco-2. Następnie komórki linii tkankowych wraz z badanymi bakteriami inkubowano w temp. 37°C w atmosferze o zwiększonej wilgotności i przy 10% zawartości CO2 przez okres 1 godziny. Po tym czasie komórki przepłukiwano PBS w celu usunięcia nie przywartych bakterii, a następnie całość utrwalano 3,7% paraformaldehydem w temperaturze 4°C przez okres 3 godzin. Następnie szkiełka płukano PBS i przeprowadzono ich barwienie metodą Grama.
Preparat był oceniany w mikroskopie świetlnym pod .powiększeniem 1000x. Komórki badanego szczepu Lactobacillus plantarum PL4, które przywarły do linii tkankowej były zliczane w 20 polach widzenia preparatu, a obliczano wynik średni, któremu przyporządkowano odpowiedni stopień adherencji zgodnie z podanym poniżej zakresem. Badanie adherencji badanych szczepów było przeprowadzone dwukrotnie. Stopień adherencji oceniano za pomocą poniższej skali:
| Stopień adherencji | Średnia liczba komórek bakteryjnych w polu widzenia |
| Powyżej 80 | |
| ++ | Zakres 60-80 |
| + | Zakres 40-60 |
| - | Poniżej 40 |
Uzyskano następujące wyniki, które przedstawiono w poniższej tabeli.
PL 232 906 Β1
Tabela 9
Wyniki badania adherencji szczepu Lactobacillus plantarum PL4 do tkanki CaCo-2
| Badany szczep | I doświadczenie (wyniki z 20 pói widzenia preparatu) | II doświadczenie (wyniki z 20 pól widzenia preparatu) | WYNIK Wartości średnie |
| Lacfobticillus plantarum PL4 | 100 (+++) | 56 (-H-) | 78 (++) |
Fig. 5. przedstawia przykładowy obraz adherencji szczepu Lactobacillus plantarum PL4 do linii tkankowej Caco-2. Mikroskop świetlny powiększenie 400x.
Tabela 10
Wyniki badania adherencji szczepu Lactobacillus plantarum PL4 do tkanki HT-29 ΜΤΧ
| Badany szczep | I doświadczenie (wyniki z 20 pól widzenia preparatu) | II doświadczenie (wyniki z 20 pól widzenia preparatu) | WYNIK Wartości średnie |
| Lactobacillus plantarum PL4 | 68 (+++) | 90 (+++) | 79 (+++) |
Badania adherencji wykazały wybitną zdolność badanego szczepu Lactobacillus plantarum PL4 do przylegania do nabłonka ludzkiego jelita.
Przykład IV
Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL4 wobec wybranych bakteryjnych czynników patogennych biegunek.
Do badania wybrano następujące szczepy wskaźnikowe oraz wzorcowy szczep L. plantarum ATCC 8014:
• Escherichia coli ATCC 25922 • Salmonella enteritidis ATCC 13076 (szczep niepatogenny z kolekcji IW) • Enterococcus faecalis ATCC 29212 • Clostridium difficile ATCC 9689 • Campylobacterjejuni ATCC 29428.
1. Metoda półilościowa (słupkowa).
Hodowlę szczepu L. plantarum PL4 i szczepu L. plantarum ATCC 8014 posiewano na stałe podłoże MRS (Oxoid). Hodowlę przeprowadzono w warunkach beztlenowych przez 24-48 godzin w 37°C. Po uzyskaniu wzrostu bakterii probiotycznych wycinano w podłożu MRS. słupki o średnicy 9 mm, które nakładano na płytki zawierające odpowiednie podłoże stałe z naniesionymi uprzednio za pomocą wacika hodowlami szczepów wskaźnikowych. Następnie płytki umieszczano na cztery godziny w lodówce w temp. 4°C, a po upływie tego czasu dalej je, inkubowano w 37°C w warunkach tlenowych przez 18 godzin. Po inkubacji mierzono średnice stref zahamowania wzrostu szczepów wskaźnikowych podając wynik w mm.
