PL228857B1 - Szczep bakteriofagowy oraz jego zastosowanie do zwalczania bakterii Proteus mirabilis zwłaszcza szczepów lekoopornych - Google Patents
Szczep bakteriofagowy oraz jego zastosowanie do zwalczania bakterii Proteus mirabilis zwłaszcza szczepów lekoopornychInfo
- Publication number
- PL228857B1 PL228857B1 PL413053A PL41305315A PL228857B1 PL 228857 B1 PL228857 B1 PL 228857B1 PL 413053 A PL413053 A PL 413053A PL 41305315 A PL41305315 A PL 41305315A PL 228857 B1 PL228857 B1 PL 228857B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- bacteriophage
- proteus mirabilis
- mirabilis
- phage
- strains
- Prior art date
Links
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 title claims abstract description 42
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title claims abstract description 36
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 abstract 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 abstract 1
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 22
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 11
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 11
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 11
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 11
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 11
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 8
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 8
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 3
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 3
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 3
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 241000023635 Aeromonas virus 65 Species 0.000 description 2
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 108010068385 carbapenemase Proteins 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 210000001635 urinary tract Anatomy 0.000 description 2
- WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-n-(5-methyl-1,2-oxazol-3-yl)benzenesulfonamide;5-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methyl]pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound O1C(C)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1.COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 AmpC Proteins 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000588772 Morganella morganii Species 0.000 description 1
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 1
- 241000906446 Theraps Species 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N clavulanic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N 0.000 description 1
- 229940047766 co-trimoxazole Drugs 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 150000001993 dienes Chemical class 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 229940124307 fluoroquinolone Drugs 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000009215 host defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 244000039328 opportunistic pathogen Species 0.000 description 1
- 229960005141 piperazine Drugs 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakteriofagowy i jego zastosowanie do produkcji preparatów stosowanych w leczeniu lub zapobieganiu zakażeniom bakteryjnym i zwalczaniu biofilmów, zwłaszcza szczepami bakterii lekoopornych z gatunku Proteus mirabilis. Nowy szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do gatunku Proteus mirabilis jest zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem depozytowym: F/00086. Zastosowanie szczepu bakteriofaga dotyczy użycia całego bakteriofaga w preparatach złożonych z pojedynczego typu faga, jak i w postaci koktajlu zawierającego kilka lub kilkanaście aktywnych bakteriofagów. Ponadto wynalazek obejmuje wykorzystanie oczyszczonych białek bakteriofagowych, korzystnie enzymów litycznych degradujących ścianę komórkową bakterii oraz rozkładających bakteryjne polisacharydy zewnątrzkomórkowe.
Description
RZECZPOSPOLITA
POLSKA
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej
| Szczep bakteriofagowy oraz jego zastosowanie do zwalczania bakterii Proteus mirabilis ( ' zwłaszcza szczepów lekoopornych | |
| (73) Uprawniony z patentu: | |
| UNIWERSYTET ŁÓDZKI, Łódź, PL | |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: | |
| 16.01.2017 BUP 02/17 | (72) Twórca(y) wynalazku: |
| AGNIESZKA MASZEWSKA, Łódź, PL | |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: | ANTONI RÓŻALSKI, Łódź, PL |
| 30.05.2018 WUP 05/18 | (74) Pełnomocnik: |
| rzecz, pat. Wojciech Zajączkowski |
rm oo oo
CM
CM
Ω.
PL 228 857 B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest szczep bakteriofagowy oraz jego zastosowanie do zwalczania bakterii Proteus mirabilis, zwłaszcza szczepów lekoopornych.
