PL223410B1 - Mikroprzepływowy układ zwłaszcza do automatycznego tworzenia dwuwarstw fosfolipidowych i badania aktywności białek błonowych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest układ mikroprzepływowy. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy układu mikroprzepływowego, obejmującego pułapkę hydrodynamiczną. Układ znajduje zastosowanie zwłaszcza do automatycznego tworzenia dwuwarstw fosfolipidowych i badania aktywności białek błonowych.

Metoda Droplet Interface Bilayers (DIBs) pozwala na otrzymywanie syntetycznych błon komórkowych charakteryzujących się stabilnością i odtwarzalnością - dwuwarstwa formowana jest pomiędzy wodnymi kroplami zanurzonymi w oleju. Jednym z potencjalnych zastosowań tej techniki jest możliwość opracowania układów do prowadzenia przesiewowego badania związków chemicznych wyk azujących aktywność wobec białek błonowych. Mikroprzepływy dwufazowe są technologią, która pozwala na prowadzenie tych badań w sposób automatyczny: wysokoprzepustow y, bardziej powtarzalny i nie wymagający udziału operatora. W stanie wiedzy nie istnieją jednak do tej pory układy umożliwiające prowadzenie zautomatyzowanych badań na białkach membranowych.

Znane jest zastosowanie układów mikroprzepływowych do badań właściwości membran lipidowych i białek błonowych. W niektórych komercyjnie dostępnych systemach pozwalających na zautomatyzowanie badań techniką patch-clamp, wykorzystano kanały mikroprzepływowe do unieruchomienia badanych komórek i podawania odczynników (Chen and Folch, 2006). Tworzenie membran fosfolipidowych w systemach mikroprzepływowych dało również możliwość opracowania sensorów do badania kinetyki wiązania przeciwciał z antygenem czy badania kinetyki enzymów (Mao et al., 2002; Yang et al., 2001).

Dzięki miniaturyzacji i ścisłej, zautomatyzowanej kontroli przepływów z powodzeniem udało się odtworzyć płaskie dwuwarstwy lipidowe, służące jako modelowa błona do inkorporacji białek błonowych. Sztuczne dwuwarstwy lipidowe w układach mikroprzepływowych charakteryzują się podwyższoną stabilnością i odtwarzalnością w porównaniu do tradycyjnej metody BLM. Do tej pory zaprezentowano kilka metod tworzenia płaskich dwuwarstw w układach mikroprzepływowych, jednak metody te są mało wydajne (Jeon et al., 2008; Ota et al., 2011; Stimberg et al., 2013; Suzuki et al., 2004; Zagnoni et al., 2009a, 2009b).

Możliwość wydajnego tworzenia kropelek i sterowania ich przepływem czynią mikroprzepływy dwufazowe idealnym narzędziem do tworzenia dwuwarstw na styku kropel (Droplet Interface Bilayers). Dodatkowo w układzie mikroprzepływowym zminimalizowany jest czas niezbędny do stabilizacji m onowarstw, które są ze sobą złączane. Zmniejszenie czasu wynika ze zwiększonego znaczenia m echanizmu dostarczania lipidów do granicy faz za pomocą adwekcji. W trakcie ruchu kropli w kanale tarcie powoduje konwekcyjny ruch cząsteczek w kropli, przez co stabilna warstwa jest tworzona 3 do 6 rzędów wielkości szybciej (w porównaniu do nieruchomych kropel). Między kroplami w pełni pokrytymi lipidem utworzenie dwuwarstwy zachodzi już w ciągu 50 ms (Thutupalli et al., 2013). Podobnie jak w przypadku ręcznego manipulowania kroplami, dwuwarstwa lipidowa może zostać rozdzielona poprzez oddalenie kropel.

Odmiennie niż w w.w. przykładach tworzenia płaskiej dwuwarstwy, powierzchnia membrany jest determinowana nie tylko przez geometrię układu, ale również przez rozmiar kropel i skład fazy olejowej. Efektywne tworzenie funkcjonalnych dwuwarstw potwierdzano przeprowadzając pomiary wbudowywania się białka - modelowego kanału o scharakteryzowanych właściwościach - głównie α-hemolizyny. W pierwszej pracy zaprezentowano dwa sposoby tworzenia dwuwarstw lipidowych w układach mikroprzepływowych. Pierwszy polegał na pipetowaniu kropel do stykających się, wypełnionych olejem studzienek wyciętych w płytce z tworzywa sztucznego. W drugiej metodzie w płytce wycięto krzyżujące się kanały. Faza wodna była podawana z dwóch stron jednego z kanałów, z kolei drugi wypełniony był olejem. Przepływ kontrolowany był za jako pomocą pomp strzykawkowych - poprzez oddalanie jako regulację możliwe było częściowe kontrolowanie powierzchni dwuwarstwy.

Zaproponowano różne modyfikacje sposobu tworzenia dwuwarstwy pomiędzy kroplami za pomocą technik mikrofluidycznych (Elani et al., 2012; El-Arabi et al., 2012; Funakoshi et al., 2006; Stanley et al., 2010; Thapliyal et al., 2011; Thutupalli et al., 2013; Tsuji et al., 2013). Krokiem w kierunku możliwości prowadzenia badań przesiewowych na białkach błonowych był system opracowany przez Tsuji (Tsuji et al., 2013), w którym zmiana składu roztworów została zapewniona przez kanał doprowadzony do jednego ze zbiorników zawierających 7,5 gL krople. W podobnym układzie Lein i wsp. (Lein et al., 2013) używali kapilar aby dostarczyć do kropli odczynniki o zmieniającym się stężeniu.