PL 232 906 Β1
Tabela 11
Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL4 wobec wybranych bakteryjnych czynników etiologicznych powodujących zakażenia przewodu pokarmowego ocenione w oparciu o metodę półilościową (strefa zahamowania podana w mm).
| Szczep | E.coli ATCC 25922 | Salmonella enteritidis ATCC 13076 | Enterococcus faecalis ATCC 29212 | Clostridium difficile ATCC 9689 | Campylobaęter jejuni ATCC 29428 |
| L. plantarum PL4 | 21 mm | 26 mm | 23 mm | 22 mm | 25 mm |
| L, plantarum ATCC 8014 | 14 mm | 17 mm | 17 mm | 14 mm | 15 mm |
Fig. 6. przedstawia przykładowe działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL4 wobec bakteryjnych .czynników etiologicznych - metoda półilościową.
Od lewej: Escherichia coli
Od prawej: Enterococcus faecalis
Od góry: L. plantarum ATCC 8014
Od dołu: L. plantarum PL4
2. Metoda ilościowa.
Szczep Lactobacillus plantarum PL4 zawieszano w 10 ml bulionu. MRS, a następnie hodowano przez 24 godziny w warunkach beztlenowych, w temperaturze 37°C. Po upływie tego czasu sprawdzano gęstość hodowli za pomocą metody rozcieńczeń dziesiętnych, a następnie z hodowli bakterii pobierano po 0,9 ml i dodawano do nich po 0,1 ml próbek, zawierających 24-godzinne, świeże hodowle szczepów bakterii wskaźnikowych. Całość inkubowano w warunkach tlenowych, jedynie w przypadku antagonistycznego działania szczepu Lactobacillus plantarum PL4 na beztlenowy szczep Clostridium difficile ATCC 9689, mieszaninę umieszczano w warunkach ściśle beztlenowych. Po upływie 8 i 24 godzin z każdej z mieszanych hodowli wykonywano rozcieńczenia dziesiętne, wysiewając kolejno po 0,1 ml. mieszaniny równolegle na odpowiednie dwa podłoża, zarówno w kierunku bakterii Lactobacillus, jak i bakterii wskaźnikowych. Liczbę kolonii zliczano, a wyniki podano w jednostkach tworzących kolonie w przeliczeniu na 1 ml (c.f.u./ml).
Tabela 12
Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL4 wobec wybranych bakterii wskaźnikowych, przy zastosowaniu metody ilościowej
| Szczep | O godz CFU/ml | 8 godz CFU/ml | 24 godz CFU/ml |
| Escherichia coli ATCC 25922 | 2,0x10’ | 0 | 0 |
| Salmonella enteritidis ATCC 13076 | l,3xl08 | 0 | 0 |
| Enterococcus faecalis ATCC 29212 | l,0xl0? | 1,0x106 | 0 |
| Clostridium difficile ATCC 9689 | 3,OxlO8 | 5,0x10: | 0 |
| Campylobacter jejuni ATCC 29428 | 2,7x10’ | 1,2x102 | 0 |
PL 232 906 Β1
| Kontrola hodowli L.plantarum PL4 | 2,0 x 10* | 4,8 x Ί08 | 1,0 x 10« |
| Kontrola hodowli Escherichia coli ATCC 25922 | 6,0 x 107 | 1,0 x 107 | 2,3 x 108 |
| Kontrola hodowli Salmonella enteritidis ATCC 13076 | 2,0 x 10« | 2,0 x 10* | 5,0 x 10« |
| Kontrola hodowli Enterococcus faecalis ATCC 29212 | 3,0 x 10* | 4,0 x ισ« | 6,0 x 107 |
| Kontrola hodowli Clostridium difficile ATCC 9689 | 4,0 x 105 | 1,0 x ΊΟ6 | 5,0 x 10« |
| Kontrola hodowli Campylobacter jejuni ATCC 29428 | 4,0 x 107 | 2,4 x W8 | 2,7 x 10« |
Fig. 7. przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL4 wobec wybranych gatunków bakterii chorobotwórczych z wykorzystaniem metody ilościowej.
