PL228848B1 - Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii należących do rodzaju Pseudomonas i ich zastosowanie do wytwarzania preparatów zwalczających infekcje bakteryjne - Google Patents

Description

(12)OPIS PATENTOWY ₍i₉₎PL ₍n)228848 (13) B1 (51) Int.CI.

(21) Numer zgłoszenia: 412828 C12N 7/00 (2006.01)

A61K 35/76 (2015.01) A61P 17/00 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 24.06.2015

Nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii należących (54) do rodzaju Pseudomonas i ich zastosowanie do wytwarzania preparatów zwalczających infekcje bakteryjne

	(73) Uprawniony z patentu:
	BIOPHAGE PHARMA SPÓŁKA AKCYJNA,
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	Kraków, PL
02.01.2017 BUP 01/17	(72) Twórca(y) wynalazku:
	GRZEGORZ RAK, Kraków, PL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.05.2018 WUP 05/18	(74) Pełnomocnik:
	rzecz, pat. Alina Magońska

oo 'st

CM

CM

Ω.

PL 228 848 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe szczepy bakteriofagów specyficzne wobec bakterii należących do rodzaju Pseudomonas o potencjale technologicznym oraz terapeutycznym do zwalczania zakażeń o etiologii Pseudomonas aeruginosa, w tym szczepów wieloopornych.

Bakteriofagi (w skrócie fagi) należą do grupy wirusów, których cykl życiowy jest związany wyłącznie z komórką bakteryjną. Zostały odkryte niezależnie przez E. Tworta (1915 r.) i przez E d'Herelle (1917 r.), i opisane jako czynniki niszczących bakterie, dających się na nich seryjnie pasażować i przechodzących przez filtry zatrzymujące bakterie. Czynniki te d'Herelle nazwał bakteriofagami. Fagi stanowią najbardziej zróżnicowaną i prawdopodobnie najliczniejszą grupę wirusów na Ziemi - ich liczbę szacuje się na ok. 10³¹. Bakteriofagi występują wszędzie tam gdzie obecne są bakterie. Licznie występują w środowisku wodnym, w glebie, jak również zasiedlają organizm ludzi i zwierząt, izolowano je m.in. ze śliny, kału, moczu, układu pokarmowego.

Obserwowany od kilku lat ogromny światowy kryzys antybiotykoterapii sprawia, iż istnieje pilna potrzeba stworzenia całkowicie nowej klasy środków przeciwbakteryjnych, na które oporność nie może się rozwinąć wskutek tych samych mechanizmów co na antybiotyki. Wśród alternatywnych wobec antybiotyków i chemioterapeutyków sposobów zwalczania infekcji bakteryjnych w tym zakażeń szczepami wieloopornymi, coraz częściej wymienia się terapię z użyciem bakteriofagów. Również Komisja Europejska wskazała bakteriofagi jako jedną z alternatyw do walki z antybiotykoopornymi bakteriami (Posiedzenie Rady ds. Konkurencyjności w dniu 26 maja 2010 r., podczas którego Rada określiła i uzasadniła zestaw potencjalnych inicjatyw w zakresie wspólnego planowania, obejmujący również inicjatywę „Wyzwanie związane z drobnoustrojami - wyłaniające się zagrożenie dla zdrowia ludzkiego”). O wzmożonym zainteresowaniu bakteriofagami może świadczyć ilość opublikowanych prac - kilka tysięcy rekordów zamieszczonych w bazie PubMed oraz wzrastająca liczba firm (obecnie jest ich 29) podejmująca próbę zastosowania bakteriofagów na różnych polach eksploatacji.

Wobec bezprecedensowego kryzysu antybiotykoterapii, poszukiwanie skutecznych środków przeciwbakteryjnych stało się najwyższym priorytetem współczesnej biotechnologii i medycyny, co podkreśla szereg ekspertów w ochronie zdrowia oraz organizacji i agencji na całym świecie (m.in. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO), Parlament Europejski, Europejskie Centrum Zapobiegania i Kontroli Chorób (ECDC - ang. European Centre for Disease Prevention and Control). amerykańskie Centrum Prewencji i Kontroli Zakażeń (CDC - ang. Centres for Diseases Control and Prevention), czy amerykańską Agencję Żywności i Leków (ang. FDA - Food and Drug Administration).

W prasie specjalistycznej istnieje bardzo dużo doniesień wskazujących na bakteriofagi jako leki alternatywne dla antybiotyków np. Inal 2003; Abhilash et al. 2009; Mathur et al. 2003; Sulakvelidze et al. 2005; Kutateladze and Adamia, 2010; Abedon 2014; Jassim and Limoge, 2014. W literaturze przedmiotu opisano także badania u ludzi prowadzone przez Ośrodek Terapii Fagowej przy IITD PAN we Wrocławiu jak również doświadczenia ośrodków rosyjskich i gruzińskich (terapia fagowa dostępna, jako standardowa metoda leczenia) i badania kliniczne prowadzone zgodnie z aktualnymi standardami przez kilka firm zachodnich (Abul-Hassan et al. 1990; Wang et al. 2006; Merabishvili et al. 2009; Rhoad et al. 2009; Wright et al. 2009; Kutter et al. 2010; Abedon et al. 2011; Pagava et al. 2011; Sarker et al. 2012; McCallin et al. 2013).

Wiele badań z zastosowaniem modeli zwierzęcych potwierdza skuteczność i bezpieczeństwo fagoterapii w leczeniu pojedynczych i mieszanych infekcji bakteryjnych (Matsuzaki et al. 2003; Chibani-Chennoufi et al. 2004; Ryan et al. 2011; VinodKumar et al. 2011; Vieira et al. 2012; Chhibber et al. 2013).

Unikatowość bakteriofagów w kontekście terapeutycznym przejawia się przede wszystkim ich mechanizmie działania i zaletach w leczeniu infekcji bakteryjnych.