Bakteriofagi to wirusy mające naturalną zdolność do niszczenia bakterii, powszechnie występujące w środowisku oraz przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt [Ackermann H.W.: Bacteriophage taxonomy. Microbiol. Australia, 2011; 2: 90-94]. Obecnie dzięki zaawansowanym metodom badawczym, bakteriofagi stały się narzędziem do walki z wielolekoopornymi drobnoustrojami, bakteriami niepożądanymi w przemyśle oraz narzędziem wykorzystywanym w diagnostyce i biologii molekularnej. Zaletą fagów jest ich duża swoistość względem bakterii, związana z występowaniem konkretnych receptorów na komórce gospodarza. Konsekwencją tego jest niszczenie bakterii należących do określonego gatunku a nawet szczepu bez naruszania naturalnej flory bakteryjnej pacjenta. Wytwarzane przez fagi enzymy odpowiedzialne za degradację ściany komórkowej lub otoczki bakteryjnej wzbudzają zainteresowanie jako potencjalne czynniki lecznicze lub składniki środków dezynfekcyjnych. Enzymy te zaliczane są do nowej grupy preparatów leczniczych zwanych enzybiotykami [Drulis-Kawa Z., MajkowskaSkrobek G., Maciejewska B., Delattre A.S. and Lavigne R.: Learning from bacteriophages - advantages and limitations of phage and phage-encoded protein applications. Curr. Protein Pept. Sci., 2012; 13: 699-722]. Do zwalczania bakterii wykorzystywane są fagi wirulentne, takie, które w wyniku procesu namnażania się w bakterii, doprowadzają do jej zniszczenia i uwolnienia wirusów potomnych zdolnych do infekowania następnych komórek bakteryjnych [Maura D., Debarbieux L.: Bacteriophages as twentyfirst century antibacterial tools for food and medicine. Apel. Microbiol. Biotechnol., 2011; 90: 851-859].
P. mirabilis to Gram-ujemne, należące do rodziny Enterobacteriaceae, oportunistyczne patogeny, będące głównie przyczyną zakażeń układu moczowego (ZUM), zwłaszcza u osób poddawanych cewnikowaniu lub pacjentów z wadami anatomicznymi lub/i defektami fizjologicznymi w układzie moczowym oraz po zabiegach chirurgicznych [Jacobsen S.M., Shirtliff M.E.: Proteus mirabilis biofilms and catheterassociated urinary tract infections. Virulence, 2011; 2, 460-465]. Wykazano, iż w przypadku pacjentów szpitali czy leczonych ambulatoryjnie poddawanych cewnikowaniu pęcherza moczowego, częstość ZUM wzrasta o 5% z każdym kolejnym dniem utrzymywania katetera w drogach moczowych. Związane jest to z tworzeniem na powierzchni cewnika biofilmu, struktury opornej na działanie czynników dezynfekcyjnych, antybiotyków czy mechanizmów obronnych gospodarza [Moryl M., Torzewska A., Jałmużna P. and Różalski A.: Analysis of Proteus mirabilis distribution in multi-species biofilms on urinary catheters and determination of bacteria resistance to antimicrobial agents. Pol. J. Microbiol, 2013; 62: 377-384]. Niewłaściwe stosowanie antybiotyków doprowadziło do wyselekcjonowania wielolekoopornych szczepów P. mirabilis [Kraśnicki K., Wolski Z., Mikucka A., Gospodarek E.: Wrażliwość pałeczek Gram-ujemnych na leki przeciwbakteryjne w oddziałach urologii. Przegląd Urologiczny, 2007; 43: 83; Schneider I., Markovska R., Marteva-Proevska Y., Mitov I., Markova B., Bauernfeind A.: Detection of CMY-99, a novel acquired AmpC-type β-lactamase, and VIM-1 in Proteus mirabilis isolates in Bulgaria. Antimicrob. Agents Chemother., 2014; 58, 620-621]. U pałeczek P. mirabilis oporność na stosowane antybiotyki β-laktamowe związana jest z wytwarzaniem cefalosporynaz AmpC, beta-laktamaz o rozszerzonym spektrum działania ESBL oraz karbapenemaz [Datta P., Gupta V., Arora S., Garg S., Chander J.: Epidemiology of extended-spectrum β-lactamase, AmpC, and carbapenemase production in Proteus mirabilis. Jpn J Infect Dis. 2014; 67(1): 44-6]. Coraz częściej stwierdzana jest oporność P. mirabilis na szerokozakresowe cefalosporyny oraz na ciprofloksacynę lek z grupy fluorochinolonów [Sohn K.M., Kang C.I., Joo E.J., Ha Y.E., Chung D.R., Peck K.R., Lee N. Y., Song J.H.: Epidemiology of ciprofloxacin resistance and its relationship to extended-spectrum β-lactamase production in Proteus mirabilis bacteremia Korean J Intern Med., 2011; 26 (1): 89-93; Wang J.T., Chen P.C., Chang S.C., Shiau Y.R., Wang H.Y., Lai J.F., Huang I.W., Tan M.C., Lauderdale T.L.; TSAR Hospitals: Antimicrobial susceptibilities of Proteus mirabilis: a longitudinal nationwide study from the Taiwan surveillance of antimicrobial resistance (TSAR) program. BMC Infect Dis. 2014 5; 14: 486]. W związku z tym poszukuje się alternatywnych metod zwalczania zakażeń wywoływanych przez P. mirabilis, w szczególności tych związanych z tworzeniem biofilmu. Jedną z nich polega na zastosowaniu swoistych bakteriofagów. Obecnie niewiele jest wiadomo na temat fagów zdolnych do infekowania bakterii z gatunku P. mirabilis jak i enzymów przez nie produkowanych. Publikacje z lat 70-tych i 90-tych wskazywały na potencjał różnicujący bakteriofagów w stosunku do szczepów z rodzaju Proteus w tym gatunku P. mirabilis [Hickman F.W., Farmer J.J. 3rd.: Differentiation of Proteus mirabilis by bacteriophage typing and the Dienes reaction. J Clin Microbiol., 1976; 3(3): 350-8; Schmidt W.C., Jeffries C.D.: Bacteriophage typing of Proteus mirabilis,
PL 228 857 B1
Proteus vulgaris, and Proteus morganii. Appl Microbiol., 1974; 27(1): 47-53; Sekaninova G„ Rychlik I., Kolarova M., Pillich J., Semenka J., Zajicova V.: A new bacteriophage typing scheme for Proteus mirabilis and Proteus vulgaris strains. 3. Analysis of lytic properties. Folia Microbiol (Praha). 1998; 43(2): 136-40]. Dostępne publikacje wskazują na możliwość zastosowania fagów w zwalczaniu biofilmów tworzonych przez P. mirabilis [Carson L., Gorman S.P., Gilmore B.F.: The use of lytic bacteriophages in the prevention and eradication of biofilms of Proteus mirabilis and Escherichia coli. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2010; 1-9; Lehman S.M., Donlan R.M.: Bacteriophage-mediated control of a two-species biofilm formed by microorganisms causing catheter-associated urinary tract infections in an in vitro urinary catheter model. Antimicrob Agents Chemother. 2015; 59(2): 1127-37].
Wynalazek dotyczy nowego szczepu bakteriofaga specyficznego wobec bakterii należących do gatunku P. mirabilis zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem depozytowym: F/00086. Wynalazek obejmuje również zastosowanie szczepu bakteriofaga zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem depozytowym: F/00086 do wytwarzania preparatów przeciwbakteryjnych służących do zwalczania bakterii należących do gatunku P. mirabilis.
Zastosowanie szczepu bakteriofaga dotyczy użycia całego bakteriofaga w preparatach złożonych z pojedynczego typu faga, jak i w postaci koktajlu zawierającego kilka lub kilkanaście aktywnych bakteriofagów. Ponadto wynalazek dotyczy wykorzystania oczyszczonych białek bakteriofagowych, korzystnie enzymów litycznych degradujących ścianę komórkową bakterii oraz rozkładających bakteryjne polisacharydy zewnątrzkomórkowe.
P r z y k ł a d 1
Bakteriofag 65 A.
