PL228858B1 - Szczep bakteriofagowy oraz jego zastosowanie do leczenia zakażeń wywoływanych przez bakterie Proteus mirabilis zwłaszcza przez szczepy lekooporne - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakteriofagowy i jego zastosowanie do produkcji preparatów stosowanych w leczeniu lub zapobieganiu zakażeniom bakteryjnym i zwalczaniu biofilmów, zwłaszcza szczepami bakterii lekoopornych z gatunku Proteus mirabilis. Nowy szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do gatunku Proteus mirabilis zdeponowany jest w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem depozytowym: F/00085. Zastosowanie szczepu bakteriofaga dotyczy użycia całego bakteriofaga w preparatach złożonych z pojedynczego typu faga, jak i w postaci koktajlu zawierającego kilka lub kilkanaście aktywnych bakteriofagów. Ponadto wynalazek obejmuje wykorzystanie oczyszczonych białek bakteriofagowych, korzystnie enzymów litycznych degradujących ścianę komórkową bakterii oraz rozkładających bakteryjne polisacharydy zewnątrzkomórkowe.

Description

(12)OPIS PATENTOWY ₍i₉₎PL ₍n)228858 (13) B1 (51) IntCI.

(21) Numer zgłoszenia: 413054 _{C12N 7},_{QQ (2006 01)}

A61K 35/76 (2015.01) A61P 31/04 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 07.07.2015

Szczep bakteriofagowy oraz jego zastosowanie do leczenia zakażeń wywoływanych przez bakterie Proteus mirabilis zwłaszcza przez szczepy lekooporne

	(73) Uprawniony z patentu:
	UNIWERSYTET ŁÓDZKI, Łódź, PL
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
16.01.2017 BUP 02/17	(72) Twórca(y) wynalazku:
	AGNIESZKA MASZEWSKA, Łódź, PL ANTONI RÓŻALSKI, Łódź, PL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.05.2018 WUP 05/18	(74) Pełnomocnik:
	rzecz, pat. Wojciech Zajączkowski

oo m

oo oo

CM

CM

Q_

PL 228 858 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest szczep bakteriofagowy oraz jego zastosowanie do leczenia zakażeń wywoływanych przez bakterie Proteus mirabilis, zwłaszcza przez szczepy lekooporne.

Bakteriofagi to wirusy mające naturalną zdolność do niszczenia bakterii, powszechnie występujące w środowisku oraz przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt [Ackermann H.W.: Bacteriophage taxonomy. Microbiol. Australia, 2011; 2: 90-94]. Obecnie dzięki zaawansowanym metodom badawczym, bakteriofagi stały się narzędziem do walki z wielolekoopornymi drobnoustrojami, bakteriami niepożądanymi w przemyśle oraz narzędziem wykorzystywanym w diagnostyce i biologii molekularnej. Zaletą fagów jest ich duża swoistość względem bakterii, związana z występowaniem konkretnych receptorów na komórce gospodarza. Konsekwencją tego jest niszczenie bakterii należących do określonego gatunku, a nawet szczepu bez naruszania naturalnej flory bakteryjnej pacjenta. Wytwarzane przez fagi enzymy odpowiedzialne za degradację ściany komórkowej lub otoczki bakteryjnej wzbudzają zainteresowanie jako potencjalne czynniki lecznicze lub składniki środków dezynfekcyjnych. Enzymy te zaliczane są do nowej grupy preparatów leczniczych zwanych enzybiotykami [Drulis-Kawa Z., Majkowska-Skrobek G., Maciejewska B., Delattre A.S. and Lavigne R.: Learning from bacteriophages - advantages and limitations of phage and phage-encoded protein applications. Curr. Protein Pept. Sci,, 2012; 13: 699-722]. Do zwalczania bakterii wykorzystywane są fagi wirulentne, takie, które w wyniku procesu namnażania się w bakterii, doprowadzają do jej zniszczenia i uwolnienia wirusów potomnych zdolnych do infekowania następnych komórek bakteryjnych [Maura D., Debarbieux L.: Bacteriophages as twentyfirst century antibacterial tools for food and medicine. Apel. Microbiol. Biotechnol., 2011; 90: 851-859].

