PL229588B1 - Nowy sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA, sztuczna nić promotora DNA zawierająca ten oligomer i jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA - Google Patents
Nowy sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA, sztuczna nić promotora DNA zawierająca ten oligomer i jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAAInfo
- Publication number
- PL229588B1 PL229588B1 PL409329A PL40932914A PL229588B1 PL 229588 B1 PL229588 B1 PL 229588B1 PL 409329 A PL409329 A PL 409329A PL 40932914 A PL40932914 A PL 40932914A PL 229588 B1 PL229588 B1 PL 229588B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- tataaa
- oligonucleotide
- oligomer
- atattt
- sequence
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 64
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims abstract description 51
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Natural products CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims abstract description 27
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims abstract description 27
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims abstract description 12
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 claims abstract description 10
- 125000000175 2-thienyl group Chemical group S1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims abstract description 9
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 8
- 229920000344 molecularly imprinted polymer Polymers 0.000 claims description 8
- 125000000848 adenin-9-yl group Chemical group [H]N([H])C1=C2N=C([H])N(*)C2=NC([H])=N1 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 6
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 5
- WSDQIHATCCOMLH-UHFFFAOYSA-N phenyl n-(3,5-dichlorophenyl)carbamate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC(NC(=O)OC=2C=CC=CC=2)=C1 WSDQIHATCCOMLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 3
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 2
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims 2
- CDDFFMJAOKTPRF-UHFFFAOYSA-M tetrabutylazanium;chlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC CDDFFMJAOKTPRF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 42
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 238000004833 X-ray photoelectron spectroscopy Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 238000000111 isothermal titration calorimetry Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- FCZOVUJWOBSMSS-UHFFFAOYSA-N 5-[(6-aminopurin-9-yl)methyl]-5-methyl-3-methylideneoxolan-2-one Chemical compound C1=NC2=C(N)N=CN=C2N1CC1(C)CC(=C)C(=O)O1 FCZOVUJWOBSMSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 5
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 4
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 4
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical group C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M Chlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)=O XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 2
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229910001914 chlorine tetroxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003077 quantum chemistry computational method Methods 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical compound CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001757 thermogravimetry curve Methods 0.000 description 2
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 2
- 229910018089 Al Ka Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 238000000026 X-ray photoelectron spectrum Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940126214 compound 3 Drugs 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku są (a) sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT o wzorze (1) (A - adenina, T - tymina) komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA, (b) sztuczna nić promotorowa DNA (podwójny łańcuch), zawierająca ten oligomer i (c) sposób otrzymywania sztucznej nici promotora DNA, zawierającej oligonukleotyd TATAAA, jako warstwy shybrydyzowanego oligomeru ATATTT, metodą molekularnego wdrukowania, za pomocą polimeryzacji elektrochemicznej w warunkach potencjodynamicznych, charakteryzujący się tym, że do elektropolimeryzacji jako monomer funkcyjny stosuje się 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitienylo)metan] i 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylometylo)fenylu i monomer sieciujący (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen. Wynalazek ten również obejmuje zastosowanie warstwy oligomeru ATATTT (1) rozpoznającego sekwencję oligonukleotydową TATAAA (5) i/lub otrzymanej powyższym sposobem, jako sztucznej nici rozpoznającej i hybrydyzującej oznaczany oligonukleotyd TATAAA (5), służący do selektywnego wykrywania i/lub oznaczania oligonukleotydu TATAAA (5) korzystnie w płynach ustrojowych człowieka lub zwierzęcia.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest (a) sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT (A - adenina, T - tymina) komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA, (b) sztuczna nić promotorowa DNA, zawierająca ten oligomer, w warstwie oligomeru ATATTT shybrydyzowanego za pomocą oligonukleotydu TATAAA, (c) sposób wytwarzania warstwy shybrydyzowanego oligomeru ATATTT jako sztucznej nici DNA oraz (d) zastosowanie sztucznej nici promotora DNA do wykrywania i selektywnego oznaczania oligonukleotydu TATAAA.
Stan techniki
Nici promotorowego DNA to shybrydyzowane fragmenty DNA zawierające rejony, zwane promotorami {L. Stryer, et al., Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009}. Promotory to odcinki DNA, położone zazwyczaj powyżej sekwencji kodującej genu, które zawierają sekwencje rozpoznawane przez polimerazę RNA zależną od DNA {S. T. Smale, et al., Ann. Rev. Biochem. 2003, 72, 449}. Po połączeniu się polimerazy RNA II z promotorem rozpoczyna się transkrypcja, tj. proces przepisywania informacji genetycznej z DNA na RNA. Miejsca promotorowe eukariotycznych genów kodujących białka zawierają sekwencje zgodne TATAAA {L. Stryer, J. M. Berg and J. L. Tymoczko, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009; S. Grunberg, et al., Trends Biochem. Sci. 2013, 38, 603} umiejscowione w łańcuchu DNA w odległości ~25 nukleotydów od miejsca rozpoczęcia transkrypcji. Kaseta TATA (ang. TATA box) w tych genach, zwana też kasetą Hognessa, jest podobna do kasety Pribnowa (o sekwencji zgodnej TATAAT) w genach prokariotycznych, z tym że jest ona zlokalizowana w większej odległości od miejsca transkrypcji pierwszego nukleotydu niż w genach prokariotycznych (tj. w odległości 10 nukleotydów przed pierwszym nukleotydem ulegającym transkrypcji). Promotorowe sekwencje nukleotydów to miejsca specyficznego przyłączenia polimerazy RNA II.
Mutacje pojedynczych zasad mogą prowadzić do utraty aktywności sekwencji promotorowych. Dlatego znalezienie szybkich i wydajnych narzędzi diagnostycznych do wczesnego i niezawodnego oznaczania sekwencji TATAAA w układach biologicznych jest tak istotne. Ze względu na skutki mutacji zasad, oznaczenia sekwencji DNA mogą nie tylko być pomocne przy podejmowaniu decyzji o sposobie leczenia, ale mogą również stanowić test diagnostyczny dostarczający dodatkowe informacje o stanie zdrowia pacjenta. Badania genetyczne są zatem uzupełnieniem tradycyjnej diagnostyki i profilaktyki. Analiza sekwencji genów odpowiedzialnych za wywołanie chorób genetycznych polega na poszukiwaniu zarówno mutacji, jak i polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (ang. single nucleotide polymorphism, SNP).