Badania antagonizmu szczepu Lactobacillus plantarum FL4 wobec najczęstszych czynników bakteryjnych powodujących ostre i przewlekłe biegunki wykazały zdecydowany efekt działania tego szczepu powodujący spadek populacji wszystkich badanych bakterii wskaźnikowych do 0 po 24 godzinach inkubacji. Taki efekt działania szczepu Lactobacillus plantarum PL4 może wskazywać na możliwość zastosowania go do zapobiegania i wspomagania leczenia ostrych i przewlekłych biegunek powodowanych przez wskazane bakterie, a także biegunek związanych z stosowaniem antybiotyków.
Przykład V
Badanie właściwości antagonistycznych szczepu Lactobacillus plantarum PL4 wobec Candida albicans.
1. Zmodyfikowana metoda półilościową wg Fitzsimmons i Berry.
W badaniu posłużono się zmodyfikowaną metodą półilościową według Fitzsimmons i Berry (Struś M, Kucharska A., Kukla G., Brzychczy-Włoch M., Maresz K.; Heczko P.B., The in vitro activity of vaginal Lactobacillus with probiotic properties against Candida. Infect Dis. Obstet. Gynecol. 2005; 13:69-75).
Do badania wybrano szczep wzorcowy pochodzenia ludzkiego z kolekcji ATCC tj. Candida albicans ATCC 10231.
Metoda polegała na zastosowaniu podłoży dwuwarstwowych. Pierwszą warstwę stanowiło podłoże dla wzrostu Lactobacillus oparte na związkach chemicznych o składzie:
• Ekstrakt drożdżowy (Argenta) • Bezwodny octan sodu (Argenta) • Cytrynian sodu (Argenta) • Siarczan magnezu (Argenta) • Chlorek manganu (Argenta) • Siarczan amonu (Argenta) • Glukoza (Argenta)
Na podłoże to posiewano w formie paska o szerokości 2 cm badany szczep Lactobacillus plantarum PL4. Po posiewie płytki inkubowano w temp. 37°C, w warunkach beztlenowych przez 48 godzin, a po upływie tego czasu na wierzch wylewano drugie, lekko przestudzone, płynne podłoże Sabouraud Dextrose (Biocorp) w kierunku wzrostu grzyba wskaźnikowego. Po zastygnięciu, na podłoże wysiewano grzyba z rodzaju Candida o gęstości 0,5 MacFarlanda. Następnie płytki umieszczano na 4 godziny w lodówce (temperatura 4°C), a po upływie tego czasu dalszą inkubację prowadzono już w warunkach tlenowych, w temperaturze 37°C przez 24 godziny.
PL 232 906 Β1
Uzyskane wyniki oceniono według następującego wzoru:
- Brak działania antagonistycznego Lactobacillus wobec szczepu Candida (nie zaobserwowano żadnej strefy zahamowania wzrostu Candida wzdłuż paska z wymazanym szczepem probiotycznym), + Częściowe działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec szczepu Candida (obserwuje się lekkie zahamowania wzrostu Candida jedynie nad paskiem z wymazanym szczepem probiotycznym), ++ Wyraźne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec szczepu Candida (obserwuje się wyraźne zahamowania wzrostu Candida nad paskiem z wymazanym szczepem pro biotycznym czasami wyraźniej w jego górnej i dolnej części), +++ Bardzo silne działanie antagonistyczne Lactobacillus wobec szczepu Candida (obserwuje się wyraźne zahamowania wzrostu Candida nad paskiem, i poza jego powierzchnią wzdłuż całej linii posiewu szczepu probiotycznego).
Tabela 13
Antagonistyczne działanie bakterii z rodzaju Lactobacillus wobec grzyba z rodzaju Candida przy zastosowaniu metody półilościowej
| Bakterie z rodzaju Lactobacillus | Candida | albicans ATCC 10231 | |
| PL4 I | +++ I |
Fig. 8. przedstawia antagonistyczne działania szczepu L. plantarum PL4 na wzrost grzyba drożdżopodobnego, wykazane za pomocą metody słupkowej.
