PL226174B1

PL226174B1 - Polaczenie analogu witaminy D z imatinibem do stosowania w leczeniu skojarzonym niedrobnokomorkowego raka pluc

Info

Publication number: PL226174B1
Application number: PL397662A
Authority: PL
Inventors: Joanna Wietrzyk; Beata Filip-Psurska; Andrzej Kutner; Wiesław Szelejewski; Wieslaw Szelejewski; Michał Chodyński; Michal Chodynski
Original assignee: Inst Farm
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2011-12-30
Publication date: 2017-06-30
Also published as: WO2013100772A1; PL397662A1

Description

Wynalazek dotyczy połączenia analogu witaminy D określonego w opisie z imatinibem do stosowania w leczeniu skojarzonym niedrobnokomórkowego raka płuc.

Tło wynalazku

Rak płuc jest najczęstszym nowotworem złośliwym płuc wywodzącym się z komórek nabłonka wyścielającego drzewo oskrzelowe. Zachorowalność na raka płuc ma tendencję wzrastającą. W Polsce rak płuc jest na pierwszym miejscu u mężczyzn i na drugim u kobiet, a tempo wzrostu zachorowalności należy do jednego z najwyższych na świecie. Umieralność z powodu raka płuc jest bardzo wysoka. Około 80% chorych umiera w pierwszym roku od rozpoznania choroby, a tylko około 10% chorych przeżywa 5 lat od momentu rozpoznania raka płuca.

Rak płuca obejmuje wiele różnych podtypów histologicznych nowotworu. Z punktu widzenia strategii leczenia przyjmuje się podział raka płuc na dwie grupy nowotworów: raki drobnokomórkowe (anaplastyczne) składające się głównie z komórek niezróżnicowanych, oraz raki niedrobnokomórkowe wywodzące się z komórek nabłonka, zróżnicowanych na komórki gruczołowe lub komórki nabłonka płaskiego.

W leczeniu raka płuc stosuje się trzy główne metody terapeutyczne - leczenie chirurgiczne, radioterapię i chemioterapię.

Dobór odpowiedniej metody leczenia zależy głównie od typu histologicznego nowotworu oraz stopnia jego zaawansowania.

W leczeniu raków niedrobnokomórkowych najbardziej pożądaną metodą leczenia jest leczenie chirurgiczne. Największe szanse wyleczenia dają zabiegi radykalne - lobektomia, pneumonektomia i radykalna pneumonektomia. Ten sam rodzaj zabiegu wykonywany jest także w momencie, gdy planowane jest następcze leczenie chemioterapią lub radioterapią. Często w guzach nieoperacyjnych podejmowane są próby podawania chemioterapii przed zabiegiem w celu likwidacji części guza i doprowadzeniu jego rozmiarów do takich, które kwalifikują się do operacji radykalnej.

W zaawansowanym niedrobnokomórkowym raku płuc metodą leczenia pierwszej linii jest chemioterapia, w wielu przypadkach łączona z radioterapią. Zwykle stosuje się dwulekową chemioterapię opartą na związkach platyny (cisplatyna lub karboplatyna) w połączeniu z jednym z leków trzeciej generacji (najczęściej winorelbina, gemcytabina, docetaksel lub pemetreksed). W przypadku nie uzyskania odpowiedzi na leczenie pierwszej linii lub nawrotu choroby, można rozważyć leczenie drugiej linii (monoterapia docetakselem, pemetreksedem lub erlotinibem), a po jego niepowodzeniu - trzeciej linii (erlotinib).

W ostatnich latach leczenie raka zostało zrewolucjonizowane przez cząsteczki ukierunkowane na wzrost i szlaki sygnałowe w komórkach nowotworowych, tak jak erlotinib i bewacizumab stosowane w niedrobnokomórkowym raku płuc.

Jedną z takich cząsteczek jest również imatinib, związek o nazwie 4-[(4-metylo-1-piperazyn1-ylometylo)-N-[4-metylo-3-[[4-(3-pirydynylo)-2-pirymidynylo]amino]-fenylo]]benzamid, który wraz z innymi związkami stanowiącymi inhibitory receptorowych kinaz tyrozynowych ujawniony został w opisie zgłoszenia o udzielenie patentu europejskiego EP-A-0 564 409.

Kinazy białkowe, wśród których wyróżniane są rodziny kinaz serynowo-treoninowych i rodziny kinaz tyrozynowych, katalizują fosforylację białek, stanowiącą niezbędny etap różnicowania i podziału komórek. Kinazy tyrozynowe stanowią: kinaza receptora płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGF), kinaza Abl i kinaza c-Kit. Dysregulacja aktywności kinaz tyrozynowych, na przykład na drodze mutacji lub aktywacji przez wiązane do nich czynniki, takie jak naturalne związki wewnątrzpochodne, np. PDGF, bądź związki zewnątrzpochodne, jest częstą przyczyną zaburzeń wzrostu komórek, a w konsekwencji chorób nowotworowych.

Kinazy tyrozynowe odgrywają kluczową rolę w szlakach transdukcji sygnałów wewnątrzkomó rkowych, prowadząc do zróżnicowanych odpowiedzi komórkowych, takich jak proliferacja, apoptoza i różnicowanie. W konsekwencji, enzymy te stały się podstawowymi celami dla opracowywania nowych leków przeznaczonych do blokowania proliferacji, metastazy, angiogenezy i wspomagania apoptozy komórek nowotworowych.

Imatinib charakteryzuje szczególnie wysoka selektywność hamowania kinazy tyrozynowej będącej wynikiem translokacji białka fuzyjnego Bcr-Abl oraz c-Abl w porównaniu z innymi kinazami tyrozynowymi, ale wstępne badania wskazują, że hamuje on również kinazę tyrozynową receptora

PL 226 174 B1 płytkopochodnego czynnika wzrostu PDGFR oraz kinazę tyrozynową receptora c-Kit in vitro. Sprawia to, że potencjalnie imatinib może wykazywać skuteczność wobec nowotoworów złośliwych, w których istotną rolę odgrywa aktywacja tych receptorów.

