PL224135B1 - Sposób automatycznego tworzenia dwuwarstw fosfolipidowych i/lub badania aktywności białek błonowych i/lub regulacji stężenia białek błonowych - Google Patents

Description

Przedmiotowy wynalazek dotyczy sposobu automatycznego tworzenia dwuwarstw fosfolipidowych i/lub badania aktywności białek błonowych i/lub regulacji stężenia białek błonowych, prowadzonego w układzie mikroprzepływowym obejmującym pułapkę hydrodynamiczną w postaci komory na płyn, posiadającej pierwszą część i drugą część, korzystnie będące wzajemnie swoimi lustrzanymi odbiciami, z przewężeniem ukształtowanym pomiędzy pierwszą częścią a drugą częścią, przy czym każda z części przeznaczona jest na kroplę płynu.

Sposób według wynalazku umożliwia m.in. automatyczne tworzenie dwuwarstw fosfolipidowych o kontrolowanej wielkości oraz regulację stężenia białek błonowych w takich dwuwarstwach.

Metoda Droplet Interface Bilayers (DIBs) pozwala na otrzymywanie syntetycznych błon komórkowych charakteryzujących się stabilnością i odtwarzalnością - dwuwarstwa formowana jest pomiędzy wodnymi kroplami zanurzonymi w oleju. Możliwe jest wbudowanie białek błonowych w jej strukturę i badania aktywności tych białek. Mikroprzepływy dwufazowe są technologią, która pozwala na prowadzenie badań z użyciem DIBs w sposób automatyczny: wysokoprzepustowy, bardziej powtarzalny i nie wymagający udziału operatora. Do tej pory nie opracowano układu mikroprzepływowego przeznaczonego do badania białek błonowych i pozwalającego na aktywną kontrolę powierzchni dwuwarstwy lipidowej.

Znane jest zastosowanie układów mikroprzepływowych do badań właściwości membran lipidowych i białek błonowych. W niektórych komercyjnie dostępnych systemach pozwalających na zautomatyzowanie badań techniką patch-clamp, wykorzystano kanały mikroprzepływowe do unieruchomienia badanych komórek i podawania odczynników (Chen i Folch, 2006). Tworzenie membran fosfolipidowych w systemach mikroprzepływowych dało również możliwość opracowania sensorów do badania kinetyki wiązania przeciwciał z antygenem, czy badania kinetyki enzymów (Mao i in., 2002; Yang i in., 2001).

Dzięki miniaturyzacji i ścisłej, zautomatyzowanej kontroli przepływów z powodzeniem udało się odtworzyć płaskie dwuwarstwy lipidowe, służące jako modelowa błona do inkorporacji białek błonowych. Sztuczne dwuwarstwy lipidowe w układach mikroprzepływowych charakteryzują się podwyższoną stabilnością i odtwarzalnością w porównaniu do tradycyjnej metody BLM. Do tej pory zaprezentowano kilka metod tworzenia płaskich dwuwarstw w układach mikroprzepływowych, jednak metody te są mało wydajne (Jeon i in., 2008; Ota i in., 2011; Stimberg i in., 2013; Suzuki i in., 2004; Zagnoni i in., 2009a, 2009b).

Możliwość wydajnego tworzenia kropelek i sterowania ich przepływem czynią mikroprzepływy dwufazowe idealnym narzędziem do tworzenia dwuwarstw na styku kropel (Droplet Interface Bilayers). Dodatkowo w układzie mikroprzepływowym zminimalizowany jest czas niezbędny do stabilizacji monowarstw, które są ze sobą złączane. Zmniejszenie czasu wynika ze zwiększonego znaczenia mechanizmu dostarczania lipidów do granicy faz za pomocą adwekcji. W trakcie ruchu kropli w kanale tarcie powoduje konwekcyjny ruch cząsteczek w kropli, przez co stabilna warstwa jest tworzona 3 do 6 rzędów wielkości szybciej (w porównaniu do nieruchomych kropel). Między kroplami w pełni pokrytymi lipidem utworzenie dwuwarstwy zachodzi już w ciągu 50 ms (Thutupalli i in., 2013). Podobnie jak w przypadku ręcznego manipulowania kroplami, dwuwarstwa lipidowa może zostać rozdzielona poprzez oddalenie kropel.

Odmiennie niż w powyższych przykładach tworzenia płaskiej dwuwarstwy, powierzchnia membrany jest determinowana nie tylko przez geometrię układu, ale również przez rozmiar kropel i skład fazy olejowej. Efektywne tworzenie funkcjonalnych dwuwarstw potwierdzano przeprowadzając pomiary wbudowywania się białka - modelowego kanału o scharakteryzowanych właściwościach - głównie α-hemolizyny. W pierwszej pracy zaprezentowano dwa sposoby tworzenia dwuwarstw lipidowych w układach mikroprzepływowych. Pierwszy polegał na pipetowaniu kropel do stykających się, wypełnionych olejem studzienek wyciętych w płytce z tworzywa sztucznego. W drugiej metodzie w płytce wycięto krzyżujące się kanały. Faza wodna była podawana z dwóch stron jednego z kanałów, z kolei drugi wypełniony był olejem.