Badanie właściwości antagonistycznych szczepu Lactobacillus plantarum PL4 wobec Candida albicans metodą ilościową.
W metodzie ilościowej szczep L. plantarum PL4 oraz szczep Candida albicans hodowano w tej samej probówce zawierającej po 900 mikrolitrów 24-godzinnej hodowli Lactobacillus o średniej gęstości 1x109 j.t.k/ml oraz 100 mikrolitrów 24-godzinnej hodowli grzyba wskaźnikowego o średniej gęstości 1x106 j.t.k/ml Całość dalej hodowano, a po upływie 8 i 24 godzin od rozpoczęcia badania materiał posiewano ilościowo na stałe podłoże przeznaczone do wzrostu Lactobacillus oraz na stałe podłoże Sabouraud'a przeznaczone do wzrostu chorobotwórczych grzybów wskaźnikowych. Obliczano liczebność obu populacji/ a wynik podawano w jednostkach tworzących kolonie w przeliczeniu na 1 ml (j.t.k./ml).
Tabela 14
Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum FL4 wobec Candida albicans w oparciu o metodę ilościową
| Szczep | □ godz CFU/ml | 8 godz CFU/ml | 24 godz. CFU/ml |
| Candida albicans | 1,5x107 | 0 | o |
| ATCC 10231 | |||
| Kontrola hodowli | 4,0 x 109 | 7,0 x 108 | 1,2x10’ |
| L.plantarum PL4 | |||
| Kontrola hodowli | 3,0x10* | 2,5x107 | 2,0x107 |
| Candida albicans | |||
| ATCC 10231 |
Fig. 9. przedstawia antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus plantarum PL4 wobec Candida albicans z wykorzystaniem metody ilościowej.
Badanie antagonistycznego działania szczepu Lactobacillus plantarum PL4 za pomocą metody półilościowej i metody ilościowej wykazało, bardzo silne działanie badanego szczepu wobec grzybowych' czynników patogennych przewodu pokarmowego z rodzaju Candida. Taki efekt działania szczepu Lactobacillus plantarum PL4 na grzyby Candida albicans może wskazywać na możliwość zastosowania go do zapobiegania i wspomagania leczenia, stanów związanych ze zniszczeniem prawidłowej mikroflory przewodu pokarmowego, określanych jako grzybica przewodu pokarmowego, w wyniku stosowania antybiotyków.
PL 232 906 Β1
Przykład VI
W celu potwierdzenia zdolności nowego szczepu Lactobacillus plantarum PL4 do przeżycia pasażu przez górne partie przewodu pokarmowego: żołądek i dwunastnicę przeprowadzono badanie jego oporności na działanie soku żołądkowego i soli żółci.
1. Oznaczenie oporności szczepu Lactobacillus plantarum PL4 na sztuczny sok żołądkowy.
W celu oznaczenie stopnia oporności bakterii Lactobacillus plantarum PL4 na pH soku żołądkowego posłużono się metodą Clarka, którą zmodyfikowano w ten sposób, iż zamiast stężonego kwasu solnego zastosowano sztuczny sok żołądkowy o pH równym 2.5, według następującego przepisu: 2.0 g NaCI, 3.2 g pepsyny w 7 ml 36% HCI o pH 1.2 rozpuszczono w 1000 ml wody destylowanej. Jałowy (po przesączeniu) sztuczny sok żołądkowy rozlewano po 1 ml do jałowych probówek, a następnie do każdej z nich kolejno dodawano po 100 μΙ świeżej (24 godzinnej) hodowli szczepu Lactobacillus plantarum PL4 o znanej gęstości. Mieszaninę inkubowano przez 20 min. w 37°C w warunkach ściśle beztlenowych. Po upływie wyznaczonego czasu mieszaninę starannie mieszano i wykonywano posiew dziesiętny w celu określenia otrzymanej gęstości końcowej. Wyniki podano w Tabeli nr 15.