Jedną z najważniejszych zalet fagoterapii jest targeting na określony gatunek, a nawet typ fagowy bakterii, przy braku niepożądanego wpływu na komórki leczonego organizmu. Dzięki wybiórczemu działaniu fagów na określony gatunek bakterii, fagi nie uszkadzają fizjologicznej flory organizmu. Tym samym u pacjentów leczonych fagami, nie rozwijają się infekcje wtórne wywołane przez np. Clostridium difficile, Candida, co często obserwuje się w przypadku zniszczenia flory bakteryjnej przez antybiotyki o szerokim spektrum działania.

Duża skuteczność terapeutyczna bakteriofagów wynika z ich wykładniczego wskaźnika samoreplikacji, przeważnie już mała dawka bakteriofaga jest wystarczająca dla leczenia infekcji bakteryjnych. Możliwość samoreplikacji bakteriofagów nabiera szczególnego znaczenia w przypadku leczenia infekcji rozwijających się w słabiej ukrwionych tkankach, do eliminacji bakterii wystarczy wówczas dotarcie do

PL 228 848 B1 zakażonego miejsca nawet małej liczby cząstek fagowych. Jest to szczególnie ważne u pacjentów z zakażeniem bakteryjnym ran oparzeniowych, ponieważ antybiotyki podawane systemowo mogą nie docierać do miejsca infekcji wskutek uszkodzenia naczyń krwionośnych lub obecności bariery fibrogranularnej, a fagi zawieszone w różnych mediach, łatwo można zastosować miejscowo. Inne, bardzo istotne zastosowanie fagów to rany pokrywające duże powierzchnie, szczególnie tam gdzie nie jest możliwe osiągnięcie terapeutycznego stężenia antybiotyków. Ponadto osiągnięcie terapeutycznego stężenia antybiotyków podawanych miejscowo może być także utrudnione przez wysięk zapalny, neutralizację przez enzymy i inne mediatory zapalenia oraz niezdolność do penetracji tkanek. Bakteriofagi w przeciwieństwie do antybiotyków pozwalają na uniknięcie tych problemów z uwagi na możliwość namnażania się bakteriofagów i zdolność penetrowania do tkanek, w obecności wrażliwych na fagi bakterii. To czyni bakteriofagi idealnym narzędziem do stosowania w leczeniu ran.

Ze względu na brak możliwości namnażania się w komórkach eukariotycznych, po eradykacji bakterii miano faga zmniejsza się aż do ich całkowitego usunięcia z ustroju z moczem lub kałem.

W terapii bakteriofagowej duże znaczenie odgrywa fakt, iż mutacje bakterii w kierunku oporności na określonego faga zachodzą znacznie rzadziej niż na antybiotyki. Wynika to z możliwości zachodzenia w genomie faga mutacji, które mogą umożliwiać łatwiejszą adaptację do mutujących komórek bakteryjnych.

W wielu przypadkach po zakończonej fagoterapii przez dłuższy okres czasu utrzymywał się stan zwiększonej odporności przeciwbakteryjnej i przedwwirusowej. Z tego względu jedną ze szczególnych grup pacjentów mogących odnieść dodatkowe korzyści z leczeniami fagami są chorzy z nowotworami, u których wskutek osłabionej funkcji układu immunologicznego, częściej występują zakażenia bakteryjne.

Niezwykle istotną właściwością bakteriofagów jest zdolność do redukcji biofilmu bakteryjnego. Badania laboratoryjne dowodzą, iż biofilm może być ponad 1000 razy bardziej oporny na antybiotyki niż bakterie planktonowe.

Na podstawie bardzo licznych doniesień literaturowych opisujących zarówno rezultaty badań laboratoryjnych jak wyniki z praktyki klinicznej przewiduje się, że fagoterapia stanowić będzie przyszłościowy kierunek rozwoju medycyny.

Patogenem o dużej istotności klinicznej z uwagi na wywoływanie wielu rodzajów ciężkich zakażeń szpitalnych oraz pozaszpitalnych, w tym posocznicy, jest pałeczka ropy błękitnej Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Ze względu na wysoki stopień naturalnej oporności na wiele antybiotyków, co ogranicza wybór opcji terapeutycznej, P. aeruginosa został zaliczony do najbardziej problematycznej grupy antybiotykoopornych bakterii określanych jako ESKAPE Group (E. faecium, S. aureus, K. pneumoniae, A. baumanii, P aeruginosa, Enterobacter spp.). P. aeruginosa przez długi czas klasyfikowana była jako drobnoustrój oportunistyczny, zdolny do wywoływania zakażeń przede wszystkim u pacjentów o obniżonej odporności lub poddanych długotrwałej antybiotykoterapii. Jednak ukończony w 2000 roku projekt sekwencjonowania genomu P. aeruginosa pozwolił na inne spojrzenie zarówno w kontekście infekcyjności bakterii jak i jej oporność przeciwdrobnoustrojowym. W porównaniu z genomami innych bakterii często izolowanych z zakażeń szpitalnych genom P. aeruginosa charakteryzuje się większą liczbą genów zjadliwości oraz genów regulacyjnych, które umożliwiają adaptację do zmiennych warunków środowiskowych. Ponadto organizacja genomu pałeczki ropy błękitnej umożliwia nabywanie mobilnych elementów genetycznych odpowiedzialnych za przenoszenie genów oporności (Junka, 2012).

P. aeruginosa cechuje się dużymi zdolności adaptacyjnymi, dlatego może wywoływać różne zakażenia, np. układu oddechowego, w tym u pacjentów z mukowiscydozą, dróg moczowych, skóry (w tym oparzenia) i tkanek miękkich, ucha, oka, bakteriemie, oraz zapalenie wsierdzia. Cechą niewątpliwie ułatwiającą P. aeruginosa kolonizację i infekcję tak różnych obszarów ciała jest zdolność do tworzenia biofilmu.