Różnorodność zastosowań polimerów wdrukowanych molekularnie, (ang. molecularly imprinted polymers, MIPs) {K. Haupt, et al., Chem. Rev. 2000, 100, 2495; C. Malitesta, et al., Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402, 1827; P. S. Sharma, et al., Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402, 3177} i ich zalety pozwalają przypuszczać, że MlPy mogą być w prosty sposób zastosowane jako matryce nici kwasów nukleinowych. Za pomocą sztucznego oligomeru ATATTT można selektywnie i wielokrotnie oznaczać oligonukleotydy o sekwencji TATAAA. Dodatkowo sztuczny oligomer ATATTT zhybrydyzowany z sekwencją TATAAA może spełniać rolę kasety TATA i rozpoczynać transkrypcję. Ponadto oligomer ATATTT może być bezpośrednio zastosowany do oznaczania oligonukleotydów o sekwencji TATAAA za pomocą szeregu metod analitycznych {J. Liu, et al., Chem. Rev. 2009, 109, 1948}.
W niniejszym wniosku zgłaszamy do ochrony patentowej sztuczny oligomer ATATTT, który służy do rozpoznawania i selektywnego oznaczania wybranych oligonukleotydów. Rozpoznawanie to naśladuje rozpoznawanie biologiczne. Nieznane są jeszcze polimery molekularnie wdrukowane oligonukleotydami za pomocą elektropolimeryzacji {J. Liu, Z. Cao and Y. Lu, Chem. Rev. 2009, 109, 1948; L. A. Thompson, et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 324; A. Sassolas, et al., Chem. Rev. 2008, 108, 109; E. Palecek, et al., Chem. Rev. 2012, 112, 3427; S. J. Li, et al., Prog. Polym. Sci. 2013, 39, 145; E. G. Hvastkovs, et al., Analyst 2010, 135, 1817; N. K. Guimard, et al., Prog. Polym. Sci. 2007, 32, 876; G. Bidan, et al., Synth. Met. 1999, 102, 1363}. Opracowanie i zsyntetyzowanie tych polimerów pozwoliło nam zbudować czujniki chemiczne czułe na pojedyncze niedopasowanie nukleozasad w sekwencji oznaczanego oligonukleotydu.
Nasz sztuczny oligomer ATATTT jest czuły na wdrukowany oligonukleotyd i selektywnie rozpoznaje właśnie ten oligonukleotyd, a nie oligonukleotydy różniące się od niego pojedynczymi sekwencjami nukleozasad. To wdrukowanie molekularne sprawia, że wdrukowany oligonukleotyd, spełniający rolę szablonu, odciska swój ślad w polimerze. Po usunięciu tego oligonukleotydu, w polimerze pozostaje
PL 229 588 Β1 wnęka molekularna odpowiadająca wielkością, kształtem jak i liczbą i orientacją miejsc rozpoznających wdrukowanemu oligonukleotydowi.
Do budowy sztucznej nici DNA zastosowano dwa elektroaktywne monomery funkcyjne, pochodne bitiofenu podstawione zasadami nukleinowymi. Monomery te wzięły udział w molekularnym wdrukowaniu wybranego oligonukleotydu, zastosowanego jako szablon, za pomocą elektropolimeryzacji. W wyniku tej elektropolimeryzacji, wokół oligonukleotydu powstał łańcuch polimeru podstawiony zasadami nukleinowymi. Po zakończeniu elektropolimeryzacji i usunięciu wdrukowanego oligonukleotydu-szablonu pozostał polimer, do którego przyłączony był oznaczany oligonukleotyd, tj. analit, zgodnie z zasadą komplementarności, jak podczas transkrypcji. Powyższa procedura naśladuje rozpoznawanie biologiczne. W celu zbudowania sztucznej nici DNA komplementarnej do sekwencji TATAAA, jako monomery funkcyjne zastosowano dwie pochodne bisbitiofenu - jedna z adeniną, a druga ztyminą.
Opracowany i wykonany przez nas syntetyczny materiał polimerowy rozpoznaje wybrany oligonukleotyd o pożądanej sekwencji. Co więcej, może być on pomocny w produkcji leków, jak i do bardziej szczegółowego poznania mechanizmu działania chorób, jako że szereg leków powstało dzięki technikom rekombinacji DNA.
Tak więc celowe jest opracowanie sztucznego oligomeru ATATTT do wykrywania i oznaczania sekwencji TATAAA, selektywnego względem tego oligonukleotydowego analitu. Do tego służy opracowanie dedykowanej warstwy ww. oligomeru i jego zastosowanie do hybrydyzacji sekwencji TATAAA w celu zbudowania kasety TATA.
Dlatego celem niniejszego wynalazku jest budowa sztucznej nici promotora DNA, zawierającą oligonukleotyd TATAAA. Kolejnym celem wynalazku jest przygotowanie sztucznego oligomeru o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT 1 (Schemat 1) komplementarnego do promotorowej sekwencji TATAAA oraz sposób przygotowania tego polimeru. Co więcej, celem wynalazku jest wytworzenie sztucznej nici DNA w postaci warstwy osadzonej na przewodzącym podłożu i metody jej przygotowania oraz jej zastosowanie jako sztucznej nici promotora DNA do wykrywania i selektywnego oznaczania oligonukleotydu TATAAA.
Zatem niniejszy wynalazek obejmuje sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT 1 (A - adenina, T - tymina) komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA o poniższym wzorze strukturalnym:
Schemat 1. Sztuczny oligomer o sekwencji ATATTT 1 (A - adenina, T - tymina) komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA.
