PL230553B1 - Sposob wytwarzania polimeru z promotorowa sekwencja TATAAA w sztucznej kasecie TATA i zastosowanie tego polimeru do rozpoznawania i/lub selektywnego oznaczania szescionukleotydowej sekwencji DNA - Google Patents
Sposob wytwarzania polimeru z promotorowa sekwencja TATAAA w sztucznej kasecie TATA i zastosowanie tego polimeru do rozpoznawania i/lub selektywnego oznaczania szescionukleotydowej sekwencji DNAInfo
- Publication number
- PL230553B1 PL230553B1 PL412848A PL41284815A PL230553B1 PL 230553 B1 PL230553 B1 PL 230553B1 PL 412848 A PL412848 A PL 412848A PL 41284815 A PL41284815 A PL 41284815A PL 230553 B1 PL230553 B1 PL 230553B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- tataaa
- layer
- mip
- tata
- dna
- Prior art date
Links
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 33
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 18
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 18
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 17
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 17
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 14
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 14
- 102000006467 TATA-Box Binding Protein Human genes 0.000 claims description 14
- 108010044281 TATA-Box Binding Protein Proteins 0.000 claims description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 14
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 13
- 238000000157 electrochemical-induced impedance spectroscopy Methods 0.000 claims description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 12
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 11
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 claims description 11
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 10
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 claims description 10
- 229920000344 molecularly imprinted polymer Polymers 0.000 claims description 10
- 238000001903 differential pulse voltammetry Methods 0.000 claims description 8
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 8
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 8
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 7
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 7
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 7
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 7
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 7
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 claims description 6
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 claims description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 6
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 6
- 125000000175 2-thienyl group Chemical group S1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 claims description 5
- 125000000848 adenin-9-yl group Chemical group [H]N([H])C1=C2N=C([H])N(*)C2=NC([H])=N1 0.000 claims description 4
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 4
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 4
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 claims description 4
- 238000002129 infrared reflectance spectroscopy Methods 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 3
- 229910001914 chlorine tetroxide Inorganic materials 0.000 claims description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- CDDFFMJAOKTPRF-UHFFFAOYSA-M tetrabutylazanium;chlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC CDDFFMJAOKTPRF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 91
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 14
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 10
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 7
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 6
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical compound C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 3
- ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 2-deoxy-D-ribose Chemical group OC[C@@H](O)[C@@H](O)CC=O ASJSAQIRZKANQN-CRCLSJGQSA-N 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N potassium nitrate Chemical compound [K+].[O-][N+]([O-])=O FGIUAXJPYTZDNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 229940035637 spectrum-4 Drugs 0.000 description 2
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 2
- 150000003577 thiophenes Chemical class 0.000 description 2
- QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-[3-[bis(2-chloroethyl)amino]phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=CC(N(CCCl)CCCl)=C1 QDGAVODICPCDMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 4- [2- (6-amino-9H-purin-9-yl) ethoxy] phenyl Chemical group 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 238000004847 absorption spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000008151 electrolyte solution Substances 0.000 description 1
- 238000006056 electrooxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 1
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000123 polythiophene Polymers 0.000 description 1
- 235000010333 potassium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polimeru z promotorową sekwencją TATAAA w sztucznej kasecie TATA oraz zastosowanie tego polimeru do rozpoznawania i/lub selektywnego oznaczania sześcionukleotydowej sekwencji DNA. W szczególności wynalazek obejmuje zastosowanie tego polimeru do badania jego oddziaływań z wybranymi z białka TBP aminokwasami oraz w czujnikach chemicznych do rozpoznawania i/lub selektywnego oznaczania sześcionukleotydowej sekwencji DNA.
Kaseta TATA (ang. TATA box) to sekwencja dwuniciowego DNA (ang. Double-stranded DNA, dsDNA) występująca w wielu promotorach genów eukariotycznych. W kasecie tej, w odległości około 25 nukleotydów od miejsca rozpoczęcia transkrypcji, znajduje się sekwencja 5'-TATAAA-3'. Do sekwencji tej przyłącza się białko wiążące TATA (ang. TATA-binding protein, TBP). Białko TBP działa jako element czynnika transkrypcyjnego, który umożliwia polimerazie RNA rozpoznanie sekwencji promotora TATAAA i rozpoczęcie transkrypcji.
Różnorodność zastosowań polimerów wdrukowanych molekularnie, (ang. molecularly imprinted polymers, MIPs) i ich zalety wskazują, że MlP-y można bezpośrednio zastosować jako matryce nici kwasów nukleinowych. To wdrukowanie molekularne sprawia, że wdrukowana pojedyncza nić DNA, spełniająca rolę szablonu, odciska swój ślad w polimerze. Po usunięciu tego szablonu w polimerze pozostaje wnęka molekularna, która pod względem wielkości, kształtu, liczby i orientacji miejsc rozpoznających odpowiada wdrukowanej sekwencji DNA.
Do budowy MIP ze sztuczną kasetą TATA i jej promotorową sekwencją TATAAA zastosowaliśmy dwa elektroaktywne monomery funkcyjne, pochodne bitiofenu podstawione zasadami nukleinowymi jeden adeniną (A), 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metan] 1, a drugi tyminą (T), 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylometylo)fenylu 2, oraz monomer sieciujący (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 3. Adeninowy i tyminowy monomer funkcyjny zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy w celu przyłączenia szablonu TATAAA w kompleksie pre-polimeryzacyjnym za pomocą parowania zasad typu Watsona-Cricka, A-T i A-T, według procedury opisanej w naszym zgłoszeniu patentowym nr P. 409328 z dnia 29 sierpnia 2014.
Monomery te uczestniczyły w molekularnym wdrukowaniu oligonukleotydu TATAAA, zastosowanego jako szablon, za pomocą elektropolimeryzacji. W wyniku tej elektropolimeryzacji powstał MIP, w którym wokół oligonukleotydu TATAAA wytworzył się komplementarny łańcuch heksameru tiofenowego podstawiony zasadami nukleinowymi o sekwencji ATATTT.
