PL232685B1 - Preparaty roślinne do zastosowania w leczeniu nosemozy u pszczół i poprawy ich odporności - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są dodawane do pokarmów pszczelich preparaty, w postaci ekstraktów chloroformowych, etanolowych czy wodnych, sporządzanych z korzeni, łodyg, liści lub owoców roślin należących do rodzaju Eleutherococcus, znajdujących zastosowanie zarówno w leczeniu nosemozy u pszczół miodnych, wywołanej zakażeniem grzybami takimi jak, Nosema apis czy Nosema ceranae, jak i poprawie ich odporności.

Dotychczas, w leczeniu nosemozy u pszczół, stosuje się powszechnie leki na bazie fumagiliny, substancji wyizolowanej z grzyba Aspergillus fumigatus, której działanie polega jedynie na hamowaniu aktywności enzymu aminopeptydazy metioninowej MetAP-2, bez niszczenia zarodników Nosema spp., co w konsekwencji prowadzi do rozwijania się oporności grzyba na ten antybiotyk.

Ponadto, fumagilina trudno rozpuszcza się w wodzie, będącej podstawą syropów cukrowych, przez co konieczne jest stosowanie różnych dodatków chemicznych zwiększających rozpuszczalność antybiotyku w roztworach wodnych, co z kolei grozi możliwością przenikania samej fumagiliny lub produktów jej metabolizmu do miodu. W leczeniu nosemozy stosowane są też mieszanki ziołowe, jak np. wyciąg z kory dębu, jednakże działanie takich preparatów nie jest dostatecznie skuteczne w stosunku do organizmów wywołujących mikrosporydiozy u pszczół.

Inny, znany z opisu patentowego MX 2011011839, sposób zapobiegania i zwalczania nosemozy u pszczół, polega na wyciszaniu wybranych genów Nosema spp., z zastosowaniem konstruktów genetycznych lub cząsteczek kwasów nukleinowych - dsRNAs, np. siRNAs, miRNAs and shRNAs - funkcjonalnie związanych z białkami penetrującymi komórkę.

Jak wykazuje praktyka, metoda ta również nie gwarantuje dostatecznej skuteczności zwalczania nosemozy u pszczół, dodatkowo wiąże się z koniecznością użycia drogich technik otrzymywania i oczyszczania genów, a sama idea aplikowania pszczołom preparatów na bazie modyfikowanych genetycznie związków jest dyskusyjna i nie jest powszechnie akceptowana.

Ze zgłoszenia patentowego P.408774, znany jest również preparat do leczenia mikrosporydioz, a zwłaszcza nosemozy u pszczół, zawierający jedną z rozprowadzonych homogenicznie, amidowych pochodnych protoporfiryny. Z uwagi na fakt, iż miód i inne produkty pszczele wykorzystywane są przez człowieka jako produkty żywnościowe, lecznicze czy suplementy diety, leczenie pszczół powinno opierać się o dobrze poznane, bezpieczne preparaty, łatwo degradowalne i nie powodujące zmian genetycznych w organizmach pszczół.

Rośliny należące do rodzaju Eleutherococcus, takie jak np. Eleutherococcus cissifolius, Eleutherococcus divaricatus Eleutherococcus giraldii, Eleutherococcus henryi, Eleutherococcus lasiogyne, Eleutherococcus leucorrhizus, Eleutherococcus nodiflorus, Eleutherococcus rehderianus, Eleuthero-coccus senticosus Eleutherococcus sessiliflorus, Eleutherococcus setulosus, Eleutherococcus siehol-dianus, Eleutherococcus spinosus czy też Eleutherococcus trifoliatus, to źródło ogromnej ilości związków biologicznie czynnych jak np. eleuterozydy, eleuterany, fenolokwasy, depsydy, polisach arydy, ci-wujianozydy, akantopanaksozydy czy olejki eteryczne, wykazujących działanie bakterio- i grzybobójcze oraz immunostymulacyjne i adaptogenne u zwierząt kręgowych, w tym i człowieka.

Przeprowadzone badania kliniczne wskazują, że podawanie pacjentom substancji otrzymanych jako ekstrakty z roślin należących do rodzaju Eleutherococcus, zwiększa odporność niespecyficzną organizmu na szereg chorób poprzez wpływanie na ekspresję genów odpowiedzialnych za skuteczną walkę z czynnikami stresogennymi oraz silne działanie antyoksydacyjne (Committee on herbal medicinal products (HMPC). Reflection paper on the adaptogenic concept. Doc. Ref. EMEA/--/HMPC/102655/2007). W znanym stanie techniki nie są znane żadne preparaty otrzymywane z roślin należących do rodzaju Eleutherococcus, mających zastosowanie w leczeniu pszczół.

