PL222759B1 - Sposób obrazowania struktur biologicznych - Google Patents
Sposób obrazowania struktur biologicznychInfo
- Publication number
- PL222759B1 PL222759B1 PL406315A PL40631513A PL222759B1 PL 222759 B1 PL222759 B1 PL 222759B1 PL 406315 A PL406315 A PL 406315A PL 40631513 A PL40631513 A PL 40631513A PL 222759 B1 PL222759 B1 PL 222759B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- group
- structures
- carbon atoms
- hydrogen atom
- nmr
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims abstract description 14
- -1 also substituted Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 9
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 9
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims abstract description 9
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 9
- RLGKSXCGHMXELQ-ZRDIBKRKSA-N trans-2-styrylquinoline Chemical class C=1C=C2C=CC=CC2=NC=1\C=C\C1=CC=CC=C1 RLGKSXCGHMXELQ-ZRDIBKRKSA-N 0.000 claims abstract description 8
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims abstract description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 3
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 claims abstract description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims abstract 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 22
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910052724 xenon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N xenon atom Chemical compound [Xe] FHNFHKCVQCLJFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 6
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 26
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 19
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 18
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 17
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 16
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 6
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 6
- SMUQFGGVLNAIOZ-UHFFFAOYSA-N quinaldine Chemical compound C1=CC=CC2=NC(C)=CC=C21 SMUQFGGVLNAIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NBYLBWHHTUWMER-UHFFFAOYSA-N 2-Methylquinolin-8-ol Chemical compound C1=CC=C(O)C2=NC(C)=CC=C21 NBYLBWHHTUWMER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 5
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 5
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 241000220257 Matthiola Species 0.000 description 3
- 235000011378 Matthiola incana Nutrition 0.000 description 3
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 235000021547 stock Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BTQAJGSMXCDDAJ-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trihydroxybenzaldehyde Chemical compound OC1=CC(O)=C(C=O)C(O)=C1 BTQAJGSMXCDDAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IUNJCFABHJZSKB-UHFFFAOYSA-N 2,4-dihydroxybenzaldehyde Chemical compound OC1=CC=C(C=O)C(O)=C1 IUNJCFABHJZSKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IBGBGRVKPALMCQ-UHFFFAOYSA-N 3,4-dihydroxybenzaldehyde Chemical compound OC1=CC=C(C=O)C=C1O IBGBGRVKPALMCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WMPDAIZRQDCGFH-UHFFFAOYSA-N 3-methoxybenzaldehyde Chemical compound COC1=CC=CC(C=O)=C1 WMPDAIZRQDCGFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 2
- VUKWLYLGIHTCKZ-UHFFFAOYSA-N chembl1682442 Chemical compound OC1=C(C(O)=O)C=CC2=NC(C)=CC=C21 VUKWLYLGIHTCKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000003504 photosensitizing agent Substances 0.000 description 2
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 2
- VGISFWWEOGVMED-UHFFFAOYSA-N 1-(chloromethyl)-3-methoxybenzene Chemical compound COC1=CC=CC(CCl)=C1 VGISFWWEOGVMED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CRPNQSVBEWWHIJ-UHFFFAOYSA-N 2,3,4-trihydroxybenzaldehyde Chemical compound OC1=CC=C(C=O)C(O)=C1O CRPNQSVBEWWHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NXNDEWNGCMCWMA-UHFFFAOYSA-N 2-(2-quinolin-2-ylethenyl)phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1C=CC1=CC=C(C=CC=C2)C2=N1 NXNDEWNGCMCWMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQEYKDVGEVDAGN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(3,5-dimethoxyphenyl)ethenyl]quinolin-8-ol Chemical compound COC1=CC(OC)=CC(C=CC=2N=C3C(O)=CC=CC3=CC=2)=C1 XQEYKDVGEVDAGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGCNQHDVSASYMK-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(3-hydroxyphenyl)ethenyl]quinolin-8-ol Chemical compound OC1=CC=CC(C=CC=2N=C3C(O)=CC=CC3=CC=2)=C1 ZGCNQHDVSASYMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SADQNNIVDUABSE-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(3-methoxyphenyl)ethenyl]quinolin-8-ol Chemical compound COC1=CC=CC(C=CC=2N=C3C(O)=CC=CC3=CC=2)=C1 SADQNNIVDUABSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCHWONNVVNJIFQ-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-ethoxyphenyl)ethenyl]quinoline Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C=CC1=CC=C(C=CC=C2)C2=N1 QCHWONNVVNJIFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCYGLFXKCBFGPC-UHFFFAOYSA-N 3,4-Dihydroxy hydroxymethyl benzene Natural products OCC1=CC=C(O)C(O)=C1 PCYGLFXKCBFGPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- IUWNDBRDDAUPCH-UHFFFAOYSA-N CC(C)(C)C(C=C1)=CC=C1C#CC1=NC2=CC=CC=C2C=C1 Chemical compound CC(C)(C)C(C=C1)=CC=C1C#CC1=NC2=CC=CC=C2C=C1 IUWNDBRDDAUPCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KSFOVUSSGSKXFI-GAQDCDSVSA-N CC1=C/2NC(\C=C3/N=C(/C=C4\N\C(=C/C5=N/C(=C\2)/C(C=C)=C5C)C(C=C)=C4C)C(C)=C3CCC(O)=O)=C1CCC(O)=O Chemical class CC1=C/2NC(\C=C3/N=C(/C=C4\N\C(=C/C5=N/C(=C\2)/C(C=C)=C5C)C(C=C)=C4C)C(C)=C3CCC(O)=O)=C1CCC(O)=O KSFOVUSSGSKXFI-GAQDCDSVSA-N 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002749 aminolevulinic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzenecarboxaldehyde Natural products O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 201000010989 colorectal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- FZTMEYOUQQFBJR-UHFFFAOYSA-M mitoTracker Orange Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(CCl)C=C1 FZTMEYOUQQFBJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940109328 photofrin Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 125000002943 quinolinyl group Chemical group N1=C(C=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 125000003011 styrenyl group Chemical group [H]\C(*)=C(/[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000005504 styryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Przedmiotem wynalazku jest sposób obrazowania struktur biologicznych, zwłaszcza błon biologicznych i struktur lipofilowych, charakteryzujący się tym, że do obrazowanych struktur wprowadza się barwniki fluorescencyjne w postaci pochodnych styrylochinoliny o wzorze ogólnym 1, w którym: L oznacza łącznik dwuwęglowy nasycony lub nienasycony; podstawniki R1-R4 oznaczają atom wodoru, atom chlorowca, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową zawierającą od jednego do sześciu atomów węgla, grupę acylową; podstawnik R5 oznacza atom wodoru, atom chlorowca, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową zawierającą od jednego do sześciu atomów węgla, grupę acylową, grupę alkilową zawierającą do czterech atomów węgla, również podstawioną lub grupę etynylową również podstawioną pierścieniem fenylowym lub korzystnie grupą tert-butylową. Natomiast podstawniki R6-R9 oznaczają atom wodoru, grupę hydroksylową, acylową lub karboksylową. Następnie wprowadzone do struktur biologicznych barwniki fluorescencyjne wzbudza się światłem w zakresie 250 - 450 nm, korzystnie 340 - 360 nm, szczególnie korzystnie przy pomocy standardowych filtrów DAPI, a odczytu poziomu fluorescencji dokonuje się z wykorzystaniem emisji mieszczącej się w zakresie światła niebieskiego.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób obrazowania struktur biologicznych, zwłaszcza błon biologicznych i struktur liofilowych, z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych w postaci pochodnych styrylochinoliny.