P. mirabilis to Gram-ujemne, należące do rodziny Enterobacteriaceae, oportunistyezne patogeny, będące głównie przyczyną zakażeń układu moczowego (ZUM), zwłaszcza u osób poddawanych cewnikowaniu lub pacjentów z wadami anatomicznymi lub/i defektami fizjologicznymi w układzie moczowym oraz po zabiegach chirurgicznych [Jacobsen S.M., Shirtliff M.E.: Proteus mirabilis biofilms and catheterassociated urinary tract infections. Virulence, 2011; 2, 460-465]. Wykazano, iż w przypadku pacjentów szpitali czy leczonych ambulatoryjnie poddawanych cewnikowaniu pęcherza moczowego, częstość ZUM wzrasta o 5% z każdym kolejnym dniem utrzymywania katetera w drogach moczowych. Związane jest to z tworzeniem na powierzchni cewnika biofilmu, struktury opornej na działanie czynników dezynfekcyjnych, antybiotyków czy mechanizmów obronnych gospodarza [Moryl M., Torzewska A., Jałmużna P. and Różalski A.: Analysis of Proteus mirabilis distribution in multi-species biofilms on urinary catheters and determination of bacteria resistance to antimicrobial agents. Pol. J. Microbiol, 2013; 62: 377-384]. Niewłaściwe stosowanie antybiotyków doprowadziło do wyselekcjonowania wielolekoopornych szczepów P. mirabilis [Kraśnicki K., Wolski Z., Mikucka A., Gospodarek E.: Wrażliwość pałeczek Gram-ujemnych na leki przeciwbakteryjne w oddziałach urologii. Przegląd Urologiczny, 2007; 43: 83; Schneider I., Markovska R., Marteva-Proevska Y., Mitov I., Markova B., Bauernfeind A.: Detection of CMY-99, a novel acquired AmpC-type β-lactamase, and VIM-1 in Proteus mirabilis isolates in Bulgaria. Antimicrob. Agents Chemother., 2014; 58, 620-621]. U pałeczek P. mirabilis oporność na stosowane antybiotyki β-laktamowe związana jest z wytwarzaniem cefalosporynaz AmpC, beta-laktamaz o rozszerzonym spektrum działania ESBL oraz karbapenemaz [Datta P., Gupta V., Arora S., Garg S., Chander J.: Epidemiology of extended-spectrum β-lactamase, AmpC, and carbapenemase production in Proteus mirabilis. Jpn J Infect Dis. 2014; 67(1): 44-6]. Coraz częściej stwierdzana jest oporność P. mirabilis na szerokozakresowe cefalosporyny oraz na ciprofloksacynę lek z grupy fluorochinolonów [Sohn K.M., Kang C.I., Joo E.J., Ha Y.E., Chung D.R., Peck K.R., Lee N. Y., Song J.H.: Epidemiology of ciprofloxacin resistance and its relationship to extended-spectrum β-lactamase production in Proteus mirabilis bacteremia Korean J Intern Med., 2011; 26 (1): 89-93; Wang J.T., Chen P.C., Chang S.C., Shiau Y.R., Wang H.Y., Lai J.F., Huang I.W., Tan M.C., Lauderdale T.L.; TSAR Hospitals: Antimicrobial susceptibilities of Proteus mirabilis: a longitudinal nationwide study from the Taiwan surveillance of antimicrobial resistance (TSAR) program. BMC Infect Dis. 2014 5; 14: 486]. W związku z tym poszukuje się alternatywnych metod zwalczania zakażeń wywoływanych przez P. mirabilis, w szczególności tych związanych z tworzeniem biofilmu. Jedną z nich polega na zastosowaniu swoistych bakteriofagów. Obecnie niewiele jest wiadomo na temat fagów zdolnych do infekowania bakterii z gatunku P. mirabilis jak i enzymów przez nie produkowanych. Publikacje z lat 70-tych i 90-tych wskazywały na potencjał różnicujący bakteriofagów w stosunku do szczepów z rodzaju Proteus w tym gatunku P. mirabilis [Hickman F.W., Farmer J.J. 3rd.: Differentiation of Proteus mirabilis by bacteriophage typing and the Dienes reaction. J Clin Microbiol., 1976; 3(3): 350-8; Schmidt W.C., Jeffries C.D.: Bacteriophage typing of Proteus mirabilis,

PL 228 858 B1

Proteus vulgaris, and Proteus morganii. AppI Microbiol., 1974; 27(1): 47-53; Sekaninova G., Rychlik I., Kolarova M., Pillich J., Semenka J., Zajicova V.: A new bacteriophage typing scheme for Proteus mirabilis and Proteus vulgaris strains. 3. Analysis of lytic properties. Folia Microbiol (Praha). 1998; 43(2): 136-40]. Dostępne publikacje wskazują na możliwość zastosowania fagów w zwalczaniu biofilmów tworzonych przez P. mirabilis [Carson L., Gorman S.P., Gilmore B.F.: The use of lytic bacteriophages in the prevention and eradication of biofilms of Proteus mirabilis and Escherichia coli. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 2010; 1-9; Lehman S.M., Donlan R.M.: Bacteriophage-mediated control of a two-species biofilm formed by microorganisms causing catheter-associated urinary tract infections in an in vitro urinary catheter model. Antimicrob Agents Chemother. 2015; 59(2):1127-37].