Zakażenia szpitalne o etiologii P. aeruginosa szacuje się na 5-15% zakażeń szpitalnych. Jednym z najgroźniejszych powikłań jest zakażenie rany (przedłużenie procesu gojenia, dłuższa hospitalizacja, możliwość konwersji oparzeń początkowo powierzchniowych lub pośledniej grubości do oparzeń głębokich). U pacjentów, u których rozwinęła się sepsa o etiologii P. aeruginosa umieralność jest bardzo wysoka, np. śmiertelność w wyniku sepsy P. aeruginosa w Oddziałach Intensywnej Opieki Medycznej wynosi 20% (Varaiya et al. 2008), w oddziałach oparzeniowych zaś 65% (Sharma et al. 2006).

Z uwagi na fakt, iż bakteriofagi przeciwko P. aeruginosa będące przedmiotem niniejszego wynalazku planuje się wykorzystywać w terapii, przy izolacji i charakterystyce bakteriofagów kierowano się

PL 228 848 B1

m.in. wytycznymi dot. biologicznych produktów leczniczych tj. „ICH Topic Q 5 D Quality of Biotechnological Products: Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Product (European Medicines Agency nr CPMP/ICH/294/95) oraz w Rozporządzeniu Ministra Zdrowia w sprawie Dobrej Praktyki Wytwarzania - wymagania szczegółowe w Aneksie nr 2 „Wytwarzanie biologicznych produktów leczniczych dla ludzi”, Podrozdział „System serii posiewowej i banku komórkowego”.

Zgodnie z danymi literaturowymi (Parracho et al. 2012; Verbeken et al. 2014; Nilsson et al. 2014) oraz Opinią Komisji Europejskiej z dnia marca 2012 r. produkty lecznicze zawierające bakteriofagi należą do kategorii biologicznych produktów leczniczych.

Znany jest z polskiego opisu patentowego PL 195437 sposób przygotowania poliwalentnych preparatów fagowych do leczenia zakażeń bakteryjnych, polegający na utworzeniu zbioru szczepów patogenów bakteryjnych określonego rodzaju oraz drugiego zbioru szczepów bakteriofagów specyficznych wobec przynajmniej jednego szczepu bakterii, następnie określa się aktywność lityczną szczepu bakteriofaga wobec każdego szczepu bakterii, posługując się metodami statystycznymi. Zgodnie z wynalazkiem korzystnie szczepy patogenne należały do rodzaju Staphylococcus albo Pseudomonas. Środek do leczenia infekcji wywołanych przez patogeny bakteryjne zawiera jako czynnik aktywny szczep bakteriofaga wybrany ze zbioru szczepów zdeponowanych. Zgodnie z wynalazkiem skuteczność w leczeniu tak przygotowanego preparatu fagowego jest wysoka szczególnie w leczeniu posocznicy (88%).

Bakterie P. aeruginosa wywołują różne zagrażające życiu infekcje dlatego dąży się do otrzymania preparatu fagowego o jeszcze wyższej skuteczności, w szczególności dla szczepów wywołujących zakażenia skóry i tkanki podskórnej.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że poddanie wybranych fagów dodatkowej selekcji według podanych poniżej kryteriów pozwala na otrzymanie fagów o zwiększonej skuteczności dla zakażeń skóry i tkanki podskórnej, co jest szczególnie istotne w leczeniu zakażeń ran, kiedy czynnikiem etiologicznym infekcji jest Pseudomonas aeruginosa.

W opisie użyto następujących oznaczeń zdefiniowanych poniżej:

- plon fagowy (ang. burst size) określany także wielkością wyrzutu po okresie namnażania bakteriofaga, jest to średnia ilość wirionów potomnych pochodzących z infekcji jednej komórki gospodarza

- czas latencji - zwany także czasem uśpienia, jest to okres w cyklu rozwojowym bakteriofaga, który trwa od adsorpcji bakteriofaga do komórki bakteryjnej, aż do lizy komórki.

- bacterial challenge - jest to tzw. „test obciążeniowy”, w którym sprawdza się w warunkach in vitro zdolność bakteriofaga do eradykacji komórek bakterii z hodowli płynnej na drodze ich lizy.

- aktywność lityczna - jest to zdolność bakteriofaga do lizy komórki bakteryjnej, Liza komórki bakterii, w procesie uwalniania fagów potomnych, prowadzi do jej śmierci.

- MOI (ang. Multiplicity of infection) - definiowany jako średnia liczba zakażania każdej komórki, obliczana jako stosunek liczby cząstek bakteriofaga i komórek bakterii.

Zasadniczym wymaganiem stawianym fagom do celów terapeutycznych jest potwierdzenie ich natury litycznej (wiruletnej), co jest możliwe do weryfikacji metodą sekwencjonowania, a następnie analizy genomu faga pod kątem obecności genów toksyn bakteryjnych, integraz i genów konwersji lizogennej. Obecność jakiegokolwiek genu z wyżej wymienionych klas całkowicie dyskwalifikuje użycie bakteriofaga w fagoterapii, ponieważ świadczy o jego szkodliwości albo o jego lizogennej naturze.

Oprócz metod molekularnych również inne testy mogą mieć wartość prognostyczną w ocenie natury litycznej fagów. Są to np.

a) morfologia łysinek fagowych - formowanie dużych klarownych łysinek jest cechą charakterystyczną dla fagów litycznych (Adams, 1959),

b) przynależność taksonomiczna - fagi wirulentne należą do rodziny Myoviridae i Podoviridae (Pantucek et al. 2004; Kwiatek et al. 2012; Łobocka et al. 2012; Kłem et al. 2013).