Przepływ kontrolowany był za pomocą pomp strzykawkowych - poprzez oddalanie i jego regulację możliwe było częściowe kontrolowanie powierzchni dwuwarstwy.

Zaproponowano różne modyfikacje sposobu tworzenia dwuwarstwy pomiędzy kroplami za pomocą technik mikrofluidycznych (Elani i in., 2012; El-Arabi i in., 2012; Funakoshi i in., 2006; Stanley i in., 2010; Thapliyal i in., 2011; Thutupalli i in., 2013; Tsuji i in., 2013). Krokiem w kierunku możliwości

PL 224 135 B1 prowadzenia badań przesiewowych na białkach błonowych był system opracowany przez Tsuji (2013), w którym zmiana składu roztworów została zapewniona przez kanał doprowadzony do jednego ze zbiorników zawierających 7,5 μL krople. W podobnym układzie Lein i in. (2013) używali kapilar aby dostarczyć do kropli odczynniki o zmieniającym się stężeniu. W obu systemach wymiana odczynników odbywała się w przedziale czasowym 5-20 s i nie naruszała stabilności dwuwarstwy.

Jednym z zagadnień dotyczących organizacji i procesów zachodzących w błonach biologicznych jest oddziaływanie między molekułami białka. W celu badania tych zależności in vitro konieczne jest opracowanie metody pozwalającej na otrzymywanie modelowych błon, w których strukturę wbudowana jest duża liczba cząsteczek białka. Do zagęszczania białek w błonie posługiwano się różnymi metodami. Większość sposobów opierała się na wykorzystaniu pola elektrycznego w celu organizacji składników błony, posiadających ładunek elektryczny (Cremer i in., 1999; Groves i Boxer, 1995; Groves i in., 1997a, 1997b; van Oudenaarden i Boxer, 1999; Ulman i in., 1997; Yoshina-lshii i Boxer, 2006).

W 2011 r. Gross i in. użyli połączenia techniki dwuwarstw lipidowych na stałym substracie i techniki Droplet Interface Bilayers w celu uzyskania błony o kontrolowanej powierzchni. Kropla otoczona warstwą lipidu umiejscawiana była na zakończonej agorozowym uchwytem ruchomej elektrodzie, następnie stykana z warstwą fosfolipidu unieruchomioną na hydrożelowym podłożu. Między kroplą a podłożem tworzona była dwuwarstwa lipidowa, w którą wbudowywały się zawarte w kropli cząsteczki białka. Następnie kropla była powoli odciągana od podłoża. Mikroskopowe obserwacje wskazywały na stopniowe zmniejszanie powierzchni dwuwarstwy, natomiast pomiar sygnału przewodnictwa zależnego od ilości kanałów białkowych był stały. Tym sposobem otrzymano 1500-krotny wzrost stężenia białek w dwuwarstwie lipidowej (Gross i in., 2011).

Otrzymywanie dwuwarstw lipidowych, których powierzchnia może być aktywnie kontrolowana, pozwala ponadto na określenie pojemności właściwej dla danego lipidu w zadanych warunkach. Gross i in. (2011) wykorzystali możliwość mikroskopowej obserwacji w celu określenia powierzchni i pomiar prądu pojemnościowego. Dodatkowo zbadali wpływ przykładanego napięcia na wartość pojemności właściwej dla difitanoilofosfatydylocholiny w heksadekanie.

W polskim zgłoszeniu wynalazku nr P.398979 opisano szereg urządzeń mikroprzepływowych, zwanych „pułapkami”, umożliwiających wykonywanie rozmaitych operacji na kroplach, w szczególności takich jak: i) pułapkowanie kropli w ustalonym położeniu, ii) odmierzenie z góry zadanej objętości kropli z większej objętości podanej do kanału, iii) połączenie dwóch lub większej liczby mikrokropli płynących w kanale, iv) zmiany odległości pomiędzy kroplami płynącymi w kanale. Zgłoszenie P.398979 ujawnia szczegóły konstrukcyjne poszczególnych typów pułapek. Osoba biegła znajdzie w tym dokumencie wyczerpujące instrukcje, umożliwiające ich zbudowanie. Zgłoszenie P.398979 zawiera ponadto przykłady układów mikroprzepływowych zawierających takie pułapki. Przykład 9 zgłoszenia P.398979 sugeruje zastosowanie pułapek do badania dwuwarstw lipidowych pomiędzy kroplami, ale nie ujawnia kompletnej struktury odpowiedniego układu mikroprzepływowego.

W innym polskim zgłoszeniu wynalazku nr P.405321 przedstawiono układ mikroprzepływowy, pozwalający na otrzymywanie funkcjonalnych dwuwarstw lipidowych pomiędzy kroplami oraz stanowiący podstawy do stworzenia układu do badań przesiewowych. W układzie tym w którym tworzenie i wymiana kropel odbywa się w automatyczny sposób za pomocą zaworów elektromagnetycznych oraz precyzyjnych pomp strzykawkowych, natomiast prowadzenie szybkich testów aktywności białek błonowych oparte jest na pomiarach elektrofizjologicznych.