PL 223 410 B1

W obu systemach wymiana odczynników odbywała się w przedziale czasowym 5-20 s i nie naruszała stabilności dwuwarstwy.

W żadnym z wyżej opisanych systemów nie opracowano wysoko wydajnego zautomatyzowanego tworzenia dwuwarstw lipidowych. W badaniach, w których uzyskiwano membrany z wysoką wydajnością (0,9 Hz) pomiędzy kroplami o małej objętości (5 nl), nie przedstawiono ich elektrofizjologic znej charakterystyki, jedynie obserwowano zawarte w kroplach fluorescencyjne barwniki (Elani et al., 2012). Stanowi to ograniczenie, uniemożliwiające przesiewowe badanie białek błonowych.

W polskim zgłoszeniu wynalazku nr P-398979 opisano szereg urządzeń mikroprzepływowych, zwanych „pułapkami”, umożliwiających wykonywanie rozmaitych operacji na kroplach, w szczególności takich jak: i) pułapkowanie kropli w ustalonym położeniu, ii) odmierzenie z góry zadanej objętości kropli z większej objętości podanej do kanału, iii) połączenie dwóch lub większej liczby mikrokropli płynących w kanale, iv) zmiany odległości pomiędzy kroplami płynącymi w kanale. Zgłoszenie P-398979 ujawnia szczegóły konstrukcyjne poszczególnych typów pułapek. Osoba biegła znajdzie w tym dokumencie wyczerpujące instrukcje, umożliwiające ich zbudowanie. Zgłoszenie P-398979 zawiera ponadto przykłady układów mikroprzepływowych zawierających takie pułapki. Przykład 9 zgłoszenia P-398979 sugeruje zastosowanie pułapek do badania dwuwarstw lipidowych pomiędzy kroplami, ale nie ujawnia kompletnej struktury odpowiedniego układu mikroprzepływowego.

Dlatego też celem wynalazku jest zaproponowanie układu mikroprzepływowego, który pozwoliłby na otrzymywanie funkcjonalnych dwuwarstw lipidowych pomiędzy kroplami oraz opracowanie podstaw do stworzenia układu do badań przesiewowych.

Do spełnienia tego celu konieczna jest realizacja poszczególnych etapów:

• zaprojektowanie i wykonanie układu mikroprzepływowego, • opracowanie parametrów jego funkcjonowania, • ocena stabilności i funkcjonalności otrzymywanych dwuwarstw lipidowych, • przeprowadzenie serii pomiarów aktywności wybranego odczynnika na aktywność a-hemolizyny w opracowanym układzie.

W ramach przeprowadzonych prac zaprojektowano oraz zoptymalizowano geometrię układu mikrofluidycznego, w którym tworzenie i wymiana kropel odbywa się w automatyczny sposób za p omocą zaworów elektromagnetycznych oraz precyzyjnych pomp strzykawkowych, natomiast prowadzenie szybkich testów aktywności białek błonowych oparte jest na pomiarach elektrofizjologicznych.

Mikroprzepływowy układ, zwłaszcza do automatycznego tworzenia dwuwarstw fosfolipidowych i badania aktywności białek błonowych, obejmujący pułapkę hydrodynamiczną w postaci komory na płyn, płytszej przy ścianach komory i głębszej z dala od ścianek komory, która to komora posiada pierwszą część i drugą część, korzystnie będące wzajemnie swoimi lustrzanymi odbiciami, z przewężeniem ukształtowanym pomiędzy pierwszą częścią a drugą częścią, przy czym każda z części przeznaczona jest na kroplę płynu, zgodnie z wynalazkiem charakteryzuje się tym, że ponadto posiada:

a) pierwszy kanał mikroprzepływowy, połączony z pierwszą częścią komory pułapki, przeznaczony do doprowadzania kropel do pierwszej części komory oraz drugi kanał mikroprzepływowy, połączony z drugą częścią komory pułapki, przeznaczony do doprowadzania kropel do drugiej części komory,

b) parę kanałów, przeznaczonych do wyprowadzania kropel z układu, przy czym jeden z kanałów prowadzi do pierwszej części komory pułapki, zaś drugi z kanałów prowadzi do drugiej części komory pułapki.

Korzystnie, mikroprzepływowy układ według wynalazku posiada dodatkowo

c) kanał mikroprzepływowy, tworzący z pierwszym kanałem mikroprzepływowym złącze typu T oraz kanał mikroprzepływowy, tworzący z drugim kanałem mikroprzepływowym złącze typu T.

Korzystnie, mikroprzepływowy układ według wynalazku posiada dodatkowo

d) parę kanałów, przeznaczonych do umieszczania w nich elektrod, przy czym jeden z kanałów prowadzi do pierwszej części komory pułapki, zaś drugi z kanałów prowadzi do drugiej części komory pułapki.