Z punktu widzenia selekcji w warunkach in vitro fagów o potencjale terapeutycznym bardzo istotne jest określenie:

a) zakresu aktywności litycznej czyli zdolności do lizowania w warunkach in vitro szczepów klinicznych. Jest to jedna z najważniejszych cech faga selekcjonowanego do celów terapeutycznych. Procent zlizowanych szczepów przez danego faga zależeć będzie w dużej mierze od kolekcji bakterii. Wyniki rzędu 50-90% są bardzo dobre i pozwalają na tworzenie koktajli o bardzo wysokiej aktywności terapeutycznej. Dobrymi wynikami w przypadku szczepów klinicznych są wyniki rzędu 15-30% lizowanych szczepów;

PL 228 848 B1

b) stopnia wirulencji fagów w teście bacterial challenge - fagi, które powodują skuteczną liżę określonej hodowli bakterii, w mniejszym stężeniu (chodzi tu o stężenie faga) są bardziej wirulentne. W badaniu takim określamy jak szybko populacja faga może wzrastać relatywnie w stosunku do populacji bakterii (Gill and Hyman 2010);

c) prognozuje się, iż fagi, które wiążą się do komórek gospodarza szybko (czas adsorpcji faga), mają krótki czas latencji i duży burst size tj. plon fagowy mogą być najbardziej skuteczne w terapii (Gill and Hyman 2010; Nilsson et al. 2014). Do celów terapeutycznych nadają się najlepiej fagi o stosunkowo wysokich plonach fagowych (~100 pfu lub więcej) i niskich czasach latencji (<1 -1,5 h). W celu scharakteryzowania powyższych parametrów wzrostu bakteriofaga należy przeprowadzić doświadczenie typu one-step growth (Ellis i Delbruck 1939). Polega ono na prześledzeniu pojedynczego cyklu rozwoju bakteriofaga w komórce bakteryjnej;

d) odporność na czynniki fizykochemiczne (np. pH)

Wpływ pH na przeżywalność faga ma kluczowe znaczenie przy stosowaniu doustnym preparatów fagowych oraz przy stosowaniu fagów razem z innymi preparatami, które mogą mieć niskie lub wysokie pH (Pujato et al. 2014, Li i Zhang 2014). W przypadku preparatu na rany należy przetestować wytrzymałość faga na zakres pH w którym mieści się pH preparatu, pH osocza i naturalne pH skóry. Zwykle jest to zakres pH 5.0-8.0.

W aspekcie technologicznym natomiast niezwykle ważną kwestią jest:

a) namnażanie się faga do wysokiego miana,

b) stabilność temperaturowa.

Wpływ temperatury na przeżywalność fagów jest niezwykle istotny jeśli chodzi o zapewnienie prawidłowej aktywności fagów w trakcie przechowywania.

Wynalazek dotyczy nowego szczepu bakteriofaga specyficznego wobec bakterii należących do rodzaju Pseudomonas wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi F/00080; F/00081; F/00082; F/00083, z których każdy ma potwierdzoną naturę lityczną i charakteryzuje się wysoką wirulencją.

Nowy szczep bakteriofaga jest specyficzny wobec bakterii Pseudomonas aeruginosa.

Wynalazek obejmuje również zastosowanie szczepu bakteriofaga wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi F/00080; F/00081; F/00082; F/00083 do wytwarzania preparatów do leczenia infekcji wywołanych przez bakterie z rodzaju Pseudomonas.

Korzystnie do wytwarzania preparatu do leczenia infekcji wywołanych przez bakterie z rodzaju Pseudomonas stosuje się mieszankę fagów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi F/00080; F/00081; F/00082; F/00083 wykazujących się brakiem interferencji i wzajemnym hamowaniem swoich właściwości.

Preparat stosuje się do leczenia infekcji skóry i tkanki podskórnej.

Bakteriofagi będące przedmiotem wynalazku zostały zdeponowane zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu (53-114 Wrocław, ul. R. Weigla 12) w dniu 03. 06. 2015r i otrzymały numery dostępu depozytu F/00080- dla faga Jar/51/2117; F/00081- dla faga P/53/2117; F/00082dla faga Kos/4/1815; F/00083- dla faga Ku/89/1815.

Bakteriofagi będące przedmiotem niniejszego wynalazku scharakteryzowano pod kątem ich przynależności taksonomicznej, cech morfologicznych, biologicznych. Dodatkowo, zgodnie z wymaganiami przytoczonej powyżej wytycznej Q5D fagi posiadają udokumentowanie pochodzenie i opisaną procedurę ich pozyskiwania.

I. Wyniki badań

I.1. Izolacja bakteriofagów

Bakteriofagi wyizolowano ze ścieków miejskich (oczyszczalnie, udokumentowane miejsce i data pobrania materiału podano w tabeli 1). Próbki ścieków poddano obróbce fizycznej poprzez proces filtracji na bibule filtracyjnej, sączeniu przez filtr o średnicy porów 1 pm i sterylizacji filtracyjnej z zastosowaniem filtrów o średnicy porów 0,22 pm. Tak otrzymane próbki skoncentrowano metodą filtracji tangencjalnej wg dokładnie wystandaryzowanej metodyki - próbki koncentrowano ok. 10 razy. Skoncentrowane próbki ścieków poddano ponownie procesowi sterylizacji filtracyjnej z zastosowaniem filtrów o średnicy porów 0,22 pm. Do izolacji fagów zastosowano procedurę „enrichment” z użyciem szczepu