Fag o oznaczeniu 65APm2833 tworzący 1 mm przejrzyste łysinki izolowany ze ścieków pobranych z Grupowej Oczyszczalni Ścieków w Łodzi na szczepie P. mirabilis 2833. 10 ml ścieków wirowanych 9000 obr/min, 30 min, 4°C i sączonych przez jałowe filtry o średnicy porów 0,2 μm mieszano z 10 ml 2 x stęż. TSB (bulion tryptozowo-sojowy) i 1 ml 24-godzinnej hodowli P. mirabilis 2833 na TSB. Tak przygotowane mieszaniny wytrząsano 150 obr/min. przez 3 godz. w temp. 37°C. Po inkubacji nanoszono ok. 1 ml hodowli na zmodyfikowane podłoże fagowe [Ślopek S., Durlakowa I., Kucharewicz-Krukowska A., Krzywy T., Ślopek A., Weber B.: Phage typing of Shigella flexneri. Arch Immunol Therap Exp, 1972; 20(1): 1-60] zwierające fenol w stężeniu końcowym 0,1% i po ściągnięciu nadmiaru zawiesiny, płytki inkubowano 24 h w temp. 37°C. Dodany do podłoża fenol zapobiegał wzrostowi rozpełzłemu bakterii. Pojedynczą łysinkę wycinano jałową pipetą pasterowską i przenoszono do bulionu wzbogaconego i dodawano 50 μl 18 h hodowli bulionowej szczepu - gospodarza. Po 4-godzinnej inkubacji w temp. 37°C, hodowle inkubowano w temp. 4°C przez noc. Kolejno lizaty fagowe wirowano 4000 obr/min, 30 min 4°C na wirówce Multifuge 3 S-R Heraeus, a supernatanty przesączono przez filtry o średnicy porów 0,2 μm. Uzyskane lizaty fagowe rozcieńczano w postępie geometrycznym. Z poszczególnych rozcieńczeń pobierano 200 μl i dodawano do 3 ml roztopionego agaru wzbogaconego (2,8 g agaru, 4,2 g bulionu wzbogaconego/1000 ml H2O destylowanej) zawierającego 100 μl 18 godzinnej hodowli szczepu-gospodarza, następnie wylewano na zmodyfikowane podłoże fagowe z 0,1% fenolem i pozostawiano do zastygnięcia. Płytki inkubowano 24 godziny w temp. 37°C. Procedurę wycinania łysinek i namnażania bakteriofagów powtarzano 5-krotnie celem uzyskania czystej linii fagowej. Wyizolowany bakteriofag 65A został wykorzystany do określenia spektrum aktywności litycznej z użyciem 50 szczepów P. mirabilis, w tym 22 szczepów wyizolowanych z biofilmu na cewnikach urologicznych, dla których wcześniej określono lekowrażliwość na 13 antybiotyków [Moryl M., Torzewska A., Jałmużna P. and Różalski A.: Analysis of Proteus mirabilis distribution in multi-species biofilms on urinary catheters and determination of bacteria resistance to antimicrobial agents. Pol. J. Microbiol, 2013; 62: 377-384]. 91%, 86% i 82% tych szczepów było odpowiednio opornych na gentamycynę, kotrimoksazol i amoksycyklinę z kwasem klawulonowym, 44% było opornych na ciprofloksacynę. Trzy z 22 szczepów wykazywało oporność na wszystkie testowane leki. Szczepy P. mirabilis pochodziły z kolekcji będącej własnością Zakładu Immunobiologii Bakterii Uniwersytetu Łódzkiego. 22 szczepy wyizolowano z cewników uzyskanych od pacjentów Przyszpitalnej Poradni Urologicznej, Szpitala im. Pirogowa w Łodzi, pozostałe 28 szczepów wyizolowano z moczu pacjentów z ZUM oddziałów Neurochirurgii, Nefrologii, Rehabilitacji Neurologicznej Szpitala IP-CZD w Warszawie. Na podłoże fagowe wylewano 6 ml roztopionego agaru wzbogaconego zwierającego 150 μl 20-godzinnej hodowli poszczególnych szczepów bateryjnych i nanoszono 10 μl lizatu faga 65A o liczbie cząstek wirusa 1x108 PFU/ml. Miano faga wyznacza się metodą Gratii. Płytki inkubowano przez 4 h w temp. 37°C, następnie przez noc w temp. 4°C. Odczytywano stopień lizy murawy bakteryjnej w skali 1-4, z uwzględnieniem pojedynczych łysinek w obszarze naniesienia lizatu
PL 228 857 B1 fagowego, gdzie: 4 - całkowita liza, 3 - lekko mętna, całkowita liza, 2 - średnio widoczna liza, 1 - słabo widoczna liza [Kutter E.: Phage host range and efficiency of plating. In Clokie MRJ, Kropinski AM (Eds):
Bacteriophages: methods and protocols. Volume 1: Isolation, characterization, and interactions. Vol.
