PL223170B1 - Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanych cząstek styrenowych sprzężonych z tiolowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych oraz sposób jego wytwarzania - Google Patents

Abstract

Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanych cząstek styrenowych sprzężonych z tiolowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych, składa się z membrany nitrocelulozowej typu Lateral Flow nasączonej punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm2 do 0,1 mg/mm2 zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu oraz reagenta detekcyjnego zawierającego 25 µg aminosilanizowanych nanocząstek styrenowych sprzęganych kowalencyjnie z sondą hybrydyzacyjną znakowanych łącznikiem tiolowym w ilości 1-10 nmoli z 1-10 pmolami sondy hybrydyzacyjnej znakowanej biotyną. Sposób wytwarzania testu diagnostycznego na bazie amino modyfikowanych cząstek styrenowych sprzężonych z tiolowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych polega na tym, że w pierwszym etapie membranę nitrocelulozową typu Lateral Flow nasącza się punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm2 do 0,1 mg/mm2 zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu, w drugim etapie prowadzi się inkubację modyfikowanych aminosilanem nanocząstek styrenowych o stężeniu 25 µg/ml z sondą hybrydyzacyjną z wolną grupą tiolową zawierającą od 1 do 10 nmoli oligonukleotydu z dodatkiem 5 mg imidu sulfobursztynowego kwasu (4-jodoacetylo)amino-benzoesowego, po zakończeniu sprzęgania powstałe nanocząstki poddaje się koncentracji poprzez odwirowanie przez 5 minut przy przyspieszeniu 14 400 x g, odrzuca się supernatant a osad zawiesza się w 100 µl -200 µl dejonizowanej wody destylowanej, następnie roztwór ponownie poddaje się koncentracji poprzez odwirowanie przez 5 minut przy przyspieszeniu 14 400 x g, osad nanocząstek magnetycznych zawiesza się w 39 -109 µl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 µl roztworu biotynylowanej sondy hybrydyzacyjnej zawierającej 1 -10 pmoli oligonukleotydu, po czym w trzecim etapie do 10 -30 µl reagenta detekcyjnego dodaje się 10 µl gęstej hodowli bakteryjnej, mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze 90 -100°C w czasie 3-5 min, następnie pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej i 10 -20 µl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę z immobilizowanym białkiem wiążącym biotynę.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanych cząstek styrenowych sprzężonych z tiolowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych takich jak: Pseudomonas areugineosa opornych na działanie karbapenemów. Staphylococcus aureus opornych na działanie antybiotyków β-laktamowych i Enterococcus spp. opornych na działanie wankomycyny oraz sposób jego wytwarzania.

Zakażenia szpitalne to problem, jaki jest obecny w współczesnej służbie zdrowia, do najpoważniejszych zakażeń szpitalnych należą zakażenia bakteryjne takimi bakteriami jak: Pseudomonas areugineosa, Staphylococcus aureus czy też Enterococcus spp. Największe zagrożenie dla człowieka stanowią zakażenia szczepami bakteryjnymi odpornymi na działanie antybiotyków. Wśród zakażeń szpitalnych najczęściej występują izolowane szczepy Pseudomonas areugineosa oporne na działanie karbapenemów, Staphylococcus aureus oporne na działanie antybiotyków β-laktamowych, czy też Enterococcus spp. opornych na działanie wankomycyny.

Obecnie stosowane procedury diagnostyczne zmierzające do identyfikacji i charakterystyki biochemicznej zakażeń bakteryjnych, to techniki bazujące na procedurach klasycznej mikrobiologii - posiewy izolacyjne oraz testy krążkowe oporności na antybiotyki lub też testy bazujące na technikach biologii molekularnej - reakcja łańcuchowa polimerazy PCR. Wymienione procedury diagnostyczne są czasochłonne oraz kosztowne i wymagają wykorzystania drogiego sprzętu w celu realizacji kompleksowego badania, mającego na celu izolację szczepu i jego charakterystykę biochemiczną taką jak oporność na antybiotyki.