Barwniki fluorescencyjne są często wykorzystywane w badaniach naukowych, medycynie i diagnostyce do obrazowania komórek lub narządów, elementów układów biologicznych takich jak organelle, antyciała DNA i RNA. Obrazowanie struktur biologicznych zyskuje szczególne znaczenie w diagnostyce nowotworów, na przykład w technice fotodynamicznej polegającej na wzbudzaniu światłoczułych związków wiązką światła o odpowiedniej długości. Zasada działania opiera się na różnych zdolnościach do akumulacji fotouczulaczy w komórkach zdrowych i nowotworowych. W tych drugich, zazwyczaj po podaniu domiejscowym lub nawet ogólnoustrojowym stężenie związków światłoczułych jest większe, co pozwala na selektywne niszczenie miejsc objętych chorobą. W diagnostyce chorób nowotworowych wykorzystuje się natomiast zjawisko fluorescencji tych samych związków po wzbudzeniu wiązką światła. Jako fotouczulacze stosuje się pochodne lub analogi protoporfiryny, takie jak fotofrin, porfimer lub ich prekursory (proleki) takie jak kwas aminolewulinowy, co zostało ujawnione w opisie patentowym WO84/04665.
W badaniach opartych na obserwacji poszczególnych układów komórkowych, tego typu związki nie znajdują zastosowania. Ich toksyczność i brak fotostabilności powodują, że ich wykorzystanie staje się kłopotliwe lub wręcz niemożliwe. Barwniki stosowane w monitorowaniu zachowań komórek, badaniach przeżyciowych oraz testach toksyczności powinny być w miarę obojętne dla badanych obiektów. W takich sytuacjach wymagana jest jak najmniejsza toksyczność barwników, brak ingerencji w naturalne mechanizmy komórki, i łatwość wzbudzania w zakresie, który nie koliduje z autofluorescencją badanych układów. Inne wymagane cechy to odpowiednio wysoka wartość przesunięcia Stockesa oraz intensywność fluorescencji. Parametry te muszą być odpowiednio wysokie dla uzyskania odpowiedniej jakości obrazu. Uważa się, że odpowiednia charakterystyka substancji stosowanych do barwienia w układach komórkowych powinna obejmować fluorescencje w zakresie 500-900 nm oraz przesunięcie Stockesa większe niż 20 nm. Związki takie powinny się odpowiednio dobrze wiązać z docelowymi strukturami oraz pozwalać łatwo usuwać ze środowiska pomiaru, będąc w postaci niezwiązanej.
Często wykorzystywanym barwnikiem jest izotiocyjanian fluoresceiny (FITC). Nie jest on jednak pozbawiony wad, a najważniejsze z nich to niewielka wartość przesunięcia Stockesa i podatność na fotoblaknięcie. Inne barwniki oparte na strukturze fluoresceiny lub ryboflawiny są również wykorzystywane do obrazowania w mikroangiografii krążeniowej, przez co znajdują zastosowanie w medycynie, co opisano w dokumencie patentowym US4945239. Interesujące barwniki cyjaninowe o niesymetrycznej strukturze opisane zostały w dokumencie patentowym US5321130. W cząsteczkach tych barwników można wyróżnić układ chinoliny modyfikowanej w pozycjach 1 i 4 długimi łańcuchami alkilowymi. Znane są również barwniki oparte na strukturze winylobenzenu (styrylowe), takie jak opisane między innymi w dokumentach patentowych: US5486616, US6794509 oraz US7781187. Nie uwzględniają one jednak chinoliny jako głównego rdzenia cząsteczki. Pojawiają się też w literaturze fachowej doniesienia o możliwości wykorzystania fluorescencyjnych własności styrylochinoliny (modyfikowanej grupą metylową w pozycji C6 chinoliny i grupą aminową w pozycji C4 pierścienia fenylowego) do diagnozowania choroby Alzheimera (M. Staderini, ACS Med. Chem. Lett, 2012). Brak jest jednak doniesień o innych styrylochinolinach, zwłaszcza modyfikowanych dla uzyskania wiązania z błonami komórkowymi lub innymi strukturami lipofilowymi i możliwych do wykorzystania do obrazowania tych struktur.
Celem wynalazku stało się zatem opracowanie sposobu obrazowania struktur biologicznych z wykorzystaniem nowych pochodnych styrylochinoliny o korzystnych parametrach fizykochemicznych.
Istotę wynalazku stanowi sposób obrazowania struktur biologicznych, zwłaszcza błon biologicznych i struktur lipofilowych, prowadzony w warunkach in vitro, charakteryzujący się tym, że do obrazowanych struktur wprowadza się barwniki fluorescencyjne w postaci pochodnych styrylochinoliny przedstawionych wzorem 1, w którym: L oznacza łącznik dwuwęglowy nasycony lub nienasycony; podstawniki R1-R4 oznaczają atom wodoru, atom chlorowca, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową zawierającą od jednego do sześciu atomów węgla, grupę acylową; podstawnik R5 oznacza atom wodoru, atom chlorowca, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową zawierającą od jednego do sześciu
PL 222 759 B1 atomów węgla, grupę acylową, grupę alkilową zawierającą do czterech atomów węgla, również podstawioną lub grupę etynylową również podstawioną pierścieniem fenylowym lub korzystnie grupą tertbutylową, natomiast podstawniki R6-R9 oznaczają atom wodoru, grupę hydroksylową, acylową lub karboksylową. Następnie barwniki fluorescencyjne wprowadzone do struktur biologicznych wzbudza się światłem w zakresie 250-450 nm, korzystnie 340-360 nm, szczególnie korzystnie przy pomocy standardowych filtrów DAPI, a odczytu poziomu fluorescencji dokonuje się z wykorzystaniem emisji mieszczącej się w zakresie światła niebieskiego. Jako źródło wzbudzenia stosuje się dowolne źródło światła, zwłaszcza laser, światło ksenonowe lub halogenowe o wyżej wskazanym zakresie długości fali.