Korzystnie, jeden lub obydwa spośród kanałów mikroprzepływowych tworzących z pierwszym kanałem mikroprzepływowym lub z drugim kanałem mikroprzepływowym złącze typu T, obejmują odcinek meandrujący.

Korzystnie, przynajmniej jeden spośród pierwszego i drugiego kanału mikroprzepływowego połączony jest z dodatkowym kanałem mikroprzepływowym do dostarczania płynu, który to dodatkowy

PL 223 410 B1 kanał mikroprzepływowy tworzy z pierwszym kanałem mikroprzepływowym lub z drugim kanałem m ikroprzepływowym złącze typu T.

Korzystnie, mikroprzepływowy układ według wynalazku posiada dodatkowy kanał mikroprzepływowy, służący do rozdzielania kropel w trakcie ich wymiany w pułapce, prowadzący z jednej strony pułapki do przeciwległej strony pułapki i położony poza pułapką, przy czym wlot i wylot dodatkowego kanału mikroprzepływowego znajdują się w miejscu przewężenia między pierwszą częścią komory pułapki a drugą częścią komory pułapki.

Korzystnie, do kanału mikroprzepływowego, tworzącego z pierwszym kanałem mikroprzepływowym złącze typu T, prowadzą dwa kanały wlotowe, korzystnie tworzące złącze typu T ze sobą.

Korzystnie, do kanału mikroprzepływowego, tworzącego z drugim kanałem mikroprzepływowym złącze typu T, prowadzą dwa kanały wlotowe, korzystnie tworzące złącze typu T ze sobą.

Korzystny przykład wykonania wynalazku

Wynalazek zostanie teraz bliżej przedstawiony w korzystnym przykładzie wykonania, z odniesieniem do załączonych rysunków, na których:

Fig. 1 przedstawia schemat układu mikroprzepływowego według wynalazku w widoku z góry; znacznik skali 1 cm;

Fig. 2 przedstawia schemat pułapki, będącej elementem układu według wynalazku, w której umieszczone są krople (16) i elektrody w kanałach doprowadzających (15);

Fig. 3 przedstawia proces tworzenia dwuwarstwy: a - krople przed utworzeniem dwuwarstwy, b - utworzenie dwuwarstwy widoczne jako zmiana załamania światła na styku dwóch kropel; znacznik skali - 200 pm;

Fig. 4 przedstawia test pojemnościowy - ocena pojemności elektrycznej dwuwarstwy lipidowej w odpowiedzi na przyłożenie potencjału o fali trójkątnej: a - potencjał o fali trójkątnej (V_m) 50 mV p-p i częstotliwości 10 Hz był zadawany przez generator funkcji; I - pomiar prądu pojemnościowego przedstawiający fragment, w trakcie którego tworzona była dwuwarstwa lipidowa (stopniowy wzrost sygnału); b - analogiczny pomiar dla fragmentu odpowiadającego stabilnej dwuwarstwie;

Fig. 5 przedstawia przykładowe pomiary skokowych wzrostów natężenia prądu w trybie voltage-clamp odpowiadający pojedynczych kanałów α-hemolizyny w dwuwarstwę lipidową. Pomiary przy +50 mV, w 1 M KCl, pH 7;

Fig. 6 przedstawia przykładowe pomiary przepływu prądu ukazujące przejściowe zamknięcia kanału białkowego przez cukrowe cząsteczki: a - 60% zablokowanie kanału przez cząsteczkę γ - cyklodekstryny; b - 100% zablokowanie przez cząsteczkę TRIMEB zaś

Fig. 7 przedstawia wykres ilustrujący wyniki pomiaru przepływu prądu przedstawiający brak trwałej kontaminacji elektrody przez inhibitor: a - przejściowe blokowanie kanału α-hemolizyny przez 50 pM γ-cyklodekstrynę; b - zastąpienie kropli z inhibitorem kroplą z buforem (1 M KCI, 10 mM Tris, pH 7). Czerwone strzałki wskazują na pojedyncze zablokowania białka, świadczące o pozostaniu małej ilości inhibitora na elektrodzie; c - wymiana kropli z buforem kolejną kroplą z buforem. Brak obserwacji blokowania kanału.

Schemat układu

Przeprowadzono testowanie ok. 30 wersji geometrii układu, wybierając najbardziej optymalną. Na fig. 1 przedstawiono schemat układu mikroprzepływowego, na którym zaznaczone są:

• 1 - pułapka hydrodynamiczna, w której unieruchamiane są krople pomiędzy którymi tworzona jest dwuwarstwa lipidowa, w pułapce znajdują się również elektrody chlorosrebrowe, które posłużyły do rejestracji przepływu prądu przez sztuczną membranę;

• 2, 3 - złącza typu T, w których formowane są krople o objętości ok. 300 nl w następujący sposób: w pierwszym etapie niewielkie objętości wodnych roztworów były wprowadzane ze strzykawek do układu mikroprzepływowego poprzez wloty;