Receptor czynnika wzrostu c-Kit ulega ekspresji w guzach stałych, w tym w drobnokomórkowym raku płuc (SCLC); co najmniej 70% przypadków drobnokomórkowego raka płuca charakteryzuje się ekspresją receptora kinazy tyrozynowej c-Kit i jej ligandu - czynnika wzrostu komórek pnia (SCF).

W publikacji G.W. Krystal, S. Honsawek, J. Litz, E. Buchdunger, Clin. Cancer Res., 2000, 8, 11,

3319-3326, The Selective Tyrosine Kinase Inhibitor STI571 Inhibits Small Cell Lung Cancer Growth, potwierdzono hipotezę, że Imatinib hamuje fosforylację kinazy tyrozynowej podobnej do białka c-kit oraz jej aktywność in vitro w komórkach drobnokomórkowego raka płuca.

Ze względu na ważną rolę jaką w sygnalizacji w obrębie komórek i ich patologicznym namnażaniu się odgrywa receptor płytkopochodnego czynnika wzrostu (PDGFR) i jego ligand - PDGF, receptor ten stał się atrakcyjnym celem terapeutycznym w szeregu nowotworów złośliwych. PDGF działa na komórki poprzez dwa różne receptory kinazy tyrozynowej: receptor α (PDGFR α) oraz receptor β (PDGFR β). Biologiczna rola PDGF w powstawaniu nowotworu rozciąga się od autokrynnej stymulacji komórek nowotworowych do parakrynnej stymulacji sąsiadującego z guzem podścieliska oraz układu naczyniowego (Mantur M., Koper O.: Płytkopochodny czynnik wzrostu - budowa, rola i jego receptory. Pol. Merk. Lek., 2008, XXIV, 140, 173).

Imatinib, oprócz hamowania Bcr-Abl w przewlekłej białaczce mieloplastycznej, wykazuje także silne własności hamowania PDGFR. Wykazano, że jest skuteczny w dwu typach nowotworów, w których patogenezie odgrywa rolę PDGF - włókniakomięsaku guzowatym skóry i glejaku wielopostaciowym.

Zwiększona ekspresja PDGF stanowi zły wskaźnik prognostyczny w ludzkim niedrobnokomórkowym raku płuc. W badaniach tkanki pobranej od pacjentów z NSCLC stwierdzono ekspresję PDGFR β ograniczoną do podścieliska guza oraz udokumentowano reaktywność PDGF β w komórkach nowotworowych w 60% próbek (Bauman J.E., Eaton K.D., Martins R.G.: Antagonism of PlateletDerived Growth Factor Receptor in Non-Small Cell Lung Cancer: Rationale and Investigations, Clin Cancer Res 2007, 13 (15 Suppl), August 1, 2007). Wiadomo, że PDGF β indukuje wzrost guza nowotworowego oraz jest odpowiedzialny za przerzuty, poprzez wytwarzanie naczyń limfatycznych (Mantur M., Koper O.: Płytkopochodny czynnik wzrostu - budowa, rola i jego receptory. Pol. Merk. Lek., 2008, XXIV, 140, 173).

W innych badaniach, gdzie badano ekspresję PDGF na liniach komórek ludzkiego raka płuc oraz próbkach po chirurgicznym wycięciu guza, obserwowano, że PDGF α ulegał ekspresji zarówno w liniach komórek nabłonka płaskiego, jak i gruczolakoraka oraz wydawał się ściśle regulować ekspresję czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF). W ksenogenicznie przeszczepionym modelu NSCLC, wzrost guza korelował z ekspresją PDGFR, a ubytek PDGF powodował zahamowanie wzrostu guza, zmniejszenie poziomu VEGF i gęstości mikronaczyń w guzie. Prawdopodobnie jest to związane z występowaniem parakrynnej pętli dotyczącej z jednej strony ekspresji PDGF w komórkach nowotworowych, z drugiej zaś z ekspresją receptora dla PDGF (PDGFR) w mikrootoczeniu nowotworu. Hipoteza ta została poddana weryfikacji w badaniach klinicznych NSCLC z użyciem kombinacji imatinibu, prowadzonych przez badaczy z Uniwersytetu Waszyngtona.

Kolejnym interesującym kierunkiem badań nad terapią celowaną w tym typie nowotworu, wydają się być strategie dotyczące szczególnych warunków jakie panują w środowisku guza nowotworowego zlokalizowanego w tkance płuca. Istnieją bowiem czynniki, które poprzez ograniczenie dostępności leku przyczyniają się do słabej odpowiedzi nowotworu na chemio- i radioterapię. Są to: wysokie wewnątrzguzowe ciśnienie płynu śródtkankowego (interstitial fluid pressure - IFP) oraz hipoksja (Vlahovic G., Rabbani Z.N., Herndon J.E., Dewhirst M.W., Vujaskovic Z. Treatment with Imatinib in NSCLC is associated with decrease of phosphorylated PDGFR-beta and VEGF expression, decrease in interstitial fluid pressure and improvement of oxygenation. Br.J. Cancer 2006; 95: 1013-1019). W badaniach tych weryfikowana jest koncepcja zmierzająca do obniżenia ciśnienia płynu śródtkankowego (IFP) poprzez działanie ukierunkowane na PDGFR, testowana uprzednio w badaniach przedklinicznych na modelach różnych nowotworów. Podwyższone ciśnienie płynu śródtkankowego jest charakterystyczne dla guzów stałych i, jak się uważa, przeszkadza w transporcie chemioterapeutyków przez naczynia włosowate. Ufosforylowany PDGFR, receptor o aktywności kinazy tyrozynowej uznawany jest za strategiczny cel do obniżenia IFP w guzach z jego nadekspresją. Tym samym guzy NSCLC wykazujące często ekspresję PDGFR powinny być podatne na stosowanie strategii terapeutycznych skierowanych przeciwko temu receptorowi (Bauman J.E., Eaton K.D., Martins R.G. Antagonism

PL 226 174 B1 of platelet-derived growth factor receptor in non small cell lung cancer: rationale and investigations.

Clin.Cancer Res. 2007, 13: s. 4632-s. 4636). Dane z badań przedklinicznych dowodzą, że działanie antagonistyczne wobec receptora płytkopochodnego czynnika wzrostu obniża ciśnienie płynu śródtkankowego, zwiększa stężenie chemioterapeutyku w obrębie guza i zaburza wzost nowotworu.