Barwniki fluorescencyjne stosuje się w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych preparatów, zwłaszcza takich jak sole, roztwory lub żele.
Barwniki proponowane w wynalazku można wykorzystać do barwienia układów biologicznych w szczególności lipofilowych, takich jak błony komórkowe lub podobne. Barwienie można wykonywać bezpośrednio na materiale biologicznym podając związki rozpuszczone w stosownym rozpuszczalniku. Korzystne rozpuszczalniki to DMSO lub alkohole. Roztwór należy wprowadzać w niewielkiej ilości, aby osiągnąć stężenie rzędu mikromoli i nie przekroczyć bezpiecznej dawki rozpuszczalnika. W zależności od zastosowanej metody odczytu proponowane barwniki mogą być wykorzystane w badaniu struktur komórkowych i tkankowych, diagnostyce, jako substancje kontrastujące podczas operacji wykonywanych na komórkach lub tkankach w warunkach in vitro. Związki te można stosować korzystnie w badaniu prostych struktur komórkowych, jak również dla tkanek lub komórek izolowanych z żywych organizmów, w tym zwierząt lub ludzi. Dawkę związku należy dostosować do szczególnych przypadków, przy czym typowo zawiera się ona w zakresie 0,01-1000 μΜ. Niewielka toksyczność związków opisanych wynalazkiem pozwala na dobranie odpowiedniego poziomu stężenia. Typowa procedura postępowania podczas detekcji i obrazowania jest taka sama jak w przypadku znanych i stosowanych środków, co podnosi walory wynalazku. Dla podniesienia kontrastu można zastosować filtr DAPI typowy dla większości zastosowań. Fluorescencje można obserwować i rejestrować przy pomocy odpowiednich urządzeń, takich jak kamera CCD, jak ma to miejsce w typowych metodach. Niska toksyczność związków opisanych wynalazkiem pozwala na stosowanie ich bez szkody dla funkcjonowania badanych struktur.
Poniżej przedstawiono przykłady związków opisanych wynalazkiem oraz sposoby obrazowania struktur biologicznych z wykorzystaniem wybranych związków.
P r z y k ł a d 1.
2-[2-(4-acetyleno-fenylo)-etyleno]-chinolina.
Etap 1.2-[2-(4-trimetylosilanoacetyleno-fenylo)-etyleno]-chinolina.
2-metylochinolinę (1 mmol) rozpuszczono w bezwodniku octowym (10 cm) i dodano p-trimetylosilanoacetylenobenzaldehyd (2 mmol). Mieszaninę ogrzewano przez 20 h w temperaturze 120°C w środowisku gazu obojętnego (azotu). Następnie bezwodnik octowy odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Mieszaninę oczyszczano na kolumnie chromatograficznej w układzie octan etylu:heksan (1:4). Surowy półprodukt krystalizowano z mieszaniny octanu etylu i heksanu (1:4). Otrzymano biały osad o temperaturze topnienia 192°C z wydajnością 55%;
1H-NMR (400 MHz. CDCfe), δ: 8.15 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H). 8.12 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar-H),
7.81 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Ar-H), 7.77-7.71 (m, 1H, Ar-H). 7.67 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Ar-H), 7.59 (d, J = 8.3 Hz, 2H, Ar-H), 7.55-7.50 (m, 3H, Ar-H, C=CH), 7.43 (d, J = 16.3 Hz, 1H, C=CH), 0.30 (s. 9H, CH3);
13C-NMR (101 MHz, DMSO-Ó6), δ: 155.8, 148.17, 137.34, 137.00, 133.53, 132.64, 130.56, 130.32, 129.22, 128.26, 128.06, 127.89, 127.60, 126.78, 122.59, 120.60, 105.69, 96.08, 0.28; m/z = 328.35 [M+H]+.
Etap 2. 2-[2-(4-acetyleno-fenylo)-etyleno]-chinolina.
2-[2-(4-trimetylosilanoacetyleno-fenylo)-etyleno]-chinolinę (0,45 mmol) otrzymaną w etapie 1 3 rozpuszczono w metanolu (6 cm ) i dodano K2CO3 (0,07 mmol). Mieszaninę ogrzewano przez 2 h w temperaturze 30°C. Następnie przesączono i odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymano żółty osad o temperaturze topnienia 154°C z wydajnością 87%;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-^) δ: 8.16 (d, J = 8,6 Hz, 1H, Ar-H), 8.11 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar-H),
7.81 (d, J = 7.9 Hz, 1H, Ar-H), 7.76-7.71 (m, 1H. Ar-H), 7.70-7.65 (m, 2H, Ar-H), 7.62 (d, J = 8.3 Hz, 2H, Ar-H), 7.56-7.51 (m, 3H, Ar-H, C=CH), 7.44 (d, J = 16.3 Hz, 1H, C=CH), 3.19 (s, 1H, C CH);
13C-NMR (101 MHz, DMSO-Ó6), δ: 155.58, 148.26, 137.00, 136.48, 133.47, 132.56, 130.04,
129.86, 129.25, 127.49, 127.44, 127.11, 126.36, 122.13, 119.43, 83.60, 78.39; m/z = 256.28 [M+H]+.
PL 222 759 B1
P r z y k ł a d 2.
2-[2-(4-acetylenobenzeno-fenylo)-etyleno]-chinolina.
2-metylochinolinę (1 mmol) rozpuszczono w bezwodniku octowym (10 cm ) i dodano p-(fenyloetyleno)benzaldehyd (2 mmol). Mieszaninę ogrzewano przez 20 h w temperaturze 120°C w środowisku azotu. Następnie bezwodnik octowy odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Mieszaninę oczyszczano na kolumnie chromatograficznej w układzie octan etylu:heksan (1:4). Surowy produkt krystalizowano z mieszaniny octanu etylu i heksanu (1:4). Otrzymano jasno-żółty osad o temperaturze topnienia 202-204°C z wydajnością 21%;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-cfe), δ: 8.15 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 8.12 (d, J = 8,5 Hz, 1H, Ar-H),
7.81 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Ar-H), 7.77-7.71 (m, 1H, Ar-H), 7.67 (dd, J = 13.7; 8.4 Hz, 4H, Ar-H), 7.61 -7.56 (m, 4H, Ar-H, C=CH), 7.53 (t, J = 7.5 Hz, 1H. Ar-H), 7.45 (d, J = 16.3 Hz, 1H, C=CH). 7.41-7.35 (m, 3H, Ar-H);
13C-NMR (101 MHz, DMSO-Ó6), δ: 155.70, 148.29. 136.44. 133.65, 132.03, 131.65, 129.83, 129.74, 129.26, 128.39, 127.53, 127.43, 127.20, 126.31, 123.39, 123.23, 119.42, 90.84, 89.46; m/z = 332.33 [M+H]+.