• 4 i 5 - roztwór z białkiem o objętości ok. 20 pl wypełnił kanał-rezerwuar oznaczony cyfrą 6, natomiast czysty bufor kanał 7. Z reguły wprowadzano nadmiar cieczy do rezerwuaru, w ten sposób, że wypełniane było złącze typu T - w celu usunięcia nadwyżki buforów, włączany był na kilka sekund przepływ oleju z kanałów 8 i 9, dzięki czemu czoło próbki zdeponowanej w układzie znajdowało się dokładnie na złączeniu obydwu kanałów w złączu T (2, 3). WłaPL 223 410 B1 ściwy proces tworzenia kropli polegał na przemiennym przepływie fazy ciągłej, który był kontrolowany przez zawory. Np. dla kropli z białkiem najpierw wtłaczano określoną objętość (np. 300 nl) oleju w kanale 8 co powodowało niewielkie przesunięcie objętości próbki z rezerwuaru do kanału za złączem typu T (2). Następnie przepływ oleju z kanału 10 powodował oderwanie kropli o takiej samej objętości od czoła próbki i następnie przepływ tej kropli aż do wnętrza pułapki 1. W analogiczny sposób generowano kroplę buforu w złączu 3 za pomocą kontrolowanego przepływu oleju z zaworów 9 i 11;

• 12 - kanał do którego wprowadzano sekwencję gotowych kropel zawierających inhibitor poprzez rozszerzenie na wężyk;

• 13 - kanał służący rozdzielaniu kropel w trakcie ich wymiany;

• 14 - kanały wyprowadzające krople z układu;

• 15 - kanały prowadzące z pułapki do wyciętych w układzie otworów, przez które wprowadzane są elektrody.

Szerokość i wysokość większości kanałów wynosi 400 pm (w przekroju poprzecznym mają kształt kwadratowy). Kanały oznaczone jako 12 i 13 były węższe - ich szerokość równała się 200 pm. Fig. 2 przedstawia szczegółowy schemat pułapki z umieszczonymi kroplami (16) i elektrodami umieszczonymi w przeznaczonych dla nich kanałach (15). Zakreskowane obszary odpowiadają tzw. 'bypassom' - są to części pułapki, których głębokość stanowi 50 pm (w porównaniu do 400 pm w miejscu, gdzie umiejscowione są krople). Ich rolą jest stabilizowanie położenia kropel w pułapce dzięki nim drobne fluktuacje ruchu oleju nie wywołują ruchu kropel, ponieważ olej omija je, przepływ ając przez wyróżnione obszary. Dodatkowo, kształt pułapki zapewnia prawidłowe wzajemne pozycjonowanie kropel, zapewniając odpowiednią powierzchnię styku pomiędzy nimi.

Tworzenie stabilnej i funkcjonalnej dwuwarstwy

Po unieruchomieniu kropel wewnątrz pułapki na granicy ich styku tworzyła się stabilna dwuwarstwa (fig. 3). Czas, jaki potrzebny był do jej utworzenia od momentu styku kropel wynosił średnio 52 ± 4 s (n = 10).

Dwuwarstwa lipidowa działa jak kondensator elektryczny ze względu na swoją niewielką grubość (7-8 nm). Przyłożenie napięcia o fali trójkątnej skutkuje ładowaniem i rozładowywaniem się dwuwarstwy i obserwowane jest jako zmiany w natężeniu prądu pojemnościowego (fig. 4). Nieznac zne odchylenia od prostokątnego kształtu sygnału prądu pojemnościowego świadczą o niedoskonałościach w strukturze dwuwarstwy (i ewentualnemu wycieku jonów). Amplituda fali prostokątnej jest uzależniona od powierzchni membrany i jest wprost proporcjonalna do pojemności właściwej, która dla dwuwarstwy utworzonej z lipidu DPhPC uformowanej w heksadekanie, wynosi 0,65 pF/cm . Pochodna po czasie dla pojemności C = q/V (q - ładunek, V - napięcie) daje wzór na chwilowy prąd i = dq/dt = dV/dtxC. dV/dt została skalibrowana jako stała wartość 1 mV/ms na podstawie modelowej komórki o znanej pojemności 100 pF (MCB-1U, Molecular Devices, Stany Zjednoczone). Na tej podstawie oszacowano pojemność C jako średnio 197 ± 30 pF (dla 10 par kropel o objętości 275 nl), co ₂ wskazuje na powierzchnię dwuwarstwy równą średnio 30321 ± 4629 pm .

Wbudowywanie cząsteczek białka w strukturę błony

Po wprowadzeniu do pułapki kropli zawierającej białko α-hemolizynę i kropli zawierającej czysty bufor i uformowaniu dwuwarstwy prowadzono pomiary w trybie voltage-clamp. Przykładano napięcie o wartości +50 mV i obserwowano skokowy wzrost natężenia prądu o 50 pA, każdy skok odpowiadał przepływowi jonów przez wbudowujące się kolejno w membranę cząsteczki białka (fig. 5).

Cyklodekstryny - cykliczne cukry z grupy dekstryn - przejściowo przyłączają się do cząsteczki α-hemolizyny, powodując zablokowanie przepływu jonów przez kanał w błonie. Zetknięcie kropli zawierającej α-hemolizynę z kroplą w której znajdowała się γ-cyklodekstryna skutkowało procesem blokowania, widocznym jako ~60% spadek sygnału. Natomiast TRIMEB (trimetylo-3-cyklodekstryna) powoduje przejściowe, 100% zablokowanie przepływu jonów przez kanał.