Ponadto wynalazek obejmuje sposób otrzymywania sztucznej nici promotorowej DNA, zawierającej oligonukleotyd TATAAA, w postaci warstwy oligomeru ATATTT 1, metodą molekularnego wdrukowania, tj. polimeru wdrukowanego molekularnie (ang. molecularly imprinted polimer, MIP), za pomocą polimeryzacji elektrochemicznej w warunkach potencjodynamicznych, na przewodzącym podłożu, charakteryzujący się tym, że jako monomer funkcyjny do elektropolimeryzacji stosuje się 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitienylo)metan] 2 i 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylometylo)fenylu 3 i monomer sieciujący (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 4.
Według wynalazku, do polimeryzacji stosuje się roztwór mieszanych rozpuszczalników, korzystnie acetonitrylu, wody, toluenu i izopropanolu o stosunku objętościowym jak, odpowiednio, 7,5:1:1:0,5, zawierający 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitienylo)metan] 2 i 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylometylo)fenylu 3 oraz (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 4, korzystnie
PL 229 588 Β1 w stosunku molowym jak, odpowiednio, 1:2,5:1,25:25, i elektrolit podstawowy, korzystnie chloran(VII) tetrabutyloamoniowy, (TBA)CIO4, o stężeniu w zakresie od 0,1 M do 1,0 M, korzystnie 0,1 M.
Według wynalazku, w tym sposobie, stosuje się potencjał liniowo zmieniany cyklicznie w zakresie od 0 do 1,5 V, korzystnie w zakresie od 0,50 do 1,25 V, ze stałą szybkością zawierającą się w przedziale od 5 do 1000 mV/s, korzystnie 50 mV/s.
Korzystnie, w sposobie według wynalazku, stosuje się przewodzące podłoże wybrane spośród grupy stałych elektrod przewodzących i półprzewodzących, korzystnie elektrody platynowej, elektrody złotej i płytki szklanej z napylonym złotem.
Wynalazek również obejmuje warstwę oligomeru ATATTT 1 rozpoznającego na drodze hybrydyzacji sekwencję oligonukleotydową TATAAA 5, prowadzącą w wyniku tej hybrydyzacji do wytworzenia sztucznej nici promotorowej DNA, wytworzoną sposobem według wynalazku, charakteryzującą się tym, że stanowi ją polimer zawierający jako monomery funkcyjne 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitienylo)metan] 2 i 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylometylo)fenylu 3 oraz jako monomer sieciujący (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 4 oraz wnękę molekularną odpowiadającą wielkością, kształtem jak i liczbą i orientacją miejsc rozpoznających wdrukowanemu oligonukleotydowi.
Wynalazek ponadto obejmuje zastosowanie warstwy oligomeru ATATTT 1 rozpoznającego sekwencję oligonukleotydową TATAAA 5, otrzymanej sposobem według wynalazku, i/lub określonej powyżej, jako sztucznej nici rozpoznającej za pomocą hybrydyzacji oznaczany oligonukleotyd TATAAA 5, służący do selektywnego wykrywania i/lub oznaczania oligonukleotydu TATAAA 5, korzystnie w płynach ustrojowych człowieka lub zwierzęcia, zwłaszcza przy diagnozowaniu chorób, albo służący w produkcji leków, zwłaszcza otrzymywanych techniką rekombinacji DNA.
Schemat 2. Wzory strukturalne monomerów funkcyjnych, 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2-bitienylo)metanu] 2 i 1-tyminooctanu 4-(di-2,2-bitiofen-5-ylometylo)fenylu 3, oraz monomeru sieciującego, (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofenu 4.
Do wytworzenia MIP wykorzystano związki przedstawione na Schemacie 2. Są to: 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitienylo)metan] 2 i 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylometylo)fenylu 3. Oba te związki służyły jako monomery funkcyjne, parujące za pomocą wiązań wodorowych typu Watsona-Cricka zasady nukleinowe oligonukleotydu TATAAA 5 (Schemat 3).
PL 229 588 Β1
Schemat 3. Proponowany wór strukturalny kompleksu oligonukleotydu TATAAA 5 z 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitienylo)metanem] 2 i 1-tyminooctanem 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylometylo)fenylu 3.
Pary te tworzy fragment tyminowy związku 3 z fragmentem adeninowym oligonukleotydu
TATAAA 5 i fragment adeninowy monomeru 2 z fragmentem tyminowym TATAAA 5. Jako monomer sieciujący zastosowano 2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 4 w celu nadania strukturze polimeru odpowiedniej sztywności. Wszystkie zastosowane związki, tj. 2, 3 i 4, zawierają w swojej strukturze fragmenty tiofenowe zdolne do elektrochemicznej polimeryzacji. Fragmenty te pozwoliły na wytworzenie, w kontrolowany sposób, cienkich warstw polimeru z przyłączonym oligonukleotydem, MIP-TATAAA.
Zastosowane monomery funkcyjne i sieciujące umożliwiają przygotowanie kompleksu TATAAA z odpowiednimi monomerami funkcyjnymi w roztworze do elektropolimeryzacji, a następnie wytworzenie warstwy MIP-TATAAA. Strukturę i skład tego kompleksu modelowano za pomocą obliczeń kwantowo-chemicznych. Aby przygotować roztwór do elektropolimeryzacji, wszystkie jego składniki, każdy o różnej polarności, należało rozpuścić w tym samym roztworze. Należało również zapewnić warunki elektropolimeryzacji takie, aby wytworzone w jej trakcie kationorodniki tiofenu nie ulegały rekombinacji. Do tego celu służyła mieszanina rozpuszczalników, acetonitrylu, wody, toluenu i izopropanolu, w stosunku objętościowym jak, odpowiednio, 7,5:1:1:0,5. W kolejnym etapie przeprowadzono elektrochemiczną polimeryzację potencjodynamiczną. Doprowadziła ona do osadzenia dobrze przylegającej do przewodzącego podłoża warstwy MIP-TATAAA. Ponadto, w celu porównania, osadzano niezależnie polimer niewdrukowany (ang. non-imprinted polimer, NIP) z roztworu o składzie j.w., ale nie zawierającego TATAAA 5. Warstwy te osadzono na powierzchni dwóch różnych przetworników sygnału chemicznego.