PL 228 848 B1

Pseudomonas aeruginosa o symbolu jak w tabeli 1, pochodzącego z kolekcji własnej (szczep indykatorowy posiada dobrze udokumentowane pochodzenie oraz charakterystykę potwierdzającą jego przynależność do gatunku P. aeruginosa). W celu izolacji fagów przygotowano układ doświadczalny, w którym połączono w określonym stosunku objętościowym 11.6x skoncentrowane podłoże bulionowe suplementowane jonami Ca+² oraz Mg+², inoculum szczepu indykatorowego w fazie logarytmicznej oraz skoncentrowaną próbkę ścieków. Tak przygotowany układ doświadczalny inkubowano w temperaturze 37°C przez ok. 18 h w inkubatorze z wytrząsaniem (100 rpm przez ok. 4 h, a następnie przy 50 rpm przez ok. 14 h). Dla układu założono próbkę kontrolną, w której zamiast próbki ścieków dodano odpowiednią objętość wody WFI (ang. Water for Injection). Po zakończonej inkubacji zmierzono gęstość układu doświadczalnego przy pomocy densytometru McFarlanda, a następnie układ odwirowano przy 3000 obr/min. przez 30 min. w temp. 4°C. Supernatant sprawdzono na obecność bakteriofagów stosując metodę RTD (ang. Routine Test Dilution), W skrócie zastosowano następującą metodykę: do probówki z upłynnionym 0,7% agarem dodano 100 pl szczepu indykatorowego P. aeruginosa . Płynny agar wylano na płytkę z podłożem agarowym i pozostawiono do zestalenia (ok. 30 min). Na zestaloną warstwę agam naniesiono 30 pl odwirowanego supernatantu. Płytki inkubowano przez ok. 20 h w temp. 24°C, a następnie przez ok. 2-3 h w temp. 37°C. Po zakończonej inkubacji na płytce z podłożem agarowym zaobserwowano wyraźną strefę lizy. Wycięto fragment zlizowanej murawy bakteryjnej, tak aby nie pobrać murawy bakteryjnej i umieszczono w probówce z podłożem bulionowym, wytrząsano na wytrząsarce laboratoryjnej przez ok. 30 min. i otrzymano w ten sposób zawiesinę fagów. Z tak otrzymanej próbki wyprowadzono czystą linię fagową stosując 5-krotny proces reizolacji. Przy każdym procesie reizolacji sprawdzono za pomocą lupy binokularnej morfologię łysinek fagowych. Do procesu reizolacji łysinek fagowych zastosowano test Gratia. W skrócie metodyka testu Gratia: Przygotowano szereg rozcieńczeń zawiesiny fagów w bulionie, następnie wybrano trzy-cztery rozcieńczenia, które przeznaczono do procesu reizolacji. Do probówki z upłynnionym 0,7% agarem wzbogaconym (ok. 3 ml, temperatura łaźni wodnej ok. 48°C) dodano 100 pl odpowiedniego szczepu P. aeruginosa, a następnie 200 pl odpowiedniego rozcieńczenia zawiesiny fagów. Płynny agar wylano na płytkę z podłożem agarowym i pozostawiono do zestalenia (ok. 30 min). Płytki inkubowano przez ok. 20 h w temp. 24°C, a następnie prz ez ok. 2-3 h w temp. 37°C. Pojedyncze łysinki izolowano za pomocą igły iniekcyjnej, umieszczano w probówce z podłożem bulionowym, wytrząsano na wytrząsarce laboratoryjnej, a następnie odwirowano przy 3000 obr/min. przez 10 min. Po tym czasie wykonano test Gratia - 5 razy (5 reizolacji). Po ostatniej reizolacji próbkę przesączono i przeznaczono do otrzymania lizatu fagowego.

Z próbki z 5-reizolacji przygotowano I pasaż bakteriofaga. Namnażanie faga wykonano metodą płytkową. Wykonano test Gratia wg opisu przedstawionego powyżej, po zakończonej inkubacji, płytki zalano ok. 10 ml podłoża bulionowego i umieszczono na wytrząsarce/kołysce laboratoryjnej przez 5 h, następnie płytki inkubowano przez ok. 18 h w temp. 2-8°C. Po zakończonej inkubacji tak otrzymany I pasaż faga poddano sterylizacji filtracyjnej z zastosowaniem filtrów o średnicy porów 0,22 pm. Z pasażu I wykonano pasaż II faga do dużej objętości. Do podłoża bulionowego dodano w odpowiednim MOI lizat fagowy z I pasażu, a następnie inoculum bakterii P. aeruginosa w fazie logarytmicznej. Tak przygotowaną hodowlę inkubowano w temp. 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem (100 rpm) przez 4 h, monitorując postęp lizy, następnie w celu uzyskania całkowitej lizy hodowlę przeniesiono do chłodni (2-8°C). Po zakończonej inkubacji lizat poddano sterylizacji filtracyjnej z zastosowaniem filtrów o średnicy porów 0,22 pm. Tak otrzymany lizat fagowy poddano charakterystyk morfologicznej, biologicznej i genetycznej.

PL 228 848 Β1

Tabela 1.

Izolacja bakteriofagów p/P. aeruginosa (próbki do izolacji, szczepy indykatorowe).

Symbol faga	Nr szczepu P. aeruginosa	Miejsce pobrania próbek
Kos/4/1815	1815	Oczyszczalnia Ścieków woj. Małopolskie
Ku/89/1815	1815	Oczyszczalnia Ścieków woj. Małopolskie
Jar/51/2117	2117	Oczyszczalnia Ścieków woj. Podkarpackie
P/53/2117	2117	Oczyszczalnia Ścieków woj. Małopolskie

I.2. Przynależność taksonomiczna i charakterystyka morfologiczna bakteriofagów Przynależność taksonomiczną fagów oraz ich charakterystykę morfologiczną przeprowadzono z zastosowaniem transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

W badaniach wykorzystano technikę kontrastowania negatywowego wg. następującej preparatyki.

Siatki miedziane 300 mesh były przepłukiwane w acetonie w celu usunięcia zanieczyszczeń. Następnie na siatki nakładano warstwę kolodium, a następnie napylano warstwą węgla. Po napyleniu na błonki węglowe nakładano 5 pl próbki i adsorbowano przez 3 minuty. Po odsączeniu nadmiaru próbki preparat barwiono przez 15 s w 2% wodnym roztworze siarczanu uranylu. Obserwacja fagów obywała się w mikroskopie elektronowym przy powiększeniu 39000 razy. Obrazy utrwalane były przy pomocy cyfrowej kamery.

Tabela 2.

Przynależność taksonomiczna oraz charakterystyka morfologiczna badanych fagów.