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób automatycznego tworzenia dwuwarstw fosfolipidowych i/lub badania aktywności białek błonowych i/lub regulacji stężenia białek błonowych, który to sposób prowadzi się w układzie mikroprzepływowym, posiadającym:

- pułapkę hydrodynamiczną w postaci komory na płyn, płytszej przy ścianach komory i głębszej z dala od ścianek komory, która to komora posiada pierwszą część i drugą część, korzystnie będące wzajemnie swoimi lustrzanymi odbiciami, z przewężeniem ukształtowanym pomiędzy pierwszą częścią a drugą częścią, przy czym każda z części przeznaczona jest na kroplę płynu;

- pierwszy kanał mikroprzepływowy, połączony z pierwszą częścią komory pułapki, przeznaczony do doprowadzania kropel do pierwszej części komory oraz drugi kanał mikroprzepływowy, połączony z drugą częścią komory pułapki, przeznaczony do doprowadzania kropel do drugiej części komory;

PL 224 135 B1

- parę kanałów, przeznaczonych do wyprowadzania kropel z układu, przy czym jeden z kanałów prowadzi do pierwszej części komory pułapki, zaś drugi z kanałów prowadzi do drugiej części komory pułapki;

- dodatkowy kanał mikroprzepływowy do rozdzielania kropel w trakcie ich wymiany w pułapce lub do ich odsuwania, położony poza pułapką, przy czym wyloty dodatkowego kanału mikroprzepływowego znajdują się po przeciwległych stronach pułapki, w miejscu przewężenia między pierwszą częścią komory pułapki a drugą częścią komory pułapki;

- przy czym wyloty dodatkowego kanału mikroprzepływowego znajdujące się w miejscu przewężenia między pierwszą częścią komory pułapki a drugą częścią komory pułapki przebiegają w kierunku normalnym do komory pułapki,

- zaś do pułapki hydrodynamicznej, w której znajdują stykające się krople, dodatkowym kanałem, mikroprzepływowym, którego wyloty umieszczone są równolegle do powierzchni błony na styku kropel, ze stałą prędkością doprowadza się olej rozdzielający krople.

W jednym z korzystnych wariantów realizacji sposobu według wynalazku stosuje się układ mikroprzepływowy, który dodatkowo posiada kanał mikroprzepływowy, tworzący z pierwszym kanałem mikroprzepływowym złącze typu T oraz kanał mikroprzepływowy, tworzący z drugim kanałem mikroprzepływowym złącze typu T. W innym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku stosuje się układ mikroprzepływowy, który dodatkowo posiada parę kanałów, przeznaczonych do umieszczania w nich elektrod, przy czym jeden z kanałów prowadzi do pierwszej części komory pułapki, zaś drugi z kanałów prowadzi do drugiej części komory pułapki. W jeszcze innym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku stosuje się układ mikroprzepływowy, w którym jeden lub obydwa spośród kanałów mikroprzepływowych obejmują odcinek meandrujący. W następnym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku stosuje się układ mikroprzepływowy, w którym przynajmniej jeden z kanałów mikroprzepływowych połączony jest z dodatkowym kanałem mikroprzepływowym do dostarczania płynu, który to dodatkowy kanał mikroprzepływowy tworzy z pierwszym kanałem mikroprzepływowym lub z drugim kanałem mikroprzepływowym złącze typu T. W kolejnym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku stosuje się układ mikroprzepływowy, w którym do kanału mikroprzepływowego, tworzącego z pierwszym kanałem mikroprzepływowym złącze typu T, prowadzą dwa kanały wlotowe, korzystnie tworzące złącze typu T ze sobą. W dalszym korzystnym wariancie realizacji sposobu według wynalazku stosuje się układ mikroprzepływowy, w którym do kanału mikroprzepływowego, tworzącego z drugim kanałem mikroprzepływowym złącze typu T, prowadzą dwa kanały wlotowe, korzystnie tworzące złącze typu T ze sobą.

Korzystny przykład wykonania wynalazku

Wynalazek zostanie teraz bliżej przedstawiony w korzystnym przykładzie wykonania, z odniesieniem do załączonych rysunków, na których:

Fig. 1 przedstawia schemat układu mikroprzepływowego stosowanego w sposobie według wynalazku w widoku z góry; znacznik skali 1 cm;

Fig. 2 przedstawia schemat pułapki, będącej elementem układu stosowanego w sposobie według wynalazku, w której umieszczone są krople (16) i elektrody w kanałach doprowadzających (15);

Fig. 3 przedstawia proces tworzenia dwuwarstwy: a - krople przed utworzeniem dwuwarstwy, b - utworzenie dwuwarstwy widoczne jako zmiana załamania światła na styku dwóch kropel; znacznik skali - 200 μm;