Tabela 15
Przeżywalność szczepu Lactobacillus plantarum PL4 w sztucznym soku żołądkowym
| Liczba bakterii probiotycznych podana w c.f.u./ml | ||
| Badany szczep | Czas 0 min. (wyjściowy) | Po 20 min. inkubacji w sztucznym soku żołądkowym o pH 2.5 |
| Lactobacillus ulantarum PL4 | 1,0x10’ | 2,0xl0? |
2. Oznaczenie oporności szczepu Lactobacillus plantarum PL4 na sole żółci.
Oporność na sole żółci oznaczono w oparciu o metodę Dashkevicz'a i Feighner'a. Metoda ta polegała na dodaniu do agaru MRS barwnika wskaźnikowego - purpury bromokrezolowej [POCH] w ilości 0,17 g/l oraz soli żółci [OXGAL, Difco], w pięciu kolejnych stężeniach: 1 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 10 g/l, 20 g/l. Na tak przygotowane, stałe podłoża posiewano metodą redukcyjną po 100 μΙ hodowli badanego szczepu Lactobacillus plantarum PL4, który następnie inkubowano w standardowych warunkach beztlenowych przez 48 godz. Po zakończonej inkubacji kolonie badanego szczepu opornego na dane stężenie soli żółci nabierały koloru jasno żółtego, jak również podłoże wzrostowe zmieniało swoje zabarwienie z fioletowego na żółte. Intensywność wzrostu badanego szczepu i zabarwienia podłoża na kolor żółty oceniono w skali półilościowej od - do +++. Wyniki podano w Tabeli 16 oraz na poniższej rycinie.
Tabela 16
Oporność szczepu z rodzaju Lactobacillus na sole żółci w stężeniach: 1, 2, 5,10, 20 g/l
| Sole żółci stężenie | Lactobacillus plantarum PL4 |
| i g/l | +++ |
| 2 g/l | 4-++ |
| 5 g/l | +++ |
| 10 g/l | +++ |
| 20 g/l | +++ |
Fig. 10. przedstawia oporność szczepu Lactobacillus plantarum PL4 na sole żółci w stężeniach: 1,2, 5,10,20 g/l.
PL 232 906 Β1
Przeprowadzone badania wykazały, że szczep Lactobacillus plantarum PL4 jest w stanie z powodzeniem przetrwać działanie soku żołądkowego i żółci w trakcie przechodzenia przez górne piętra przewodu pokarmowego po doustnym podaniu.
Przykład VII
Zbadano również wrażliwość nowego szczepu Lactobacillus plantarum PL4 na wybrane antybiotyki w celu wykazania jego bezpieczeństwa w stosowaniu do przewodu pokarmowego, jak i możliwości przetrwania w trakcie leczenia podstawowymi antybiotykami stosowanymi do leczenia wcześniej powstałych biegunek związanych ze stosowaniem antybiotyków.
Oznaczenie wrażliwości na antybiotyki z wykorzystaniem metody dyfuzyjno-krążkowej wg. Kirby-Bauera.
W celu zbadania lekoopomości szczepu L. plantarum PL4 metodą dyfuzyjno-krążkową, zawiesinę hodowli (OD= 0,5 w skali McFarlanda) rozprowadzono na podłożu agarowym MRS (Oxoid) na płytce Petriego. Następnie podłoże z naniesioną zawiesiną pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut w celu jej wysuszenia. Po tym czasie na płytkę naniesiono za pomocą jałowej pęsety krążki nasączone odpowiednimi antybiotykami. Inkubację prowadzono w warunkach beztlenowych, przez 24 h w temp. 37°C. Po inkubacji zmierzono strefy zahamowanego wzrostu szczepu bakteryjnego wokół krążka z antybiotykiem (w mm). Odczytu lekoopomości różnicującego szczep L. plantarum PL4 na wrażliwy i oporny, dokonano zgodnie z wskazaniami interpretacyjnymi EUCAST. W badaniach wykorzystano następujące antybiotyki: penicylina, ciprofloksacyna, cefaklor, doksycyklina, oksacylina, kotrymoksazol, erytromycyna, ampicylina, klindamycyna, wankomycyna, gentamycyna, metronidazol, (Oxoid).