P r z y k ł a d 3.
Kwas 2-(3-metoksyfenyloetylo)-5-hydroksychinolino-6-karboksylowy.
Kwas 5-hydroksy-2-metylochinolino-6-karboksylowy (1 mmola) rozpuszczono w świeżo przede3 stylowanym THF-ie (7,5 cm ) i dodano LDA (4 mmol). Całość mieszano przez 1 h, utrzymując temperaturę 0°C, w atmosferze azotu. Następnie dodano chlorek 3-metoksybenzylu (1,5 mmola) i mieszano 3 przez 4 h w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny poreakcyjnej dodano wody destylowanej (25 cm3) i ekstrahowano eterem dietylowym. Frakcję wodną zakwaszono 20% HCl do lekko kwasowego odczynu. Wytrącony żółty osad przesączono i oczyszczano na kolumnie chromatograficznej w układzie etanol:heksan (1:2). Otrzymano pomarańczowy osad o temperaturze topnienia 206-211°C z rozkładem i wydajnością 44%;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-cfe), δ: 8.44 (d, J = 8.4 Hz, 1H. Ar-H), 7.95 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar-H). 7.30 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Ar-H), 7.17 (t, J = 8.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.09 (d, J = 8.8 Hz, 1H, Ar-H), 6.84 (d, J = 6.5 Hz, 1H, Ar-H), 6.73 (d, J = 7.3 Hz. 1H, Ar-H), 3.71 (s. 3H, OCH3), 3.16 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH2), 3.05 (t, J = 7.7 Hz. 2H, CH2):
13C NMR (101 MHz, DMSO-cfe), δ: 172.73, 163.34, 162.58, 159.70, 150.93, 143.59, 132.57, 130.83, 129.72, 121.09, 119.97, 119.68, 114.99, 114.46, 111.82, 111.61, 55.32, 35.24, 0.56; m/z = 344.48 [M-H+Na]+.
P r z y k ł a d 4.
2-[2-(3,5-dimetoksy-fenylo)-winylo]-8-hydroksychinolina.
Sposób otrzymania został opisany w literaturze: Machura et al. Polyhedron, 2012, 33, 388. Beżowy osad o temperaturze topnienia 122°C; wydajność 57%; czystość HPLC 96.28%; UV (nm), Xmax/log ε: 300.8/3.52;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ: 9.55 (s, 1H, OH), 8.31 (t, J = 6.9 Hz, 1H, Ar-H), 8.07 (d, J = 16.2 Hz, 1H, C=CH), 7.77 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.50 (d, J = 16.2 Hz, 1H, C=CH), 7.44-7.32 (m, 2H, Ar-H), 7.13-7.05 (m, 1H, Ar-H), 6.90 (d, J = 2.2 Hz, 2H, Ar-H), 6.51 (t, J = 2.1 Hz, 1H, Ar-H), 3.82 (s. 6H, OCH3);
13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6), δ: 161.41, 161.22, 153.77, 153.43, 138.98, 138.63. 136.99,
134.87, 128.97, 128.18, 127.55, 121.48, 118.03, 111.66, 105.51, 101.41, 55.73; m/z = 309.47 [M+2H]+.
P r z y k ł a d 5.
2-[2-(3,4-Diacetoksy-5-metoksy-fenylo)-winylo]-8-hydroksychinolina.
3
8-hydroksy-2-metylochinolinę (2,5 mmol) rozpuszczono w bezwodniku octowym (10 cm ), dodano 3,4-dihydroksybenzaldehydu (5 mmol) i mieszano przez 16 h w temperaturze 130°C, w atmosferze azotu. Następnie odparowano bezwodnik octowy i krystalizowano z etanolu. Otrzymano żółty osad o temperaturze topnienia 172°C z wydajnością 72%; czystość HPLC 96.65%; UV (nm). Xmax/log ε: 296.0/3.52;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ: 8.44 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.87 (dd, J = 10.6, 4.9 Hz, 2H, Ar-H), 7.79 (d, J = 16.2 Hz, 1H, C=C-H), 7.58 (t, J = 7.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.51 (ddd, J = 18.0, 5.2, 1.5 Hz, 2H, Ar-H), 7.44 (d, J = 1.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.27 (d, J = 1.5 Hz, 1H. Ar-H), 3.91 (s, 3H, OCH3), 2.32 (s, 3H, CH3), 2.30 (s, 3H, CH3);
PL 222 759 B1 13C-NMR (101 MHz, DMSO-de). δ: 169.88, 168.69, 168.05, 155.57, 152.79, 147.53, 143.85,
140.88, 137.29, 135.14, 133.85, 132.29, 130.23, 128.74, 126.34, 122.31, 121.22, 114.79, 109.28, 56.87, 21.23, 20.81; m/z = 395.70 [M+2H]+.
P r z y k ł a d 6.
2-[2-(2,4-Diacetoksy-fenylo)-winylo]-8-acetoksychinolina.
3
8-hydroksy-2-metylochinolinę (2,5 mmol) rozpuszczono w bezwodniku octowym (10 cm ), dodano 2,4-dihydroksybenzaldehydu (5 mmol) i mieszano przez 16 h w temperaturze 130°C, w atmosferze azotu. Następnie odparowano bezwodnik octowy i krystalizowano z etanolu. Otrzymano żółty osad o temperaturze topnienia 159°C z wydajnością 81%; czystość HPLC 96.77%; UV (nm), Xmax/iog ε: 292.5/3.56;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ: 8.43 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 8.01 (d, J = 8.6 Hz, 1H. Ar-H), 7.91-7.85 (m, 2H, Ar-H), 7.75 (d, J = 16.3 Hz, 1H, C=C-H), 7.61-7.52 (m, 2H, Ar-H), 7.48 (d, J = 16.2 Hz, 1H, C=C-H), 7.17 (dd, J = 8.5, 2.4 Hz, 1H, Ar-H), 7.13 (d, J = 2.3 Hz, 1H, Ar-H), 2.47 (s, 3H, CH3), 2.41 (s, 3H, CH3), 2.30 (s. 3H, CH3);
13C-NMR (101 MHz, DMSO-Ć6). δ: 169.70, 169.50, 169.36, 155.32, 151.40, 149.32, 147.54, 140.76, 137.36, 131.04, 128.83, 128.07, 127.14, 126.91, 126.60, 126.16, 122.19, 121.83, 120.61, 117.51,21.31,21.20, 21.10; m/z = 407.75 [M+2H]+.
P r z y k ł a d 7.
2-[2-(2-Hydroksy-fenylo)-winylo]-chinolina.