Jednocześnie wykazano, iż komórki macierzyste izolowane z linii NSCLC wykazują ekspresję c-kit, oraz że oś sygnałowa SCF-c-kit odgrywa istotną rolę w samoodnowie i proliferacji komórek macierzystych nowotworów płuc (Levina V., Marrangoni A., Wang T. et al. Elimination of human lung cancer stem cells through targeting of the stem cell factor-c-kit autocrine signaling loop. Cancer Res. 2010;70:338-346.). Blokowanie szlaku sygnałowego SCF-c-kit, podobnie jak PDGF, powinno poprawić skuteczność terapeutyczną chemioterapii NSCLC. Lekiem, którego celem terapeutycznym są zarówno PDGFR, jak i c-kit, jest imatinib (Zhang P., Gao W.Y., Turner S., Ducatman B.S. Gleevec (STl-571) inhibits lung cancer cell growth (A549) and potentiates the cisplatin effect in vitro . Mol. Cancer 2003; 2:1, Wang W.L., Healy M.E., Sattler M. et al. Growth inhibition and modulation of kinase pathways of small cell lung cancer cell lines by the novel tyrosine kinase inhibitor STI 571. Oncogene 2000; 19: 3521-3528., Vlahovic G., Rabbani Z.N., Herndon J.E., Dewhirst M.W., Vujaskovic Z. Treatment with Imatinib in NSCLC is associated with decrease of phosphorylated PDGFR-beta and VEGF expression, decrease in interstitial fluid pressure and improvement of oxygenation. Br.J. Cancer 2006; 95: 1013-1019). Wykazano dotychczas, iż zastosowanie terapii skierowanej przeciwko tym czynnikom z użyciem inhibitorów kinaz tyrozynowych takich jak imatinib powoduje, iż obniża się ekspresja p-PDGFR-beta, VEGF oraz obniża się IFP, ponadto poprawia się utlenowanie środowiska guza NSCLC (Vlahovic G., Rabbani Z.N., Herndon J.E., Dewhirst M.W., Vujaskovic Z. Treatment with Imatinib in NSCLC is associated with decrease of phosphorylated PDGFR-beta and VEGF expression, decrease in interstitial fluid pressure and improvement of oxygenation. Br.J. Cancer 2006; 95: 1013-1019).

Inne podejście do terapii skojarzonej NSCLC wykorzystuje fakt, iż w kompartmencie unaczynienia guza (drugim kompartmencie obok komórek nowotworowych, na który ukierunkowana jest terapia substancjami o działaniu neoplastycznym) występują niezależnie dwa typy komórek: komórki śródbłonka i perycyty. Dane z badań przedklinicznych sugerują, że podwójne ukierunkowanie działania na perycyty, których funkcjonowanie jest regulowane również przez PDGFR, oraz komórki śródbłonka, których fizjologiczna i patologiczna angiogeneza jest zależna od szlaku sygnałowego VEGF, może stanowić synergiczną i bardziej skuteczną strategię przeciwangiogenną niż terapia ukierunkowana tylko przeciw VEGF. Dane te są aktualnie weryfikowane w badaniach klinicznych testujących nową strategię podtrzymującą z użyciem imatinibu i przeciwciała blokującego proces angiogenezy naczyń krwionośnych śródbłonka, bewacizumabu, po niepowodzeniu terapii pierwszej linii bewacizumabem.

Zatem aktualne koncepcje w leczeniu przeciwnowotworowym, w tym w leczeniu niedrobnokomórkowego raka płuca, zmierzają w kierunku kojarzenia ze sobą różnych modulatorów szlaków sygnałowych w komórce.

Powyższe doniesienia skłoniły obecnych Twórców do przeprowadzenia badań nad zastosowaniem kombinacji modulatorów szlaków sygnałowych, imatinibu i analogów kalcytriolu, w modelu niedrobnokomórkowego raka płuca.

Kalcytriol, hormonalnie aktywna forma witaminy D3, podobnie jak imatinib posiada aktywność regulującą cykl komórkowy, jednakże efekty działania obydwu związków przebiegają prawdopodobnie poprzez różne mechanizmy molekularne. Wyniki badań in vitro i in vivo dotyczące cytostatycznej aktywności kalcytriolu i jego analogów wskazują na możliwość zastosowania tych związków w leczeniu chorych na niektóre typy nowotworów (Ma Y., Trump D.L., Johnson C.S. Vitamin D in combination cancer treatment, Journal of Cancer 2010; 1, 101-107). Powszechnie wiadomo, że w rozwoju nowotworu, podobnie jak w przebiegu innych schorzeń o charakterze hiperproliferacyjnym, takich jak łuszczyca, dochodzi do zaburzenia równowagi pomiędzy procesami proliferacji i apoptozy. Indukcja różnicowania komórek przy pomocy kalcytriolu lub jego analogów może przywracać tę równowagę w konsekwencji prowadzić do zahamowania wzrostu nowotworu (Diaz G.D., Paraskeva C., Thomas M.G., Binderup L., Hague A. Apoptosis is induced by the active metabolite of vitamin D3 and its analogue EB1089 in colorectal adenoma and carcinoma cells: possible implications for prevention and therapy. Cancer Res. 60: 2304-2312, 2000). Jak wykazano wcześniej w modelu raka głowy i szyi, jak i ludzkiej białaczki HL-60, łączne zastosowanie kalcytriolu lub analogu PRI-2191 z imatinibem wzmacnia działanie antyproliferacyjne imatinibu jednocześnie powodując efekt synergistyczny w działaniu obu leków (Wietrzyk J., Milczarek M., Kutner A. The effect of combined treatment on head and neck human cancer cell lines with novel analogs of calcitriol and cytostatics. Oncol Res. 16: 517-525, 2007, Switalska M.,

PL 226 174 B1

Nasulewicz-Goldeman A., Opolska A. et al. The in-vitro antiproliferative effect of PRI-2191 and imatinib applied in combined treatment with cisplatin, idarubicin, or docetaxel on human leukemia cells. Anticancer Drugs 2011).