Nazwa faga	Przynależność taksonomiczna	Morfotyp	Wymiary (nm)
Wys gl·	Szer gl-	Dł. Og.	Szer. Og-
Kos/4/1815	Caudovirales, Myoviridae	Al	67,52 +/- 2,29	64,28 +/- 3,73	125,26 +/- 6,53	16,67 +/- 1,44
Ku/89/1815	Caudoviral.es, Myoviridae	Al	62,60 +/- 4,82	62,58 +/- 2,97	126,78 +/- 5,11	14,61 +/- 1,40
Jar/51/2117	Caudovirales, Podoviridae	Cl	64,91 +/- 2,21	62,4 +/- 1,76	-5,36 #	-12,34 #
P/53/2117	Caudovirales, Myoviridae	Al	70,01 +/- 3,01	71,88 +/- 3,18	126,26 +/- 6,72	17,63 +/- 1,06

# Podoviridae posiadają bardzo krótkie ogonki, które są bardzo trudne do wybarwienia. Mimo prawidłowego wybarwienia preparatu ogonki w większości cząsteczek były niewidoczne.

Wizualizacja cząstek fagowych w transmisyjnym mikroskopie elektronowym (TEM) przedstawiono na fig 1 w kolejności dla fagów: Kos/4/1815, Ku/89/1815 i na fig. 2 w kolejności dla fagów Jar/51/2117, P/53/2117.

Wniosek:

badane fagi reprezentują rodzinę Myoviridae oraz Podoviridae, do której przynależą bakteriofagi lityczne.

I.3. Wpływ czynników fizykochemicznych na aktywność biologiczną fagów Zbadano odporności fagów p/P. aeruginosa na pH oraz na temperaturę.

PL 228 848 B1

1. Wpływ pH

Do badania stabilności fagów na określone wartości pH, lizaty fagowe inkubowano w podłożu bulionowym o różnych wartościach pH (pH w zakresie 3-11, adjustowanych NaOH lub HCl) przez 1 h w temperaturze 25°C. Miano fagów poddanych badaniom wpływu pH oznaczono testem Gratia wg opisu podanego powyżej. W niniejszym teście przygotowano kontrolę pH, w celu określenia wpływ samego pH na zahamowanie wzrostu szczepu, widocznego jako przejaśnienie) i tym samym wykluczenia nieswoistej reakcji.

Fae Kos/4/1815

Nie zanotowano wpływu pH w zakresie 3,0-11,00 na aktywność biologiczną faga po 1 h inkubacji.

Fag Ku/89/1815

Nie zanotowano wpływu pH w zakresie 3,0-11,00 na aktywność biologiczną faga po 1 h inkubacji.

Fag Jar/51/2117

W zakresie pH 4,0-11,0 nie zanotowano wpływu pH na aktywność biologiczną faga po 1 h inkubacji. Natomiast przy pH = 3,0 następuje kompletna redukcja cząstek fagowych.

Fag P/53/2117

Nie zanotowano wpływu pH w zakresie 3,0-11,00 na aktywność biologiczną faga po 1 h inkubacji.

2. Termostabilność fagów

Dla określenia termostabilności fagów, badane fagi w postaci lizatów fagowych inkubowano w temp. 37°C (kontrola testu), 60°C, 70°C i 80°C. Próbki były pobierane do testów dla temperatury 37°C, 60°C, 70°C po 1 godzinie i 3 godzinach, natomiast dla temperatury 80°C po 30 min. i 1 godzinie. Miano fagów poddanych badaniom termostabilności oznaczono testem Gratia wg opisu podanego powyżej.

Fag Kos/4/1815

Nie zanotowano wpływu temperatury 60°C do 3 h inkubacji na aktywność biologiczną faga - rząd wielkości zostaje utrzymany. Natomiast w temp. 70°C następuje spadek miana faga w liczbie zależnej od czasu inkubacji - po 1 h odnotowano spadek o 1 log, natomiast po 2 h o 2 log. Podczas inkubacji faga w temp. 80°C następuje drastyczny spadek miana faga o 7 log do 1 godziny inkubacji.

Fag Ku/89/1815

Nie zanotowano wpływu temperatury 60°C do 3 h inkubacji na aktywność biologiczną faga - rząd wielkości zostaje utrzymany. Natomiast w temp. 70°C następuje spadek miana faga w liczbie zależnej od czasu inkubacji - po 1 h odnotowano spadek o 1 log, natomiast po 2 h o 3 log. Podczas inkubacji faga w temp. 80°C do 1 h następuje drastyczny spadek miana faga o 6 log do 1 godziny inkubacji.

Fag Jar/51/2117

W temp. 60°C następuje spadek aktywności faga o 2 log po 1 h inkubacji i o 4 log po 3 h inkubacji. W temp. 70°C następuje drastyczny spadek miana fag o 6 log po 1 h inkubacji i aż o 7 log po 3 h inkubacji. W temp. 80°C po 1 h nie obserwowano już większego spadku miana faga w stosunku do temp. 70°C.

Fag P/53/2117

Nie zanotowano wpływu temperatury 60°C do 3 h inkubacji na aktywność biologiczną faga - rząd wielkości zostaje utrzymany. Natomiast w temp. 70°C następuje spadek miana faga w liczbie zależnej od czasu inkubacji - po 1 h odnotowano spadek o 1 log, natomiast po 2 h o 3 log. Podczas inkubacji faga w temp. 80°C do 1 h, następuje drastyczny spadek miana faga, obserwowano pojedyncze łysinki.

Wnioski:

Fagi będące przedmiotem niniejszego wynalazku cechują się odpornością na działanie czynników fizykochemicznych tj. pH i temperaturę.

II. Wynalazek ilustrują poniższe przykłady, w których opisano przeprowadzone doświadczenia dokumentujące wynalazek

II.1 P r z y k ł a d

Ocena morfologii łysinek fagowych

Ku/89/1815

Łysinki średniej wielkości okrągłe, dobrze zlizowany środek, nieregularne, słabo zlizowane brzegi. Wizualizację łysinek przedstawia fig. 3.