Fig. 4 przedstawia test pojemnościowy - ocena pojemności elektrycznej dwuwarstwy lipidowej w odpowiedzi na przyłożenie potencjału o fali trójkątnej:

a - potencjał o fali trójkątnej (Vm) 50 mV p-p i częstotliwości 10 Hz był zadawany przez generator funkcji;

I - pomiar prądu pojemnościowego przedstawiający fragment, w trakcie którego tworzona była dwuwarstwa lipidowa (stopniowy wzrost sygnału);

b - analogiczny pomiar dla fragmentu odpowiadającego stabilnej dwuwarstwie;

Fig. 5 przedstawia przykładowe pomiary skokowych wzrostów natężenia prądu w trybie voltage-clamp odpowiadający pojedynczych kanałów α-hemolizyny w dwuwarstwę lipidową. Pomiary przy +50 mV, w 1 M KCl, pH 7;

Fig. 6 przedstawia pomiar prądu pojemnościowego w teście pojemnościowym dwuwarstw o różnej wielkości. Różne wielkości otrzymywane są przez podawanie oleju kanałem służącym

PL 224 135 B1 do rozdzielania kropel. Po wyłączeniu przepływu oleju dwuwarstwa wracała do pierwotnego rozmiaru.

Rozdzielanie kropel przepływem: a - 5 nl/s, b -10 nl/s, c -15 nl/s;

Fig. 7 przedstawia mikrofotografie (a) przedstawiające kolejne etapy: krople przed oddalaniem, krople w trakcie oddalania, krople po wyłączeniu oleju rozdzielającego. Pomiar natężenia prądu (b) uzyskano dla wbudowanych kanałów białkowych (ok. 10).

Schemat układu

Przeprowadzono testowanie ok. 30 wersji geometrii układu, wybierając najbardziej optymalną. Na fig. 1 przedstawiono schemat układu mikroprzepływowego, na którym zaznaczone są:

- pułapka hydrodynamiczna, w której unieruchamiane są krople pomiędzy którymi tworzona jest dwuwarstwa lipidowa, w pułapce znajdują się również elektrody chlorosrebrowe, które posłużyły do rejestracji przepływu prądu przez sztuczną membranę;

2, 3 - złącza typu T, w których formowane są krople o objętości ok. 300 nl w następujący sposób: w pierwszym etapie niewielkie objętości wodnych roztworów były wprowadzane ze strzykawek do układu mikroprzepływowego poprzez wloty;

i 5 - roztwór z białkiem o objętości ok. 20 μl wypełnił kanał-rezerwuar oznaczony cyfrą 6, natomiast czysty bufor kanał 7. Z reguły wprowadzano nadmiar cieczy do rezerwuaru, w ten sposób, że wypełniane było złącze typu T - w celu usunięcia nadwyżki buforów, włączany był na kilka sekund przepływ oleju z kanałów 8 i 9, dzięki czemu czoło próbki zdeponowanej w układzie znajdowało się dokładnie na złączeniu obydwu kanałów w złączu T(2, 3). Właściwy proces tworzenia kropli polegał na przemiennym przepływie fazy ciągłej, który był kontrolowany przez zawory. Np. dla kropli z białkiem najpierw wtłaczano określoną objętość (np. 300 nl) oleju w kanale 8, co powodowało niewielkie przesunięcie objętości próbki z rezerwuaru do kanału za złączem typu T(2). Następnie przepływ oleju z kanału 10 powodował oderwanie kropli o takiej samej objętości od czoła próbki i następnie przepływ tej kropli aż do wnętrza pułapki 1. W analogiczny sposób generowano kroplę buforu w złączu 3 za pomocą kontrolowanego przepływu oleju z zaworów 9 i 11;

- kanał do którego wprowadzano sekwencję gotowych kropel zawierających inhibitor poprzez rozszerzenie na wężyk;

- kanał służący odsuwaniu kropel po sformowaniu dwuwarstwy; wyloty tego kanału znajdują się w miejscu przewężenia między pierwszą częścią komory pułapki a drugą częścią komory pułapki i przebiegają w kierunku normalnym do komory pułapki oraz są ukształtowane tak, że w warunkach pracy układu wyloty tego kanału umieszczone są równolegle do powierzchni błony na styku kropel;

- kanały wyprowadzające krople z układu;

- kanały prowadzące z pułapki do wyciętych w układzie otworów, przez które wprowadzane są elektrody.

Szerokość i wysokość większości kanałów wynosi 400 μm (w przekroju poprzecznym mają kształt kwadratowy). Kanały oznaczone jako 12 i 13 były węższe - ich szerokość równała się 200 μm. Fig. 2 przedstawia szczegółowy schemat pułapki z umieszczonymi kroplami (16) i elektrodami umieszczonymi w przeznaczonych dla nich kanałach (15). Zakreskowane obszary odpowiadają tzw. „bypassom” - są to części pułapki, których głębokość stanowi 50 μm (w porównaniu do 400 μm w miejscu, gdzie umiejscowione są krople). Ich rolą jest stabilizowanie położenia kropel w pułapce dzięki nim drobne fluktuacje ruchu oleju nie wywołują ruchu kropel, ponieważ olej omija je, przepływając przez wyróżnione obszary. Dodatkowo, kształt pułapki zapewnia prawidłowe wzajemne pozycjonowanie kropel, zapewniając odpowiednią powierzchnię styku pomiędzy nimi.