501, Humana Press, New York, 2009; pp. 141-149]. Dodatnie reakcje lityczne obserwowano dla 48 badanych szczepów, w tym 39 (4), 5 (3), 3 (2), 1 (1).
P r z y k ł a d 2
Badanie wrażliwości biofilmów P. mirabilis na faga 65A.
Wykorzystano 50 szczepów P. mirabilis, w tym 22 szczepy wyizolowane z biofilmu powstałego na cewnikach urologicznych oraz 28 pochodzących z moczu pacjentów z ZUM. Hodowle bakteryjne inkubowane 20 godz., w temp. 37°C rozcieńczono 50-krotnie w bulionie wzbogaconym o pH=7,1 uzyskując miano bakterii ok. 1x107/ml. Na 96-dołkową płaskodenną płytkę polistyrenową nanoszono hodowle bakteryjne w objętości 100 μl na studzienkę. Po 24 godzinnej inkubacji płytek w temp. 37°C w komorze wilgotnej zbierano podłoże i płukano biofilmy bakteryjne jałowym 0,85% NaCl. Następnie do studzienek dodawano lizat fagowy o mianie 1x108 PFU/ml bulionu wzbogaconego zawierającego 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1 w objętości 100 μl na studzienkę.
Naniesiono również do oddzielnych studzienek lizaty fagowe oraz bulion wzbogacony zawierający 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1, które stanowiły kontrolę tzw. tło. Kontrolę biofilmu tworzonego przez poszczególne szczepy P. mirabilis stanowiły hodowle bakteryjne nie poddawane działaniu bakteriofaga 65A, do których nanoszono bulion wzbogacony zawierający 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1. Płytki inkubowano 24 godz., w temp. 37°C w komorze wilgotnej. Po inkubacji studzienki płukano jałowym 0,85% NaCl, a następnie dodawano po 100 μl bulionu wzbogaconego zawierającego 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1 i 10 μl MTT [bromek 3-(4,5-dimetylo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolu] o stężeniu 5 mg/ml PBS. Po 3 godzinnej inkubacji w temp. 37°C w komorze wilgotnej zebrano podłoże i do każdej studzienki dodawano po 150 μl DMSO i 25 μl buforu glicynowego o pH 10,6 (50 ml 0,2 M glicyny, 43,5 ml 0,2 M NaOH, 106,5 ml wody bidestylowanej) w celu rozpuszczenia k ryształów formazanu. Wartość absorbancji zmierzono przy długości fali 550 nm na czytniku płytek Multiscan Ex Labsystems typ 355. Od wartości absorbancji dla poszczególnych prób badanych odejmowano wartość tła, które stanowiła wartość absorbancji uzyskana dla kontroli fagów i bulionu wzbogaconego zawierającego 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1. Procent redukcji biofilmu P. mirabilis powodowanej przez faga 65A obliczono za pomocą wzoru: % zniszczenia biofilmu = 100% - (Ap550 x 100%/ Ak550), gdzie: Ap550 średnia wartość absorbancji przy długości fali 550 nm próby badanej - biofilm poddany działaniu fagów; Ak550 - średnia wartość absorbancji przy długości fali 550 nm biofilmu hodowanego w bulionie wzbogaconym zawierającego 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1 bez faga 65 A. W rezultacie wykazano, że fag 65 A powodował w powyżej 50% redukcję biofilmów 18 z 50 badanych szczepów P. mirabilis, w tym biofilmy 6 szczepów były niszczone powyżej 75% w porównaniu do kontroli.
P r z y k ł a d 3
Badanie wrażliwości form planktonowych P. mirabilis na faga 65 A.