Celem wynalazku było opracowanie skutecznego i nie powodującego skutków ubocznych, preparatu roślinnego do zwalczania grzybów z rodzaju Nosema i hamowania rozwoju ich zarodników, znajdującego zastosowanie w leczeniu mikrosporydioz u pszczół miodnych.

Nieoczekiwanie okazało się, że grupa specjalnie wyselekcjonowanych ekstraktów z różnych części roślin z rodzaju Eleutherococcus, znajduje zastosowanie w preparatach do leczenia nosemozy u pszczół i podnosi ich odporność.

Preparaty z roślin należących do rodzaju Eleutherococcus, według wynalazku charakteryzują się tym, że zostały wyekstrahowane z różnych części roślin z rodzaju Eleutherococcus do zastosowania w leczeniu nosemozy u pszczół i podnoszenia ich odporności.

Korzystnym jest jeśli rośliny należące do rodzaju Eleutherococcus, to np. Eleutherococcus cissi-folius, Eleutherococcus divaricatus Eleutherococcus giraldii, Eleutherococcus henryi, Eleutherococcus lasiogyne, Eleutherococcus leucorrhizus, Eleutherococcus nodiflorus, Eleutherococcus rehderianus, Eleutherococcus senticosus, Eleutherococcus sessiliflorus, Eleutherococcus setulosus, Eleutherococ-cus sieboldianus, Eleutherococcus spinosus czy też Eleutherococcus trifoliatus.

Korzystnym jest jeśli ekstrakty sporządzone są z korzeni, łodyg, liści lub owoców roślin należących do rodzaju Eleutherococcus, z użyciem chloroformu, etanolu czy też gorącej wody.

Korzystnym jest również jeśli ekstrakty roślinne stosowane są w ilości od 1x10-3 do 1 na 1000 j.w. pokarmu.

Jak wykazano w przykładach, preparaty według wynalazku, to substancje nietoksyczne, wykazujące wysoki poziom terapeutyczny zakażeń pszczół miodnych grzybami Nosema spp., skutecznie wpływają na wzmocnienie układu odpornościowego pszczół, wyrażonego wzrostem aktywności oksydazy fenolowej.

Wynalazek przedstawiono w poniższych przykładach wykonania. P r z y k ł a d 1 W kilku kolbach miarowych umieszczono po 50 g wysuszonych i rozdrobnionych korzeni Eleutherococcus senticosus, które zalewano 500 ml chloroformu. Po 24 godz. maceracji, próbki poddano działaniu ultradźwięków przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po dekantacji, roztwory przesączano przez bibułę filtracyjną. Czynność tę powtórzono jeszcze dwukrotnie, przy czym w ostatniej operacji zmniejszono ilość chloroformu do 200 ml. Otrzymane ekstrakty zagęszczono, wysuszono zliofilizowano. 100 mg liofilizatu rozpuszczono w 100 ml wody i 4 ml takiego roztworu dodano do pokarmu dla pszczół otrzymanego przez rozpuszczenie 500 g cukru spożywczego w 500 g wody.

Otrzymano pokarm płynny z ekstraktem z korzeni Eleutherococcus senticosus w ilości 4x10-3 j.w. na 1000 j.w. pokarmu. P r z y k ł a d 2