Tworzenie stabilnej i funkcjonalnej dwuwarstwy

Po unieruchomieniu kropel wewnątrz pułapki na granicy ich styku tworzyła się stabilna dwuwarstwa (fig. 3). Czas, jaki potrzebny był do jej utworzenia od momentu styku kropel wynosił średnio 52 ± 4 s (n = 10).

Dwuwarstwa lipidowa działa jak kondensator elektryczny ze względu na swoją niewielką grubość (7-8 nm). Przyłożenie napięcia o fali trójkątnej skutkuje ładowaniem i rozładowywaniem się dwuwarstwy i obserwowane jest jako zmiany w natężeniu prądu pojemnościowego (fig. 4). Nieznaczne odchylenia od prostokątnego kształtu sygnału prądu pojemnościowego świadczą o niedoskonałościach w strukturze dwuwarstwy (i ewentualnego wycieku jonów). Amplituda fali prostokątnej jest uzależniona od powierzchni membrany i jest wprost proporcjonalna do pojemności właściwej, która dla ₂ dwuwarstwy utworzonej z lipidu DPhPC uformowanej w heksadekanie, wynosi 0,65 μF/cm . Pochodna po czasie dla pojemności C = q/V (q - ładunek, V - napięcie) daje wzór na chwilowy prąd i = dq/dt = dV/dt x C, dV/dt została skalibrowana jako stała wartość 1 mV/ms na podstawie modelowej

PL 224 135 B1 komórki o znanej pojemności 100 pF (MCB-1U, Molecular Devices, Stany Zjednoczone). Na tej podstawie oszacowano pojemność C jako średnio 197 ± 30 pF (dla 10 par kropel o objętości 275 nl), ₂ co wskazuje na powierzchnię dwuwarstwy równą średnio 30321 ± 4629 μm .

Wbudowywanie cząsteczek białka w strukturę błony

Po wprowadzeniu do pułapki kropli zawierającej białko α-hemolizynę i kropli zawierającej czysty bufor i uformowaniu dwuwarstwy prowadzono pomiary w trybie voltage-clamp. Przykładano napięcie o wartości +50 mV i obserwowano skokowy wzrost natężenia prądu o 50 pA, każdy skok odpowiadał przepływowi jonów przez wbudowujące się kolejno w membranę cząsteczki białka (fig. 5).

Kontrolowana zmiana powierzchni dwuwarstwy

Celem wynalazku było zapewnienie sposobu wykorzystania układu mikroprzepływowego, pozwalającego na otrzymywanie funkcjonalnych dwuwarstw lipidowych pomiędzy kroplami oraz możliwość aktywnej kontroli ich powierzchni.

Aby zrealizować ten cel, w sposobie według wynalazku do pułapki hydrodynamicznej, w której znajdują się stykające się krople, doprowadza się olej kanałem, którego wyloty umieszczone są równolegle do powierzchni błony na styku kropel. Doprowadzanie oleju podawanego z pompy strzykawkowej z zadaną stałą prędkością skutkuje odsuwaniem kropel. Jest ono widoczne zarówno w mikroskopowym obrazie, jak i w spadku amplitudy prądu pojemnościowego. Wielkość prądu pojemnościowego wynika m.in. z wielkości kondensatora, w tym przypadku błony. Pomiary wskazywały na spadek wielkości dwuwarstwy wraz z podniesieniem prędkości przepływu oleju rozdzielającego krople. W trakcie oddalania kropel dla danego przepływu osiągano stałą wielkość dwuwarstwy. Nieznaczne (ok. 10%) zmiany w wielkości wynikały z oscylacji kropel spowodowanej hydrodynamiką układu.

Dyskusja

Dzięki sposobowi według wynalazku można było zastosować układ mikroprzepływowy przeznaczony do badania białek błonowych z uzyskaniem dodatkowych efektów technicznych, w szczególn ości zaś możliwe stało się uzyskanie funkcjonalnych dwuwarstw lipidowych pomiędzy kroplami oraz aktywna kontrola ich powierzchni. Do tej pory dwufazowe układy mikroprzepływowe były używane do tworzenia dwuwarstw lipidowych na styku kropel, ale pozbawione były możliwości generowania kropli z dużą wydajnością i jednoczesnego prowadzenia pomiarów elektrofizjologicznych. W prezentowanym układzie dwuwarstwy fosfolipidowe tworzone są w powtarzalny, zautomatyzowany sposób. Przeprowadzono pomiary działania inhibitorów modelowego białka błonowego - α-hemolizyny - ukazujące potencjalne wykorzystanie przedstawionego systemu w poszukiwaniu nowych cząsteczek oddziałujących z białkami błonowymi. Zaprezentowano kontrolowanie powierzchni otrzymanej dwuwarstwy i wykorzystanie tego do zmian stężenia białek błonowych.