Sposób otrzymania został opisany w literaturze: Polanski et al. Bioorg. Med. Chem., 2012, 20, 6960. Żółty osad o temperaturze topnienia 205°C; wydajność 6,1%; czystość HPLC 96,13%; UV (nm), Xmax/iog ε: 346.2/3.61;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ: 9.99 (s, 1H, OH), 8.33 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 8.05 (d, J = 16.5 Hz, 1H, C=CH), 7.99 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.93 (t. J = 7.4 Hz, 1H, Ar-H), 7.80 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.74 (ddd, J = 6.9, 5.9, 1.4 Hz, 1H, Ar-H), 7.70 (dd, J = 7.7, 1.4 Hz. 1H, Ar-H), 7.57-7.52 (m, 1H, Ar-H), 7.48 (d, J = 16.5 Hz, 1H, C=CH), 7.22-7.15 (m, 1H, Ar-H), 6.96-6.91 (m, 1H, Ar-H), 6.87 (t, J = 7.5 Hz, 1H, Ar-H);
13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6), δ: 156.63, 156.30, 148.19, 136.89, 131.22, 130.24, 130.04, 129.09, 128.47, 128.24, 127.87, 127.40, 126.41, 123.48, 120.51, 119.90, 116.52.
P r z y k ł a d 8.
2-{2-[4-(3,3-Dimetylobut-1-ynylo-fenylo)]-winylo}-chinolina.
Sposób otrzymania został opisany w literaturze: Musiol et al. International Bulletin of Pharmaceutical Sciences, 2012, 1, 3. Żółty osad o temperaturze topnienia 153°C; wydajność 60%;
1H-NMR (499 MHz, CDCfe), δ: 8.13 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 8.10 (d. J = 8.5 Hz, 1H, Ar-H). 7.80 (dd, J = 6.5 Hz, J = 2.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.75-7.69 (m, 1H, Ar-H), 7.68-7.63 (m, 2H, Ar-H), 7.57 (d, J = 8.2 Hz, 2H, Ar-H), 7.51 (ddd, J = 8.1,6.9, 1.1 Hz, 1H, Ar-H), 7.43 (dd, J = 8.1 Hz, J = 1.4 Hz, 2H, Ar-H), 7.38 (s, 1H, Ar-H), 1.36 (s, 9H, CH3);
13C-NMR (125 MHz, CDCis). δ: 155.73, 148.26, 136.21, 135.58, 133.60, 131.85, 129.61. 129.23, 127.72, 126.82, 126.06, 124.23, 119.20, 99.97, 78.88, 30.98, 27.99; m/z = 312.17 [M+H]+.
P r z y k ł a d 9.
2-[2-(4-Butoksy-fenyio)-winyio]-chinoiina.
3
2-metylochinolinę (2,5 mmol) rozpuszczono w bezwodniku octowym (10 cm), dodano 4-butoksybenzaidehydu (5 mmol) i mieszano przez 16 h w temperaturze 130°C, w atmosferze azotu. Następnie odparowano bezwodnik octowy i krystalizowano z etanolu. Otrzymano beżowy osad o temperaturze topnienia 93°C z wydajnością 24%;
1H-NMR (400 MHz, CDCi2). δ: 8.13 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 8.09 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.80 (d, J = 8.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.73 (d, J = 8.3 Hz, 1H, Ar-H), 7.71-7.67 (m, 1H, Ar-H), 7.65 (d, J = 7.2 Hz, 1H, Ar-H), 7.60 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Ar-H), 7.50 (t, J = 7.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.33 (s, 1H, Ar-H), 6.95 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Ar-H), 4.03 (t, J = 6.5 Hz, 2H, OCH2), 1.86-1.77 (m, 2H, CH2), 1.59-1.48 (m, 2H, CH2), 1.01 (t, J = 7.4 Hz, 3H, CH3);
13C-NMR (101 MHz, CDCi2), δ: 159.09, 157.41, 135.51, 134.74, 130.62, 129.59, 128.89, 128.71, 127.51, 127.47, 127.14, 126.89, 126.40, 122.25, 118.97, 114.86, 114.24, 67.76, 31.30, 19.24, 13.84; m/z = 304.34 [M+H]+.
PL 222 759 B1
P r z y k ł a d 10.
2-[2-(4-Etoksy-fenylo)-winylo]-chinolina.
Sposób otrzymania został opisany w literaturze: Polanski et al. Bioorg. Med. Chem., 2012, 20, 6960. Żółty osad o temperaturze topnienia 143-145°C; wydajność 17%; czystość HPLC 98.94%; UV (nm), Xmax/log ε: 346.2/3.62;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ: 8.32 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.98 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.93 (d, J = 8.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.84 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.79 (d, J = 16.3 Hz. 1H, C=CH), 7.73 (dd, J = 11.2, 4.2 Hz, 1H, Ar-H), 7.68 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Ar-H), 7.58-7.51 (m, 1H, Ar-H), 7.33 (d, J = 16.4 Hz, 1H, C=CH), 6.99 (d, J = 8.7 Hz, 2H, Ar-H), 4.08 (q, J = 6.9 Hz, 2H, OCH2), 1.35 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CH3);
13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6), δ: 159.60, 158.92, 157.11, 156.46, 148.17, 136.06, 134.35, 131.16, 130.22, 129.24, 128.25, 127.35, 126.81, 122.51, 120.25, 115.27, 114.59, 64.20, 15.10.
P r z y k ł a d 11.
2-[2-(3-Hydroksy-fenylo)-winyl]-8-hydroksychinolina.
Sposób otrzymania został opisany w literaturze: Polanski et al. Bioorg. Med. Chem., 2012, 20, 6960. Pomarańczowy osad o temperaturze topnienia 215°C; wydajność 50%; czystość HPLC 99,91%; UV (nm), Xmax/log ε: 296.9/3.55;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ: 10.93 (bs, 1H, OH), 9.73 (bs, 1H, OH), 8.68 (s, 1H, Ar-H), 8.24 (s. 1H, Ar-H), 8.14 (d, J = 16.3 Hz, 1H, C=CH), 7.72 (d, J = 16.3 Hz, 1H, C=CH), 7.62-7.50 (m, 2H. Ar-H), 7.31 (t. J = 7.8 Hz, 2H, Ar-H), 7.17 (d, J = 7.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.14 (d, J = 18.3 Hz, 1H, Ar-H), 6.86 (dd. J = 8.0, 1.8 Hz, 1H, Ar-H);
13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6), δ: 158.33, 153.17, 150.63, 141.76, 140.68, 137.34, 130.58, 129.06, 128.46, 123.86, 120.23, 119.37, 118.58, 117.78, 114.58; m/z = 264.45 [M+2H]+.
P r z y k ł a d 12.
2-[2-(2,4,6-Triacetoksy-fenylo)-winylo]-8-acetoksychinolina.