Próbki korzeni Eleutherococcus senticosus przygotowane jak w przykładzie 1, ekstrahowano zgodnie z procedurą z przykładu 1, używając odpowiednio 2 x po 500 ml i w ostatniej fazie 300 ml 75% roztworu etanolu. 135 mg otrzymanego liofilizatu równomierne wymieszano z 1,0 kg cukru pudru i 0,25 kg miodu ogrzanego do temp. 50°C. Otrzymano ciasto zawierające 1,2x10-1 j.w. ekstraktu na 1000 j.w. pokarmu. P r z y k ł a d 3 W kilku kolbach miarowych umieszczono po 50 g wysuszonych i rozdrobnionych łodyg Eleuthe-rococcus henryi, które zalewano 500 ml wrzącej wody. Po 10 minutach preparaty przesączono, zamrożono i poddano liofilizacji. 1 g liofilizatu rozpuszczono w 1 litrze ddH2O, po czym 10 ml tego roztworu dodano do 500 g cukru spożywczego rozpuszczonego w 500 g wody. Otrzymano pokarm płynny zawierający 10x10-3 j.w. ekstraktu w 1000 j.w. pokarmu. P r z y k ł a d 4 W kilku kolbach miarowych umieszczono po 50 g wysuszonych i rozdrobnionych łodyg Eleutherococcus henryi, które zalano 500 ml wrzącej wody. Po 10 minutach preparaty przesączono, zamrożono i poddano liofilizacji. 1 g liofilizatu rozpuszczono w 1 litrze ddH2O i 1 ml tego roztworu dodano do 500 g cukru spożywczego rozpuszczonego w 500 g wody. Otrzymano pokarm płynny zawierający 1x10-3 j.w. ekstraktu w 1000 j.w. pokarmu. P r z y k ł a d 5 W kilku kolbach miarowych umieszczono 50 g mieszaniny wysuszonych i rozdrobnionych korzeni Eleutherococcus giraldii i Eleutherococcus spinosus, a także owoców Eleutherococcus lasiogyne i Eleu-therococcus trifoliatus, które zalano 500 ml chloroformu. Po 24 godz. maceracji próbki umieszczono poddano działaniu ultradźwięków przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po dekantacji, roztwory przesączano przez bibułę filtracyjną. Czynność tę powtórzono jeszcze dwukrotnie, przy czym w ostatniej operacji zmniejszono ilość chloroformu do 200 ml. Otrzymane ekstrakty zagęszczono, wysuszono zliofilizowano. 120 mg liofilizatu równomierne wymieszano z 1,0 kg cukru pudru i 0,25 kg miodu ogrzanego do temp. 50°C. Otrzymano ciasto zawierające 9,5x10-2 j.w. ekstraktu na 1000 j.w pokarmu. P r z y k ł a d 6 W kilku kolbach miarowych umieszczono 50 g mieszaniny wysuszonych i rozdrobnionych łodyg Eleutherococcus nodiflorus i Eleutherococcus rehderianus, a także owoców Eleutherococcus sessiliflo-rus, które zalewano 500 ml 75% roztworu etanolu. Po 24 godz. maceracji próbki umieszczono w łaźni ultradźwiękowej i poddano działaniu ultradźwięków przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po de-kantacji, roztwory przesączano przez bibułę filtracyjną. Czynność tę powtórzono jeszcze dwukrotnie, przy czym w ostatniej operacji zmniejszono ilość 75% roztworu etanolu do 200 ml.

Otrzymane ekstrakty zagęszczono i poddano liofilizacji. 500 mg liofilizatu zmieszano z 250 g hydrolizatu skrobiowego rozpuszczonego w 250 mg przegotowanej wody. Otrzymano pokarm zawierający 1,0 j.w. ekstraktu na 1000 j.w pokarmu. P r z y k ł a d 7 W kilku kolbach miarowych umieszczono 50 g mieszaniny wysuszonych i rozdrobnionych owoców Eleutherococcus setulosus, łodyg Eleutherococcus leucorrhizus oraz korzeni Eleutherococcus sie-boldianus, które zalano 500 ml wrzącej wody. Po 10 minutach preparaty przesączono, zamrożono i poddano liofilizacji. 9,5 g liofilizatu rozpuszczono w 1 litrze ddH2O i 1 ml tego roztworu dodano do 500 g cukru spożywczego rozpuszczonego w 500 g wody. Otrzymano pokarm płynny zawierający 9,5x10-2 j.w. ekstraktu w 1000 j.w. pokarmu. Sporządzając pokarm stały, wymieszano równomiernie 120 mg liofilizatu z 1,0 kg cukru pudru i 0,25 kg miodu ogrzanego do temp. 50°C. Otrzymano ciasto zawierające 9,5x10-2 j.w. ekstraktu na 1000 j.w. pokarmu. P r z y k ł a d 8. Działanie preparatów według wynalazku na leczenie nosemozy