Wynalazek jest bliżej przedstawiony poniżej, w korzystnych przykładach wykonania, z odniesieniem do załączonych figur.
Fig. 1. (a) Krzywe potencjodynamiczne oraz krzywe (b) zmian częstotliwości rezonansowej i (b) rezystancji dynamicznej w zależności od potencjału zarejestrowane w trakcie osadzania warstwy NIP za pomocą polimeryzacji elektrochemicznej na elektrodzie złotej, o średnicy 5 mm, rezonatora kwarcowego, Au-QCR, o podstawowej częstotliwości rezonansowej 10 MHz. Polimeryzacja prowadzona była dla 0,1 mM 2, 0,05 mM 3, 1 mM 4 i 0,1 M (TBA)CIO4, roztworu rozpuszczalników, acetonitrylu, wody, toluenu i izopropanolu, o stosunku objętościowym jak, odpowiednio, 7,5:1:1:0,5, w zakresie potencjałów od 0,50 do 1,25 V vs Ag|AgCI. Szybkość zmian potencjału wynosiła 50 mV/s.
Fig. 2. Widmo przeglądowe XPS dla warstwy NIP.
Fig. 3. Krzywa miareczkowania ITC oligonukleotydu TATAAA-PNA 6 za pomocą adeninowej pochodnej bitiofenu 2, w DMSO.
PL 229 588 Β1
Fig. 4. Widma korelacyjne 15N-1H HMBC dla (1) 0,4 mM adeniny oraz (2) 0,4 mM adeniny w kompleksie z 0,4 mM oligonukleotydem TATAAA 5 w roztworze D2O.
Korzystne przykłady wykonania wynalazku
Przykład 1
Molekularne modelowanie, za pomocą metod kwantowo-chemicznych, struktury oligomeru ATATTT komplementarnego do oligonukleotydu TATAAA.
Schemat 4. Sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT 1, komplementarny do sekwencji promotora TATAAA 5, zbudowany z pochodnych bisbitiofenu podstawionych adeniną 2 i tyminą 3. Model szkieletowy zoptymalizowanej struktury oligomeru ATATTT 1 molekularnie modelowany za pomocą półempirycznej metody parametryzacyjnej PM6.
Schemat 4 przedstawia sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT 1, komplementarny do sekwencji promotora TATAAA 5, zbudowany z pochodnych bisbitiofenu podstawionych adeniną 2 i tyminą 3. Struktura polimeru ATATTT 1 została zoptymalizowana za pomocą półempirycznej metody parametryzacyjnej PM6 z zastosowaniem obliczeń kwantowo-mechanicznych wykorzystujących pakiet oprogramowania Gaussian 09 {M. J. Frisch, et al., Gaussian, Inc., Wallingford, CT, USA 2009}. Wygenerowany za pomocą tych obliczeń model molekularny, oszacowany pod względem składu monomerów bisbitiofenowych podstawionych adeniną 2 i tyminą 3, umożliwił zlokalizowanie reszt zasad nukleinowych w oligomerze ATATTT. Modelowanie molekularne potwierdziło możliwość wytworzenia sztucznego oligomeru złożonego z monomerów bisbitiofenowych podstawionych adeniną 2 i tyminą 3. Dodatkowo obliczenia te wykazały, że monomery 2 i 3 można uporządkować w takiej kolejności, aby tworzyły mechanicznie trwały oligomer komplementarny do pojedynczej nici oligonukleotydu TATAAA 5.
Sztuczny oligomer ATATTT 1, złożony z monomerów funkcyjnych zawierających adeninę i tyminę, wytworzony został za pomocą polimeryzacji elektrochemicznej w warunkach potencjodynamicznych. Monomery bisbitiofenowe podstawione adeniną 2 i tyminą 3 ulegają polimeryzacji elektrochemicznej, o czym świadczy Przykład 2 (poniżej) wykonania naszego wynalazku. W wyniku elektropolimeryzacji tych monomerów, w nieobecności oligonukleotydu TATAAA, wytwarza się oligomer o nieznanej sekwencji zasad nukleinowych, w postaci warstwy polimeru niewdrukowanego molekularnie (ang. non-imprinted polymer, NIP).
W celu wytworzenia oligomeru ATATTT 1, do roztworu momomerów 2 i 3 dotaje się oligonukleotyd TATAAA 5. Zasady nukleinowe oligonukleotydu TATAAA tworzą pary Watsona-Cricka z zasadami nukleinowymi monomerów funkcyjnych 2 i 3. Wytworzone pomiędzy zasadami nukleinowymi wiązania wodorowe stabilizują kompleks TATAAA-(monomery funkcyjne 2 i 3) porządkując monomery 2
PL 229 588 B1 i 3 wokół oligonukleotydu TATAAA 5. W wyniku polimeryzacji elektrochemicznej monomerów 2 i 3 w obecności TATAAA powstaje warstwa MIP-TATAAA.
Na podstawie stechiometrii zasad nukleinowych w sekwencji TATAAA 5, do wytworzenia komplementarnego do niej oligomeru ATATTT 1 został użyty dwukrotny nadmiar monomeru bisbitiofenowego podstawionego tyminą 3 względem monomeru bisbitiofenowego podstawionego adeniną 2, przy nadmiarze monomeru sieciującego 4. Warstwa NIP została wytworzona (Przykład 2, poniżej) w takich samych warunkach, ale w nieobecności TATAAA 5. W warstwie oligomeru o nieznanej sekwencji, stosunek molowy monomerów 2 i 3 jest zachowany (Przykład 3, poniżej). Podobnie jak w warstwie MIP-TATAAA (Przykład 5, poniżej). Oznacza to, że można wytworzyć oligomer z momomerów 2 i 3 komplementarny do tak dużej cząsteczki jak oligonukleotyd TATAAA 5.