Po wyekstrahowaniu oligonukleotydu TATAAA wytworzonego we wnęce molekularnej MIP-u, heksamer ATATTT hybrydyzował oligonukleotyd TATAAA tworząc sztuczną promotorową sekwencję TATAAA. Hybrydyzowanie to potwierdziliśmy za pomocą wybranych metod analitycznych, w tym pomiarów oporności przeniesienia ładunku za pomocą elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (ang. electrochemical impedance spectroscopy, EIS), impedimetrycznych pomiarów pojemności (ang. capacitive impedimetry, Cl) w warunkach analizy przepływowo-wstrzykowej (ang. flow-injection analysis, FIA), odbiciowo-absorpcyjnej spektroskopii w podczerwieni (ang. infra-red reflectance-absorption spectroscopy, IRRAS) i różnicowej woltamperometrii pulsowej (ang. differential pulse voltammetry, DPV). Opracowanie i przygotowanie warstw MIP z wyekstrahowanym oligonukleotydem TATAAA oraz ich połączenie z odpowiednimi przetwornikami rozpoznawania chemicznego sygnału na sygnał analityczny doprowadziło do wytworzenia selektywnych czujników chemicznych do wykrywania pojedynczych niedopasowań nukleozasad w sekwencji oznaczanego oligonukleotydu. W naszym czujniku chemicznym, zbudowanym z warstwy rozpoznającej kwasy nukleinowe i przetwornika sygnału chemicznego, nie ma potrzeby wbudowania znacznika, np. barwnika fluorescencyjnego niezbędnego do tradycyjnego fluorescencyjnego obrazowania DNA {J. Liu, et al., Chem. Rev. 2009, 109, 1948}. W niniejszym wniosku przedstawiamy czujnik chemiczny, który służy do rozpoznawania i selektywnego oznaczania wybranych oligonukleotydów za pomocą Cl.
Nie usuwając wdrukowanego oligonukleotydu TATAAA z warstwy polimeru MIP, otrzymaliśmy polimer z wypełnionymi szablonem wnękami molekularnymi jako matrycę polimerową z promotorową sekwencją TATAAA w sztucznej kasecie TATA. W tej kasecie grupy fosforanowe i reszty deoksyrybozy cząsteczki szablonu TATAAA nie były związane z monomerami funkcyjnymi w kompleksie pre-polimeryzacyjnym. Dlatego do tych miejsc w sztucznej sekwencji promotorowej TATAAA chętnie przyłączały się wybrane cząsteczki aminokwasów występujące w TBP. Dlatego MIP z wbudowanymi sztucznymi kasetami TATA może rozpoczynać transkrypcję przyłączając czynniki transkrypcyjne. Znana jest już
PL 230 553 B1 elektrochemiczna platforma wiążąca TBP {Y. Zhang, et al.. Analyst 2014, 139, 2193}, lecz do jej budowy nie zastosowano MIP-ów.
W niniejszym wniosku zgłaszamy również do ochrony patentowej alternatywny sposób przygotowania rozpoznających oligonukleotydy MIP-ów za pomocą elektropolimeryzacji monomerów funkcyjnych w obecności PNA - elektrycznie nienaładowanego analogu DNA.
Zgodnie z wynalazkiem, sposób wytworzenia warstwy polimeru z promotorową sekwencją TATAAA w sztucznej kasecie TATA, do rozpoznawania wybranych aminokwasów występujących w białku wiążącym TATA (TBP) oddziałujących z kasetą TATA, metodą molekularnego wdrukowania prowadzącą do wytworzenia polimerów wdrukowanych molekularnie (MIP-ów), za pomocą polimeryzacji elektrochemicznej w warunkach potencjodynamicznych, gdzie jako monomery funkcyjne do elektropolimeryzacji stosuje się 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metan] 1 i 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylometylo)fenylu 2, a jako monomer sieciujący stosuje się (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 3, charakteryzuje się tym, że jako szablon/analit stosuje się sześcionukleotydową sekwencję DNA lub analog DNA, korzystnie peptydowy kwas nukleinowy (PNA), korzystniej analog oligonukleotydu TATAAA, tj. PNA-TATAAA.
Według wynalazku, do polimeryzacji stosuje się roztwór rozpuszczalników organicznych, korzystnie wody, acetonitrylu, toluenu i propanolu, o stosunku objętościowym jak, odpowiednio, 1,5 : 6 :1:1,5, lub w acetonitrylu, zawierający sześcionukleotydową sekwencję DNA lub analog DNA, odpowiednio, 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)-metan] 1, 1 -tyminooctan 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylo-metylo)fenylu 2, (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 3, korzystnie w stosunku molowym jak, odpowiednio, 1 : 2,5 : 1,25 : 25, oraz 0,1 M elektrolit podstawowy, korzystnie chloran(VII) tetrabutyloamoniowy, (TBA)CIO4.
Według wynalazku, stosuje się potencjał liniowo zmieniany cyklicznie w zakresie od 0 do 1,5 V, korzystnie w zakresie od 0,50 do 1,25 V, ze stałą szybkością zawierającą się w przedziale od 5 do 1000 mV/s, korzystnie 50 mV/s.
Ponadto wynalazek obejmuje zastosowanie warstwy rozpoznającego polimeru z promotorową sekwencją TATAAA w sztucznej kasecie TATA, otrzymanej sposobem według wynalazku, do wykrywania i/lub selektywnego oznaczania sześcionukleotydowej sekwencji DNA, w płynach ustrojowych pacjenta.
Korzystnie wynalazek ma zastosowanie do badań podstawowych obejmujących transkrypcję DNA z udziałem aminokwasów, takich jak: L-seryna, L-lizyna, kwas L-glutaminowy, L-asparagina, L-treonina, L-walina, L-fenyloalanina i L-leucyna z warstwą otrzymanego polimeru, z wykorzystaniem mikrograwimetrii piezoelektrycznej (PM) w warunkach analizy przepływowo-wstrzykowej (FIA).
Korzystnie wynalazek ma zastosowanie w inżynierii genetycznej, zwłaszcza do testów genetycznych przy wczesnym wykrywaniu dziedzicznych chorób genetycznych.
Korzystnie wynalazek ma zastosowanie jako warstwa elementu czujnika chemicznego do wykrywania i/lub selektywnego oznaczania sześcionukleotydowej sekwencji DNA, w płynach ustrojowych pacjenta, z wykorzystaniem impedimetrycznych pomiarów pojemności (Cl) w warunkach analizy przepływowo-wstrzykowej (FIA).
Korzystnie wynalazek ma zastosowanie do badania efektywności wdrukowania a następnie ekstrakcji szablonu TATAAA z warstwy MIP-TATAAA oraz unieruchomienia analitu TATAAA w warstwie MIPu za pomocą elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS) pomiarów oporności przeniesienia ładunku dla elektrody pokrytej warstwą MIP-TATAAA, albo różnicowej woltamperometrii pulsowej (DPV), albo odbiciowo-absorpcyjnej spektroskopii w podczerwieni (IRRAS).
Wynalazek jest bliżej przedstawiony poniżej w korzystnych przykładach wykonania, z odniesieniem do załączonych rysunków.