Tabela 17
Wielkość stref zahamowania wzrostu otrzymane dla badanego szczepu L. plantarum PL4 oraz szczepu wzorcowego L. plantarum ATCC 8014
| Antybiotyk Stężenie | L. pinntarmn PL4 | L. plantarum ATCC 8014 |
| Penicylina (P) [1 pg] | 10 min | 13 mm |
| Ciprofloksacyna (CIP) 15 Mg] | 10 mm | 11 mm |
| Cefaklor (CEC) [30Mg! | 29 mm | 32 mm |
| Doksacyklina (DO) [30pg| | 30 mm | 26 mm |
| Oksacylina (OX) (1 Mgl | 6 mm | 11 mm |
| Kotrymoksazol (SXT) [25 pg] | 21 mm | 25 mm |
| Erytromycyna (E) [15 pg] | 31 mm | 26 mm |
| Ampicylina (AMP) [2 pg] | 32 mm | 32 mm |
| Klindamycyna (DA) [2 Mg] | 18 mm | 18 mm |
| Gentamycyna (CN) 130 Mgl | 19 mm | 18 mm |
| Wankomycyna (VA) (30 pg] | 6 mm | 6 mm |
| Metronidazol (Χ'ΓΓΖ) [5 Mg] | 6 mm | 6 mm |
PL 232 906 B1
Wykazano, że nowy szczep Lactobacillus plantarum PL4 wykazuje taki sam wzór oporności na wybrane antybiotyki jak szczep wzorcowy L. plantarum, co wskazuje na brak obecności genów kodujących oporność i stanowi o bezpieczeństwie jego stosowania. Ponadto, szczep Lactobacillus plantarum PL4 jest oporny na wankomycynę i metronidazol, podstawowe leki stosowane do leczenia biegunek związanych ze stosowaniem antybiotyków. Zatem ten szczep można stosować w trakcie leczenia tymi lekami, bez utraty jego żywotności w przewodzie pokarmowym.
Wykazano, że nowy szczep Lactobacillus plantarum PL4 wykazuje taki sam wzór oporności na wybrane antybiotyki jak szczep wzorcowy L. plantarum, co wskazuje na brak obecności genów kodujących oporność i stanowi o bezpieczeństwie jego stosowania. Ponadto, szczep Lactobacillus plantarum PL4 jest oporny na wankomycynę i metronidazol, podstawkowe leki stosowane do leczenia biegunek związanych ze stosowaniem antybiotyków. Zatem ten szczep można stosować w trakcie leczenia tymi lekami bez utraty jego żywotności w przewodzie pokarmowym.
Powyższe przykłady wykazują, że szczep Lactobacillus plantarum PL4 ma znacznie większą i wszechstronną aktywność w stosunku do znanych szczepów tego gatunku.
Zatem, wykazane w badaniach swoiste i unikalne właściwości szczepu Lactobacillus plantarum PL4 wskazują na możliwość jego zastosowania jako probiotyku w produktach żywnościowych ze względu na bezpośrednie działanie na czynniki bakteryjne i grzybicze biegunek oraz działanie uszczelniające i przeciwzapalne na błonę śluzową jelit. Zatem w szczególności szczep Lactobacillus plantarum PL4 może być zalecany w:
- przywracaniu prawidłowej mikroflory przewodu pokarmowego w stanach jej zaburzenia po leczeniu antybiotykami, przywracaniu prawidłowej mikroflory przewodu pokarmowego we stanach jej zaburzenia u osób starszych,
- zapobieganiu i skracaniu przebiegu biegunek bakteryjnych powodowanym przez patogenne bakterie,
- zapobieganiu grzybicy przewodu pokarmowego po leczeniu antybiotykami,
- zapobieganiu i skracaniu przebiegu biegunek związanych z stosowaniem antybiotyków.