Wykorzystano 50 szczepów P. mirabilis, w tym 22 szczepy wyizolowane z biofilmu powstałego na cewnikach urologicznych oraz 28 pochodzących z moczu pacjentów z ZUM. Hodowle bakteryjne inkubowane 20 godz., w temp. 37°C rozcieńczono 50-krotnie w bulionie wzbogaconym o pH=7,1 uzyskując miano bakterii ok. 1x107/ml. Na 96-dołkową płaskodenną płytkę polistyrenową nanoszono hodowle bakteryjne w objętości 100 μl na studzienkę. Następnie do studzienek dodawano lizat fagowy o mianie 5x105 PFU/ml bulionu wzbogaconego zawierającego 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1 w objętości 200 μl na studzienkę. Naniesiono również do oddzielnych studzienek lizaty fagowe oraz bulion wzbogacony zawierający 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1, które stanowiły kontrolę tzw. tło. Kontrolę wzrostu poszczególnych szczepów P. mirabilis stanowiły hodowle bakteryjne nie poddawane działaniu bakteriofaga 65 A, do których nanoszono bulion wzbogacony zawierający 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1. Po 24 godzinnej inkubacji płytek w temp. 37°C w komorze wilgotnej mierzono absorbancję prób przy długości fali 550 nm na czytniku płytek Multiscan Ex Labsystems typ 355. Od wartości absorbancji dla poszczególnych prób badanych odejmowano wartość tła, które stanowiła wartość absorbancji uzyskana dla kontroli fagów i bulionu wzbogaconego zawierającego 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1. Procent redukcji wzrostu form planktonowych P. mirabilis powodowanej przez faga 65A obliczono za pomocą wzoru: % redukcji wzrostu = 100% - (Ap550 x 100%/ Ak55o), gdzie: Ap550 - średnia wartość absorbancji przy długości fali 550 nm próby badanej - hodowle płynne poddane działaniu fagów; Ak55o - średnia wartość absorbancji przy długości fali 550 nm hodowli
PL 228 857 B1 płynnych w bulionie wzbogaconym zawierającego 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1 bez faga
65A. W rezultacie wykazano, że fag 65A hamował w powyżej 80% wzrost 18 z 50 badanych szczepów
P. mirabilis, w tym wzrost 6 szczepów został zahamowany powyżej 95% w porównaniu do kontroli.
Claims (5)
- Zastrzeżenia patentowe1. Nowy szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do gatunku Proteus mirabilis zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem depozytowym: F/00086.
- 2. Zastosowanie szczepu bakteriofaga zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem depozytowym: F/00086 do wytwarzania preparatów przeciwbakteryjnych służących do zwalczania bakterii należących do gatunku Proteus mirabilis.
- 3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że do wytwarzania preparatów antybakteryjnych wykorzystuje się całe cząsteczki bakteriofaga wirulentnego w preparatach złożonych z pojedynczego typu faga.
- 4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że do wytwarzania preparatów antybakteryjnych wykorzystuje się koktajl zawierający kilka lub kilkanaście aktywnych bakteriofagów.
- 5. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że do wytwarzania preparatów antybakteryjnych wykorzystuje się oczyszczone białka bakteriofagowe, korzystnie enzymy lityczne degradujące ścianę komórkową bakterii oraz rozkładające bakteryjne polisacharydy zewnątrzkomórkowe.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL413053A PL228857B1 (pl) | 2015-07-07 | 2015-07-07 | Szczep bakteriofagowy oraz jego zastosowanie do zwalczania bakterii Proteus mirabilis zwłaszcza szczepów lekoopornych |
| SI201630733T SI3319626T1 (sl) | 2015-07-07 | 2016-07-07 | Sevi bakteriofagov proti proteus mirabilis in njihova uporaba |
| PL16753961T PL3319626T3 (pl) | 2015-07-07 | 2016-07-07 | Szczepy bakteriofagów specyficznych wobec Proteus mirabilis oraz ich zastosowanie |
| EP16753961.8A EP3319626B1 (en) | 2015-07-07 | 2016-07-07 | Bacteriophage strains against proteus mirabilis and uses thereof |
| US15/742,127 US10435671B2 (en) | 2015-07-07 | 2016-07-07 | Bacteriophage strains against proteus mirabilis and use thereof |
| PCT/IB2016/000974 WO2017006175A1 (en) | 2015-07-07 | 2016-07-07 | New bacteriophage strains against proteus mirabilis and use thereof |