Otrzymane w przykładach 1-7, płynne i stałe pokarmy zawierające wyekstrahowane wyciągi z różnych części roślin z rodzaju Eleutherococcus, używano w temperaturze pokojowej do karmienia pszczół sztucznie zakażonych Nosema spp. oraz pszczół zdrowych dla wykazania ewentualnego stopnia toksyczności. W każdym z eksperymentów, dla każdej grupy pokarmowej, w 10 standardowych klatkach utrzymywano 40 pszczół sztucznie zakażonych Nosema spp. Pszczoły karmiono pokarmami kolejno otrzymanymi wg poszczególnych przykładów. W końcowej fazie, z pszczół leczonych wyciągami wykonywano standardowe rozciery z 10 pszczół w dwóch powtórzeniach, do sporządzenia preparatów mikroskopowych. Zarodniki liczono w komorze Burkera obserwowanej w mikroskopie optycznym Olympus BX61 i porównywano z preparatem sporządzonym z rozcieru z 10 pszczół zakażonych ale nie leczonych wyciągami roślin z rodzaju Eleu-therococcus, czyli karmionych czystym pokarmem. W zależności od użytego w pokarmie wyciągu, w obrazach mikroskopowych nie zaobserwowano zarodników Nosema spp. co wskazuje na wyeliminowanie choroby - pokarmy z wyciągami z przykładów 1 i 2 - bądź zaobserwowano zmniejszoną ich ilość w stosunku do kontroli. Podczas gdy w grupie pszczół kontrolnych, nie leczonych, zakażenie rozwinęło się do poziomu 28 mln zarodników Nosema spp./pszczołę, to w grupie pszczół którym podawano pokarm opisany w przykładach 3-7, liczba zarodników zmalała do granic do 1,0-5,0 min zarodników/pszczołę. Spadek liczby zarodników Nosema spp. po dokarmianiu pszczół poszczególnymi preparatami otrzymanymi w przykładach od 1 do 7, w stosunku do kontroli - ilości zarodników u pszczół karmionych czystym pokarmem - przedstawiono graficznie na rysunku jako fig. 1.

Wyniki jednoznacznie wskazują na dużą skuteczność preparatu według wynalazku. P r z y k ł a d 9. Badanie toksyczności preparatów według wynalazku na organizmy pszczół

Dla każdej grupy pokarmowej, w 10 klatkach umieszczono po 40 zdrowych pszczół i karmiono je pokarmami zawierającymi wyciągi otrzymane w przykładach od 1 do 7. Dla porównania analogiczną liczbę pszczół, jako kontrole, karmiono czystym pokarmem. Po 21 dniach porównano liczbę żywych pszczół w poszczególnych klatkach z kontrolą. Liczba pszczół w grupach badawczych wynosiła od 19 do 26 sztuk, natomiast średnia żywych pszczół w kontrolach wynosiła 23 sztuki.

Przeżywalność pszczół w poszczególnych klatkach w porównaniu do kontroli, przedstawiono graficznie - fig. 2.

Mając na względzie naturalną umieralność pszczół, należy stwierdzić, iż preparaty według wynalazku to substancje nietoksyczne i w pełni bezpieczne jako dodatki do pszczelich pokarmów. P r z y k ł a d 10. Wpływ preparatów według wynalazku na wzrost odporności pszczół miodnych Wzrost odporności pszczół po dokarmianiu pszczół pokarmami zawierającymi wyciągi otrzymane w przykładzie 1-7, wykazano poprzez wzrost w aktywności oksydazy fenolowej.

Dla każdej grupy pokarmowej, w 10 klatkach umieszczono po 40 zdrowych pszczół, które karmiono syropem i ciastem zawierającymi wyciągi według wynalazku i analogicznie grupę kontrolną dokarmianą czystym pokarmem. Po 3 dniach, od 10 pszczół z każdej grupy, pobrano hemolimfę w celu określenia poziomu oksydazy fenolowej. W grupie pszczół karmionych syropem cukrowym i ciastem z dodatkiem preparatów według wynalazku, zaobserwowano wzrost aktywności oksydazy fenolowej w hemolimfie pszczół w granicach od 7,5 do prawie 14 razy w stosunku do grupy kontrolnej.

Wzrost w aktywności oksydazy fenolowej po dokarmianiu pszczół preparatami otrzymanymi w przykładach od 1 do 7, w stosunku do oksydazy grupy kontrolnej pszczół karmionych czystym pokarmem, przedstawiono na rysunku - fig. 3.

Claims (4)

Zastrzeżenia patentowe

1. Preparaty z roślin należących do rodzaju Eleutherococcus, do zastosowania w leczeniu nose-mozy u pszczół i podnoszenia ich odporności.

2. Preparaty według zastrz. 1, znamienne tym, że rośliny należące do rodzaju Eleutherococcus, to Eleutherococcus cissifolius, Eleutherococcus divaricatus, Eleutherococcus giraldii, Eleutherococcus henryi, Eleutherococcus lasiogyne, Eleutherococcus leucorrhizus, Eleutherococcus nodiflorus, Eleutherococcus rehderianus, Eleutherococcus senticosus, Eleutherococcus se-ssiliflorus, Eleutherococcus setulosus, Eleutherococcus sieboldianus, Eleutherococcus spino-sus czy też Eleutherococcus trifoliatus.

3. Preparaty według zastrzeż. 1 i 2 sporządzone są z korzeni, łodyg, liści lub owoców roślin należących do rodzaju Eleutherococcus.

4. Preparaty według zastrzeż. 1, 2 i 3 ekstrahowane są użyciem chloroformu, etanolu czy też gorącej wody.