Schemat 1 Kaseta TATA z wybranymi aminokwasami występującymi w białku wiążącym TATA, TBP (Y. Kim, J. H. Geiger, S. Hahn and P. B. Sigler, Nature, 1993, 365, 512-520).
Fig. 1 Krzywe potencjodynamiczne dla acetonitrylowego roztworu 40 pM TATAAA-PNA, 0,05 mM adeninowego monomeru funkcyjnego 1, 0,1 mM tyminowego monomeru funkcyjnego 2, i 0,2 mM monomer sieciujący 3, w 0,1 M (TBA)CIO4, zarejestrowane na platynowej elektrodzie dyskowej o średnicy 1 mm dla siedmiu cykli zmian potencjału w zakresie od 0,50 do 1,25 V vs Ag/AgCI. Szybkość zmian potencjału wynosiła 50 mV/s.
Fig. 2 Widma elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS) dla próbnika redoks, 0,1 M K3[Fe(CN)6] i 0,1 M K4[Fe(CN)6], na platynowej elektrodzie dyskowej o średnicy 1 mm,
PL 230 553 B1 pokrytej warstwą MIP-TATAAA (krzywa 1) przed i (krzywa 2) po ekstrakcji szablonu TATAAA oraz (krzywa 3) po zanurzeniu elektrody z warstwą MIP-TATAAA z wyekstrahowanym szablonem na 15 min do roztworu 50 pM TATAAA. Pomiary EIS przeprowadziliśmy przykładając sinusoidalnie zmienne napięcie o amplitudzie 10 mV w zakresie częstotliwości od 0,2 Hz do 500 kHz, przy stałym potencjale polaryzacji elektrody pracującej równym potencjałowi obwodu otwartego. Warstwę MIP-TATAAA osadziliśmy w warunkach potencjodynamicznych w trakcie sześciu cykli zmian potencjału w zakresie potencjałów od 0,50 do 1,25 V vs Ag/AgCI, przy szybkości zmian potencjału 50 mV/s.
Fig. 3 Widma odbiciowo-absorpcyjnej spektroskopii w podczerwieni (IRRAS) dla osadzonej na pozłacanym szkiełku mikroskopowym warstwy (1) TATAAA, (2) polimeru niewdrukowanego (NIP) oraz MIP-TATAAA (3) przed i (4) po ekstrakcji TATAAA za pomocą 0,1 M NaOH.
Fig. 4. Woltamperogramy różnicowej woltamperometrii pulsowej (DPV) dla 0,1 M K4Fe(CN)6 w 0,1 M KNO3, zarejestrowane na platynowej elektrodzie dyskowej o średnicy 1 mm pokrytej warstwą MIP-TATAAA (krzywa 1) przed ekstrakcją i po (krzywa 2) 25-min i (krzywa 3) 45-min ekstrakcji szablonu TATAAA za pomocą 0.1 M NaOH oraz (krzywa 4) po zanurzeniu elektrody z warstwą MIP-TATAAA z wyekstrahowanym szablonem do roztworu 50 pM TATAAA na 15 min. Warstwę MIP-TATAAA osadziliśmy w warunkach potencjodynamicznych w trakcie sześciu cykli zmian potencjału w zakresie od 0,50 do 1,25 V vs Ag/AgCI, przy szybkości zmian potencjału 50 mV/s. W pomiarach DPV na zmieniany liniowo od 0,00 do 0,70 V potencjał elektrody pracującej nakładane były prostokątne pulsy potencjałowe o amplitudzie 50 mV, o czasie trwania pulsu 100 ms i skoku potencjału 5 mV.
Fig. 5(a) Zmiana pojemności w czasie dla różnych stężeń TATAAA w 0,5 M NaF. Zmianę tę mierzyliśmy w warunkach analizy przepływowo-wstrzykowej (FIA) przy potencjale 0,50 V vs Ag/AgCI i częstotliwości 20 Hz za pomocą chemoczujnika z warstwą MIP-TATAAA z wyekstrahowanym szablonem TATAAA pokrywającą platynową elektrodę dyskową o średnicy 1 mm, 0,5 M NaF, pompowany z szybkością 20 pL/min, służył jako roztwór nośny. (b) Krzywa kalibracyjna dla (1) TATAAA, (2) TATAGA i (3) TATAAG dla chemoczujnika z wyekstrahowaną warstwą MIP-TATAAA oraz (4) TATAAA dla chemoczujnika z warstwą NIP.
Fig. 6 Zmiany częstotliwości rezonansowej elektrody Au-QCR pokrytej warstwą MIP-TATAAA wywołane oddziaływaniami z kwasem L-glutaminowym (Glu), L-seryną (Ser), L-lizyną (Lys), L-asparaginą (Asn), L-treoniną (Thr), L-waliną (Val) i L-fenyloalaniną (Phe). Liczby na kolumnach histogramu wskazują liczbę zewnętrznych monowarstw MIP-TATAAA, przez które przenika dany aminokwas.
Korzystne przykłady wykonania wynalazku
P r z y k ł a d 1
Przygotowanie warstw polimerów wdrukowanych molekularnie za pomocą PNA-TATAAA
Ważne z punktu widzenia biologicznego i medycznego substancje, takie jak białka, kwasy nukleinowe, itp., są rozpuszczalne w roztworach wodnych. Dlatego są one molekularnie wdrukowywane za pomocą monomerów funkcyjnych rozpuszczalnych w roztworach wodnych. Jednak tworzenie warstw MIP-ów jest efektywniejsze w rozpuszczalnikach organicznych niż w roztworach wodnych, zwłaszcza wówczas gdy wdrukowanie szablonów w warstwy MIP ma charakter niekowalencyjny, w tym za pomocą wiązań wodorowych. Za pomocą aprotycznych rozpuszczalników organicznych można wyeliminować wszystkie inne wiązania wodorowe niż te pomiędzy cząsteczkami substancji rozpuszczonej a cząsteczkami monomerów funkcyjnych, uniemożliwiające tworzenie kompleksu pre-polimeryzacyjnego. Takie dogodne możliwości rozpoznawania DNA stwarza peptydowy kwas nukleinowy (ang. peptide nucleic acid, PNA). W niniejszym zgłoszeniu, proponujemy wdrukowanie w warstwę MIP rozpuszczalnego w rozpuszczalnikach organicznych analogu jednoniciowego DNA (ang. single-stranded, ssDNA), jakim jest PNA. Jest to alternatywny sposób przygotowania warstw MIP-ów w celu selektywnego rozpoznawania oligodeoksyrybonukleotydów. Na Fig. 1 przedstawione są krzywe polimeryzacji elektrochemicznej przeprowadzonej w warunkach potencjodynamicznych, w wyniku której na dyskowej elektrodzie platynowej osadza się warstwa MIP z wdrukowanym PNA-TATAAA. PNA-TATAAA wdrukowano w warstwę MIP-u za pomocą adeninowego 1 i tyminowego 2 monomeru funkcyjnego. Adeninowy i tyminowy
PL 230 553 B1 monomer funkcyjny zaprojektowano i zsyntetyzowano do przyłączania szablonu TATAAA w kompleksie pre-polimeryzacyjnym za pomocą parowania zasad A-T i A-T typu Watsona-Cricka, według procedury opisanej w naszym zgłoszeniu patentowym nr P. 409328 z dnia 29 sierpnia 2014.