3
8-hydroksy-2-metylochinolinę (2,5 mmol) rozpuszczono w bezwodniku octowym (10 cm ). dodano 2,4,6-trihydroksybenzaldehydu (5 mmol) i mieszano przez 16 h w temperaturze 130°C, w atmosferze azotu. Następnie odparowano bezwodnik octowy i krystalizowano z etanolu. Otrzymano beżowy osad o temperaturze topnienia 189°C z wydajnością 41%; czystość HPLC 98.74%; UV (nm), Xmax/log ε: 290.1/3.53;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ; 8.44 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.95-7.85 (m, 2H, Ar-H), 7.57 (qd, J = 7.5, 3.0 Hz, 3H, Ar-H), 7.38 (d, J = 16.5 Hz, 1H, C=C-H), 7.13 (s, 2H, Ar-H), 2.45 (s, 3H, CH3), 2.37 (s, 6H, CH3), 2.30 (s, 3H, CH3);
13C-NMR (101 MHz, DMSO-d6), δ: 169.60, 169.16, 169.12, 155.05, 150.43, 149.91, 147.58, 140.65, 137.51, 134.23, 128.96, 126.76, 126.17, 123.67, 122.16, 121.84, 120.98, 116.29, 115.65, 31.13, 21.26, 21.18, 21.01; m/z = 465.98 [M+2H]+.
P r z y k ł a d 13.
2-[2-(3-Metoksy-fenylo)-winylo]-8-hydroksychinolina.
3
8-hydroksy-2-metylochinolinę (2,5 mmol) rozpuszczono w bezwodniku octowym (10 cm ). dodano 3-metoksybenzaldehydu (5 mmol) i mieszano przez 16 h w temperaturze 130°C. w atmosferze azotu. Następnie odparowano bezwodnik octowy, dodano pirydynę (9 cm) i wodę (3 cm ), całość mieszano przez 3 h w temperaturze 100°C. Odparowano pirydynę pod zmniejszonym ciśnieniem. Mieszaninę oczyszczano na kolumnie chromatograficznej w układzie octan etylu:heksan (1:2). Otrzymano żółty osad o temperaturze topnienia 115°C z wydajnością 54%; czystość HPLC 98.78%; UV (nm). Xmax/log ε: 294.9/3.54;
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6), δ: 9.55 (bs, 1H, OH), 8.30 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 8.10 (d, J = 16.2 Hz, 1H, C=C-H), 7.78 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.50 (d, J = 16.2 Hz, 1H, C=C-H), 7.40-7.34 (m, 3H, Ar-H), 7.32-7.28 (m, 2H, Ar-H), 7.10 (dd, J = 7.0, 1.8 Hz, 1H, Ar-H), 6.94 (dd, J = 8.1, 1.5 Hz, 1H, Ar-H), 3.84 (s, 3H, OCH3);
13C-NMR (101 MHz, DMSO-deA δ; 160.15, 153.82, 153.42, 138.63, 138.42, 136.98, 134.76, 130.37, 128.76, 128.17, 127.47, 121.45, 120.23, 118.04, 115.05, 112.46, 111.59, 55.59; m/z = 302.42 [M+Na+2H]+.
PL 222 759 B1
P r z y k ł a d 14.
2-[2-(2,3,4-Triacetoksy-fenylo)-winylo]-8-acetoksychinolina.
8-hydroksy-2-metylochinolinę (2,5 mmol) rozpuszczono w bezwodniku octowym (10 cm ), dodano 2,3,4-trihydroksybenzaldehydu (5 mmol) i mieszano przez 16 h w temperaturze 130°C, w atmosferze azotu. Następnie odparowano bezwodnik octowy i krystalizowano z etanolu. Otrzymano biały osad o temperaturze topnienia 194°C z wydajnością 88%; czystość HPLC 98.64%; UV (nm), 7max/log ε: 293.7/3.53;
1 H-NMR (400 MHz, DMSO-^), 8: 8.44 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.97-7.85 (m, 3H, Ar-H), 7.71 (d, J = 16.3 Hz, 1H, C=C-H), 7.62-7.49 (m, 3H, Ar-H), 7.36-7.31 (m, 1H, Ar-H), 2.47 (s, 3H, CH3), 2.44 (s, 3H, CH3), 2.35 (s, 3H, CH3), 2.31 (s, 3H, CH3);
13C-NMR (101 MHz, DMSO-Ć6), δ: 169.69, 168.60, 168.43, 167.65, 155.10, 147.57, 143.69, 142.04, 140.76, 137.40, 135.70, 131.95, 128.89, 128.61, 126.71, 126.64, 126.16, 124.27, 122.22, 121.94, 121.86, 21.08, 20.85, 20.59, 20.32; m/z = 466.03 [M+2H]+.
P r z y k ł a d 15.
2-[(4-tert-Butylo-fenylo)-etynylo]-chinolina.
Sposób otrzymania został opisany w literaturze: Musiol et al. International Bulletin of Pharmacentical Sciences, 2012, 1, 3. Beżowy osad o temperaturze topnienia 99°C; wydajność 22%;
1H-NMR (499 MHz, DMSO-cfe), 8: 8.43 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Ar-H), 8.06-7.99 (m, 2H, Ar-H), 7.87 -7.79 (m, 1H, Ar-H), 7.73 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Ar-H), 7.69-7.65 (m, 1H, Ar-H), 7.62 (d. J = 8.5 Hz, 2H, Ar-H), 7.52 (d, J = 8.5 Hz, 2H, Ar-H), 1.31 (s, 9H, CH3);
13C-NMR (125 MHz, DMSO-^), 8: 153.03, 148.16, 143.28, 137.14, 132.19, 130.83, 129.04, 128.43, 127.79, 127.31, 126.26, 124.77, 118.76, 89.83, 89.53, 35.16, 31.31; m/z = 286.41 [M+H]+.
P r z y k ł a d 16.
Kwas 2-(3,4-dichlorofenyloetylo)-5-hydroksychinolino-6-karboksylowy.
Kwas 5-hydroksy-2-metylochinolino-6-karboksylowy (1 mmola) rozpuszczono w świeżo przede3 stylowanym THF-ie (7,5 cm ) i dodano LDA (4 mmol). Całość mieszano przez 1 h, utrzymując temperaturę 0°C, w atmosferze azotu. Następnie dodano chlorek 3,4-dichorobenzylu (1,5 mmola) i mieszano przez 4 h w temperaturze pokojowej. Do mieszaniny poreakcyjnej dodano wody destylowanej 3 (25 cm ) i ekstrahowano eterem dietylowym. Frakcję wodną zakwaszono 20% HCl do lekko kwasowego odczynu. Wytrącony żółty osad przesączono i oczyszczano na kolumnie chromatograficznej w układzie metanol:chloroform (1:1). Otrzymano żółty osad o temperaturze topnienia 210-211°C z wydajnością 28%.