Wśród opisanych w literaturze rozwiązań diagnostycznych wykorzystywanych do identyfikacji antybiotykoodporności należy wymienić głównie techniki bazujące na mikromacierzach. Jedną z technik opisanych w literaturze przez Douglas R. Call i współpracowników w artykule pt. „Identifying Antimicrobial Resistance Genes with DNA Microarrays” (Antimicrob. Agents Chemother. October 2003 vol. 47 no. 10 3290-3295) jest metoda identyfikacji antybiotykooporność szczepów bakteryjnych wyk orzystująca macierz diagnostyczną wykonaną na bazie silanizowancgo szkła z immobilizowanym kolwancyjnie nukleotydem (sondą molekularną) znakowaną fluoroforem hybrydyzującą z genem warunkującym antybiotykooporność. Procedura analityczna związana z detekcją genu oporności na antybiotyki zaproponowana przez autorów wymaga ekstrakcji DNA bakteryjnego a analiza wyników wymaga zastosowania skanera fluorescencyjnego, co czyni procedurę mało użyteczną w warunkach słabo wyposażonych laboratoriów szpitalnych.

Alternatywne rozwiązanie mikromacierzowe bazujące na badaniach polimorfizmu pojedynczych nukleotydów w celu identyfikacji antybiotykooporności przedstawiła Verena Grimm i współautorzy w publikacji „Use of DNA Microarrays for Rapid Genotyping of TEM Beta-Lactamases That Confer Resistance” (J. Clin. Mkrobiol. August 2004 vol. 42 no. 8 3766-3774). Opisane rozwiązanie diagnostyczne bazuje na zastosowaniu matrycy diagnostycznej z szeregiem sond diagnostycznych o określonej sekwencji (z polimorfizmem pojedynczych nukleotydów), które wykorzystywane są w proced urze analitycznej do detekcji genu oporności na antybiotyki. Jako znacznika fluorescencyjnego użyto dodatkowej sondy znakowanej fluorescencyjnie, której związanie z genem przejawia się wzrostem fluorescencji określonego rejonu macierzy diagnostycznej. Fluorescencja układu diagnostycznego a zarazem obecność genu warunkującego oporność na antybiotyki jest rejestrowana za pomocą sk anera fluorescencyjnego.

Z publikacji James J. Storhoff i współpracownicy „Homogeneous detection of unamplified genomic DNA sequences based on colorimetric scatter of gold nanoparticle probes” (Nature Biotechn ology 22, 883-887 2004) znany jest układ diagnostyczny na bazie szkla oraz nanocząstek złota do detekcji antybiotykoodporności bakterii. Zaproponowane rozwiązanie wykorzystuje nanocząstki modyfikowane sondami nukleotydowymi hybrydyzującymi z genem oporności na antybiotyki. Analiza wyniku testu diagnostycznego odbywa się poprzez ocenę barwy układu nanocząstek naniesionych na szklaną powierzchnię.

Z amerykańskiego zgłoszenia patentowego nr US 2012129180 znana jest metoda detekcji bakterii opornych na karbapemy bazująca na multipleksowej reakcji PCR ze specjalnie zaprojektowanymi starterami pozwalającymi na detekcję bakterii Gram (-).

Natomiast z międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr W02010062001 znany jest sposób wytwarzania testu diagnostycznego opartego na dwóch sondach hybrydyzacyjnych, z których jedna jest immobilizowana na powierzchni szkła natomiast druga znakowana fluor ePL 223 170 B1 scencyjnie jest dodana do mieszaniny hybrydyzacyjnej. Warunkiem zadziałania testu jest obe cność w badanym materiale genu o sekwencjach komplementarnych do dwóch sond, których rolą jest wychwyt i zabarwienie analitu.

Istotą wynalazku jest test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanych cząstek styrenowych sprzężonych z tiolowanymi nukleotydami do identyfikacji Iekooporności szczepów bakteryjnych, który składa się z membrany nitrocelulozowej typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do 240 sekund/cm nasączonej punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm do 0,1 mg/mm zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu oraz reagenta detekcyjnego zawierającego 25 μg aminosilanizowanych nanocząstek styrenowych sprzęganych kowalencyjnie z sondą hybrydyzacyjną znakowanych łącznikiem tiolowym w ilości 1-10 nmoli z 1-10 pmolami sondy hybrydyzacyjnej znakowanej biotyną, przy czym sondy hybrydyzacyjne określone są wzorami od 1 do 6.

Korzystnie, białko wiążące biotynę wybrane jest z grupy: streptawidyna, awidyna lub ich rekombinowane pochodne.

Korzystnie, test diagnostyczny do identyfikacji szczepu Pseudomonas areugineosa zawiera pojedynczą sondę o wzorze 1 lub 2.

Korzystnie, test diagnostyczny do identyfikacji szczepu Staphylococcus aureus zawiera równomolową mieszaninę 2 sond o wzorze 3 lub 4.

Korzystnie, test diagnostyczny do identyfikacji szczepu Enterococcus spp. zawiera równomolową mieszaninę 4 sond o wzorze 5 lub 6.