Kalcytriol, jak i jego analogi są dobrymi kandydatami do terapii skojarzonej z imatinibem ze względu na to, iż kalcytriol wpływa na szlaki sygnałowe aktywowane przez kinazę białkową aktywowaną miogenami (MAPK) w szczególności na kaskady Raf/MEK/ERK oraz JNK, które również są elementami wspólnymi dla szlaków sygnałowych aktywowanych na drodze aktywacji kinaz c-Kit lub Bcr-Abl. Wiadomo również, iż podczas różnicowania komórek linii HL-60 kalcytriol obniża ekspresję PDGFR (receptora płytkowo pochodnego czynnika wzrostu), kinazy będącej jednym z celów dla imatinibu (Reiterer G., Yen A. Platelet-derived growth factor receptor regulates myeloid and monocytic differentiation of HL-60 cells. Cancer Res. 2007; 67: 7765-7772).

Wyniki publikowanych prac wykazują, iż aktywność przeciwnowotworowa kalcytriolu związana jest z aktywowaniem bądź hamowaniem różnych szlaków sygnałowych w komórce. Wiadomo, iż kalcytriol, obok klasycznych efektów genomowych, reguluje wiele komórkowych szlaków sygnałowych przekazywanych przez kinazę białkową C, ras, MAPK, lipazę białkową A i prostaglandyny, cykliczne AMP i kinazę białkową A, fosfatydyloinozytol 3 i inne. Aktywacja cytoplazmatycznego szlaku sygnałowego często powoduje szybkie zmiany w poziomie wapnia wewnątrz komórki i aktywację bądź inaktywację takich białek jak bcl-2 lub c-jun. Wiele z tych szlaków sygnałowych w konsekwencji wywiera wpływ na proliferację komórki, różnicowanie, apoptozę i może współdziałać z klasycznym szlakiem genomowym.

Wykazano także istotną rolę receptora witaminy D (VDR) w proliferacji komórek śródbłonkowych pochodzących z guza oraz działanie antyangiogenne kalcytriolu. Wykorzystując myszy z nokautem genu dla VDR (VDR KO), stwierdzono, iż u zwierząt tych powstaje bardziej upośledzone unaczynienie w obrębie rozwijających się guzów nowotworowych (przeszczepialnych), w porównaniu do myszy szczepu dzikiego. Ponadto, poszerzenie i deformacja naczyń krwionośnych u myszy VDR KO, związane były z mniejszą liczbą perycytów oraz zwiększoną ilością czynników angiogennych jak: HIF-1 alfa, VEGF, Ang1 i PDGF-BB. Znaczenie VDR w regulacji tych czynników nie jest w pełni wyjaśnione. W przypadku różnych ludzkich nowotworów wykazano, że kalcytriol hamuje ekspresję białka HIF-1 alfa oraz jego genów docelowych: VEGF, endoteliny-1 i transportera glukozy-1. Jednocześnie, komórki śródbłonka naczyniowego izolowane z guzów od myszy VDR KO traktowane kalcytriolem nie reagowały obniżeniem ekspresji VEGF, Ang1 i PDGF-BB, w przeciwieństwie do komórek izolowanych od myszy szczepu dzikiego (Chung I., Han G., Seshadri M., Gillard B.M., Yu W.D., Foster B.A., Trump

D.L., Johnson C.S. (2009) Role of vitamin D receptor in the antiproliferative effects of calcitriol in tumor-derived 5 endothelial cells and tumor angiogenesis in vivo. Cancer Res 69: 967-975).

Biorąc pod uwagę zarówno mechanizm działania imatinibu, jak i kalcytriolu, założono, że związki te mogą działać bądź na te same szlaki sygnałowe, ale na innych ich etapach, bądź na podobne procesy toczące się w obrębie nowotworu i przez to mogą wspomagać wzajemnie swoje działanie przeciwnowotworowe.

Hipotezę tę potwierdziły wyniki badań in vivo w modelu ludzkiego niedrobnokomórkowego raka płuca A549, gdzie okazało się, iż wybrane analogi witaminy D nie dosyć, iż same spowalniają wzrost guza nowotworowego, gdy stosowano je samodzielnie, to również wzmagają efekt przeciwnowotworowy imatinibu. Zatem przeciwnowotworowa aktywność imatinibu, obejmująca zarówno zahamowanie proliferacji, jak i indukcję apoptozy, może korzystnie współdziałać z aktywnością tych analogów.

Zwięzły opis rysunków

Fig. 1A przedstawia kinetykę wzrostu guzów u myszy (wszystkie grupy) obarczonych niedrobnokomórkowym rakiem płuc A549 leczonych imatinibiem (GV) (50 mg/kg/dzień) w skojarzeniu z analogami witaminy D.

Fig. 1B przedstawia kinetykę wzrostu guzów u myszy obarczonych niedrobnokomórkowym rakiem płuc A549 leczonych imatinibiem (GV) (50 mg/kg/dzień) w skojarzeniu z analogami witaminy D.

Fig. 2 przedstawia zmiany masy ciała myszy NOD/SCID obarczonych ludzkim niedrobnokomórkowym rakiem płuc A549 podczas leczenia imatinibiem oraz analogami witaminy D.

Fig. 3 przedstawia poziom wapnia całkowitego we krwi myszy po zakończeniu leczenia [mmol/L] (dzień 34).

PL 226 174 B1

Ujawnienie wynalazku

Istotę wynalazku stanowi połączenie analogu witaminy D wybranego spośród takalcytolu i (1S,3R,5E,7E,22E,24S)-24-cyklopropylo-9,10-sekochola-5,7,10(19),22-tetraen-1,3,24-triolu (izomeru

5,6-trans kalcypotriolu) z inhibitorem kinaz tyrozynowych - imatinibem do stosowania w leczeniu skojarzonym niedrobnokomórkowego raka płuc.

W badaniach in vivo w modelu ludzkiego niedrobnokomórkowego raka płuca A549 imatinib obniża w stopniu statystycznie istotnym masę guzów w stosunku do kontroli tylko w przypadku łącznego stosowania z analogami witaminy D.

Współdziałanie związków oceniane na podstawie parametru zahamowania wzrostu guza TGI (tumor growth inhibition) wskazuje, że stosowanie w skojarzeniu analogów witaminy D z imatinibem hamuje wzrost guzów w sposób addytywny, przechodzący w synergizm w dalszych dniach eksperymentu, zwłaszcza w przypadku podawania takalcytolu.