Zsyntetyzowanie dwóch nowych pochodnych tiofenu podstawionych zasadami nukleinowymi otworzyło nowe możliwości molekularnego wdrukowania oligonukleotydu TATAAA za pomocą tworzenia par typu Watsona-Cricka. W niniejszym zgłoszeniu przedstawiamy wdrukowanie analogu oligonukleotydu TATAAA, tj. PNA-TATAAA, za pomocą tworzenia par typu Watsona-Cricka. Po rozwiązaniu problemu wymywania szablonu PNA z warstwy MIP, możliwe będzie rozpuszczenie w jednym rozpuszczalniku organicznym składników kompleksu pre-polimeryzacyjnego i ich elektropolimeryzacja w nieobecności wody. Zaowocuje to opracowaniem nowej procedury przygotowania warstw MIP wdrukowanych za pomocą szablonu rozpuszczalnego w aprotycznych rozpuszczalnikach organicznych, takiego jak PNA. Elektropolimeryzacja potencjodynamiczna w zakresie dodatnich potencjałów znakomicie nadaje się do wdrukowania PNA-TATAAA w polimer zbudowany z pochodnych tiofenu z uwagi na zalety tego wdrukowania, takie jak (i) krótki czas przygotowania warstwy MIP, wynoszący zaledwie kilka minut, potrzebny do osadzenia warstwy za pomocą zaledwie kilku cykli zmian potencjału, (ii) trwałe przywieranie warstwy MIPu do podłoża o dostatecznej szorstkości, (iii) łatwa kontrola grubości warstwy za pomocą liczby cykli potencjałowych, (iv) łatwa kontrola porowatości warstwy za pomocą wyboru odpowiednich składników roztworu do elektropolimeryzacji i (v) elektropolimeryzacja w jednym aprotycznym rozpuszczalniku organicznym ułatwiającym polimeryzację tiofenowych monomerów funkcyjnych.
Warstwy MIPu wdrukowanego sztucznym oligonukleotydem PNA-TATAAA osadziliśmy z roztworu do elektropolimeryzacji, zawierającego szablon PNA-TATAAA, zamiast TATAAA stosując taką samą procedurę jak procedura, którą wcześniej opracowaliśmy do osadzania warstw MIP-TATAAA.
Warstwy MIPu z wdrukowanym PNA-TATAAA przygotowaliśmy za pomocą polimeryzacji elektrochemicznej w warunkach potencjodynamicznych w zakresie potencjałów od 0,50 do 1,25 V vs Ag/AgCI przy szybkości zmian potencjału 50 mV/s. Wzrost warstwy MIP, zarówno na platynowej elektrodzie dyskowej jak i na elektrodzie złotej krystalicznego rezonatora kwarcowego (ang. quartz crystal resonator, QCR), Au-QCR, o podstawowej częstotliwości rezonansowej 10 MHz, kontrolowaliśmy za pomocą liczby cykli zmian potencjału. Po zakończeniu elektropolimeryzacji, warstwy MIP-u obficie przemyliśmy acetonitrylem, aby usunąć z nich nadmiar roztworu elektrolitu podstawowego. Następnie z warstw MIP-ów próbowaliśmy wyekstrahować szablon PNA-TATAAA za pomocą 0,1 M NaOH przez 45 min w temperaturze pokojowej, według procedury opisanej w naszym zgłoszeniu patentowym nr P. 409328 z dnia 29 sierpnia 2014. Pomimo zastosowania roztworów o wysokiej kwasowości lub zasadowości, usuwanie szablonu PNA-TATAAA nie powiodło się. W przyszłości powrócimy do badań wymywania PNA z warstw MIP.
Dlatego do dalszych badań wdrukowaliśmy oligodeoksyrybonukleotyd TATAAA w mieszaninie rozpuszczalników opisanych w naszym zgłoszeniu patentowym nr P. 409328 z dnia 29 sierpnia 2014. Poniższe przykłady obejmują badania warstw MIP-ów wdrukowanych oligodeoksyrybonukleotydem TATAAA, tj. MIP-TATAAA.
P r z y k ł a d 2
Badania efektywności wdrukowania a następnie ekstrakcji szablonu TATAAA z warstwy MIP-TATAAA za pomocą pomiarów EIS oporności przeniesienia ładunku oraz pomiarów IRRAS i DPV
Zmierzyliśmy oporność przeniesienia ładunku warstwy MIPu za pomocą EIS. W tym celu na dyskowej elektrodzie platynowej o średnicy 1 mm osadziliśmy warstwę MIP-TATAAA według procedury opisanej w naszym zgłoszeniu patentowym nr P. 409328 z dnia 29 sierpnia 2014 r. Pomiary EIS przeprowadziliśmy na platynowej elektrodzie dyskowej pokrytej warstwą MIP-TATAAA z zastosowaniem próbnika redoks, 0.1 M K3[Fe(CN)6] i 0.1 M K4[Fe(CN)6], przy potencjale otwartego obwodu i częstotliwości zmienianej w zakresie od 200 kHz do 100 mHz, co 10 mHz, i amplitudzie napięcia zmiennego 0,1 mV. Zależności składowej urojonej impedancji od składowej rzeczywistej dla próbnika redoks, zarejestrowane przed i po ekstrakcji szablonu TATAAA oraz po zanurzeniu elektrody pokrytej warstwą MIPTATAAA z wyekstrahowanym szablonem w roztworze analitu TATAAA przedstawia, odpowiednio, krzywa 1, 2 i 3 na Fig. 2. Krzywa 1 na Fig. 2 to krzywa typowa dla elektrody pokrytej wdrukowaną oligonukleotydem TATAAA warstwą MIP w postaci dużego półokręgu, który odpowiada oporowi przeniesienia ładunku (13 kQ). Półokrąg ten to krzywa teoretyczna dopasowana do punktów eksperymentalnych po odpowiednim dobraniu parametrów elektrycznych zastępczego obwodu Randlesa-Erszlera. Warstwa MIP zawierająca wdrukowany oligonukleotyd TATAAA utrudnia transport próbnika redox do
PL 230 553 B1 powierzchni elektrody. Krzywa zarejestrowana po ekstrakcji szablonu TATAAA składa się z półokręgu i odcinka prostoliniowego, odpowiednio, w zakresie wysokich i niskich częstotliwości (Krzywa 2 na Fig. 2). Średnica tego półokręgu jest mniejsza od średnicy półokręgu przedstawionego na Krzywej 1. Oznacza to, że opór przeniesienia ładunku (2,04 kQ) jest mniejszy w przypadku warstwy MIPu z usuniętym szablonem TATAAA. W przypadku wyekstrahowanej warstwy MIP, opór ten wzrasta po przyłączeniu analitu TATAAA, do wartości 2,42 kQ. Nachylenie (0,58 ± 0,01) prostoliniowego odcinka na Krzywej 3 na Fig. 2 w zakresie niskich częstotliwości jest mniejsze niż nachylenie (0,65 ± 0,01) analogicznego odcinka na Krzywej 2 na Fig. 2. Co oznacza, że po usunięciu szablonu TATAAA, w warstwie MIP pozostają puste wnęki molekularne, dzięki którym warstwa ta jest przepuszczalna dla próbnika redoks. Natomiast po przyłączeniu analitu TATAAA, przepuszczalność warstwy MIP jest mniejsza.