Sposób wytwarzania testu diagnostycznego na bazie amino modyfikowanych cząstek styrenowych sprzężonych z tiolowanymi nukleotydami do identyfikacji Iekooporności szczepów bakteryjnych polega na tym, że w pierwszym etapie membranę nitrocelulozową typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do 240 sekund/cm nasącza się punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm do 0,1 mg/mm zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu, w drugim etapie prowadzi się inkubację modyfikowanych aminosilanem nanocząstek styrenowych o stężeniu 25 μg/ml z sondą hybrydyzacyjną z wolną grupą tiolową zawierającą od 1 do 10 nmoli oligonukleotydu z dodatkiem 5 mg imidu sulfobursztynowego kwasu (4-jodoacetylo)amino-benzoesowego, po zakończeniu sprzęgania powstałe nanocząstki poddaje się koncentracji poprzez odwirowanie przez 5 minut przy przyspieszeniu 14 400 x g, odrzuca się supernatant a osad zawiesza się w 100 pl - 200 pl dejonizowanej wody destylowanej, następnie roztwór ponownie poddaje się koncentracji poprzez odwirowanie przez 5 minut przy przyspieszeniu 14 400 x g, osad nanocząstek styrenowych zawiesza się w 39-109 pl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 pl roztworu biotynylowanej sondy hybrydyzacyjnej zawierającej 1-10 pmoli oligonukleotydu, po czym w trzecim etapie do 10-30 pl reagenta detekcyjnego dodaje się 10 pl gęstej hodowli bakteryjnej, mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze 90-100°C w czasie 3-5 min, następnie pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej i 10-20 pl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę z immobilizowanym białkiem wiążącym biotynę.

Korzystnie, jako białko wiążące biotynę stosuje się streptawidynę, awidynę lub ich rekombinowane pochodne.

Korzystnie, w przypadku identyfikacji szczepu Pseudomonas areugineosa stosuje się pojedynczą sondę o wzorze 1 lub 2.

Korzystnie, w przypadku identyfikacji szczepu Staphylococcus aureus stosuje się równomolową mieszaninę 2 sond o wzorze 3 lub 4.

Korzystnie, w przypadku identyfikacji szczepu Enterocaccus spp, stosuje się równomolową mieszaninę 4 sond o wzorze 5 lub 6.

Zaletą testu diagnostycznego na bazie amino modyfikowanych cząstek styrenowych sprzężonych z tiolowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych według wynalazku jest to, że test pozwala na identyfikację lekooporności w oparciu o genetyczne mechanizmy oporności. Analiza lekooporności bakterii nie wymaga wstępnej ekstrakcji kwasów nukleinowych.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonania.

Przykład 1

Sposób wytworzenia testu do identyfikacji szczepu Pseudomonas areugineosa opornego na karbapenemy.

Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 135 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem strepta₂ widyny w ilości 0,1 pg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka

PL 223 170 B1 i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min. a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml roztworu aminosilanizowanych nanocząstek styrenowych 25 μg nanocząstek dodaje się 1 nmol oligonukleotydu GTTTGGTCGCATATCGCAAC znakowanego łącznikiem tiolowym oraz 5 mg imidu sulfobursztynowego kwasu (4-jodoacetylo)amino-benzoesowego. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie separacji magnetycznej przez 4 minuty. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie separacji magnetycznej, po czym osad nanocząstek styrenowych zawiesza się w 39 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu biotynylowanej sondy AATGCGCAGCACCAGGATAG zawierającej 1 pmol oligonukieotydu.

W kolejnym etapie miesza się 10 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 90°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ost ygnięcia do temperatury pokojowej, po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną streptawidyną.

Analiza wyniku:

a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

P rz yk ła d 2

Sposób wytworzenia testu do identyfikacji szczepu Pseudomonas areugineosa opornego na karbapenemy

Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 135 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem awidyny w ilości 0,1 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml roztworu aminosilanizowanych nanocząstek styrenowych 25 μg nanocząstek dodaje się 5 nmol oligonukleotydu AATGCGCAGCACCAGGATAG znakowanego łącznikiem tiolowym oraz 5 mg imidu sulfobursztynowego kwasu (4-jodoacetylo)amino-benzoesowego. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie separacji magnetycznej przez 4 minuty. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie separacji magnetycznej, po czym osad nanocząstek styrenowych zawiesza się w 39 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu biotynylowanej sondy GTTTGGTCGCATATCGCAAC zawierającej 5 pmol oligonukleotydu.