W celu oceny stopnia pozostawania inhibitorów na elektrodzie (np. wnikania w agarozową powłokę) wykonano następujący eksperyment. Utworzono dwuwarstwę między kroplą zawierającą białko a kroplą, w której umieszczono 50 μΜ roztwór γ-cyklodekstryny. Przez okres 10 minut obserwowano odwracalne, 60% blokowania przepływu jonów przez kanały białkowe. Po wypłukaniu kropli zawierającej inhibitor w jej miejscu umieszczono kroplę z czystym buforem. Występowały pojedyncze bloko6

PL 223 410 B1 wania, których nie obserwowano po wprowadzeniu kolejnej kropli z buforem. Wynik zobrazowany jest na fig. 6.

Generowanie sekwencji inhibitorów

Sekwencja kropel zawierająca inhibitor a-hemolizyny (γ-cyklodestryna) w 3 różnych stężeniach (5, 10 i 50 pM) została wygenerowana za pomocą pompy strzykawkowej i robotycznego systemu pozycjonującego. Pompa strzykawkowa służyła zaciąganiu zadanych objętości z płytki 96-dołkowej do wężyka za pomocą systemu pozycjonującego (Kaminski i wsp., 2012). Pobierano ciąg kropel o następującej kompozycji: 1 pM γ-cyklodestryna, 5 pM γ-cyklodestryna, 50 pM γ-cyklodestryna. Dodatkowo, krople z inhibitorem były rozdzielone kroplami zawierającymi bufor służący do płukania elektrod. Objętość kropel wynosiła 300 nl, natomiast między nimi znajdowała się faza olejowa o objętości 700 nl. Następnie otrzymaną sekwencję wprowadzono do układu, umieszczając wężyk z kroplami w teflonowej rurce, która z kolei łączyła się z siecią kanałów w układzie mikroprzepływowym. Sekwencję kropel wtłoczono do układu uruchamiając przepływ z pompy strzykawkowej z prędkością 200 nl/s.

Testowanie ciągu inhibitorów na a-hemolizynie

Testowanie aktywności inhibitorów przeprowadzono według następującego protokołu. W pierwszej kolejności wygenerowano kroplę zawierającą białko i unieruchomiono ją w pułapce na jednej z elektrod. Następnie wprowadzano kolejne krople zawierające inhibitor. Po uformowaniu dwuwarstwy dla każdej pary kropel mierzono przepływ jonów i jego blokowanie przykładając +50 mV przez 3 minuty. Testowanie γ-cyklodekstryny w 3 stężeniach zajęło <15 min. Na fig. 7 przedstawione są fragmenty pomiarów elektrofizjologicznych ukazujące częstość blokowania dla poszczególnych stężeń inhibitora. Na histogramach poniżej przedstawione są zliczenia wartości zmierzonego prądu dla 40 s odcinków czasowych. Wartości ok. 50 pA wskazują na otwarty kanał, natomiast niższe wartości odpowiadają zablokowaniom wywołanym przez cząsteczki inhibitora. Dla najwyższego stężenia widoczne są całkowite zablokowania kanału.

W obecnym wynalazku zrealizowano cel, jakim było opracowanie układu mikroprzepływowego przeznaczonego do badania białek błonowych. Do tej pory dwufazowe układy mikroprzepływowe były używane do tworzenia dwuwarstw lipidowych na styku kropel, ale pozbawione były możliwości generowania kropli z dużą wydajnością i jednoczesnego prowadzenia pomiarów elektrofizjologicznych. W prezentowanym układzie dwuwarstwy fosfolipidowe tworzone są w powtarzalny, zautomatyzowany sposób. Przeprowadzono pomiary działania inhibitorów modelowego białka błonowego - a-hemolizyny ukazujące potencjalne wykorzystanie przedstawionego systemu w poszukiwaniu nowych cząsteczek oddziałujących z białkami błonowymi.

Właściwości układu

Układ został wykonany z poliwęglanu, którego struktura, w przeciwieństwie do innego powszechnie używanego materiału - elastomeru poli(dimetylosiloksanu), jest odporna na pęcznienie w wyniku wnikania oleju, stanowiącego fazę ciągłą. Fosfolipid, dodawany do fazy ciągłej, ma właściwości surfaktantu. W przypadku użycia poliwęglanu zapobiega to zwilżaniu jego powierzchni przez krople wodne. Nie była więc konieczna chemiczna modyfikacja powierzchni kanałów w układzie. Do wykonania układu wykorzystano proste techniki fabrykacji (frezowanie), bez konieczności użycia skomplikowanych technik litograficznych. Zastosowanie systemu deponowania próbek w kanałachrezerwuarach i precyzyjnej kontroli tworzenia kropel, a następnie manipulację ich przepływem, pozwala na minimalizację zużycia odczynników.