Wynalazek dotyczy nowego szczepu bakteriofaga specyficznego wobec bakterii należących do gatunku P. mirabilis zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem depozytowym: F/00085.

Wynalazek obejmuje również zastosowanie szczepu bakteriofaga zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem depozytowym: F/00085 do wytwarzania preparatów przeciwbakteryjnych służących do zwalczania bakterii należących do gatunku P. mirabilis. Zastosowanie szczepu bakteriofaga dotyczy użycia całego bakteriofaga w preparatach złożonych z pojedynczego typu faga, jak i w postaci koktajlu zawierającego kilka lub kilkanaście aktywnych bakteriofagów. Ponadto wynalazek dotyczy wykorzystania oczyszczonych białek bakteriofagowych, korzystnie enzymów litycznych degradujących ścianę komórkową bakterii oraz rozkładających bakteryjne polisacharydy zewnątrzkomórkowe.

P r z y k ł a d 1

Bakteriofag 39A.

Fag o oznaczeniu 39APmC32 tworzący 3 mm przejrzyste, nieregularne łysinki otoczone 5 mm strefą halo izolowany ze ścieków pobranych ze Stacji Wodociągów i Kanalizacji w Zgierzu na szczepie P. mirabilis C32. 10 ml ścieków wirowanych 9000 obr/min, 30 min, 4°C i sączonych przez jałowe filtry o średnicy porów 0,2 μm mieszano z 10 ml 2 x stęż. TSB (bulion tryptozowo-sojowy) i 1 ml 24 - godzinnej hodowli P. mirabilis C32 na TSB. Tak przygotowane mieszaniny wytrząsano 150 obr/min. przez 3 h w temp. 37°C. Po inkubacji nanoszono ok. 1 ml hodowli na podłoże fagowe [Ślopek S., Durlakowa I., Kucharewicz-Krukowska A., Krzywy T., Ślopek A., Weber B.: Phage typing of Shigella flexneri. Arch Immunol Therap Exp, 1972; 20(1): 1-60] i po ściągnięciu nadmiaru zawiesiny, płytki inkubowano 24 h w temp. 37°C. Pojedynczą łysinkę wycinano jałową pipetą pasterowską i przenoszono do bulionu wzbogaconego i dodawano 50 μl 18 h hodowli bulionowej szczepu - gospodarza. Po 4-godzinnej inkubacji w temp. 37°C, hodowle inkubowano w temp. 4°C przez noc. Kolejno lizaty fagowe wirowano 4000 obr/min, 30 min 4°C na wirówce Multifuge 3 S-R Heraeus, a supernatanty przesączono przez filtry o średnicy porów 0,2 μm. Uzyskane lizaty fagowe rozcieńczano w postępie geometrycznym. Z poszczególnych rozcieńczeń pobierano 200 μl i dodawano do 3 ml roztopionego agaru wzbogaconego (2,8 g agaru, 4,2 g bulionu wzbogaconego/1000 ml H2O destylowanej) zawierającego 100 μl 18 godzinnej hodowli szczepu-gospodarza, następnie wylewano na podłoże fagowe i pozostawiano do zastygnięcia. Płytki inkubowano 24 godziny w temp. 37°C. Procedurę wycinania łysinek i namnażania bakteriofagów powtarzano 5-krotnie celem uzyskania czystej linii fagowej. Wyizolowany bakteriofag 39A został wykorzystany do określenia spektrum aktywności litycznej z użyciem 50 szczepów P. mirabilis, w tym 22 szczepów wyizolowanych z biofilmu na cewnikach urologicznych, dla których wcześniej określono lekowrażliwość na 13 antybiotyków [Moryl M., Torzewska A., Jałmużna P. and Różalski A.: Analysis of Proteus mirabilis distribution in multi-species biofilms on urinary catheters and determination of bacteria resistance to antimicrobial agents. Pol. J. Microbiol, 2013; 62: 377-384]. 91 %, 86% i 82% tych szczepów było odpowiednio opornych na gentamycynę, kotrimoksazol i amoksycyklinę z kwasem klawulonowym, 44% było opornych na ciprofloksacynę. Trzy z 22 szczepów wykazywało oporność na wszystkie testowane leki. Szczepy P. mirabilis pochodziły z kolekcji będącej własnością Zakładu Immunobiologii Bakterii Uniwersytetu Łódzkiego. 22 szczepy wyizolowano z cewników uzyskanych od pacjentów Przyszpitalnej Poradni Urologicznej, Szpitala im. Pirogowa w Łodzi, pozostałe 28 szczepów wyizolowano z moczu pacjentów z ZUM oddziałów Neurochirurgii, Nefrologii, Rehabilitacji Neurologicznej Szpitala IP-CZD w Warszawie. Na podłoże fagowe wylewano 6 ml roztopionego agaru wzbogacony zwierającego 150 μl 20-godzinnej hodowli poszczególnych szczepów bateryjnych i nanoszono 10 μl lizatu faga 39A o liczbie cząstek wirusa 1x10⁸ PFU/ml. Miano faga wyznaczano się metodą Gratii. Płytki inkubowano przez 4 h w temp. 37°C, następnie przez noc w temp. 4°C. Odczytywano stopień lizy murawy bakteryjnej w skali