W kolejnym etapie miesza się 10 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 90°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną awidyną.

Analiza wyniku:

a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny,

b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

PL 223 170 B1

Przykład 3

Sposób wytworzenia testu do identyfikacji szczepu Pseudomonas areugineosa opornego na karbapenemy

Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 135 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem rekombinowanej awidyny w ilości 0,01 ąg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml roztworu aminosilanizowanych nanocząstek styrenowych 25 ąg nanocząstek dodaje się 10 nmol oligonukleotydu AATGCGCAGCACCAGGATAG znakowanego łącznikiem tiolowym oraz 5 mg imidu sulfobursztynowego kwasu (4-jodoacetylo)amino-benzoesowego. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie separacji magnetycznej przez 4 minuty. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 ąl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie separacji magnetycznej, po czym osad nanocząstek styrenowych zawiesza się w 59 ąl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 ąl roztworu biotynylowanej sondy GTTTGGTCGCATATCGCAAC zawierającej 10 pmol oligonukleotydu.

W kolejnym etapie miesza się 20 ąl reagenta detekcyjnego z 10 ąl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 ąl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 100°C na 3 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej po czym 10 ąl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowanym rekombinowaną awidyną.

Analiza wyniku:

a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

P r z y k ł a d 4

Sposób wytworzenia testu do detekcji Staphylcoccus aureus opornego na metycylinę Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 180 sekund/cni nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem rekombinowanej streptawidyny w ilości 0,005 ąg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml roztworu aminosilanizowanych nanocząstek styrenowych 25 ąg nanocząstek dodaje się 1 nmol mieszaniny oligonukleotydów o następujących sekwencjach: GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA, TTACAGAGTTAACTGTTACC znakowanych łącznikiem tiolowym oraz 5 mg imidu sulfobursztynowego kwasu (4-jodoacetylo)amino-benzoesowego. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie separacji magnetycznej przez 4 minuty. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 ąl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie separacji magnetycznej, po czym osad nanocząstek styrenowych zawiesza się w 69 pl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 ąl roztworu sondy złożonej z następujących oligonukleotydów: CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA, ATACAAATCCAGCACGCTCT zawierającej łącznie 1 pmol oligonukleotydów znakowanych biotyną.

W kolejnym etapie miesza się 10 ąl reagenta detekcyjnego z 10 ąl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 ąI dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 90°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ost ygnięcia do temperatury pokojowej, po czym 10 ąl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną rekombinowaną streptawidyną.

PL 223 170 B1

Analiza wyniku:

a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny kiedy inaczej wynik negatywny.

Przykład 5

Sposób wytworzenia testu do detekcji Sraphylococcus aureus opornego na metycylinę Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 180 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem rekombinowanej streptawidyny w ilości 0,005 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml roztworu aminosilanizowanych nanocząstek styrenowych 25 μg nanocząstek dodaje się 1 nmol mieszaniny oligonukleotydów o następujących sekwencjach: CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA, ATACAAATCCAGCACGCTCT znakowanych łącznikiem tiolowym oraz 5 mg imidu sulfobursztynowego kwasu (4-jodoacetyIo)aminobenzoesowego. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, a następnie separacji magnetycznej przez 4 minuty. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie separacji magnetycznej, po czym osad nanocząstek styrenowych zawiesza się w 69 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu sondy złożonej z następujących oligonukleotydów: GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA, TTACAGAGTTAACTGTTACC zawierającej łącznie 1 pmol oligonukleotydów znakowanych biotyną.

W kolejnym etapie miesza się 25 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 100°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną rekombinowaną streptawidyną.

Analiza wyniku:

a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

Przykład 6

Sposób wytworzenia testu do detekcji Enterococcus spp. opornych na wankomycynę.

Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 240 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem strepta₂ widyny w ilości 0,1 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml roztworu aminosilanizowanych nanocząstek styrenowych 25 μg nanocząstek dodaje się 10 nmol mieszaniny oligonukleotydów o następujących sekwencjach: CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA, GTGACAAACCGGAGGCGAGGA, GGTATCAAGGAAACCTC, CGGGGAAGATGGCAGTAT znakowanych łącznikiem tiolowym oraz 5 mg imidu sulfobursztynowego kwasu (4-jodoacetylo)amino-benzoesowego. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie separacji magnetycznej przez 4 minuty. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie separacji magnetycznej, po czym osad nanocząstek styrenowych zawiesza się w 109 μl dejonizowanej wody

PL 223 170 B1 destylowanej i dodaje się 1 μ roztworu sondy złożonej z następujących oligonukleotydów: CCCCTTTAACGCTAATACGATCAA, CCGCCATCCTCCTGCAAAAAA, CTTCCGCCATCATAGCT, CGCAGGGACGGTGATTTT zawierającej łącznie 10 pmol oligonukleotydów znakowanych biotyną.