Za pomocą pomiarów IRRAS zarejestrowano widma dla czterech próbek, tj. dla warstwy TATAAA (widmo 1 na Fig. 3), NIP (widmo 2 na Fig. 3) oraz MIP-TATAAA przed (widmo 3 na Fig. 3) i po (widmo 4 na Fig. 3) ekstrakcji szablonu TATAAA. W widmie 3 można wyróżnić piki odpowiadające drganiom wiązań w szablonie TATAAA pomimo znacznego nakładania się tych pików na piki odpowiadające drganiom wiązań polimeru. Są to piki o liczbie falowej 1013 i 1077 cm-1 odpowiadające drganiom rozciągającym wiązań ugrupowania, odpowiednio, PO2- i P-O-P w skompleksowanym TATAAA {R. Cini, et al., J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1989, 575; H. Takeuchi, et al., J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 392; E. Mateo-Marti, et al., Biosen. Bioelectron. 2007, 22, 1926}. Piki te były znacznie niższe po ekstrakcji szablonu TATAAA (Widmo 4 na Fig. 3). Powyższe zmiany w widmie znacznie uwydatniły się po normalizacji wysokości pików względem wysokiego piku o liczbie falowej 800 cm-1 odpowiadającemu drganiom wiązań w cząsteczce politiofenu.
O usunięciu szablonu TATAAA z warstwy MIP-TATAAA świadczą również wyniki badań DPV (Fig. 4). W badaniach tych zastosowaliśmy Fe(CN)64- jako próbnik redoks. Okupujące wnęki molekularne MIP-TATAAA cząsteczki szablonu utrudniają dyfuzję tego próbnika do powierzchni elektrody. Dlatego pik elektroutleniania Fe(CN)6* 2- był stłumiony (krzywa 1 na Fig. 4). Jednakże po ekstrakcji TATAAA pik ten był znacznie wyższy (krzywe 2 i 3 na Fig. 4), ponieważ opróżnienie wdrukowanych wnęk molekularnych ułatwiło dyfuzję próbnika do powierzchni elektrody. Po zanurzeniu na 15 min elektrody pokrytej wyekstrahowaną warstwą MIP do roztworu 50 pM TATAAA, pik DPV zmalał (krzywa 4 na Fig. 4). Świadczy to o unieruchomieniu analitu TATAAA w warstwie MIPu a przez to o obniżeniu szybkości dyfuzji przez tę warstwę.
P r z y k ł a d 3
Oznaczanie TATAAA w warunkach FIA za pomocą chemoczujnika Cl z warstwą rozpoznającą MIP-TATAAA
Pozbawione TATAAA warstwy MIP-TATAAA pokrywające platynową elektrodą dyskową o średnicy 1 mm zbadaliśmy za pomocą Cl w warunkach FIA. Roztwór nośny był pompowany z szybkością 30pl/min przez przepływowe naczynko elektrochemiczne o cienkowarstwowym przepływie radialnym z zamocowaną platynową elektrodą dyskową o średnicy 1 mm w izolatorze z PTFE. Objętość każdej zastrzykiwanej próbki wynosiła 100 pl. Zastrzykiwane substancje byty rozpuszczone w roztworze o takim samym składzie jak roztwór nośny, tj. w 0,5 M NaF.
Badania Cl przeprowadziliśmy przy stałym potencjale i częstotliwości prądu zmiennego równym, odpowiednio, 0,50 V vs Ag/AgCI i 20 Hz. Przy tej wartości potencjału na elektrodzie nie przebiegał żaden proces faradajowski.
Do oznaczeń TATAAA służył pomiar pojemności elektrycznej warstwy podwójnej, C. Pojemność tę wyznaczaliśmy ze zmierzonej składowej urojonej impedancji, Z, przy stałej częstotliwości kołowej prądu zmiennego, ω, i potencjale przyłożonym do elektrody, za pomocą Równania (1).
mC (1)
Zgodnie z oczekiwaniem, po zastrzyknięciu każdej kolejnej próbki roztworu TATAAA pojemność początkowo rosła w miarę jak TATAAA wnikał do warstwy MIP-TATAAA (Fig. 5). Następnie pojemność malała powracając do swojej pierwotnej wartości w miarę wymywania TATAAA z warstwy przez nadmiar roztworu nośnego - elektrolitu podstawowego (0,5 M NaF). Zachowanie to wskazuje na pełną odwracalność wiązania TATAAA w warstwie. Za mierzone zmiany pojemności najprawdopodobniej odpowiedzialne były zmiany pojemności części sztywnej elektrycznej warstwy podwójnej z uwagi na znikomy wkład pojemności jej części rozmytej do całkowitej pojemności warstwy przy tak wysokim stężeniu elektrolitu podstawowego o nieadsorbujących się specyficznie jonach jak 0,5 M NaF. Dlatego część sztywną
PL 230 553 B1 warstwy przybliżyliśmy za pomocą modelu Helmholtza. W modelu tym pojemność warstwy podwójnej jest wprost proporcjonalna do jej przenikalności elektrycznej. Przenikalność ta rośnie wraz ze wzrostem obsadzenia wnęk molekularnych warstwy MIP-TATAAA przez analit TATAAA.