PL 228 858 B1

1-4, z uwzględnieniem pojedynczych łysinek w obszarze naniesienia lizatu fagowego, gdzie: 4 - całkowita liza, 3 - lekko mętna, całkowita liza, 2 - średnio widoczna liza, 1 - słabo widoczna liza [Kutter E.: Phage host range and efficiency of plating. In Clokie MRJ, Kropinski AM (Eds): Bacteriophages: methods and protocols. Volume 1: Isolation, characterization, and interactions. Vol. 501, Humana Press, New York, 2009; pp. 141-149]. Dodatnie reakcje lityczne obserwowano dla 46 badanych szczepów, w tym 20 (4), 6 (3), 11 (2), 8 (1) i 1 - pojedyncze łysinki.

P r z y k ł a d 2

Badanie wrażliwości biofilmów P. mirabilis na faga 39 A.

Wykorzystano 50 szczepów P. mirabilis, w tym 22 szczepy wyizolowane z biofilmu powstałego na cewnikach urologicznych oraz 28 pochodzących z moczu pacjentów z ZUM. Hodowle bakteryjne inkubowane 20 godz., w temp. 37°C rozcieńczono 50-krotnie w bulionie wzbogaconym o pH=7,1 uzyskując miano bakterii ok. 1x10⁷/ml. Na 96-dołkową płaskodenną płytkę polistyrenową nanoszono hodowle bakteryjne w objętości 100 pl na studzienkę. Po 24 godzinnej inkubacji płytek w temp. 37°C w komorze wilgotnej zbierano podłoże i płukano biofilmy bakteryjne jałowym 0,85% NaCl. Następnie do studzienek dodawano lizat fagowy o mianie 1x10⁸ PFU/ml bulionu wzbogaconego zawierającego mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1 w objętości 100 pl na studzienkę. Naniesiono również do oddzielnych studzienek lizaty fagowe oraz bulion wzbogacony zawierający 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1, które stanowiły kontrolę tzw. tło. Kontrolę biofilmu tworzonego przez poszczególne szczepy P. mirabilis stanowiły hodowle bakteryjne nie poddawane działaniu bakteriofaga 39A, do których nanoszono bulion wzbogacony zawierający 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1. Płytki inkubowano 24 godz., w temp. 37°C w komorze wilgotnej. Po inkubacji studzienki płukano jałowym 0,85% NaCl, a następnie dodawano po 100 pl bulionu wzbogaconego zawierającego 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1 i 10 pl MTT [bromek 3-(4,5-dimetylo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolu] o stężeniu 5 mg/ml PBS. Po 3 godzinnej inkubacji w temp. 37°C w komorze wilgotnej zebrano podłoże i do każdej studzienki dodawano po 150 pl DMSO i 25 pl buforu glicynowego o pH 10,6 (50 ml 0,2 M glicyny, 43,5 ml 0,2 M NaOH, 106,5 ml wody bidestylowanej) w celu rozpuszczenia kryształów formazanu. Wartość absorbancji zmierzono przy długości fali 550 nm na czytniku płytek Multiscan Ex Labsystems typ 355. Od wartości absorbancji dla poszczególnych prób badanych odejmowano wartość tła, które stanowiła wartość absorbancji uzyskana dla kontroli fagów i bulionu wzbogaconego zawierającego 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1. Procent redukcji biofilmu P. mirabilis powodowanej przez faga 39A obliczono za pomocą wzoru: % zniszczenia biofilmu = 100% - (Ap550 x 100%/ Akb550), gdzie: Ap550 - średnia wartość absorbancji przy długości fali 550 nm próby badanej - biofilm poddany działaniu fagów; Akb550 - średnia wartość absorbancji przy długości fali 550 nm biofilmu hodowanego w bulionie wzbogaconym zawierającego 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1 bez faga 39A. W rezultacie wykazano, że fag 39A powodował w powyżej 50% redukcję biofilmów 31 z 50 badanych szczepów P. mirabilis, w tym biofilmy szczepów były niszczone powyżej 75% w porównaniu do kontroli.