Pomiar pojemności elektrycznej i ocena powierzchni oraz stabilności dwuwarstwy lipidowej

Powierzchnię dwuwarstwy otrzymywanej w układzie między dwiema 275 nl kroplami oceniano na ok. 30770 pm . Jest to wynik zgodny z wartością teoretyczną (31400 pm ), dla której na podstawie mikroskopowej obserwacji za promień przyjęto 100 pm. Jakkolwiek, przeliczenie pojemności elektrycznej na powierzchnię wymagało dokonania pewnych uproszczeń. Ze względu na niedoskonałości istniejące w błonie powodujące „przeciekanie jonów, mierzony prąd pojemnościowy nigdy nie osiąga wartości teoretycznej dla danego obszaru. Dodatkowo, w obliczeniu powierzchni przyjęto dla pojem₂ ności właściwej wartość 0,65 pF/cm . Jest to wartość dla dwuwarstwy utworzonej z lipidu DPhPC w czystym heksadekanie, natomiast nie znaleziono danych uwzględniających wpływ 25% dodatku oleju silikonowego.

PL 223 410 B1

Zmniejszenie rozmiaru tworzonych kropel było ograniczone m.in. minimalną szerokością kanałów (100 pm) możliwych do otrzymania za pomocą frezarki i średnicy elektrod (> 100 pm). Dla mniejszych kropel dwuwarstwa między nimi jest stabilniejsza i mniej podatna na zakłócenia sygnału w trakcie pomiarów pikoamperowych prądów, jednakże użycie bardzo małych objętości może być kłopotliwe w przypadku gdy zmienia się skład jonowy, a zatem ładunki wewnątrz kropel. Pomimo stosunkowo dużej powierzchni otrzymanej dwuwarstwy, charakteryzowała ją duża stabilność. Została ona zape wniona przez 25% dodatek oleju silikonowego do fazy olejowej i stężenie fosfolipidu równe 1 mg/ml. Utworzone błony były stabilne przez czas minimum 24 godzin i wytrzymywały przyłożone napięcia do 250 mV, co jest wystarczającą wartością dla wykonywania pomiarów przepływu jonów przez pojedyncze kanały białkowe. Również drgania mechaniczne nie wywoływały zlewania się kropel, jedynie zakłócały pomiar prądu.

Czynnikiem limitującym wydajność układu był czas potrzebny do utworzenia stabilnej dwuwarstwy (ok. 50 s). Elani i wsp. (2012) oraz Thutupalli i wsp. (2013) uzyskiwali czas tworzenia dwuwarstwy wielokrotnie niższy, jednak wynik ten oparty był głównie na optycznej obserwacji stykających się ze sobą kropel, niepoparty pomiarami takimi jak np. test pojemnościowy, potwierdzający całkowite uformowanie błony. Dodatkowo na czas utworzenia stabilnej dwuwarstwy może mieć wpływ skład fazy olejowej i stężenie użytego fosfolipidu oraz fakt, że znajdował się on w fazie ciągłej.

Automatyzacja testowania ciągu inhibitorów i potencjalne zastosowania systemu

Odkąd przedstawiono formowanie dwuwarstw fosfolipidowych na granicy kropel w układach mikroprzepływowych (Funakoshi i wsp., 2006) zaproponowano różne modyfikacje mające na celu usprawnienie tego procesu poprzez automatyzację i redukcję ręcznego manipulowania nanolitrowymi objętościami płynów. Jednak dotychczas technologicznie nieosiągalna była pełna kontrola nad położeniem kropel w układzie, które mogło by zapewnić wydajne i powtarzalne tworzenie stabilnych membran na styku kropel. W opisywanym tu systemie połączono technologię aktywnego manipulowania cieczami za pomocą zaworów elektromagnetycznych i precyzyjnych pomp z innowacyjnymi metodami pasywnego kontrolowania położeniem kropel za pomocą pułapek hydrodynamicznych. Dzięki temu, operacje na kroplach mogą odbywać się według zadanego protokołu, a wytworzona membrana jest stabilna przez długi czas. Potencjał technologii zademonstrowano na przykładzie badania inhibitorów o różnym stężeniu, przy czym kompozycja chemiczna i umiejscowienie kropel w pułapce oraz czas ich zetknięcia były ściśle określone. W szczególności możliwość precyzyjnego określenia czasu, w jakim krople pozostają w kontakcie ma znaczenie w przypadku charakteryzowania białek transportowych.

Synergia rozwiązań technologicznych daje dodatkowe możliwości analiz kropel (nie zademonstrowane w tej pracy), które jednak będą realizowane w kolejnych etapach projektu. Po rozłączeniu krople mogłyby być poddane dalszym operacjom, takim jak łączenie z kolejnymi kroplami, np. zawierającymi substrat fluorescencyjnej reakcji, służący do ilościowej analizy badanego procesu. Inne przykładowe zastosowania to testowanie aktywności różnych mutantów białek błonowych, które pozwoliłoby na ich szybką charakteryzację. Genetycznie modyfikowana α-hemolizyna była używana do takich zastosowań jak kontrolowane uwalnianie, sensor pojedynczych molekuł czy w sekwencjonowaniu DNA III generacji. Z kolei stosując technikę lipid-in można zmieniać lipidową kompozycję błon, badając właściwości asymetrycznych dwuwarstw. Jednym z ważnych wyzwań w biochemii błon komórkowych są trudności z wbudowywaniem się wielu białek (np. większości eukariotycznych kanałów jonowych) do sztucznych błon lipidowych. System opisany w tej pracy może posłużyć jako narzędzie wydajnego testowania mieszanin lipidów - komponentów błon biologicznych, tak aby znaleźć optymalne warunki dla insercji wielu białek, które do tej pory nie mogły być analizowane w warunkach in vitro.