Wysokość piku zmian pojemności była proporcjonalna do stężenia TATAAA w roztworze badanym (Krzywa 1 na Fig. 5). Liniowy zakres stężeniowy rozciągał się przynajmniej od 0.05 do 2.00 μΜ spełniając następujące równanie regresji liniowej, C ^F cm-2) = 0,18 ^F cm-2) + 0,014 Ctataaa ^M). W równaniu tym Ctataaa oznacza stężenie TATAAA w roztworze badanym. Przy stosunku sygnału do szumu, S/N = 3, wartość LOD wynosiła 10 nM TATAAA a czułość 0,014 μF cm-2 μM-1 ze współczynnikiem korelacji 0,99. Niniejsze parametry analityczne przemawiają za tym, że wytworzony czujnik chemiczny nadaje się do oznaczania sekwencji TATAAA. Czujnik chemiczny z warstwą MIP był ~3,2 i ~1,7 razy bardziej czuły względem analitu TATAAA niż względem oligonukleotydów TATAAG i TATAGA. Korzystnie dla tych oznaczeń TATAAA, analityczny sygnał Cl był o wiele bardziej stały w czasie niż sygnał mikrograwimetrii piezoelektrycznej (ang. piezoelectric micrograwimetry, PM) w oznaczeniach opisanych w zgłoszeniu patentowym nr P. 409328 z dnia 29 sierpnia 2014 r.
Analityczne sygnały detekcji Cl rejestrowane w postaci pików a nie schodków wskazują, że wiązanie cząsteczek TATAAA we wdrukowanych wnękach molekularnych MIP-TATAAA jest w pełni odwracalne. Zachowanie to jest korzystne do wytwarzania czujników chemicznych wielokrotnego użycia do oznaczania TATAAA. Najniższa wartość LOD dla warstwy MIP-TATAAA o grubości ~140 nm wynosiła 10 nM TATAAA. Osiągnięto ją za pomocą czujnika FIA-CI. Czujnik ten lepiej nadaje się do oznaczania TATAAA niż czujnik FIA- PM.
Czujnik FIA-CI można zastosować w inżynierii genetycznej, zwłaszcza do testów genetycznych przy wczesnym wykrywaniu dziedzicznych chorób genetycznych.
P r z y k ł a d 4
Sztuczna sekwencja promotorowa w kasecie TATA i jej powinowactwo do wybranych aminokwasów
Spośród 180 aminokwasów wchodzących w skład TBP wybraliśmy aminokwasy oddziałujące z promotorową sekwencją TATAAA w naturalnej kasecie TATA. Zbadaliśmy oddziaływania tych aminokwasów z warstwą MIP-TATAAA za pomocą PM w warunkach FIA. Warstwa ta stanowiła matrycę ze sztucznymi kasetami TATA. Promotorową sekwencję TATAAA ze sztucznej kasety TATA rozpoznawały aminokwasy, takie jak L-seryna, L-lizyna, kwas L-glutaminowy, L-asparagina, L-treonina, L-walina, L-fenyloalanina i L-leucyna.
Roztworem nośnym była woda pompowana z szybkością 30 μ^Μ przez oprawkę przepływową do QCR za pomocą pompy strzykawkowej. Do zastrzykiwania próbek roztworów badanych zastosowano sześciopozycyjny pętlicowy zawór dozujący. Objętość zastrzykiwanej próbki wynosiła 100 μΚ W pomiarach PM rejestrowaliśmy zmiany częstotliwości rezonansowej elektrody Au-QCR pokrytej warstwą MIP-TATAAA wywołane zastrzykami 0,2 M roztworów aminokwasów wymienionych powyżej (Tabela 1).
Masę aminokwasów oddziałujących z wdrukowaną oligodeoksyrybonukleotydem TATAAA warstwą MIP wyznaczyliśmy ze zmian częstotliwości rezonansowej, zgodnie z zależnością Sauerbry'a {D. A. Buttry, et al., Chem. Rev. 1992, 92, 1355}. W ten sposób wyznaczyliśmy liczbę moli poszczególnych aminokwasów oddziałujących z wdrukowaną oligodeoksyrybonukleotydem TATAAA warstwą MIP (Tabela 1).
PL 230 553 Β1
Tabela 1. Oddziaływania wdrukowanej oligodeoksyrybonukleotydem TATAAA warstwy MIP z cząsteczkami aminokwasów, takich jak: kwas L-glutaminowy (Glu), L-seryna (Ser), L-lizyna (Lys), L-asparagina (Asn), L-treonina (Thr), L-walina (Val), L-fenyloalanina (Phe) i L-leucyna (Leu).
| Aminokwas | Zmiana częstotliwości rezonansowej, Hz | Masa aminokwasu oddziałującego z warstwą MIP-TATAAA, ng | Liczba cząsteczek aminokwasu oddziałująca z kasetą TATA | Liczba moli aminokwasu oddziałująca z mono warstwą MIP-TATAAA | Liczba zewnętrznych monowarsw MIP-TATAAA dostępnych dla cząsteczki aminokwasu |
| Ser | -17 | 14,7 x 10 9 | 2 | 8,8 x 10 12 | 4,0 |
| Lys | -22 | 19,1 x 10 9 | 7 | 3,1 x 10u | 1,0 |
| Glu | 22 | 19,1 x 10'9 | 1 | 4,4 χ 1012 | 7,3 |
| Asn | -22 | 19,1 x 10 9 | 2 | 8,8 x 10 12 | 4,0 |
| Thr | -7.5 | 6,5 x 10 9 | 3 | 1,3 x 10u | 1,0 |
| Val | -15 | 13,0 χ 10’9 | 6 | 2,6 χ 1O’U | 1,0 |
| Phe | -20 | 17,3 χ 109 | 4 | 1,7 χ 1011 | 1,5 |
Leu Brak sygnału ° Y. Kim, J. H. Geiger, S. Hahn, and P. B. Sigler, Naturę, 1993, 365, 512-520.
W naturalnej kasecie TATA sześcionukleotydowa sekwencja TATAAA wiąże od 2 do 7 cząsteczek wybranych aminokwasów (Schemat 1).
Wdrukowane oligodeoksyrybonukleotydem TATAAA warstwy MIP tworzą matrycę ze sztuczną promotorową sekwencją TATAAA w kasecie TATA. Grupy fosforanowe tej sekwencji silnie oddziaływują z dodatnio naładowaną cząsteczką L-seryny i L-lizyny (Tabela 1). W naszej sztucznej kasecie TATA, dwie sferyczne cząsteczki L-seryny i sześć wydłużonych cząsteczek L-lizyny oddziaływują, odpowiednio, z dwoma i sześcioma grupami fosforanowymi wdrukowanego oligodeoksyrybonukleotydu TATAAA, podobnie jak w naturalnej kasecie TATA.