| DK16753961.8T DK3319626T3 (da) | 2015-07-07 | 2016-07-07 | Bakteriofagstammer mod Proteus mirabilis og anvendelser deraf |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL413053A PL228857B1 (pl) | 2015-07-07 | 2015-07-07 | Szczep bakteriofagowy oraz jego zastosowanie do zwalczania bakterii Proteus mirabilis zwłaszcza szczepów lekoopornych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL413053A1 PL413053A1 (pl) | 2017-01-16 |
| PL228857B1 true PL228857B1 (pl) | 2018-05-30 |
Family
ID=57756500
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL413053A PL228857B1 (pl) | 2015-07-07 | 2015-07-07 | Szczep bakteriofagowy oraz jego zastosowanie do zwalczania bakterii Proteus mirabilis zwłaszcza szczepów lekoopornych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL228857B1 (pl) |
-
2015
- 2015-07-07 PL PL413053A patent/PL228857B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL413053A1 (pl) | 2017-01-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rajivgandhi et al. | Detection of ESBL genes from ciprofloxacin resistant Gram negative bacteria isolated from urinary tract infections (UTIs) | |
| JP5651407B2 (ja) | アシネトバクター・バウマニのファージ | |
| Gangoué-Piéboji et al. | The in-vitro antimicrobial activity of some medicinal plants against β-lactam-resistant bacteria | |
| ES2857199T3 (es) | Terapia con fagos de infecciones de Pseudomonas | |
| JP2017507913A (ja) | Ｅ．ｃｏｌｉ感染のファージを用いての治療 | |
| JP2020510024A (ja) | ファージ療法 | |
| US10435671B2 (en) | Bacteriophage strains against proteus mirabilis and use thereof | |
| Shehabi et al. | Characterization of antimicrobial resistance and class 1 integrons found in Escherichia coli isolates from human stools and drinking water sources in Jordan | |
| Shi et al. | Antagonistic activity and mechanism of Lactobacillus rhamnosus SQ511 against Salmonella enteritidis | |
| Pajavand et al. | Evaluation of combined carbon dots and ciprofloxacin on the expression level of pslA, pelA, and ppyR genes and biofilm production in ciprofloxacin-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from burn wound infection in Iran | |
| AL–Dulaimi et al. | Antimicrobial and Anti–Biofilm Activity of Polymyxin E Alone and in Combination with Probiotic Strains of Bacillus subtilis KATMIRA1933 and Bacillus amyloliquefaciens B–1895 against Clinical Isolates of Selected Acinetobacter spp.: A Preliminary Study. Pathogens 2021, 10, 1574 | |
| PL228856B1 (pl) | Szczep bakteriofagowy oraz jego zastosowanie do leczenia infekcji powodowanych przez bakterie Proteus mirabilis zwłaszcza przez szczepy lekooporne | |
| JPH0820510A (ja) | 抗菌活性のある香辛料、およびこれを原料とする抗菌剤 | |
| CN110124041B (zh) | 一种能够抗持留菌和生物膜菌的药物组合物及其用途 | |
| CN115645414B (zh) | 抗菌药物组合物及其应用 | |
| PL228857B1 (pl) | Szczep bakteriofagowy oraz jego zastosowanie do zwalczania bakterii Proteus mirabilis zwłaszcza szczepów lekoopornych | |
| Li et al. | vB_Ent31 bacteriophage may combat Enterobacter cloacae infections with macrophage modulating activity | |
| PL228858B1 (pl) | Szczep bakteriofagowy oraz jego zastosowanie do leczenia zakażeń wywoływanych przez bakterie Proteus mirabilis zwłaszcza przez szczepy lekooporne | |
| Singh et al. | In vitro efficacy of bacteriophage and colistin combinations in eradicating biofilm formed by colistin-resistant Enterobacter cloacae complex. | |
| Awad et al. | LicD-mediated cell wall decoration governs phage sensitivity in Enterococcus faecalis clinical isolates | |
| Zadeh et al. | Bacteriophage and probiotic therapy in the treatment of Pseudomonas aeruginosa burn infection and their synergistic effect | |
| Hussain et al. | Antimicrobial activity of non-bond colicin on Candida albicans biofilm | |
| RU2808830C1 (ru) | Штамм бактериофага Pseudomonas phage Ka2 для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, вызываемых Pseudomonas aeruginosa | |
| Al-daan et al. | Effect of piper cubeba fruits extract on bacteriocin production of E. coli isolated from patient with urinary tract infection | |
| CN117180242B (zh) | 龙血素a在制备抗幽门螺杆菌药物中的应用 |