Właściwości układu

Układ został wykonany z poliwęglanu, którego struktura, w przeciwieństwie do innego powszechnie używanego materiału - elastomeru poli(dimetylosiloksanu), jest odporna na pęcznienie w wyniku wnikania oleju, stanowiącego fazę ciągłą. Fosfolipid, dodawany do fazy ciągłej, ma właściwości surfaktantu. W przypadku użycia poliwęglanu zapobiega to zwilżaniu jego powierzchni przez krople wodne. Nie była więc konieczna chemiczna modyfikacja powierzchni kanałów w układzie. Do wykonania układu wykorzystano proste techniki fabrykacji (frezowan ie), bez konieczności użycia skomplikowanych technik litograficznych. Zastosowanie systemu deponowania próbek w kanałachrezerwuarach i precyzyjnej kontroli tworzenia kropel, a następnie manipulację ich przepływem, pozwala na minimalizację zużycia odczynników.

Pomiar pojemności elektrycznej i ocena powierzchni oraz stabilności dwuwarstwy lipidowej

Powierzchnię dwuwarstwy otrzymywanej w układzie między dwiema 275 nl kroplami oceniano 22 na ok. 30770 μm . Jest to wynik zgodny z wartością teoretyczną (31400 μm ), dla której na podstawie mikroskopowej obserwacji za promień przyjęto 100 μm. Jakkolwiek, przeliczenie pojemności elektrycznej na powierzchnię wymagało dokonania pewnych uproszczeń. Ze względu na niedoskonałości istniejące w błonie powodujące „przeciekanie” jonów, mierzony prąd pojemnościowy nigdy nie osiąga wartości teoretycznej dla danego obszaru. Dodatkowo, w obliczeniu powierzchni przyjęto dla pojem₂ ności właściwej wartość 0,65 pF/cm². Jest to wartość dla dwuwarstwy utworzonej z lipidu DPhPC w czystym heksadekanie, natomiast nie znaleziono danych uwzględniających wpływ 25% dodatku oleju silikonowego.

Zmniejszenie rozmiaru tworzonych kropel było ograniczone m.in. minimalną szerokością kanałów (100 μm) możliwych do otrzymania za pomocą frezarki i średnicy elektrod (> 100 μm). Dla mniejPL 224 135 B1 szych kropel dwuwarstwa między nimi jest stabilniejsza i mniej podatna na zakłócenia sygnału w trakcie pomiarów pikoamperowych prądów, jednakże użycie bardzo małych objętości może być kłopotliwe w przypadku gdy zmienia się skład jonowy, a zatem ładunki wewnątrz kropel. Pomimo stosunkowo dużej powierzchni otrzymanej dwuwarstwy, charakteryzowała ją duża stabilność. Została ona zapewniona przez 25% dodatek oleju silikonowego do fazy olejowej i stężenie fosfolipidu równe 1 mg/ml. Utworzone błony były stabilne przez czas minimum 24 godzin i wytrzymywały przyłożone napięcia do 250 mV, co jest wystarczającą wartością dla wykonywania pomiarów przepływu jonów przez pojedyncze kanały białkowe. Również drgania mechaniczne nie wywoływały zlewania się kropel, jedynie zakłócały pomiar prądu. Zastosowania niewielkich przepływów z dwóch ramion dodatkowego kanału, położonych prostopadle do komory, powodowało rozsuwanie się kropel i zmianę powierzchni dwuwarstwy.

Czynnikiem limitującym wydajność układu był czas potrzebny do utworzenia stabilnej dwuwarstwy (ok. 50 s). Elani i in. (2012) oraz Thutupalli i in. (2013) uzyskiwali czas tworzenia dwuwarstwy wielokrotnie niższy, jednak wynik ten oparty był głównie na optycznej obserwacji stykających się ze sobą kropel, niepoparty pomiarami takimi jak np. test pojemnościowy, potwierdzający całkowite uformowanie błony. Dodatkowo na czas utworzenia stabilnej dwuwarstwy może mieć wpływ skład fazy olejowej i stężenie użytego fosfolipidu oraz fakt, że znajdował się on w fazie ciągłej.

Kontrola wielkości dwuwarstwy i koncentracja białek błonowych

Otrzymywanie dwuwarstwy lipidowej o kontrolowanej powierzchni, połączone z mikroskopowymi obserwacjami, pozwala na wyznaczenie wartości pojemności właściwej dla danego fosfolipidu, umieszczonego w fazie olejowej. Opisywany wynalazek może być wykorzystany w takim badaniu, przy założeniu że stykające się krople tworzą błonę o okrągłym kształcie. Pomiary uzyskane z użyciem białka błonowego - α-hemolizyny - wskazują na wzrost stężenia białka w błonie wraz z oddalaniem kropel. Taki sposób manipulowania położeniem białek w błonie jest korzystny w poznawaniu interakcji między cząstkami białka występującymi w błonie.