Głównym ograniczeniem opisywanego systemu jest konieczność przenoszenia sekwencji kropel z pompy strzykawkowej do układu i brak całkowitej automatyzacji prowadzonych badań. Może ona zostać osiągnięta poprzez depozycję ciągu kropel z inhibitorami w układzie, a następnie manipulację ich przepływem za pomocą przepływu oleju sterowanego zaworami. Dokładne pozycjonowanie kropel w pułapce jest możliwe do osiągnięcia dzięki zastosowaniu optycznej detekcji kropel i optycznemu sprzężeniu zwrotnemu (Jakiela et al., 2013). W rozwiązaniu tym przepływ cieczy z zaworów jest elektronicznie sprzężony z detekcją kropel za pomocą kamery. Jest ono konieczne ze względu na nieznacznie zmieniające się odległości między kroplami generowanymi przez robota laboratoryjnego, które może wynikać z wielu zjawisk hydrodynamicznych towarzyszących przepływowi kropel w układzie (Baroud et al., 2010; Jakiela et al., 2011). Innym usprawnieniem byłoby generowanie pojedynczych stężeń inhibitorów poza układem, a następnie ich rozcieńczanie gdy znajdą się w kanałach.

PL 223 410 B1

Generowanie gradientów chemicznych mogłoby się odbywać z użyciem złożonej kontroli przepływu za pomocą zaworów (Jakiela et al., 2013), lub za pomocą rozcieńczających pułapek hydrodynamicznych(Korczyk et al., 2013).

W rezultacie stosowania wynalazku uzyskiwano stabilne dwuwarstwy lipidowe, które posiadają cechy zbliżone do błon biologicznych występujących w żywych komórkach. Funkcjonalność membran DIBs potwierdziły wysoce precyzyjne pomiary elektrofizjologiczne przepływu jonów przez pojedyncze cząsteczki białka - α-hemolizyny. Mikroprzepływy dwufazowe pozwalają na manipulowanie położeniem kropel, dzięki czemu możliwe było przeprowadzenie pomiarów aktywności białek błonowych z nie osiągalną do tej pory wydajnością.

Demonstracyjne eksperymenty z zastosowaniem inhibitora modelowego białka błonowego α-hemolizyny wskazują na bardzo duży potencjał przedstawionego układu w badaniach aplikacyjnych: np. poszukiwaniu nowych leków modulujących aktywność kanałów jonowych, oraz w badaniach podstawowych (np. wysokoprzepustowe badanie aktywności zmutowanych wersji białek błonowych).

Bibliografia:

Baroud, C.N., Gallaire, F., and Dangla, R. (2010). Dynamics of microfluidic droplets. Lab. Chip

10,2032-2045.

Chen, C., and Folch, A. (2006). A high-performance elastomeric patch clamp chip. Lab. Chip 6,

1338-1345.

Elani, Y., deMello, A.J., Niu, X., and Ces, O. (2012). Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab. Chip 12, 3514-3520.

El-Arabi, A.M., Salazar, C.S., and Schmidt, J.J. (2012). Ion channel drug potency assay with an artificial bilayer chip. Lab. Chip 12, 2409-2413.

Funakoshi, K., Suzuki, H., and Takeuchi, S. (2006). Lipid bilayer formation by contacting monolayers in a microfluidic device for membrane protein analysis. Anal. Chem. 78, 8169-8174.

Jakiela, S., Makulska, S., Korczyk, P.M., and Garstecki, P. (2011). Speed of flow of individual droplets in microfluidic channels as a function of the capillary number, volume of droplets and contrast of viscosities. Lab. Chip 11,3603-3608.

Jakiela, S., Kaminski, T.S., Cybulski, O., Weibel, D.B., and Garstecki, P. (2013). Bacterial Growth and Adaptation in Microdroplet Chemostats. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 8908-8911.

Jeon, T.-J., Poulos, J.L., and Schmidt, J.J. (2008). Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform. Lab. Chip 8, 1742-1744.

Lein, M., Huang, J., and Holden, M.A. (2013). Robust reagent addition and perfusion strategies for droplet-interface bilayers. Lab. Chip 13, 2749-2753.

Malmstadt, N., Nash, M.A., Purnell, R.F., and Schmidt, J.J. (2006). Automated formation of lipidbilayer membranes in a microfluidic device. Nano Lett. 6, 1961 -1965.

Mao, H.B., Yang, T.L., and Cremer, P.S. (2002). Design and characterization of immobilized enzymes in microfluidic systems. Anal. Chem. 74, 379-385.

Ota, S., Suzuki, H., and Takeuchi, S. (2011). Microfluidic lipid membrane formation on microchamber arrays. Lab. Chip 11, 2485-2487.

Stanley, C.E., Elvira, K.S., Niu, X.Z., Gee, A.D., Ces, O., Edel, J.B., and deMello, A.J. (2010). A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chem. Commun. 46, 1620-1622.

Stimberg, V.C., Bomer, J.G., van Uitert, I., van den Berg, A., and Le Gac, S. (2013). High Yield,

Reproducible and Quasi-Automated Bilayer Formation in a Microfluidic Format. Small 9, 10761085.