Przykład 2
Wytworzenie polimeru niewdrukowanego molekularnie, NIP
Polimer niewdrukowany molekularnie, NIP, wytworzono na dyskowej elektrodzie złotej o średnicy 5 mm rezonatora kwarcowego o częstotliwości rezonansowej 10 MHz. Polimer ten tworzy się z monomerów funkcyjnych zawierających zasady nukleinowe w nieobecności TATAAA 5.
Skład warstwy NIP został potwierdzony za pomocą XPS, co przedstawia Przykład 3, poniżej.
Przykład 3
Analiza jakościowa i ilościowa warstwy NIP za pomocą rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów (XPS)
Badania warstwy NIP za pomocą rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów, XPS, umożliwiły przeprowadzenie zarówno analizy jakościowej, jak i ilościowej składu ich powierzchni.
Na Fig. 2 przedstawiono widmo przeglądowe XPS dla warstwy NIP. Warstwa NIP składa się z atomów azotu, tlenu, siarki i węgla. Atomy te są składnikami cząsteczek monomerów funkcyjnych, bisbitiofenowych pochodnych zawierających adeninę lub tyminę. Skład procentowy poszczególnych atomów w powierzchniowej warstwie NIP przedstawia Tabela 1. Skład ten potwierdza, że NIP został utworzony z monomerów funkcyjnych zawierających zasady nukleinowe, adeninę i tyminę, w stosunku molowym jak 1:2, przy nadmiarze monomeru sieciującego.
Analiza widm XPS dla badanej warstwy NIP (Tabela 1) wykazała ponadto, że stosunek stechiometryczny atomów jest inny niż stosunek charakterystyczny dla warstwy NIP o grubości kilku do kilkunastu warstw atomowych. Przyczyną tej rozbieżności może być różna głębokość próbkowania warstwy NIP dla różnych atomów. Głębokość próbkowania warstw NIP przez promieniowanie rentgenowskie emitowane przez lampę Al Ka była dla każdego rodzaju atomu inna i wynosiła dla N - 1,35 nm, O - 1,65 nm, S - 0,7 nm, P - 0,67 nm, C - 0,65 nm {P. J. Cumpson, et al., Surf. Interface Anal. 1997, 25, 430}. Analiza XPS pozwalająca na określenie składu atomowego warstwy NIP została przeprowadzona z dokładnością ±3% {A. Jablonski, et al., Surf. Interface Anal. 1994, 21,724}.
Szablon TATAAA 5 odciska swój ślad w martycy polimerowej. Parowanie nukleozasad typu Watsona-Cricka są na tyle silne (czego dowodzą pomiary ITC i NMR w Przykładach 6 i 7, poniżej), aby zapewnić trwałe rozmieszczenie monomerów w przestrzeni wokół oligonukleotydu TATAAA. Wytworzony kompleks pre-polimeryzacyjny jest trwały, czego dowodzi modelowanie molekularne tego kompleksu (Przykład 4, poniżej).
PL 229 588 Β1
Przykład 4
Molekularne modelowanie, za pomocą metod kwantowo-chemicznych, kompleksu TATAAA 5 z monomerami bisbitiofenowymi zawierającymi adeninę 2 i tyminę 3.
Schemat 5. Model szkieletowy zoptymalizowanej struktury kompleksu TATAAA 5 z monomerami bisbitiofenowymi zawierającymi adeninę 2 i tyminę 3 molekularnie modelowany za pomocą półempirycznej metody parametryzacyjnej PM6.
Modelowanie molekularne potwierdza możliwość tworzenia kompleksu TATAAA 5 z monomerami bisbitiofenowymi zawierającymi adeninę 2 i tyminę 3, w stosunku molowym jak, odpowiednio, 1:2:4.
Przykład 5
Analiza jakościowa i ilościowa warstwy MIP-TATAA za pomocą rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów (XPS)
Jeżeli szablon TATAAA 5 przyłączy się za pomocą wiązań wodorowych do zasad nukleinowych monomerów funkcyjnych, które zostaną poddane elektropolimeryzacji, to wytwarza się warstwa MIP-TATAAA. Procentowy skład atomowy warstwy MIP-TATAAA (Tabela 2) potwierdza, że TATAAA 5 jest wdrukowany w warstwę MIP-TATAAA utworzoną w obecności 5 za pomocą monomerów bisbitiofenowych zawierających adeninę 2 lub tyminę 3, w stosunku molowym jak, odpowiednio, 1:2:4, przy nadmiarze monomeru sieciującego. Sztuczna warstwa MIP-TATAAA, wdrukowana za pomocą 5, naśladuje nić promotorową DNA z promotorem o sekwencji TATAAA tuż przed rozpoczęciem transkrypcji.
PL 229 588 Β1
Przykład 6
Badanie oddziaływań adeniny i adeninowej pochodnej bis(bitiofenu) 2 z oligonukleotydem TATAAA oraz peptydowym kwasem nukleinowym (ang. peptide nucleic acid, PNA) o analogicznej sekwencji TATAAA-PNA
Tworzenie wiązań wodorowych pomiędzy resztami zasad nukleinowych sztucznego polimeru ATATTT 1 i resztami zasad nukleinowych oligonukleotydu TATAAA 5 w roztworze potwierdzono za pomocą izotermicznej kalorymetrii miareczkującej (ang. isothermal titration calorimetry, ITC) i magnetycznego rezonansu jądrowego (ang. nucleic magnetic resonance, NMR). Poniżej opisane są korzystne przykłady oddziaływań polegających na tworzeniu par zasad nukleinowych typu Watsona-Cricka, naśladujących sztuczną nić promotora DNA, komplementarną do oligonukleotydu TATAAA 5 lub peptydowego kwasu nukleinowego (ang. peptide nucleic acid, PNA) o analogicznej sekwencji TATAAA-PNA 6.