Bibliografia

Baroud, C.N., Gallaire, F., and Dangla, R. (2010). Dynamics of microfluidic droplets. Lab. Chip 10, 2032-2045.

Chen, C., and Folch, A. (2006). A high-performance elastomeric patch clamp chip. Lab. Chip 6, 1338-1345.

Cremer, P.S., Groves, J.T., Kung, L.A., and Boxer, S.G. (1999). Writing and erasing barriers to lateral mobility into fluid phospholipid bilayers. Langmuir 15, 3893-3896.

Elani, Y., deMello, A.J., Niu, X., and Ces, O. (2012). Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab. Chip 12, 3514-3520.

El-Arabi, A.M., Salazar, C.S., and Schmidt, J.J. (2012). Ion channel drug potency assay with an artificial bilayer chip. Lab. Chip 12, 2409-2413.

Funakoshi, K., Suzuki, H., and Takeuchi, S. (2006). Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Anal. Chem. 78, 8169-8174.

Gross, L.C.M., Heron, A.J., Baca, S.C., and Wallace, M.l. (2011). Determining Membrane Capacitance by Dynamic Control of Droplet Interface Bilayer Area. Langmuir 27, 14335-14342.

Groves, J.T., and Boxer, S.G. (1995). Electric field-induced concentration gradients in planar supported bilayers. Biophys. J. 69, 1972-1975.

Groves, J.T., Ulman, N., and Boxer, S.G. (1997a). Electric field-induced reorganization of proteins and lipids in a fluid bilayer membrane. Biophys. J. 72, MP274-MP274.

Groves, J.T., Ulman, N., and Boxer, S.G. (1997b). Micropatterning fluid lipid bilayers on solid supports. Science 275, 651-653.

Jakiela, S., Makulska, S., Korczyk, P.M., and Garstecki, P. (2011). Speed of flow of individual droplets in microfluidic channels as a function of the capillary number, volume of droplets and contrast of viscosities. Lab. Chip 11, 3603-3608. Jakiela, S., Kaminski, T.S., Cybulski, O., Weibel, D.B., and Garstecki, P. (2013).

Bacterial Growth and Adaptation in Microdroplet Chemostats. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 8908-8911.

PL 224 135 B1

Jeon, T.-J., Poulos, J.L., and Schmidt, J.J. (2008). Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip 8, 1742-1744.

Lein, M., Huang, J., and Holden, M.A. (2013). Robust reagent addition and perfusion strategies for droplet-interface bilayers. Lab. Chip 13, 2749-2753.

Mao, H.B., Yang, T.L., and Cremer, P.S. (2002). Design and characterization of immobilized enzymes in microfluidic systems. Anal. Chem. 74, 379-385.

Ota, S., Suzuki, H., and Takeuchi, S. (2011). Microfluidic lipid membrane formation on microchamber arrays. Lab. Chip 11, 2485-2487.

Van Oudenaarden, A., and Boxer, S.G. (1999). Brownian ratchets: Molecular separations in lipid bilayers supported on patterned arrays. Science 285, 1046-1048.

Stanley, C.E., Elvira, K.S., Niu, X.Z., Gee, A.D., Ces, O., Edel, J.B., and deMello, A.J. (2010). A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chem. Commun. 46, 1620-1622.

Stimberg, V.C., Borner, J.G., van Uitert, I., van den Berg, A., and Le Gac, S. (2013).

High Yield, Reproducible and Quasi-Automated Bilayer Formation in a Microfluidic Format. Small 9, 1076-1085.

Suzuki, H., Tabata, K., Kato-Yamada, Y., Noji, H., and Takeuchi, S. (2004). Planar lipid bilayer reconstitution with a micro-fluidic system. Lab. Chip 4, 502-505.

Thapliyal, T, Poulos, J.L., and Schmidt, J.J. (2011). Automated lipid bilayer and ion channel measurement platform. Biosens. Bioelectron. 26, 2651-2654.

Thutupalli, S., Fleury, J.-B,, Steinberger, A., Herminghaus, S., and Seemann, R. (2013). Why can artificial membranes be fabricated so rapidly in microfluidics? Chem. Commun. 49, 1443-1445.

Tsuji, Y., Kawano, R., Osaki, T, Kamiya, K., Miki, N., and Takeuchi, S. (2013). Droplet-based lipid bilayer system integrated with microfluidic channels for solution exchange. Lab. Chip 13, 476-1481.

Ulman, N., Groves, J.T., and Boxer, S.G. (1997), Microlithographic patterning of fluid bilayer membranes. Biophys. J. 72, MP444-MP444.

Yang, T.L, Jung, S.Y., Mao, H.B., and Cremer, P.S. (2001), Fabrication of phospholipid bilayercoated microchannels for on-chip immunoassays, Anai, Chem. 73, 165-169,

Yoshina-lshii, C., and Boxer, S.G. (2006), Controlling two-dimensional tethered vesicle motion using an electric field: Interplay of electrophoresis and electro-osmosis. Langmuir 22, 2384-2391.