W interpretacji wyników badań oddziaływań aminokwasów z warstwą MIP-TATAAA uwzględniliśmy średnicę, kształt i właściwości chemiczne wybranych aminokwasów.
Aminokwasy polarne, takie jak L-asparagina i L-treonina oraz niepolarne, takie jak L-walina i L-fenyloalanina, oddziaływały, odpowiednio, z zasadami nukleinowymi oraz resztami dezoksyrybozy sztucznej promotorowej sekwencji TATAAA z kasety TATA (Tabela 1). Dla cząsteczek L-asparaginy spadek częstotliwości rezonansowej elektrody Au-QCR pokrytej warstwą MIP-TATAAA był większy niż dla pokrytej cząsteczkami L-treoniny (Fig. 6). Natomiast spadek częstotliwości dla podłużnych cząsteczek L-fenyloalaniny był znacznie większy niż dla cząsteczek kulistej L-waliny ze względu na oddziaływania π-π pierścienia aromatycznego L-fenyloalaniny z pierścieniami tiofenowymi warstwy MIP (Fig. 6). Co więcej, wielkość i kształt hydrofobowych grup tetrabutylowych L-leucyny utrudniał jej oddziaływania z wdrukowaną oligodeoksyrybonukleotydem TATAAA warstwą MIP. Dlatego w obecności L-leucyny częstotliwość rezonansowa elektrody Au-QCR nie uległa zmianie.
PL 230 553 B1
Oszacowaliśmy liczbę moli poszczególnych aminokwasów oddziałujących z monowarstwą MIPTATAAA i głębokość przenikania cząsteczek aminokwasów przez warstwę MIP-TATAAA (Tabela 1). Okazało się, że im bardziej kulisty kształt aminokwasu tym głębiej wnikał on w warstwę MIP-TATAAA. Przykładowo, kuliste cząsteczki L-seryny i podłużne cząsteczki L-lizyny przenikały na głębokość, odpowiednio, czterech i jednej monowarstwy MIP-TATAAA. W obliczeniach uwzględniliśmy względne pole powierzchni (ang. relative surface area, Rsa = 4,08 ± 0,2 nm) warstwy MIP-TATAAA wyznaczone za pomocą mikroskopii sił atomowych (ang. atomic force microscopy, AFM).
Stężenie TATAAA w warstwie MIP, równe ~0,50 M, wyznaczyliśmy zgodnie z procedurą opisaną w naszym zgłoszeniu patentowym nr PL 209950 z dnia 9 czerwca 2011.
Dla oddziaływań z pojedynczymi cząsteczkami aminokwasów, zmiana częstotliwości rezonansowej elektrody Au-QCR pokrytej warstwą MIP była znacznie większa dla aminokwasów przenikających na głębokość od 4 do 7 monowarstw MIP-TATAAA. Przykładowo, cząsteczka kwasu L-glutaminowego silnie oddziałuje z cząsteczką adeniny promotorowej sekwencji TATAAA w sztucznej kasecie TATA (Fig. 6), dlatego przenika aż na głębokość siedmiu monowarstw MIP-TATAAA (Tabela 1). Najprawdopodobniej cząsteczki kwasu L-glutaminowego obecne w TBP przyczyniają się do oddziaływania tego białka ze sztuczną kasetą TATA. Dlatego kaseta ta może uczestniczyć w transkrypcji DNA.
Podsumowując, nasza sztuczna promotorowa sekwencja TATAAA z kasety TATA w warstwie MIP-TATAAA jest rozpoznawana przez aminokwasy oddziałujące z promotorową sekwencją TATAAA w naturalnej kasecie TATA.
Claims (8)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytworzenia warstwy polimeru z promotorową sekwencją TATAAA w sztucznej kasecie TATA, do rozpoznawania wybranych aminokwasów występujących w białku wiążącym TATA (TBP) oddziałujących z kasetą TATA, metodą molekularnego wdrukowania prowadzącą do wytworzenia polimerów wdrukowanych molekularnie (MIP-ów), za pomocą polimeryzacji elektrochemicznej w warunkach potencjodynamicznych, gdzie jako monomery funkcyjne do elektropolimeryzacji stosuje się 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metan] 1 i 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylometylo)fenylu 2, a jako monomer sieciujący stosuje się (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 3, znamienny tym, że jako szablon/analit stosuje się sześcionukleotydową sekwencję DNA lub analog DNA, korzystnie peptydowy kwas nukleinowy (PNA), korzystniej analog oligonukleotydu TATAAA, tj. PNA-TATAAA.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do polimeryzacji stosuje się roztwór rozpuszczalników organicznych, korzystnie wody, acetonitrylu, toluenu i propanolu, o stosunku objętościowym jak, odpowiednio, 1,5 : 6 :1:1,5, lub w acetonitrylu, zawierający sześcionukleotydową sekwencję DNA lub analog DNA, odpowiednio, 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)-metan] 1, 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylo-metylo)fenylu 2, (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 3, korzystnie w stosunku molowym jak, odpowiednio, 1 : 2,5 : 1,25 : 25, oraz 0,1 M elektrolit podstawowy, korzystnie chloran(VII) tetrabutyloamoniowy, (TBA)CIO4.
- 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się potencjał liniowo zmieniany cyklicznie w zakresie od 0 do 1,5 V, korzystnie w zakresie od 0,50 do 1,25 V, ze stałą szybkością zawierającą się w przedziale od 5 do 1000 mV/s, korzystnie 50 mV/s.
- 4. Zastosowanie warstwy rozpoznającego polimeru z promotorową sekwencją TATAAA w sztucznej kasecie TATA, otrzymanej sposobem według zastrz. 1, do wykrywania i/lub selektywnego oznaczania sześcionukleotydowej sekwencji DNA, w płynach ustrojowych pacjenta.
- 5. Zastosowanie według zastrz. 4 do badań podstawowych obejmujących transkrypcję DNA z udziałem aminokwasów, takich jak: L-seryna, L-lizyna, kwas L-glutaminowy, L-asparagina, L-treonina, L-walina, L-fenyloalanina i L-leucyna z warstwą otrzymanego polimeru, z wykorzystaniem mikrograwimetrii piezoelektrycznej (PM) w warunkach analizy przepływowo-wstrzykowej (FIA).
- 6. Zastosowanie według zastrz. 4 w inżynierii genetycznej, zwłaszcza do testów genetycznych przy wczesnym wykrywaniu dziedzicznych chorób genetycznych.PL 230 553 Β1
- 7. Zastosowanie według zastrz. 4 jako warstwa elementu czujnika chemicznego do wykrywania i/lub selektywnego oznaczania sześcionukleotydowej sekwencji DNA, w płynach ustrojowych pacjenta, z wykorzystaniem impedimetrycznych pomiarów pojemności (Cl) w warunkach analizy przepływowo-wstrzykowej (FIA).