Schemat 6. Wzór strukturalny oligonukleotydu TATAAA-PNA 6.
Pomiary mikrokalorymetryczne oddziaływania TATAAA-PNA 6 z adeninową pochodną bis(bitiofenu) 2
Pomiary mikrokalorymetryczne przeprowadzono z zastosowaniem mikrokalorymetru NanolTC firmy TA.
Pomiary ITC wykonywano z zastosowaniem DMSO, tj. rozpuszczalnika organicznego, w którym rozpuszcza się zarówno TATAAA-PNA 6 (analit), jak i adeninowa pochodna bitiofenu 2 (titrant). W komorze porównawczej znajdował się DMSO (~1,3 mL). Komorę pomiarową wypełniono 0,125 mM roztworem badanym TATAAA-PNA 6 (940 pL). Następnie do komory pomiarowej wprowadzane były próbki roztworu DMSO 2,5-mM adeninowej pochodnej bitiofenu 2 o niewielkiej (10 pL) objętości w zadanych odstępach czasu (300 s). Wszystkie próbki były przed pomiarem odpowietrzone pod zmniejszonym ciśnieniem. Pomiar wykonano w temperaturze pokojowej (20±1°C). Końcowe stężenie titranta 2 w roztworze badanym wynosiło 0,525 mM. W trakcie miareczkowania stężenie TATAAA-PNA 6 zmalało od 0,125 mM do 98,7 pM.
Po dodaniu każdej porcji roztworu titranta 2 mierzono moc wymaganą do utrzymania stałej różnicy temperatur pomiędzy komorami. Moc tę następnie przeliczono na ciepło reakcji. Dane pomiarowe miareczkowania ITC przedstawiono na termogramie zależności mocy od czasu, t = f(d/7/d/). Termogram ten przedstawia serię pików, które odpowiadają kolejnym porcjom miareczkowania. Dane zebrano za pomocą oprogramowania, które umożliwia obliczanie (metodą całkową) pola pod pikiem i zapisywanie wyników na dysku komputera. Powierzchnia pod pikiem jest proporcjonalna do efektu cieplnego reakcji. Ciepło oddziaływania adeninowej pochodnej bitiofenu 2 z TATAAA-PNA 6 oszacowano po uwzględnieniu poprawki na rozcieńczenie.
Do uzyskanych metodą ITC eksperymentalnych danych oddziaływania Uganda 2 z TATAAA-PNA 6 (Fig. 3) dopasowano model oddziaływań. W dopasowaniu tym pominięto pierwszy pomiar, który obarczony jest błędem wynikającym z możliwości dyfuzji związku ze strzykawki do roztworu. Uzyskane dane ciepła oddziaływania 2 z 6 wprowadzono do programu NanoAnalyze, za pomocą którego obliczono podstawowe parametry termodynamiczne, tj. zmianę entalpii (Δ/7 = -18,96 kJ) i stałą trwałości kompleksu 6 z 2 [Ks = 1,65 χ 105 M1). Tak więc reszty tym i nowe w TATAAA-PNA 6 wiążą się z resztami adeninowymi bitiofenowego monomeru funkcyjnego 2 znacznie silniej niż niezwiązane cząsteczki tyminy wiążą się z niezwiązanymi cząsteczkami adeniny (Ks, a-t = 102 Μ1) {T. J. Murray, et al., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4010}. Wyznaczone parametry termodynamiczne wykorzystano również do obliczenia zmiany entropii kompleksowania, AS = 35,66 J mol1 K1. Miareczkowanie ITC potwierdziło również, że w roztworze oligonukleotyd TATAAA-PNA 6 zawierający dwie reszty tyminy
PL 229 588 Β1 kompleksuje monomer funkcyjny zawierający adeninę 2 w stosunku molowym jak 1:2, zgodnie ze stechiometrią kompleksu.
Pomiary magnetycznego rezonansu jądrowego (15N NMR) oddziaływania adeniny z oligonukleotydem TATAAA
Za pomocą spektroskopii 15N NMR zmiareczkowano znaczoną izotopem 15N adeninę (adenina-1,3-15N2) oligonukleotydem TATAAA 5 w D2O. Miareczkowanie to umożliwiło wykrycie sprzężeń dalekiego zasięgu pomiędzy protonem a jądrem izotopu 15N połączonych ze sobą dwoma lub trzema wiązaniami. Mianowicie, zarejestrowanie dwuwymiarowego widma korelacyjnego 15N-1H (ang. heteronuclear multiple bond coherence, HMBC) wykazało (Fig. 4) przesunięcie chemiczne związane z tworzeniem par Watsona-Cricka pomiędzy cząsteczkami adeniny a resztami tyminowymi oligonukleotydu TATAAA 5.
Wnioski
Obliczenia kwantowo-chemiczne wykazały możliwość tworzenia oligomeru ATATTT 1 oraz kompleksu oligonukleotydu TATAAA 5 zarówno z każdym z monomerów funkcyjnych z osobna, jak też z obydwoma monomerami równocześnie. Wyniki obliczeń dają wgląd w strukturę i stechiometrię wytworzonego kompleksu pre-polimeryzacyjnego.
W roztworze badanym tworzy się trwały kompleks pre-polimeryzacyjny, w którym reszty zasad nukleinowych sztucznego polimeru ATATTT 1 oddziałują za pomocą wiązań wodorowych z resztami zasad nukleinowych oligonukleotydu TATAAA 5 lub oligonukleotydu TATAAA-PNA 6 o takiej samej sekwencji. Są to oddziaływania polegające na tworzeniu par zasad nukleinowych typu Watsona-Cricka. W ten sposób wytworzono sztuczną nić promotorową DNA. W wyniku elektropolimeryzacji, a następnie usunięcia szablonu TATAA 5 tworzy się sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT 1 komplementarnej do promotorowej sekwencji TATAAA 5.