1H-NMR (400 MHz. DMSO-cfe), 8: 8.67 (d, J = 8.2 Hz, 1H, Ar-H), 8.01 (d, J = 8.9 Hz, 1H, Ar-H), 7.60 (d, J = 1.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.57-7.48 (m, 2H, Ar-H), 7.35 (d, J = 9.0 Hz. 1H, Ar-H), 7.27 (d, J = 8.2 Hz, 1H, Ar-H), 3.30 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH2), 3.13 (t, J = 7.7 Hz, 2H, CH2);
13C-NMR (101 MHz. DMSO-Ć6), 8: 172.15, 163.26, 162.52, 149.34, 142.72, 134.64, 131.34, 130.98, 130.85, 130.78, 129.32, 129.12, 121.21, 119.51, 115.55, 108.05, 38.54, 33.64; m/z = 386.37 [M+H+Na]+.
P r z y k ł a d 17.
Poniżej w tabeli zebrano najważniejsze parametry spektroskopowe potwierdzające, iż przedstawione pochodne styrylochinoliny nadają się do obrazowania struktur biologicznych sposobem według wynalazku.
PL 222 759 B1
| Przykładowy związek | Zakres absorpcji /ran | Położenie pasm absorpcji λ/nm (ε/Μ~ cm1) | Maksimum fluorescencji A-mor ί n m | Intensywność fluorescencji0 |
| Przykład 1 | 250- 408 | 290 (2.54E+05) 342 (3.38E+05) 356 (3.35E+05) | 402 | 2833 |
| Przykład 2. | 250 420 | 360 (4.40E+05) | 411 | 9990* |
| Przykład 3. | 250 420 | 344 (3.26E+04) | 463 | 9201 |
| Przykład 4. | 250 410 | 304 (3.38E+05) 348 (1.95E+05) | 464 | 2722 |
| Przykład 5. | 250 422 | 288 (2.23E+05) 350 (2.18E+05) | 410 | 6168 |
| Przykład 6. | 250 406 | 286 (2.92E+05) 346 (2.36E+05) | 413 | 3418 |
| Przykład 7. | 250 412 | 282 (1.83E+O5) 358 (2.11E+05) | 438 | 4934 |
| Przykład 8. | 250 400 | 292 (2.21E+05) 346 (3.65E+05) 360 (3.70E+05) | 407 | 5290* |
| Przykład 9. | 250- 412 | 290 (1.49E+05) 358 (2.42E+05) | 438 | 2948 |
| Przykład 10, | 250- 410 | 358 (2.08E+05) | 438 | 2441 |
| Przykład 11. | 250- 422 | 300 (2.53E+05) 350(1.48E+05) | 462 | 1804 |
| Przykład 12. | 250- 392 | 284 (2.43E+05) 340(1.72E+05) | 407 | 1552 |
| Przykład 13. | 250- 412 | 298 (3.56E+05) 348 (1.97E+05) | 468 | 2184 |
| Przykład 14. | 250- 422 | 288 (2.58E+O5) 346 (2.22E+05) | 410 | 941 |
| Przykład 15. | 246- 362 | 278 (1.76E+05) 316 (1.22E+05) 330 (1.39E+05) | 367 | 2193 |
PL 222 759 B1
PL 222 759 B1
Przykład 18.
Przykładowe widma absorpcji i emisji związków opisanych wynalazkiem. Związek z przykładu 2:
Widmo absorpcji
Widmo emisji (wzbudzenie 360 nm) Stężenia na wykresie (od najwyższego): l,95e-7, 9,77e-8, 4,7e-8 M stężenie roztworu c b stężenie roztworu c
Abs 3.0-( 2.5 ( 2,0-(
1.5I.O7
0.5(
0.0-7
-0.5- 200
200
300
500 600 700
| 9 OH | F | 250- 424 | 300 (3.65E+05) 342 (1.75E+05) | 478 | 1633 | ||||
| •r OAc | F 9/ | 250- 406 | 280 (3.16E+05) 344 (2.18E+05) | 408 | 861 |
= 1.56E-6M = 1.95E-7M
PL 222 759 B1
P r z y k ł a d 19.
Sposób obrazowania struktur komórkowych.
Przykładowa procedura barwienia komórek ludzkiego nowotworu jelita grubego HCT-116. 10 tys. komórek w 300 μl medium hodowlanego DMEM inkubowano do uzyskania odpowiedniej konfluencji (24 h). Barwnik z przykładu 2 podano w 2 μl DMSO osiągając stężenia 2, 10, 25 i 50 μM i pozostawiono na okres potrzebny do wniknięcia związków do błony lipofilowej. Związki opisane wynalazkiem wnikają już po kilkunastu minutach, najlepsze wyniki osiągano po 15 minutach. Inkubacja przedłużona do 4 h nie wpływa znacząco na uzyskane efekty. Po tym czasie odlano medium z barwnikiem, komórki przemyto buforem PBS, dodano ilość PBS potrzebną do zakrycia komórek (ok. 200 μl na dołek w płytce 96 dołkowej) i obserwowano przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego w kontraście fazowym oraz po wzbudzeniu filtrem DAPI. Na rysunku (fig. 1 i fig. 2) przedstawiono zdjęcia wykonane podczas obserwacji potwierdzające skuteczność proponowanych barwników. W analogiczny sposób przeprowadzono oznaczenia dla barwników z przykładów 4 i 8, które również okazały się skuteczne.
PL 222 759 B1
P r z y k ł a d 20.
Sposób obrazowania struktur komórkowych w ludzkich komórkach nabłonka (NHDF). Około 6 tys. komórek w 300 μΐ medium hodowlanego DMEM inkubowano do uzyskania odpowiedniej konfiuencji (24 h). Barwnik z przykładu 2 podano w 2 μi DMSO osiągając stężenia 2, 10, 25 i 50 μM i pozostawiono na 1 h dla wniknięcia związków do błony komórkowej. Po tym czasie odlano medium z barwnikiem, komórki przemyto buforem PBS, dodano ilość PBS potrzebną do zakrycia komórek (ok. 200 μi na dołek w płytce 96 dołkowej) i obserwowano zabarwione struktury przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego w kontraście fazowym oraz po wzbudzeniu filtrem DAPI. Zastosowanie wskazanych barwników pozwala obserwować zmiany zachodzące w komórkach nabłonka podczas ich podziału. W anaiogiczny sposób przeprowadzono barwienie dla związku z przykładu 8, które również okazało się skuteczne.
P r z y k ł a d 21.