Stosowanie połączenia objętego wynalazkiem jest bezpieczne i nie wywołuje ryzyka występowania hiperkalcemii i hiperfosfatemii, o czym świadczy obserwowany brak podwyższenia stężenia wapnia całkowitego w surowicy krwi myszy zarówno po podaniu analogu witaminy D i imatinibu samodzielnie, jak i po podaniu połączenia imatinibu z każdym z badanych analogów witaminy D.

W oparciu o wyniki badań połączenia in vivo można stwierdzić, że analogi witaminy D potęgują korzystne działanie przeciwnowotworowe imatinibu, w związku z czym mogą być stosowane w terapii skojarzonej ze wskazaniem do leczenia niedrobnokomórkowego raka płuc.

Korzystny analog witaminy D do stosowania w połączeniu według wynalazku stanowi takalcytol.

Składniki połączenia można podawać choremu w postaci jednego lub osobnych środków farmaceutycznych, zawierających terapeutycznie skuteczną ilość substancji aktywnej/ych w połączeniu ze znanymi farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami i/lub substancjami pomocniczymi.

Imatinib można podawać w postaci wolnej zasady lub soli addycyjnej z kwasem, w szczególn ości z kwasem metanosulfonowym. Sól addycyjna imatinibu z kwasem metanosulfonowym, znana pod nazwą mesylan imatinibu, może być stosowana w dowolnej postaci krystalicznej, na przykład w postaci krystalicznej α lub β, znanych z opisu publikacji zgłoszenia międzynarodowego WO 99/03854 i odpowiadającego mu patentu PL 188348 B1.

Takalcytol może być podawany w postaci bezwodnej lub solwatowanej, korzystnie w postaci monohydratu.

Terapeutycznie skuteczne dawki składników połączenia w leczeniu niedrobnokomórkowego raka płuc mogą być ustalone przez lekarza specjalistę na podstawie badań klinicznych i dostosowane do stopnia zaawansowania choroby, wieku i wagi chorego, ryzyka zagrożenia rozwinięcia się choroby u danego osobnika oraz drogi podawania.

Dobową dawkę substancji można podawać pacjentowi w postaci jednej dawki jednostkowej raz dziennie lub podzieloną na kilka dawek dziennych.

Skuteczną terapeutycznie dobową dawkę analogu witaminy D w przypadku dorosłego człowieka może stanowić od 0,1 do 200 μg substancji aktywnej, korzystnie od 0,5 do 50 μg.

Skuteczne terapeutycznie dobowe dawki imatinibu w leczeniu białaczki u ludzi wynoszą od 100 do 800 mg substancji aktywnej, a zalecana dawka jednorazowa przy podawaniu doustnym to 100 lub 400 mg. Można zatem podawać imatinib w jednostkowej postaci dawkowania zawierającej, odpowiednio: 119,5 lub 478 mg mesylanu imatinibu.

W przypadku obecnego wynalazku, ze względu na synergiczne współdziałanie z analogiem witaminy D, dawka dobowa imatinibu może być odpowiednio obniżona.

Generalnie, terapeutycznie skuteczną dawkę dobową imatinibu będzie stanowić od 50 do 1000 mg substancji aktywnej w przeliczeniu na wolną zasadę. Dawka ta może być podawana raz lub dwa razy dziennie.

Jak wynika z przeprowadzonych badań in vivo na mysim modelu ludzkiego niedrobnokomórkowego raka płuca A549, droga podawania składników połączenia ma duży wpływ na ich aktywność przeciwnowotworową. Wyraźny synergiczny efekt terapeutyczny imatinibu i analogu witaminy D obserwuje się przy podawaniu imatinibu drogą dootrzewnową w połączeniu z podskórnym podawaniem takalcytolu, kiedy to uzyskuje się do 40% zahamowania wzrostu guza w porównaniu z grupą kontrolną.

Uzyskane wyniki badań na modelu zwierzęcym potwierdzają skuteczność chemioterapii dootrzewnowej skojarzonej z podskórną. Skojarzenie tych dwóch metod podania leków przeciwnowotworowych u ludzi mogłoby pozwolić na obniżenie podawanych dawek obu składników połączenia oraz zwiększenie skuteczności terapii.

PL 226 174 B1

Zatem, w zastosowaniu zgodnie z wynalazkiem, w leczeniu niedrobnokomórkowego raka płuc u ludzi, imatinib można podawać drogą doustną lub dożylną, a analog witaminy D drogą doustną lub podskórną.

Środek farmaceutyczny, oprócz substancji aktywnej/ych, może zawierać znane dopuszczalne farmaceutycznie nośniki i/lub substancje pomocnicze, odpowiednie dla danej postaci farmaceutycznej, nie wywierające własnego działania farmakologicznego i nie wchodzące w niepożądane reakcje z substancją/ami aktywną/ymi.

Środek farmaceutyczny może być sporządzany w postaci odpowiedniej do podawania ogólnoustrojowego, na przykład doustnie, jak tabletki, kapsułki, tabletki powlekane, tabletki dojelitowe, w postaci odpowiedniej do podawania pozajelitowego, takiej jak roztwory, zawiesiny lub liofilizat do odtwarzania ex tempore lub w postaci odpowiedniej do podawania miejscowego. Dobór i ilość nośników i substancji pomocniczych zależna jest od postaci i drogi podawania środka. W celu wytworzenia odpowiedniej postaci leku stosuje się techniki dobrze znane specjalistom, stosując dowolne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, rozcieńczalniki, wypełniacze i inne substancje pomocnicze.

Środek farmaceutyczny do podawania drogą doustną może w szczególności przyjmować postać kapsułek. W tym przypadku substancję czynną łączy się z nośnikiem i otrzymaną kompozycją napełnia się żelatynowe kapsułki. Wypełnienie kapsułek ma postać roztworu olejowego, zawiesiny lub emulsji. Odpowiednie nośniki obejmują na przykład olej rycynowy, olej kokosowy, olej z oliwek, olej palmowy, olej kukurydziany, olej arachidowy, syntetyczne i naturalne trójglicerydy kwasów tłuszczowych, nienasycone kwasy tłuszczowe średniołańcuchowe, modyfikowane kwasy tłuszczowe długołańcuchowe, estry glikoli, polietylenoglikole i inne. Odpowiednie substancje pomocnicze stanowią tenzydy, na przykład lecytyna, mono- i diglicerydy, estry kwasów tłuszczowych polioksyetylenosorbitanu.