Elektropolimeryzacja potencjodynamiczna w zakresie dodatnich potencjałów prowadzi do wytworzenia sztucznych warstw polimerów tiofenowych zarówno w obecności (MIP-TATAAA), jak i nieobecności (NIP) oligonukleotydu TATAAA. Opracowana metoda polimeryzacji pozwala na szybkie przygotowanie warstw polimerów dobrze przylegających do przewodzącego podłoża zarówno o dużej (Au-QCR), jak i małej szorstkości (Au/szkło, elektrody platynowe). Metoda ta pozwala na dogodną kontrolę grubości i porowatości otrzymanych warstw za pomocą liczby cykli zmian potencjału oraz doboru odpowiednich składników porogenicznych roztworu (rodzaj elektrolitu podstawowego).
Wyznaczony atomowy skład warstw polimerów potwierdza, że zostały one utworzone z monomerów funkcyjnych podstawionych zasadami nukleinowymi, adeniną 2 i tyminą 3, w stosunku 1:2 przy nadmiarze monomeru sieciującego 4.
Podziękowania
Niniejsza praca była sfinansowana ze środków Fundacji na rzecz Nauki Polskiej (grant POMOST/2012-6/10 dla A.P.L.), projektu „Kwantowe nanostruktury półprzewodnikowe do zastosowań w biologii i medycynie - Rozwój i komercjalizacja nowej generacji urządzeń diagnostyki molekularnej opartych o nowe polskie przyrządy półprzewodnikowe” (POIG.01.01.02-00-008/08 dla W.K.) oraz ze środków US National Science Foundation (Grant No. 1110942, dla F.D.).
Opłaty związane z ochroną wynalazku sfinansowano ze środków projektu Nanotechnology, Biomaterials and alternative Energy Source for ERA integration FP7-REGPOT-CT-2011-285949 -NOBLESSE.
Tabela 1. Procentowy skład atomowy warstwy NIP wyznaczony za pomocą analizy ilościowej XPS.
| Pierwiastek w warstwie NIP | Wyznaczona zawartość pierwiastka (dane XPS), % at. | Obliczona zawartość pierwiastka (stosunek stechiometryczny), % at. |
| N | 1,1 | 2,8 |
| 0 | 8,0 | 2,8 |
| S | 15,4 | 15,2 |
| C | 75,5 | 78,1 |
PL 229 588 Β1
Tabela 2. Procentowy skład atomowy warstwy MIP-TATAAA wyznaczony za pomocą analizy ilościowej XPS.
| Pierwiastek w warstwie MIP-TATAAA | Wyznaczona zawartość pierwiastka (dane XPS), % at. | Obliczona zawartość pierwiastka (stosunek stechiometryczny), % at. |
| N | 2,85 | 5,49 |
| O | 10,57 | 6,93 |
| S | 14,04 | 13,59 |
| P | 0,52 | 0,78 |
| C | 72,89 | 73,20 |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (7)
1. Sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT (A - adenina, T - tymina) komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA o poniższym wzorze strukturalnym:
2. Sposób otrzymywania sztucznej nici promotorowej DNA, zawierającej oligonukleotyd TATAAA, w postaci warstwy oligomeru ATATTT 1, metodą molekularnego wdrukowania, tj. polimeru wdrukowanego molekularnie (ang. molecularly imprinted polimer, MIP), za pomocą polimeryzacji elektrochemicznej w warunkach potencjodynamicznych, na przewodzącym podłożu, znamienny tym, że jako monomer funkcyjny do elektropolimeryzacji stosuje się 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitienylo)metan] 2 i 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylometylo)fenylu 3 i monomer sieciujący (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 4.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że do polimeryzacji stosuje się roztwór mieszanych rozpuszczalników, korzystnie acetonitrylu, wody, toluenu i izopropanolu, o stosunku objętościowym jak, odpowiednio, 7,5:1:1:0,5, zawierający 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitienylo)metan] 2 i 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylometylo)fenylu 3 oraz (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 4, korzystnie w stosunku molowym jak, odpowiednio, 1:2,5:1,25:25, i elektrolit podstawowy, korzystnie chloran(VII) tetrabutyloamoniowy ((TBAjCICM), w zakresie stężeń od 0,01 M do 1,0 M, korzystnie 0,1 M.
4. Sposób według zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, że stosuje się potencjał liniowo zmieniany cyklicznie w zakresie od 0 do 1,5 V, korzystnie w zakresie od 0,50 do 1,25 V, ze stałą szybkością zawierającą się w przedziale od 5 do 1000 mV/s, korzystnie 50 mV/s.
PL 229 588 Β1
5. Sposób według zastrz. 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że stosuje się przewodzące podłoże wybrane spośród grupy stałych elektrod przewodzących i półprzewodzących, korzystnie elektrody platynowej, elektrody złotej i płytki szklanej z napylonym złotem.
6. Warstwa oligomeru ATATTT 1 rozpoznającego, na drodze hybrydyzacji, sekwencję oligonukleotydową TATAAA, prowadząca w wyniku tej hybrydyzacji do wytworzenia sztucznej nici promotorowej DNA, wytworzona sposobem według zastrz. 2, znamienna tym, że stanowi ją polimer zawierający jako monomery funkcyjne 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitienylo)metan] 2 i 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitiofen-5-ylometylo)fenylu 3 oraz jako monomer sieciujący (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 4 oraz wnękę molekularną odpowiadającą wielkością, kształtem jak i liczbą i orientacją miejsc rozpoznających wdrukowanemu oligonukleotydowi.