Suzuki, H., Tabata, K., Kato-Yamada, Y., Noji, H., and Takeuchi, S. (2004). Planar lipid bilayer reconstitution with a micro-fluidic system. Lab. Chip 4, 502-505.

Thapliyal, T., Poulos, J.L., and Schmidt, J.J. (2011). Automated lipid bilayer and ion channel measurement platform. Biosens. Bioelectron. 26, 2651 -2654.

PL 223 410 B1

Thutupalli, S., Fleury, J.-B., Steinberger, A., Herminghaus, S., and Seemann, R. (2013). Why can artificial membranes be fabricated so rapidly in microfluidics? Chem. Commun. 49, 1443-1445.

Tsuji, Y, Kawano, R., Osaki, T., Kamiya, K., Miki, N., and Takeuchi, S. (2013). Droplet-based lipid bilayer system integrated with microfluidic channels for solution exchange. Lab. Chip 13, 1476-1481.

Yang, T.L., Jung, S.Y., Mao, H.B., and Cremer, P.S. (2001). Fabrication of phospholipid bilayercoated microchannels for on-chip immunoassays. Anal. Chem. 73, 165-169.

Zagnoni, M., Sandison, M.E., and Morgan, H. (2009a). Microfluidic array platform for simultaneous lipid bilayer membrane formation. Biosens. Bioelectron. 24, 1235-1240.

Zagnoni, M., Sandison, M.E., Marius, P., and Morgan, H. (2009b). Bilayer lipid membranes from falling droplets. Anal. Bioanal. Chem. 393, 1601 -1605.

Claims (8)

Zastrzeżenia patentowe

1. Mikroprzepływowy układ, zwłaszcza do automatycznego tworzenia dwuwarstw fosfolipidowych i badania aktywności białek błonowych, obejmujący pułapkę hydrodynamiczną w postaci komory na płyn, płytszej przy ścianach komory i głębszej z dala od ścianek komory, która to komora posiada pierwszą część i drugą część, korzystnie będące wzajemnie swoimi lustrzanymi odbiciami, z przewężeniem ukształtowanym pomiędzy pierwszą częścią a drugą częścią, przy czym każda z części przeznaczona jest na kroplę płynu, znamienny tym, że ponadto posiada:

a) pierwszy kanał mikroprzepływowy (10), połączony z pierwszą częścią komory pułapki (1), przeznaczony do doprowadzania kropel do pierwszej części komory oraz drugi kanał mikroprzepływowy (11), połączony z drugą częścią komory pułapki (1), przeznaczony do doprowadzania kropel do drugiej części komory,

b) parę kanałów (14), przeznaczonych do wyprowadzania kropel z układu, przy czym jeden z kanałów (14) prowadzi do pierwszej części komory pułapki (1), zaś drugi z kanałów (14) prowadzi do drugiej części komory pułapki (1).

2. Mikroprzepływowy układ według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo posiada kanał mikroprzepływowy (6), tworzący z pierwszym kanałem mikroprzepływowym (10) złącze typu T (2) oraz kanał mikroprzepływowy (7), tworzący z drugim kanałem mikroprzepływowym (11) złącze typu T (3).

3. Mikroprzepływowy układ według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że dodatkowo posiada

c) parę kanałów (15), przeznaczonych do umieszczania w nich elektrod, przy czym jeden z kanałów (15) prowadzi do pierwszej części komory pułapki (1), zaś drugi z kanałów (15) prowadzi do drugiej części komory pułapki (1).

4. Mikroprzepływowy układ według zastrz. 1, 2 albo 3, znamienny tym, że jeden lub obydwa spośród kanałów mikroprzepływowych (6), (7) obejmują odcinek meandrujący.

5. Mikroprzepływowy układ według zastrz. 1, 2, 3 albo 4, znamienny tym, że przynajmniej jeden z kanałów mikroprzepływowych (10), (11) połączony jest z dodatkowym kanałem mikroprzepływowym (12) do dostarczania płynu, który to dodatkowy kanał mikroprzepływowy (12) tworzy z pierwszym kanałem mikroprzepływowym (10) lub z drugim kanałem mikroprzepływowym (11) złącze typu T.

6. Mikroprzepływowy układ według zastrz. 1, 2, 3, 4 albo 5, znamienny tym, że posiada dodatkowy kanał mikroprzepływowy (13), służący do rozdzielania kropel w trakcie ich wymiany w pułapce (1), prowadzący z jednej strony pułapki (1) do przeciwległej strony pułapki (1) i położony poza pułapką (1), przy czym wlot i wylot dodatkowego kanału mikroprzepływowego (13) znajdują się w miejscu przewężenia między pierwszą częścią komory pułapki (1) a drugą częścią komory pułapki (1).

7. Mikroprzepływowy układ według zastrz. 1, 2, 3, 4, 5 albo 6, znamienny tym, że do kanału mikroprzepływowego (6) prowadzą dwa kanały wlotowe (4), (8), korzystnie tworzące ze sobą złącze typu T.

8. Mikroprzepływowy układ według zastrz. 1, 2, 3, 4, 5, 6 albo 7, znamienny tym, że do kanału mikroprzepływowego (7) prowadzą dwa kanały wlotowe (5), (9), korzystnie tworzące ze sobą złącze typu T.