Zagnoni, M., Sandison, M.E., and Morgan, H, (2009a). Microfluidic array platform for simultaneous lipid bilayer membrane formation. Biosens. Bioelectron. 24, 1235-1240.

Zagnoni, M., Sandison, M.E., Marius, P., and Morgan, H. (2009b). Bilayer lipid membranes from falling droplets. Anal. Bioanal. Chem. 393, 1601-1605.

Claims (7)

1. Sposób automatycznego tworzenia dwuwarstw fosfolipidowych i/lub badania aktywności białek błonowych i/lub regulacji stężenia białek błonowych, znamienny tym, że prowadzi się go w układzie mikroprzepływowym, posiadającym:

- pułapkę hydrodynamiczną w postaci komory na płyn, płytszej przy ścianach komory i głębszej z dala od ścianek komory, która to komora posiada pierwszą część i drugą część, korzystnie będące wzajemnie swoimi lustrzanymi odbiciami, z przewężeniem ukształtowanym pomiędzy pierwszą częścią a drugą częścią, przy czym każda z części przeznaczona jest na kroplę płynu;

- pierwszy kanał mikroprzepływowy, połączony z pierwszą częścią komory pułapki, przeznaczony do doprowadzania kropel do pierwszej części komory oraz drugi kanał mikroprzepływowy, połączony z drugą częścią komory pułapki, przeznaczony do doprowadzania kropel do drugiej części komory;

- parę kanałów, przeznaczonych do wyprowadzania kropel z układu, przy czym jeden z kanałów prowadzi do pierwszej części komory pułapki, zaś drugi z kanałów prowadzi do drugiej części komory pułapki;

- dodatkowy kanał mikroprzepływowy do rozdzielania kropel w trakcie ich wymiany w pułapce lub do ich odsuwania, położony poza pułapką, przy czym wyloty dodatkowego kanału mikroprzepływowego znajdują się po przeciwległych stronach pułapki, w miejscu przewężenia między pierwszą częścią komory pułapki a drugą częścią komory pułapki;

PL 224 135 B1

- przy czym wyloty dodatkowego kanału mikroprzepływowego (13) znajdujące się w miejscu przewężenia między pierwszą częścią komory pułapki (1) a drugą częścią komory pułapki (1) przebiegają w kierunku normalnym do komory pułapki (1),

- zaś do pułapki hydrodynamicznej, w której znajdują stykające się krople, dodatkowym kanałem mikroprzepływowym (13), którego wyloty umieszczone są równolegle do powierzchni błony na styku kropel, ze stałą prędkością doprowadza się olej rozdzielający krople.

2. Sposób według zastrzeżenia 1, znamienny tym, że stosuje się układ mikroprzepływowy, który dodatkowo posiada kanał mikroprzepływowy (6), tworzący z pierwszym kanałem mikroprzepływowym (10) złącze typu T(2) oraz kanał mikroprzepływowy (7), tworzący z drugim kanałem mikroprzepływowym (11) złącze typu T(3).

3. Sposób według zastrzeżenia 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się układ mikroprzepływowy, który dodatkowo posiada parę kanałów (15), przeznaczonych do umieszczania w nich elektrod, przy czym jeden z kanałów (15) prowadzi do pierwszej części komory pułapki (1), zaś drugi z kanałów (15) prowadzi do drugiej części komory pułapki (1).

4. Sposób według jednego z zastrzeżeń od 1 do 3, znamienny tym, że stosuje się układ mikroprzepływowy, w którym jeden lub obydwa spośród kanałów mikroprzepływowych (6), (7) obejmują odcinek meandrujący,

5. Sposób według jednego z zastrzeżeń od 1 do 4, znamienny tym, że stosuje się układ mikroprzepływowy, w którym przynajmniej jeden z kanałów mikroprzepływowych (10), (11) połączony jest z dodatkowym kanałem mikroprzepływowym (12) do dostarczania płynu, który to dodatkowy kanał mikroprzepływowy (12) tworzy z pierwszym kanałem mikroprzepływowym (10) lub z drugim kanałem mikroprzepływowym (11) złącze typu T.

6. Sposób według jednego z zastrzeżeń od 1 do 5, znamienny tym, że stosuje się układ mikroprzepływowy, w którym do kanału mikroprzepływowego (6), tworzącego z pierwszym kanałem mikroprzepływowym złącze typu T, prowadzą dwa kanały wlotowe (4), (8), korzystnie tworzące złącze typu T ze sobą.

7. Sposób według jednego z zastrzeżeń od 1 do 6, znamienny tym, że stosuje się układ mikroprzepływowy, w którym do kanału mikroprzepływowego (7), tworzącego z drugim kanałem mikroprzepływowym złącze typu T, prowadzą dwa kanały wlotowe (5), (9), korzystnie tworzące złącze typu T ze sobą.