Sposób obrazowania selektywnego przy pomocy pochodnych styrylochinoliny oraz komercyjnie dostępnych barwników podczas obserwacji zmian w strukturach komórkowych. Materiał biologiczny (komórki nowotworowe o zmienionej ekspresji genów TP53) przygotowany podobnie jak w przykładach 19, 20 poddano działaniu związków toksycznych (doksorubicyny) a następnie wybarwiono komercyjnie dostępnym barwnikiem MitoTracker® Orange CMTMRos (100 nM; 30 min) oraz związkiem z przykładu 2. Następnie komórki przepłukano PBS i ponownie wprowadzono do medium. Obserwacja była prowadzona w czasie kilku godzin przy wzbudzonych selektywnie barwnikach. Zastosowana procedura pozwala na selektywną obserwację zmian zachodzących w specyficznych miejscach komórek pod wpływem substancji cytotoksycznych. W analogiczny sposób wykonano barwienie komórek przy pomocy komercyjnie dostępnego barwnika LysoTracker®Yeiiow-HCK-123 (5 μM; 1 h) oraz związków z przykładów 4 i 8.
Zastosowanie pochodnych stryrylochinoliny według wynalazku pozwala obserwować błonę komórkową oraz inne lipofilowe struktury, szczególnie pod kątem powstających nieprawidłowości. Korzystnie można przy pomocy barwników określać stopnień uszkodzenia komórek, w tym określać rodzaj śmierci komórkowej. Niska toksyczność związków opisanych wynalazkiem jest korzystna dla badań wymagających dłuższej obserwacji, na przykład testów przeżyciowych.
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób obrazowania struktur biologicznych, zwłaszcza błon biologicznych i struktur lipofilowych, prowadzony w warunkach in vitro, znamienny tym, że do obrazowanych struktur wprowadza się barwniki fluorescencyjne w postaci pochodnych styrylochinoliny przedstawionych wzorem 1, w którym: L oznacza łącznik dwuwęglowy nasycony lub nienasycony; podstawniki R1-R4 oznaczają atom wodoru, atom chlorowca, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową zawierającą od jednego do sześciu atomów węgla, grupę acylową; podstawnik R5 oznacza atom wodoru, atom chlorowca, grupę hydroksylową, grupę alkoksylową zawierającą od jednego do sześciu atomów węgla, grupę acylową, grupę alkilową zawierającą do czterech atomów węgla, również podstawioną lub grupę etynylową również podstawioną pierścieniem fenylowym lub korzystnie grupą tert-butylową, natomiast podstawniki R6-R9 oznaczają atom wodoru, grupę hydroksylową, acylową lub karboksylową, następnie wprowadzone do struktur biologicznych barwniki fluorescencyjne wzbudza się światłem w zakresie 250 -450 nm, korzystnie 340-360 nm, szczególnie korzystnie przy pomocy standardowych filtrów DAPI, a odczytu poziomu fluorescencji dokonuje się z wykorzystaniem emisji mieszczącej się w zakresie światła niebieskiego.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako źródło wzbudzenia stosuje się laser, światło ksenonowe lub halogenowe.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że barwniki stosuje się w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych preparatów, zwłaszcza takich jak sole, roztwory lub żele.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL406315A PL222759B1 (pl) | 2013-11-29 | 2013-11-29 | Sposób obrazowania struktur biologicznych |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL406315A PL222759B1 (pl) | 2013-11-29 | 2013-11-29 | Sposób obrazowania struktur biologicznych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL406315A1 PL406315A1 (pl) | 2015-06-08 |
| PL222759B1 true PL222759B1 (pl) | 2016-09-30 |
Family
ID=53269128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL406315A PL222759B1 (pl) | 2013-11-29 | 2013-11-29 | Sposób obrazowania struktur biologicznych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL222759B1 (pl) |
-
2013
- 2013-11-29 PL PL406315A patent/PL222759B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL406315A1 (pl) | 2015-06-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5997288B2 (ja) | ナフタレンを基本骨格とする二光子蛍光プローブ、その製造方法及びその利用方法 | |
| CN105566938B (zh) | 一类线粒体靶向的七甲川吲哚花菁染料及制备方法和应用 | |
| Daly et al. | BF2-azadipyrromethene NIR-emissive fluorophores with research and clinical potential | |
| CN102762555B (zh) | 荧光细胞标记 | |
| CN103820104B (zh) | 一类以尼罗蓝为母体的近红外荧光探针、其制法及应用 | |
| CN105339436A (zh) | 4，4-二取代环己基桥连七甲川花菁染料及其应用 | |
| CN111196819A (zh) | 一类d-a-d型苯并吡嗪类化合物及制备方法和应用 | |
| Henary et al. | Near infrared active heptacyanine dyes with unique cancer-imaging and cytotoxic properties | |
| Ma et al. | Synthesis, optical properties and cytotoxicity of meso-heteroatom substituted IR-786 analogs | |
| CN116768789A (zh) | 一种聚集诱导发光自报告光敏剂探针及其制备方法与应用 | |
| Zhu et al. | Design, synthesis and biological evaluation of vinyl selenone derivatives as novel microtubule polymerization inhibitors | |
| WO2021176428A1 (en) | Phenanthroline, carbazole and flavylium based cyanines and compositions and methods of making and using the same | |
| EP3464293B1 (en) | Molecular probes for detection and imaging of pancreatic cancer | |
| Bora et al. | Exploration of cytotoxic potential and tubulin polymerization inhibition activity of cis-stilbene-1, 2, 3-triazole congeners | |
| Liao et al. | Tetraphenylporphyrin derivatives possessing piperidine group as potential agents for photodynamic therapy | |
| JP5353509B2 (ja) | 新規錯体化合物、並びにそれを用いた酸素濃度測定試薬および癌の診断薬 | |
| Xu et al. | Two-photon absorption and cell imaging of two multi-branched dyes based on curcumin | |
| CN107118206A (zh) | 一类喹啉‑二吡啶衍生物Zn2+荧光探针及其应用 | |
| Jiang et al. | Novel selenium-containing photosensitizers for near-infrared fluorescence imaging-guided photodynamic therapy | |
| Chow | Two-photon induced emissive thiophene donor–acceptor systems as molecular probes for in vitro bio-imaging: synthesis, crystal structure, and spectroscopic properties | |
| PL222759B1 (pl) | Sposób obrazowania struktur biologicznych | |
| CN102617554A (zh) | 一类以萘为母体的双光子荧光探针、其制备方法及应用 | |
| PL233179B1 (pl) | Nowe zastosowanie pochodnych para-iminostyrylochinoliny | |
| CN105820597B (zh) | 含高能磷酸键的荧光染料 | |
| RU2707972C1 (ru) | 4-(2,4-диметоксифенил)-2-(2-гидроксифенил)-5,6-дигидро-4н-бензо[h]хромен-3-карбоновая кислота, обладающая цитотоксической активностью |