7. Zastosowanie warstwy oligomeru ATATTT 1 rozpoznającego sekwencję oligonukleotydową TATAAA 5, otrzymanej sposobem według zastrz. 2, i/lub określonej w zastrz. 6, jako sztucznej nici rozpoznającej za pomocą hybrydyzacji oznaczany oligonukleotyd TATAAA 5, służący do selektywnego wykrywania i/lub oznaczania oligonukleotydu TATAAA 5, korzystnie w płynach ustrojowych człowieka lub zwierzęcia, zwłaszcza przy diagnozowaniu chorób, albo służący w produkcji leków, zwłaszcza otrzymywanych techniką rekombinowanego DNA.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL409329A PL229588B1 (pl) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | Nowy sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA, sztuczna nić promotora DNA zawierająca ten oligomer i jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA |
| PL412848A PL230553B1 (pl) | 2014-08-29 | 2015-06-25 | Sposob wytwarzania polimeru z promotorowa sekwencja TATAAA w sztucznej kasecie TATA i zastosowanie tego polimeru do rozpoznawania i/lub selektywnego oznaczania szescionukleotydowej sekwencji DNA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL409329A PL229588B1 (pl) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | Nowy sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA, sztuczna nić promotora DNA zawierająca ten oligomer i jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL409329A1 PL409329A1 (pl) | 2016-03-14 |
| PL229588B1 true PL229588B1 (pl) | 2018-08-31 |
Family
ID=55450755
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL409329A PL229588B1 (pl) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | Nowy sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA, sztuczna nić promotora DNA zawierająca ten oligomer i jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA |
| PL412848A PL230553B1 (pl) | 2014-08-29 | 2015-06-25 | Sposob wytwarzania polimeru z promotorowa sekwencja TATAAA w sztucznej kasecie TATA i zastosowanie tego polimeru do rozpoznawania i/lub selektywnego oznaczania szescionukleotydowej sekwencji DNA |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL412848A PL230553B1 (pl) | 2014-08-29 | 2015-06-25 | Sposob wytwarzania polimeru z promotorowa sekwencja TATAAA w sztucznej kasecie TATA i zastosowanie tego polimeru do rozpoznawania i/lub selektywnego oznaczania szescionukleotydowej sekwencji DNA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (2) | PL229588B1 (pl) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL239699B1 (pl) * | 2017-09-18 | 2021-12-27 | Inst Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk | Nowy bisbitiofenowy analog oktanukleotydu o sekwencji nukleotydów CGCCGCCG, sposób jego otrzymywania, czujnik elektrochemiczny zawierający ten analog, sposób wytworzenia tego czujnika i zastosowanie czujnika elektrochemicznego |
| PL238942B1 (pl) * | 2017-11-24 | 2021-10-25 | Inst Chemii Fizycznej Polskiej Akademii Nauk | Syntetyczny polimer nukleotydowy z warstwą rozpoznającą, jego wytwarzanie i zastosowanie do selektywnego oznaczania rakotwórczej heterocyklicznej aminy aromatycznej za pomocą czujnika chemicznego |
-
2014
- 2014-08-29 PL PL409329A patent/PL229588B1/pl unknown
-
2015
- 2015-06-25 PL PL412848A patent/PL230553B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL412848A1 (pl) | 2016-03-14 |
| PL409329A1 (pl) | 2016-03-14 |
| PL230553B1 (pl) | 2018-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tanaka et al. | Structures, physicochemical properties, and applications of T–Hg II–T, C–Ag I–C, and other metallo-base-pairs | |
| Zhang et al. | An electrochemiluminescence biosensor for Kras mutations based on locked nucleic acid functionalized DNA walkers and hyperbranched rolling circle amplification | |
| Li et al. | Highly selective and sensitive determination of dopamine by the novel molecularly imprinted poly (nicotinamide)/CuO nanoparticles modified electrode | |
| Dauphin-Ducharme et al. | High-precision electrochemical measurements of the guanine-, mismatch-, and length-dependence of electron transfer from electrode-bound DNA are consistent with a contact-mediated mechanism | |
| Simonova et al. | Tuning of oxidation potential of ferrocene for ratiometric redox labeling and coding of nucleotides and DNA | |
| Megger et al. | Contiguous metal‐mediated base pairs comprising two AgI ions | |
| Jash et al. | A metal-mediated base pair that discriminates between the canonical pyrimidine nucleobases | |
| Goldau et al. | Reversible photoswitching of RNA hybridization at room temperature with an azobenzene C‐nucleoside | |
| Spata et al. | Role of excitonic coupling and charge-transfer states in the absorption and CD spectra of adenine-based oligonucleotides investigated through QM/MM simulations | |
| Zhang et al. | Programmable mismatch-fueled high-efficiency DNA signal converter | |
| Kataev et al. | Understanding stacking interactions between an aromatic ring and nucleobases in aqueous solution: experimental and theoretical study | |
| Liu et al. | Nonenzymatic multiamplified electrochemical detection of medulloblastoma-relevant microRNAs from cerebrospinal fluid | |
| Sarmah et al. | Interaction between small gold clusters and nucleobases: a density functional reactivity theory based study | |
| Ziółkowski et al. | Electrochemical detection of DNA hybridization using metallacarborane unit | |
| Mittal et al. | Amplifying quantum Tunneling current sensitivity through Labeling nucleotides using graphene Nanogap electrodes | |
| PL229588B1 (pl) | Nowy sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA, sztuczna nić promotora DNA zawierająca ten oligomer i jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA | |
| Babar et al. | Detecting Hachimoji DNA: An eight-building-block genetic system with MoS2 and Janus MoSSe monolayers | |
| Smith et al. | Strong sequence–dependence in RNA/DNA hybrid strand displacement kinetics | |
| Crnolatac et al. | Small molecule probes finely differentiate between various ds-and ss-DNA and RNA by fluorescence, CD and NMR response | |
| US20100035248A1 (en) | Surface-based nucleic acid assays employing morpholinos | |
| US10597704B2 (en) | Nucleic acid classification | |
| Navarro et al. | Supported synthesis of ferrocene modified oligonucleotides as new electroactive DNA probes | |
| Zheng et al. | Unnatural Nucleic Acid Aptamers: from SELEX to Tailored Functionalization and Applications | |
| Lahlalate et al. | New catalyst for synthesis of cyclic nucleosides: Insights into silyl-Hilbert-Johnson reaction, ADME survey, dynamic simulation and molecular docking studies targeting HCV | |
| Wagenknecht | Principles and mechanisms of photoinduced charge injection, transport, and trapping in dna |