Kos/4/1815

Łysinki drobne, okrągłe, dobrze zlizowany środek, brzegi nie regularne, zlizowane. Wizualizację łysinek przedstawia fig. 4.

PL 228 848 Β1

Jar/51/2117

Łysinki bardzo duże, okrągłe, dobrze zlizowany środek, regularne, zlizowane brzegi. Wizualizację łysinek przedstawia fig. 5.

P/53/2117

Łysinki średniej wielkości, z dobrze zlizowanym środkiem, brzegi nie regularne, słabo zlizowane. Wizualizację łysinek przedstawia fig. 6.

Wniosek:

Fagi będące przedmiotem niniejszego wynalazku formują na murawie bakteryjnej łysinki charakterystyczne dla fagów litycznych.

II. 2 Przykład

Zakres aktywności litycznej test „host rangę

W celu określenia aktywności litycznej fagów będących przedmiotem niniejszego wynalazku wykonano spot test. Przygotowano murawę bakteryjną każdego z testowanych szczepów P. aeruginosa, w tym celu do 0,7% agaru wzbogaconego wprowadzono 100 μΙ inoculum odpowiedniego szczepu testowego w fazie logarytmicznej i wylano na płytkę z podłożem agarowym. Płytki pozostawiono do podsuszenia przez ok. 30 min. - 45 min. Na tak przygotowaną murawę wg określonego wzornika nakropiono po 10 μΙ danego lizatu fagowego. Płytki inkubowano w temp. 37°C przez ok. 18 h. Po zakończonej inkubacji odczytano wyniki testu stosując czterostopniową skalę w celu oceny stopnia zlizowania szczepu testowego. W celu sprawdzenia poprawności wykonania testu i wykluczenia reakcji fałszywie dodatnich, dla każdego testowanego szczepu wykonano kontrole ujemne.

Zakres aktywności litycznej przeprowadzono z użyciem ok. 150 izolatów klinicznych P. aeruginosa pochodzących z zakażeń skóry i tkanki podskórnej oraz kilku szczepów od chorych z mukowiscydoząjak również 7 szczepów pochodzących ze środowiska. Każdy z testowanych szczepów posiada dobrze udokumentowane pochodzenie i wykonaną charakterystykę potwierdzającą ich przynależność do gatunku P. aeruginosa.

Test „host rangę” wykonano dla każdego z badanych fagów co najmniej dwukrotnie z każdym z testowanych szczepów, badanie wykonano w niezależnych eksperymentach. Do oceny lizy zastosowano 4 stopniową skalę: c - całkowita liza, o1 - przezroczysty spot, z kilkoma do kilkunastoma pojedynczymi koloniami wtórnego wzrostu szczepu; o2 - przezroczysty spot z wtórnym wzrostem szczepu w postaci licznych pojedynczych kolonii lub skupisk kolonii; o3 - silny wtóry wzrost szczepu w obrębie spotu z możliwą zlizowaną obwódką i wyraźnym przejaśnieniem.

Tabela 3.

Wyniki testu „host rangę” ze szczepami klinicznymi oraz środowiskowymi P. aeruginosa.

Stopień lizy szczepu testowego oceniono w 4 stopniowej skali: c - całkowita liza, o1 - przezroczysty spot, z kilkoma do kilkunastoma pojedynczymi koloniami wtórnego wzrostu szczepu; o2 - przezroczysty spot z wtórnym wzrostem szczepu w postaci licznych pojedynczych kolonii lub skupisk kolonii; o3 - silny wtóry wzrost szczepu w obrębie spotu z możliwą zlizowaną obwódką i wyraźnym przejaśnieniem.

Fag	Stopień lizy (%)
c	o1	o2	o3	n
Kos/4/1815	13,07	15,36	13,40	10,78	41,18
Ku/89/1815	28,10	15,69	17,32	20,92	14,38
Jar/51/2117	19,61	16,67	6,86	8,50	45,75
P/53/2117	14,38	12,75	12,42	26,14	28,10

PL 228 848 Β1

Tabela 4.

Wyniki testu „host rangę” ze szczepami klinicznymi P. aeruginosa wieloopornymi. Stopień lizy szczepu testowego oceniono w 4 stopniowej skali: c - całkowita liza, o1 - przezroczysty spot, z kilkoma do kilkunastoma pojedynczymi koloniami wtórnego wzrostu szczepu; o2 - przezroczysty spot z wtórnym wzrostem szczepu w postaci licznych pojedynczych kolonii lub skupisk kolonii; o3 - silny wtóry wzrost szczepu w obrębie spotu z możliwą zlizowaną obwódką i wyraźnym przejaśnieniem.

Fag	Stopień lizy (%)
c	ol	o2	o3	n
Kos/4/1815	0	16,7	25	16,7	41,7
Ku/89/1815	41,7	16,7	8,3	16,7	16,7
Jar/51/2117	0	8,3	8,3	16,7	66,7
P/53/2117	8,3	16,7	0	33,3	41,7

W celu potwierdzenia, iż uzyskane wyniki w teście spot są rzeczywiście efektem namnażania się faga w komórkach gospodarza w wyniku czego powstaje liza, a nie efektem inhibicji wzrostu szczepu bakteryjnego będącego efektem enzymów fagowych, wykonano test kropelkowy dla każdego z fagów oraz dla mieszanki fagów. Do testu kropelkowego wybrano szczepy kliniczne w łącznej liczbie ok. 60 izolatów, cechujących się różnym stopniem wrażliwości na badane fagi. W skrócie: przygotowano murawę bakteryjną szczepu testowego w sposób opisany w teście spot. Następnie wykonano seryjne rozcieńczenia w bulionie lizatu fagowego/mieszanki lizatów fagowych i naniesiono wg wzornika na murawę bakteryjną. Płytki inkubowano w temp. 37°C przez ok. 20 h. Wyniki odczytano wg opracowanej skali.