- 8. Zastosowanie według zastrz. 4 do badania efektywności wdrukowania a następnie ekstrakcji szablonu TATAAA z warstwy MIP-TATAAA oraz unieruchomienia analitu TATAAA w warstwie MIPu za pomocą elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej (EIS) pomiarów oporności przeniesienia ładunku dla elektrody pokrytej warstwą MIP-TATAAA, albo różnicowej woltamperometrii pulsowej (DPV), albo odbiciowo-absorpcyjnej spektroskopii w podczerwieni (IRRAS).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL412848A PL230553B1 (pl) | 2014-08-29 | 2015-06-25 | Sposob wytwarzania polimeru z promotorowa sekwencja TATAAA w sztucznej kasecie TATA i zastosowanie tego polimeru do rozpoznawania i/lub selektywnego oznaczania szescionukleotydowej sekwencji DNA |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PLPL409329 | 2014-08-29 | ||
| PL409329A PL229588B1 (pl) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | Nowy sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA, sztuczna nić promotora DNA zawierająca ten oligomer i jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA |
| PL412848A PL230553B1 (pl) | 2014-08-29 | 2015-06-25 | Sposob wytwarzania polimeru z promotorowa sekwencja TATAAA w sztucznej kasecie TATA i zastosowanie tego polimeru do rozpoznawania i/lub selektywnego oznaczania szescionukleotydowej sekwencji DNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL412848A1 PL412848A1 (pl) | 2016-03-14 |
| PL230553B1 true PL230553B1 (pl) | 2018-11-30 |
Family
ID=55450755
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL409329A PL229588B1 (pl) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | Nowy sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA, sztuczna nić promotora DNA zawierająca ten oligomer i jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA |
| PL412848A PL230553B1 (pl) | 2014-08-29 | 2015-06-25 | Sposob wytwarzania polimeru z promotorowa sekwencja TATAAA w sztucznej kasecie TATA i zastosowanie tego polimeru do rozpoznawania i/lub selektywnego oznaczania szescionukleotydowej sekwencji DNA |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL409329A PL229588B1 (pl) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | Nowy sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA, sztuczna nić promotora DNA zawierająca ten oligomer i jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (2) | PL229588B1 (pl) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL239699B1 (pl) * | 2017-09-18 | 2021-12-27 | Inst Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk | Nowy bisbitiofenowy analog oktanukleotydu o sekwencji nukleotydów CGCCGCCG, sposób jego otrzymywania, czujnik elektrochemiczny zawierający ten analog, sposób wytworzenia tego czujnika i zastosowanie czujnika elektrochemicznego |
| PL238942B1 (pl) * | 2017-11-24 | 2021-10-25 | Inst Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk | Syntetyczny polimer nukleotydowy z warstwą rozpoznającą, jego wytwarzanie i zastosowanie do selektywnego oznaczania rakotwórczej heterocyklicznej aminy aromatycznej za pomocą czujnika chemicznego |
-
2014
- 2014-08-29 PL PL409329A patent/PL229588B1/pl unknown
-
2015
- 2015-06-25 PL PL412848A patent/PL230553B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL229588B1 (pl) | 2018-08-31 |
| PL412848A1 (pl) | 2016-03-14 |
| PL409329A1 (pl) | 2016-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ratautaite et al. | Characterization of caffeine-imprinted polypyrrole by a quartz crystal microbalance and electrochemical impedance spectroscopy | |
| Ouyang et al. | A molecularly imprinted copolymer designed for enantioselective recognition of glutamic acid | |
| Guiducci et al. | DNA detection by integrable electronics | |
| Aghaei et al. | A novel capacitive biosensor for cholesterol assay that uses an electropolymerized molecularly imprinted polymer | |
| Sharma et al. | Chitosan encapsulated quantum dots platform for leukemia detection | |
| Pietrzyk et al. | Molecularly imprinted polymer (MIP) based piezoelectric microgravimetry chemosensor for selective determination of adenine | |
| Kong et al. | Molecularly imprinted quartz crystal microbalance sensor based on poly (o-aminothiophenol) membrane and Au nanoparticles for ractopamine determination | |
| Huynh et al. | Cytosine derivatized bis (2, 2′-bithienyl) methane molecularly imprinted polymer for selective recognition of 6-thioguanine, an antitumor drug | |
| EP3279651A1 (en) | Methods using microelectrodes and biosensing devices incorporating the same | |
| Zhang et al. | Selective recognition of Histidine enantiomers using novel molecularly imprinted organic transistor sensor | |
| Ou et al. | Molecularly imprinted electrochemical sensor, formed on Ag screen-printed electrodes, for the enantioselective recognition of d and l phenylalanine | |
| CN109072284A (zh) | 用于电化学检测相关分子的系统 | |
| Azadbakht et al. | Design and characterization of electrochemical dopamine–aptamer as convenient and integrated sensing platform | |
| TW200415676A (en) | Process for lining a surface using an organic film | |
| Regasa et al. | Novel multifunctional molecular recognition elements based on molecularly imprinted poly (aniline-co-itaconic acid) composite thin film for melamine electrochemical detection | |
| CN103261892A (zh) | 分析物的电化学检测 | |
| PL230553B1 (pl) | Sposob wytwarzania polimeru z promotorowa sekwencja TATAAA w sztucznej kasecie TATA i zastosowanie tego polimeru do rozpoznawania i/lub selektywnego oznaczania szescionukleotydowej sekwencji DNA | |
| Peng et al. | Fabrication of an electrochemical sensor for Helicobacter pylori in excrement based on a gold electrode | |
| Hu et al. | Conjugated self-doped polyaniline–DNA hybrid as trigger for highly sensitive reagentless and electrochemical self-signal amplifying DNA hybridization sensing | |
| Aghaei et al. | A novel label free electrochemical aptasensor based on poly (anthranilic acid-co-aniline) for detection of miRNA-155, a cancer biomarker | |
| Fandrich et al. | Electrochemical detection of the thermally induced phase transition of a thin stimuli-responsive polymer film | |
| Chen et al. | A fast, sensitive and label free electrochemical DNA sensor | |
| US20030175737A1 (en) | Quantifying target molecules contained in a liquid | |
| Ramanaviciene et al. | Molecularly imprinted polypyrrole for sensor design | |
| Conejo‐Cuevas et al. | Microneedles for Continuous, Minimally Invasive Monitoring: A Technology Overview |