Kapsułki mogą mieć postać kapsułek żelatynowych miękkich lub twardych, różniących się składem masy żelatynowej do ich wytwarzania. W skład masy żelatynowej w przypadku kapsułek miękkich wchodzą plastyfikatory, takie jak glicerol, sorbitol; środki konserwujące, takie jak kwas benzoesowy i jego sole lub hydroksybenzoesany alkilowe; środki barwiące i smakowe.

Środek farmaceutyczny do podawania drogą pozajelitową może mieć postać zawiesiny gotowej do podania, postać liofilizatu do odtwarzania ex tempore bądź też koncentratu do sporządzania wlewów dożylnych. Nośniki odpowiednie do podawania środka farmaceutycznego drogą dożylną obejmują na przykład wyjałowione roztwory wodne, takie jak roztwór soli fizjologicznej, roztwory węglowodanów, np. glukozy, mannitolu, dekstrozy, laktozy i roztwory wodne buforów, na przykład buforu fosforanowego. Ponadto środek może zawierać inne substancje pomocnicze, tradycyjnie stosowane w celu zapewnienia izoosmotyczności, przeciwutleniacze, substancje konserwujące i inne.

Połączenie zgodnie z wynalazkiem stanowi potencjalną opcję leczenia niedrobnokomórkowego raka płuc.

Badania aktywności biologicznej

W dalszym opisie stosowane są następujące oznaczenia:

PRI-2191 - takalcytol

PRI-2205 - izomer 5,6-trans kalcypotriolu

GV - imatinib

W badaniach stosowano monohydrat takalcytolu i izomer 5,6-trans kalcypotriolu wytworzone w Instytucie Farmaceutycznym, Warszawa.

Imatinib podawany był w postaci mesylanu, postać krystaliczna α, wytwarzanego w Instytucie Farmaceutycznym, Warszawa.

Ilości i stężenia substancji aktywnych stosowanych w postaci hydratów i soli podane są w przeliczeniu na wolne związki.

Badania in vivo

Wpływ analogów witaminy D na aktywność przeciwnowotworową Imatinibu w modelu ludzkiego niedrobnokomórkowego raka płuca A549

Metodyka badania • Myszy szczepu NOD/SCID (samice) obarczone niedrobnokomórkowym rakiem płuc, komórki nowotworowe wszczepione podskórnie w stężeniu 5x10⁶ komórek/0,25 ml/mysz • Liczba myszy w grupach: kontrola - 8; PRI-2191 - 8; PRI-2205 - 8;

Imatinib (GV) - 8; GV + PRI-2191 - 8; GV + PRI-2205 - 8 • Leczenie myszy rozpoczęto 7 dnia od zaszczepienia komórek nowotorowych (7 dzień eksperymentu)

PL 226 174 B1 • Imatinib: dawka 50 mg/kg/dzień, podanie dootrzewnowe, codziennie (w dniach 7-21) • PRI-2191: dawka 1 μg/kg/dzień, podawany podskórnie na połowę m.c., wielokrotne podanie, 3x w tygodniu (w dniach 10, 12, 14, 17, 19, 21, 24, 26, 28) • PRI-2205: dawka 10 μg/kg/dzień, podawany podskórnie na połowę m.c., wielokrotne podanie, 3x w tygodniu (w dniach 10, 12, 14, 17, 19, 21, 24, 26, 28)

W dniu 34 eksperyment zakończono, pobrano krew i guzy do dalszej analizy.

Krew poddano analizie na zawartość wapnia całkowitego w surowicy.

Dokonywano pomiarów guzów podskórnych w trakcie eksperymentu, 3 razy w tygodniu. Obję32 tość guza [mm³] wyliczano wg formuły: (a² x b)/2, gdzie a = krótszy wymiar guza w mm, b = dłuższy wymiar guza w mm.

Analiza wyników

Analizę statystyczną wykonywano wg testu Kruskal-Wallis ANOVA, test dla wielokrotnych porównań oraz porównanie grup wg Mann-Whitney U-test.

Opracowanie statystyczne uzyskanych wyników zahamowania wzrostu guzów (TGI) przeprowadzono analizując procent zahamowania w poszczególnych kombinacjach związków.

TGI [%] obliczono wg wzoru:

TGI = 100 - [(średnia objętość guza w grupie leczonej/średnia objętość guza w kontroli) x 100]

Tak obliczony TGI (%) wyraża o ile procent guzy w danej grupie są mniejsze od guzów w kontroli. Wartość hipotetyczną TGI obliczano na podstawie wzoru:

%H = 100 - [(100 - TGI GV) x (100 - TGI Wit)/100] gdzie:

%H - hipotetyczne zahamowanie wzrostu guzów przez kombinację związków [%];

TGI GV - zahamowanie wzrostu guzów przez sam imatinib [%];

TGI Wit - zahamowanie proliferacji przez sam analog witaminy D [%];

W zależności od uzyskanych w eksperymentach wartości, uzyskane wartości oceniano jako efekt synergiczny, addytywny, subaddytywny lub antagonistyczny.

Gdy wartość hipotetyczna znajduje się poniżej wartości eksperymentalnej wyznaczonej dla połączenia stosowanych związków, świadczy to o synergizmie działania związków. Efekt addytywny występuje, gdy wartość eksperymentalna i hipotetyczna pokrywają się, efekt subaddytywny, gdy wartość wyznaczona eksperymentalnie znajduje się poniżej wartości hipotetycznej, ale powyżej wartości dla samego imatinibu, a działanie antagonistyczne - jeżeli wartość wyznaczona dla imatinibu stosowanego pojedynczo znajduje się powyżej wartości eksperymentalnej dla połączenia obu związków [Peters G.J. i wsp. Pharmacol Ther. 2000, 87, 227-253].