Wnioski: potwierdzono, iż obserwowany efekt lizy jest efektem działania faga, a nie efektem nieswoistej inhibicji wzrostu szczepu testowego na podłożu agarowym.

Szerokie spektrum lityczne badanych fagów sugeruje ich poliwalentną naturę, wykazano wysoką siłę lityczną fagów.

Lizaty fagowe skomponowane w mieszankę fagową tzw. koktajl fagowy cechują się lepszą aktywnością lityczną oraz szerszym zakresem litycznym niż pojedyncze lizaty fagowe.

11.3 Przykład

Bacterial challenge

Wykonano szereg eksperymentów na podstawie których wybrano wartość MOI dla każdego z fagów, będących przedmiotem niniejszego wynalazku.

Fag Kos/4/1815

MOI na poziomie 1 jest wystarczające do redukcji bakterii P. aeruginosa o 5 log po 2 h inkubacji.

Fag Ku/89/1815

MOI na poziomie 10 jest wystarczające do redukcji bakterii P. aeruginosa o 4 log po 2 h inkubacji.

Fag Jar/51/2117

MOI na poziomie 1 jest wystarczające do całkowitej redukcji bakterii P. aeruginosa po 2 h inkubacji.

Fag P/53/2117

MOI na poziomie 1 jest wystarczające do redukcji bakterii P. aeruginosa o 6 log po 2 h inkubacji.

Wniosek: Badane fagi cechują się wysoką wirulencją o czym świadczy szybkość eliminacji bakterii P. aeruginosa z hodowli.

11.4 Przykład

Parametry wzrostu bakteriofaga (czas adsorpcji, one-step growth)

1. Czas adsorpcji

Zawiesina homologicznego szczepu P. aeruginosa (faza logarytmiczna) została zainfekowana fagiem przy określonej wartości MOI. Tak przygotowany układ doświadczalny inkubowano wtemp. 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem (100 rpm) przez 90 min. Z układu doświadczalnego pobierano próbki w określonych interwałach czasowych (0; 5 min., 10 min., 15 min., 20 min., 25 min., 30 min., 45 min., 60 min., 90 min.). Pobrane próbki odwirowano przy 10 000 obr/min. przez 5 min. wtemp. pokojowej. W supernatancie sprawdzono miano niezadsorbowanych fagów testem Gratia. Adsorpcja faga została wyrażona jako procent redukcji miana faga w supernatancie w porównaniu do kontroli.

2. One-step growth

Zawiesina homologicznego szczepu P. aeruginosa (faza logarytmiczna) została zainfekowana fagiem przy określonej wartości MOI. Tak przygotowany układ doświadczalny inkubowano wtemp. 37°C

PL 228 848 Β1 w inkubatorze z wytrząsaniem (100 rpm) w celu umożliwienia adsorpcji faga do receptorów bakterii gospodarzy. Następnie układ odwirowano przy 10 000 obr. przez 5 min. w temp, pokojowej. Supernatant odrzucono, natomiast pellet zawieszono w określonej objętości podłoża bulionowego. Dokładnie wymieszano i inkubowano w temp. 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem (100 rpm) przez 120 min. W trakcie inkubacji pobierano z układu doświadczalnego próbki w określonych interwałach czasowych 5 min., 10 min., 15 min., 20 min., 25 min., 30 min., 35 min., 40 min., 45 min., 50 min., 55 min., 60 min., 70 min., 80 min., 90 min., 100 min., 110 min., 120 min. Następnie niezwłocznie wykonywano seryjne rozcieńczenia pobranych próbek i wykonywano test Gratia. Wykreślono krzywą one-step growth.

Czas latencji określono jako: czas pomiędzy adsorpcją faga a pierwszym uwolnieniem (wyrzutem) cząstek fagowych.

Burst size obliczono jako stosunek końcowego miana uwolnionych cząstek fagowych do początkowej liczby zainfekowanych komórek bakterii w czasie latencji faga.

Tabela 5.

Charakterystyka parametrów wzrostu fagów (na podstawie testu czas adsorpcji oraz one-step growth)

Fag	Czas adsorpcji*	Czas latencji (min.)	Burst size (pfu/zainfekowane komórki)
Kos/4/1815	30 min.	5	ok. 5
Ku/89/1815	15 min.	15	ok. 55
Jar/51/2117	ok. 5 min.	5	ok. 18
P/53/2117	15 min.	15	ok. 27

* przy podanym czasie adsorpcji procent fagów zaadsorbowanych do komórek gospodarza wynosił ponad 90%.

Wniosek:

Badane fagi cechują się krótkim czasem adsorpcji i krótkim okresem latencji oraz wysokim plonem fagowym (burst size) co predysponuje ich odpowiednimi kandydatami do fagoterapii.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nowy szczep bakteriofaga specyficzny wobec bakterii należących do rodzaju Pseudomonas wybrany ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi F/00080; F/00081; F/00082; F/00083, z których każdy ma potwierdzoną naturę lityczną i charakteryzuje się wysoką wirulencją.
2. 2. Nowy szczep według zastrz. 1, znamienny tym, że jest specyficzny wobec bakterii Pseudomonas aeruginosa.
3. 3. Zastosowanie szczepu bakteriofaga wybranego ze szczepów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi F/00080; F/00081; F/00082; F/00083, do wytwarzania preparatów do leczenia infekcji wywołanych przez bakterie z rodzaju Pseudomonas.
4. 4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że do wytwarzania preparatu do leczenia infekcji wywołanych przez bakterie z rodzaju Pseudomonas stosuje się mieszankę fagów zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów pod numerami depozytowymi F/00080; F/00081; F/00082; F/00083, wykazujących się brakiem interferencji.
5. 5. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że preparaty służą do leczenia infekcji skóry i tkanki podskórnej.