W kolejnym etapie miesza się 25 μΙ reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 95°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną streptawidyną.

Analiza wyniku:

a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny kiedy inaczej wynik negatywny.

Przykład 7

Sposób wytworzenia testu do detekcji Enterococcus spp. opornych na wankomycynę Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 240 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem streptawidyny w ilości 0,05 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpuszczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml roztworu aminosilanizowanych nanocząstek styrenowych 25 μg nanocząstek dodaje się 5 nmol mieszaniny oligonukleotydów o następujących sekwencjach: CCCCTTTAACGCTAATACGATCAA, CCGCCATCCTCCTGCAAAAAA, CTTCCGCCATCATAGCT, CGCAGGGACGGTGATTTT znakowanych łącznikiem tiolowym oraz 5 mg imidu sulfobursztynowego kwasu (4-jodoacetylo)aminobenzoesowego. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, separacji magnetycznej przez 4 minuty. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 μl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w separacji magnetycznej, po czym osad nanocząstek styrenowych zawiesza się w 109 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu sondy złożonej z następujących oligonukleotydów: CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA, GTGACAAACCGGAGGCGAGGA, GGTATCAAGGAAACCTC, CGGGGAAGATGGCAGTAT zawierającej łącznie 10 pmol oligonukleotydów znakowanych biotyną.

W kolejnym etapie miesza się 30 μl reagenta detekcyjnego z 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez, odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 μl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 95°C na 5 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej po czym 10 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną streptawidyną.

Analiza wyniku:

a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

Przykład 8

Sposób wytworzenia testu do detekcji Enterococcus spp. opornych na wankomycynę Membranę nitrocelulozową o minimalnych wymiarach 3 cm x 3 cm typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu 240 sekund/cm nasącza się punktowo w centralnym miejscu roztworem ₂ streplawidyny w ilości 0,025 μg/mm zawieszonej w 10% roztworze wodnym etanolu. Po naniesieniu białka i wyschnięciu membranę umieszcza się w 2% roztworze mleka rozpus zczonego w buforze TBS, a następnie inkubuje się w czasie 1 godziny przy łagodnym mieszaniu. Po procesie blokowania

PL 223 170 B1 membranę dwukrotnie przemywa się buforem TBS poprzez delikatne wytrząsanie w czasie 15 min, a następnie membranę suszy się.

Do 1 ml roztworu aminosilanizowanych nanocząstek styrenowych 25 gg nanocząstek dodaje się 1 nmol mieszaniny oligonukleotydów o następujących sekwencjach: CCCCTTTAACGCTAATACGATCAA, CCGCCATCCTCCTGCAAAAAA, CTTCCGCCATCATAGCT, CGCAGGGACGGTGATTTT znakowanych łącznikiem tiolowym oraz 5 mg imidu sulfobursztynowego kwasu (4-jodoacetylo)aminobenzoesowego. Mieszaninę poddaje się inkubacji przez 2 godziny, następnie separacji magnetycznej przez 4 minuty. Powstały supernatant oddziela się, a osad zawiesza się w 200 gl dejonizowanej wody destylowanej. Roztwór ponownie poddaje się koncentracji w procesie wirowania, po czym osad nan ocząstek styrenowych zawiesza się w 109 gl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 gl roztworu sondy złożonej z następujących oligonukleotydów: CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA, GTGACAAACCGGAGGCGAGGA, GGTATCAAGGAAACCTC, CGGGGAAGATGGCAGTAT zawierającej łącznie 1 pmol oligonukleotydów znakowanych biotyną.

W kolejnym etapie miesza się 30 gl reagenta detekcyjnego z 10 gl gęstej hodowli bakteryjnej powstałej przez odwirowanie 0,5 ml preinkubowanej w okresie 5 godzin na pożywce płynnej próbki zawierającej bakterie i zawieszenie jej w 50 gl dejonizowanej wody. Mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 100°C na 3 min. Po inkubacji mieszaninę pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej, po czym 10 gl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę detekcyjną z immobilizowaną streptawidyną.