TGI przedstawiano również jako procent objętości guza grupy kontrolnej jaki stanowi objętość guza w grupie badanej. Wtedy objętość guza w kontroli przyjmowano jako 100%, a objętość guza w grupie leczonej wyrażano jako (100% - %TGI) (Tabela 1).

Wyniki • Kinetyka wzrostu guza A549

W celu zobrazowania działania zastosowania połączenia analogów witaminy D z imatinibem obliczono procent zahamowania wzrostu guza TGI [%], określający o ile mniejsze są guzy u myszy w grupach leczonych w porównaniu z guzami u myszy w grupie kontrolnej otrzymującej placebo (rozpuszczalnik). Wyniki przedstawiono na wykresach fig. 1A (wszystkie grupy) i 1B - dla wybranych grup.

W Tabeli 1 przedstawiono obliczenia wykonane dla ostatniego dnia pomiarowego eksperymentu, gdzie klasyczny parametr TGI przedstawiony jest w kolumnie nr 3. Spośród wszystkich trzech preparatów zastosowanych samodzielnie, najsłabiej wzrost guzów A549 zahamował imatinib (19%). Analogi witaminy D stosowane samodzielnie zahamowały wzrost guzów w 38% dla PRI-2191 oraz w 46% dla PRI-2205. Kombinacje każdego z analogów z imatinibem w równym stopniu zahamowały wzrost guza w stosunku do kontroli; imatinib + PRI-2191 o 62%, natomiast imatinib + PRI-2205 o 61%. Wartości TGI otrzymane dla połączenia, jak i dla obu analogów witaminy D stosowanych samodzielnie są istotne statystycznie.

PL 226 174 B1

Wpływ analogów witamin D na wzrost guzów u myszy obarczonych niedrobnokomórkowym rakiem płuc A549 leczonych Imatinibem - średnia objętość guza, odchylenie standardowe, % zahamowania wzrostu guza TGI oraz hipotetyczny % TGI, N - liczba myszy w grupach

	GUZY - 31 DZIEŃ EKSPERYMENTU
1	2	3	4	5	6
GRUPY	ŚREDNIA ± SD [mm³]	TGI [%]	TGI hip. H [%]	N - 31 DZIEŃ	***Objętość guza wyrażona w % w stosunku do kontroli
KONTROLA	441±146	-	-	7	100
PRI-2191	272±86	38**	-	8	62
PRI-2205	237±60	46**	-	7	54
Imatinib (GV)	360±200	19	-	8	81
GV + PRI-2191	168±60	62*	50	6	38
GV + PRI-2205	172±66	61*	56	8	39

*p<0.05 Kruskal-Wallis test, **p<0.05 Mann-Whitney U test jako porównanie do kontroli ***TGI przedstawione jako procent objętości guza grupy N - liczba myszy w grupie

W kolumnie 4 tabeli 1 przedstawiono hipotetyczny parametr TGI obliczony na podstawie wzoru:

%H = 100 - [(100 - TGI GV) x (100 - TGI Wit)/100]. Analizując dane teoretyczne (%H) otrzymane dla połączenia imatinibu z analogami witaminy D oraz dane eksperymentalne zaobserwowano, iż efekt synergiczny współdziałania analogów z imatinibem, a w szczególności analogu PRI-2191, utrzymał się do ostatniego dnia pomiarowego eksperymentu. Hipotetyczna wartość TGI (%H) dla połączenia GV+PRI-2191 jest o 12% niższa od eksperymentalnego TGI, a dla GV+PRI-2205 o 5%.

Dla lepszego zilustrowania uzyskanych rezultatów, w kolumnie 6 Tabeli 1 przedstawiono objętość guzów w poszczególnych grupach w 31 dniu eksperymentu jako procent objętości guzów kontrolnych. Objętość guzów w grupach traktowanych kombinacją imatinibu z analogami PRI-2191 oraz PRI-2205 stanowi niewiele ponad 1/3 objętości guzów kontrolnych (38% dla GV+PRI-2191, 39% dla GV+PRI-2205).

• Zmiany masy ciała myszy w trakcie leczenia oraz poziom wapnia całkowitego we krwi myszy po zakończeniu leczenia

Kolejnym parametrem oceny skuteczności leczenia była obserwacja masy ciała myszy. Wyniki zilustrowano na wykresie fig. 2.

Na podstawie wykresu na fig. 2, przedstawiającego zmiany masy ciała myszy w trakcie trwania eksperymentu [wyrażone w %], gdzie masa ciała w danym dniu była porównywana do masy ciała w dniu „0”, można wnioskować, iż stosowanie analogów witaminy D pojedynczo jest bezpieczne dla myszy. Obserwowane spadki masy ciała o więcej niż 5% dla obu grup otrzymujących kombinację imatinibu z analogiem PRI-2191 lub PRI-2205 było prawdopodobnie spowodowane codziennym podawaniem imatinibu (w dniach od 7 do 21). Po 22 dniu eksperymentu spadek masy ciała w obu grupach wynosi około 10%, a po dniu 28 około 6-8%.

Obserwowane zmiany masy ciała nie są spowodowane toksycznością kalcemiczną, jakiej można by oczekiwać w przypadku analogów witaminy D. Świadczą o tym otrzymane wyniki pomiaru poziomu wapnia w surowicy myszy. W dniu 34 zwierzęta zostały uśmiercone, pobrano krew i wykonano analizę poziomu wapnia w ich surowicy (fig. 3). Żaden z obu zastosowanych w tym eksperymencie analogów witaminy D nie podniósł poziomu wapnia w surowicy ponad poziom wykryty u myszy kontrolnych, traktowany jako prawidłowy dla myszy obarczonych nowotworem. Myszy otrzymujące analogi witaminy D lub imatinib pojedynczo wykazywały nieznacznie niższy poziom wapnia w surowicy niż myszy kontrolne. Nawet u myszy w grupach otrzymujących kombinację PRI-2191 lub PRI-2205 z imatinibem poziom wapnia był zbliżony do grupy kontrolnej i porównywalny do poziomu u myszy otrzymujących każdy z leków osobno, co przemawia za bezpieczeństwem stosowania połączenia imatinibu z analogami witaminy D.