P r z y k ł a d 3

Badanie wrażliwości form planktonowych P. mirabilis na faga 3 9A. Wykorzystano 50 szczepów P. mirabilis, w tym 22 szczepy wyizolowane z biofilmu powstałego na cewnikach urologicznych oraz 28 pochodzących z moczu pacjentów z ZUM. Hodowle bakteryjne inkubowane 20 godz., w temp. 37°C rozcieńczono 50-krotnie w bulionie wzbogaconym o pH=7,1 uzyskując miano bakterii ok. 1x10⁷/ml. Na 96-dołkową płaskodenną płytkę polistyrenową nanoszono hodowle bakteryjne w objętości 100 pl na studzienkę. Następnie do studzienek dodawano lizat fagowy o mianie 5x10⁵ PFU/ml bulionu wzbogaconego zawierającego 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1 w objętości 200 pl na studzienkę. Naniesiono również do oddzielnych studzienek lizaty fagowe oraz bulion wzbogacony zawierający 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1, które stanowiły kontrolę tzw. tło. Kontrolę wzrostu poszczególnych szczepów P. mirabilis stanowiły hodowle bakteryjne nie poddawane działaniu bakteriofaga 39A, do których nanoszono bulion wzbogacony zawierający 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1. Po 24 godzinnej inkubacji płytek w temp. 37°C w komorze wilgotnej mierzono absorbancję prób przy długości fali 550 nm na czytniku płytek Multiscan Ex Labsystems typ 355. Od wartości absorbancji dla poszczególnych prób badanych odejmowano wartość tła, które stanowiła wartość absorbancji uzyskana dla kontroli fagów i bulionu wzbogaconego zawierającego 10 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1. Procent redukcji wzrostu form planktonowych P. mirabilis powodowanej przez faga 39A obliczono za pomocą wzoru: % redukcji wzrostu = 100% - (Ap550 x 100%/ Ak55o), gdzie: Ap550 - średnia wartość absorbancji przy długości fali 550 nm próby badanej - hodowle płynne poddane działaniu fagów; Ak550 - średnia wartość absorbancji przy długości fali 550 nm hodowli płynnych w bulionie wzbogaconym zawierającego

PL 228 858 B1 mM MgSO4 i 10 mM CaCl2 o pH 7,1 bez faga 39A. W rezultacie wykazano, że fag 39A hamował w powyżej 80% wzrost 36 z 50 badanych szczepów P. mirabilis, w tym wzrost 18 szczepów został zahamowany powyżej 95% w porównaniu do kontroli.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nowy szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do gatunku Proteus mirabilis zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem depozytowym: F/00085.
2. 2. Zastosowanie szczepu bakteriofaga zdeponowanego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) pod numerem depozytowym: F/00085 do wytwarzania preparatów przeciwbakteryjnych służących do zwalczania bakterii należących do gatunku Proteus mirabilis.
3. 3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że do wytwarzania preparatów antybakteryjnych wykorzystuje się całe cząsteczki bakteriofaga wirulentnego w preparatach złożonych z pojedynczego typu faga.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że do wytwarzania preparatów antybakteryjnych wykorzystuje się koktajl zawierający kilka lub kilkanaście aktywnych bakteriofagów.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że do wytwarzania preparatów antybakteryjnych wykorzystuje się oczyszczone białka bakteriofagowe, korzystnie enzymy lityczne degradujące ścianę komórkową bakterii oraz rozkładające bakteryjne polisacharydy zewnątrzkomórkowe.