Analiza wyniku:

a) „bez odmywania” po naniesieniu próbki obserwuje się powstałą plamę, jeśli plama posiada jasną (czasami nawet wodnistą dobrze wyodrębnioną obwódkę) wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

b) „z odmywaniem” po naniesieniu próbki membranę płucze się wodą lub dowolnym buforem, w przypadku kiedy powstała plama barwna nie ulegnie odmyciu wynik pozytywny, kiedy inaczej wynik negatywny.

Claims (10)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Test diagnostyczny na bazie amino modyfikowanych cząstek styrenowych sprzężonych z tiolowanymi nukleotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych, znamienny tym, że składa się z membrany nitrocelulozowej typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do

   240 sekund/cm nasączonej punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm ₂ do 0,1 mg/mm zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu oraz reagenta detekcyjnego zawierającego 25 gg aminosilanizowanych nanocząstek styrenowych sprzęganych kowalencyjnie z sondą hybrydyzacyjną znakowanych łącznikiem tiolowym w ilości 1-10 nmoli z 1-10 pmolami sondy hybrydyzacyjnej znakowanej biotyną, przy czym sondy hybrydyzacyjne określone są wzorami od 1 do 6.
2. 2. Test według zastrz. 1, znamienny tym, że białko wiążące biotynę wybrane jest z grupy: streptawidyna, awidyna lub ich rekombinowane pochodne.
3. 3. Test według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku identyfikacji szczepu Pseudomonas areugineosa zawiera pojedynczą sondę o wzorze 1 lub 2.
4. 4. Test według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku identyfikacji szczepu Staphylococcus aureus stosuje się równomolową mieszaninę 2 sond o wzorze 3 lub 4.
5. 5. Test według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku identyfikacji szczepu Enterococcus spp. zawiera równomolową mieszaninę 4 sond o wzorze 5 lub 6.
6. 6. Sposób wytwarzania testu diagnostycznego na bazie amino modyfikowanych cząstek styrenowych sprzężonych z tiolowanymi nukieotydami do identyfikacji lekooporności szczepów bakteryjnych, znamienny tym, że w pierwszym etapie membranę nitrocelulozową typu Lateral Flow o natężeniu przepływu analitu od 135 do 240 sekund/cm nasącza się punktowo roztworem białka wiążącego biotynę w ilości od 0,005 mg/mm do 0,1 mg/mm zawieszonego w 10% roztworze wodnego etanolu, w drugim etapie prowadzi się inkubację modyfikowanych aminosilanem nanocząstek styrenowych o stężeniu 25 gg/ml z sondą hybrydyzacyjną z wolną grupą tiolową zawierającą od 1 do 10 nmoli oligonukleotydu z dodatkiem 5 mg imidu sulfobursztynowego kwasu (4-jodoacetylo)aminobenzoesowego, po zakończeniu sprzęgania powstałe nanocząstki poddaje się koncentracji poprzez odwirowanie przez 5 minut przy przyspieszeniu 14 400 x g, odrzuca się supernatant a osad zawiesza się

   PL 223 170 B1 w 100 μl - 200 μl dejonizowanej wody destylowanej, następnie roztwór ponownie poddaje się koncentracji poprzez odwirowanie przez 5 minut przy przyspieszeniu 14 400 x g, osad nanocząstek styrenowych zawiesza się w 39-109 μl dejonizowanej wody destylowanej i dodaje się 1 μl roztworu biotynylowanej sondy hybrydyzacyjnej zawierającej 1-10 pmoli oligonukleotydu, po czym w trzecim etapie do 10-30 μl reagenta detekcyjnego dodaje się 10 μl gęstej hodowli bakteryjnej, mieszaninę reakcyjną umieszcza się w łaźni wodnej w temperaturze 90-100°C w czasie 3-5 min, następnie pozostawia się do ostygnięcia do temperatury pokojowej i 10-20 μl mieszaniny reakcyjnej przenosi się na membranę z immobilizowanym białkiem wiążącym biotynę.
7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako białko wiążące biotynę stosuje się streptawidynę, awidynę lub ich rekombinowane pochodne.
8. 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w przypadku identyfikacji szczepu Psudomonas areugineosa stosuje się pojedynczą sondę o wzorze 1 lub 2.
9. 9. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że w przypadku identyfikacji szczepu Staphylococcus aureus stosuje się równomolową mieszaninę 2 sond o wzorze 3 lub 4.
10. 10. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że przypadku identyfikacji szczepu Enterococcus spp. stosuje się równomolową mieszaninę 4 sond o wzorze 5 lub 6.