Claims (1)
- Zastrzeżenie patentowe1. Nowy szczep Lactobacillus plantarum oznaczony symbolem PL4 zdeponowany, zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu w dniu 18 listopada 2015 pod numerem B/00104.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415947A PL232906B1 (pl) | 2016-01-28 | 2016-01-28 | Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL4 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415947A PL232906B1 (pl) | 2016-01-28 | 2016-01-28 | Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL4 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL415947A1 PL415947A1 (pl) | 2017-07-31 |
| PL232906B1 true PL232906B1 (pl) | 2019-08-30 |
Family
ID=59383824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL415947A PL232906B1 (pl) | 2016-01-28 | 2016-01-28 | Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL4 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL232906B1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL245526B1 (pl) * | 2022-09-14 | 2024-08-19 | Prolab Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Spolka Komandytowa | Szczep Lactobacillus plantarum PL8 i jego zastosowanie |
-
2016
- 2016-01-28 PL PL415947A patent/PL232906B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL415947A1 (pl) | 2017-07-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Strus et al. | The in vitro activity of vaginal Lactobacillus with probiotic properties against Candida | |
| Pascual et al. | Lactobacillus rhamnosus L60, a potential probiotic isolated from the human vagina | |
| Sandes et al. | Selection of new lactic acid bacteria strains bearing probiotic features from mucosal microbiota of healthy calves: Looking for immunobiotics through in vitro and in vivo approaches for immunoprophylaxis applications | |
| AU2017285211A1 (en) | Treatment of clostridium difficile infection | |
| Aziz et al. | An assessment of the aggregation and probiotic characteristics of Lactobacillus species isolated from native (desi) chicken gut | |
| Strompfová et al. | Isolation and characterization of faecal bifidobacteria and lactobacilli isolated from dogs and primates | |
| KR101781211B1 (ko) | 락토바실러스 살리바리우스 kctc18458p 신균주 또는 이의 배양액을 포함하는 생균제 조성물 | |
| Mohsin et al. | Antagonistic activity of bacteriocin-producing Lactobacillus against Candida spp | |
| AU2022465859B2 (en) | Limosilactobacillus reuteri for prolonging lifespan, resisting aging and reducing fat, and product thereof and use thereof | |
| Er et al. | Anticandidal activities of lactic acid bacteria isolated from the vagina | |
| EP3818985A1 (en) | Lactobacillus fermentum pl9 and its application | |
| Bouridane et al. | Technological and probiotic traits of the lactobacilli isolated from vaginal tract of the healthy women for probiotic use | |
| KR101201337B1 (ko) | 신규한 락토바실러스속 유산균 복합 균주를 포함하는 사료첨가제 | |
| KR101201420B1 (ko) | 신규 락토바실러스 존슨니 및 이를 포함하는 사료첨가제 조성물 | |
| KR101098946B1 (ko) | 신규한 락토바실러스 살리바리우스 균주 및 이를 함유하는 사료첨가제 조성물 | |
| PL232906B1 (pl) | Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL4 | |
| CZ2014565A3 (cs) | Kmeny laktobacilů produkující látky účinné proti vaginálním patogenům, jejich použití a hygienické prostředky je obsahující | |
| KR100523256B1 (ko) | 결장 암 세포 및 유해 미생물 증식 억제 활성과 장내정착력이 뛰어난 신규 내산성 락토바실러스 애시도필러스 Probio-40 | |
| Amin et al. | Isolation and identification of Lactobacillus species from the vagina and their antimicrobial properties | |
| KR100736517B1 (ko) | 장내 유해세균 억제능을 갖는 락토바실루스 존소니이 아이디씨씨 9203 | |
| ES2927904T3 (es) | Lactobacillus amylovorus SGL 14: actividad probiótica y reducción de oxalato entérico | |
| PL239868B1 (pl) | Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL5 i jego zastosowanie | |
| PL230548B1 (pl) | Nowy szczep Lactobacillus plantarum PL3, jego metabolit oraz zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum PL3 i jego metabolitu | |
| KR101765197B1 (ko) | 락토바실러스 속 미생물의 오토인듀서-2 신호활성 분석용 최적배지 조성물 및 이를 이용한 분석방법 | |
| RU2835581C1 (ru) | Способ подбора пробиотических и аутопробиотических штаммов микроорганизмов по устойчивости к цитостатикам при терапии колоректального рака |