PL 226 174 B1

Wnioski:

Imatinib w skojarzeniu z analogami witaminy D obniża w stopniu statystycznie istotnym objętość guzów A549 w stosunku do kontroli począwszy od dnia 12 do dnia 31 dla połączenia GV+PRI-2205 oraz w dniach 12, 14, 19-31 dla połączenia GV+PRI-2191 (Mann-Whitney U test). Według analizy przeprowadzonej testem Kruskal-Wallis ANOVA bardziej korzystnym połączeniem jest kombinacja imatinibu z PRI-2191 (istotne statystycznie różnice w dniach 12, 14, 19-31).

Sam imatinib, podobnie jak analogi witaminy D: PRI-2191 lub PRI-2205, zmniejsza objętość guzów, ale jedynie w wybranych dniach lub okresach eksperymentu, różnice pomiędzy objętością guzów w grupach leczonych każdym z preparatów z osobna a objętością guzów w grupie kontrolnej są istotne statystycznie (fig 1, Mann-Whitney U test).

Współdziałanie testowanych połączeń związków oceniano uwzględniając parametry zahamowania wzrostu guza TGI (tumor growth inhibition). Stosowanie połączenia analogów witaminy D z imatinibem hamuje wzrost guzów w sposób addytywny, przechodzący w synergizm w dalszych dniach eksperymentu i utrzymujący się do końca eksperymentu (Tabela 1, dzień 31), zwłaszcza w przypadku analogu PRI-2191, co przemawia za zastosowaniem połączenia imatinib+takalcytol. Zastosowane analogi PRI-2191 oraz PRI-2205, podawane myszom samodzielnie, jak i w skojarzeniu z imatinibem, nie podwyższają stężenia wapnia w surowicy myszy ponad poziom prawidłowy, co zapewnia bezpieczeństwo stosowania połączenia.

W oparciu o rezultaty badań na modelu mysim in vivo można stwierdzić, że analogi witaminy D potęgują korzystne działanie przeciwnowotworowe imatinibu, w związku z czym mogą być stosowane w terapii skojarzonej niedrobnokomórkowego raka płuc.

Claims

1. Połączenie analogu witaminy D wybranego spośród takalcytolu i (1S,3R,5E,7E,22E,24S)-24cyklopropylo-9,10-sekochola-5,7,10(19),22-tetraen-1,3,24-triolu (izomeru 5,6-trans kalcypotriolu) z inhibitorem kinaz tyrozynowych - imatinibem do stosowania w leczeniu skojarzonym niedrobnokomórkowego raka płuc.

2. Połączenie według zastrz. 1, w którym analog witaminy D stanowi takalcytol.

3. Połączenie według zastrz. 1 albo 2, w którym imatinib i analog witaminy D są w jednej lub dwu osobnych jednostkowych postaciach dawkowania.

4. Połączenie według dowolnego z zastrz. 1-3, w którym imatinib i analog witaminy D są w dwu osobnych jednostkowych postaciach dawkowania.

5. Połączenie według dowolnego z zastrz. 1-4, w którym jednostkowe postaci dawkowania zawierają terapeutycznie skuteczne dawki imatinibu i analogu witaminy D.

6. Połączenie według dowolnego z zastrz. 1-5, w którym imatinib jest w jednostkowej postaci dawkowania przeznaczonej do podawania drogą doustną lub dożylną, a analog witaminy D jest w jednostkowej postaci dawkowania przeznaczonej do podawania drogą doustną lub podskórną.

7. Połączenie według dowolnego z zastrz. 1-5, w którym terapeutycznie skuteczna dawka dobowa imatinibu stanowi od 50 do 1000 mg substancji aktywnej w przeliczeniu na wolną zasadę.

8. Połączenie według zastrz. 7, w którym imatinib jest w postaci monometanosulfonianu.

9. Połączenie według dowolnego z zastrz. 1-6, w którym terapeutycznie skuteczna dawka dobowa analogu witaminy D stanowi od 0,1 do 200 μg, korzystnie od 0,5 do 50 μg substancji aktywnej, w przeliczeniu na wolną zasadę.

10. Połączenie według zastrz. 9, w którym analog witaminy D stanowi takalcytol w postaci monohydratu.

PL 226 174 B1

Rysunki

Fig. 1A. Kinetyka wzrostu guzów u myszy (wszystkie grupy) obarczonych niedrobnokomórkowym rakiem płuc A549 leczonych imatinibiem (GV) (50mg/kg/dzień) w skojarzeniu z analogami witaminy D.

* p<0,05 wg testów Kruskal-Wallis ANOVA oraz Mann-Whitney U test.

a - PRJ-2191 względem kontroli w dniach 14, 19-26 i 3\{Mann-Whitney Vtest) b - PR1-2205 względem kontroli w dniach 14, 19- 3\{Mann-Whitney U test) c - imatinib względem kontroli w dniach 14,21, 24{Mann-Whitney U test) d - GV+PRI-2191 względem kontroli w dniach 12, 14, 19- 31 {Kruskal-Wallis ANOVA oraz MannWhitney U test) e - GV+PRI-2205 względem kontroli w dniach 14, 19- 31 {Kruskal-Wallis ANOVA joraz 12-31 {MannWhitney U test) f- GV+PRI-2191 względem PRI-2191 w dniach 19- 3i{Mann-Whitney U test)

PL 226 174 B1

Fig. IB. Kinetyka wzrostu guzów u myszy obarczonych niedrobnokomórkowym rakiem płuc A549 leczonych imatinibiem (GV) (50mg/kg/dzień) w skojarzeniu z analogami witaminy D : PRJ-2191 iPRI-2205.

* p<0,05 wg testów Kruskal-Wallis ANOYA oraz Marm- Whitney U test.

g _ GV+PRI-2191 względem imatinibu w dniach 12 i 26 (Kruskal-Wallis ANOYA) oraz 12, 19, 24-31 (Mann-Whitney U test) h - GV+PRI-2205 względem imatinibu w dniu 31 (Mann-Whitney U test)

PL 226 174 B1

Fig. 2. Zmiany masy ciała myszy NOD/SCID obarczonych ludzkim niedrobnokomórkowym rakiem płuc A549 podczas leczenia imatinibiem oraz analogami witaminy D: PR 1-2191, PRI-2205.