PL218693B1 - Sposób wytwarzania preparatu peptydowego - Google Patents
Sposób wytwarzania preparatu peptydowegoInfo
- Publication number
- PL218693B1 PL218693B1 PL388408A PL38840809A PL218693B1 PL 218693 B1 PL218693 B1 PL 218693B1 PL 388408 A PL388408 A PL 388408A PL 38840809 A PL38840809 A PL 38840809A PL 218693 B1 PL218693 B1 PL 218693B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- colostrum
- mixture
- minutes
- cooled
- acetone
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 79
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 claims description 35
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 claims description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000012465 retentate Substances 0.000 claims description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 5
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 4
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 claims 1
- 101710088675 Proline-rich peptide Proteins 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 6
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 4
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002682 neurofibrillary tangle Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108010043324 Amyloid Precursor Protein Secretases Proteins 0.000 description 1
- 102000002659 Amyloid Precursor Protein Secretases Human genes 0.000 description 1
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000000899 L-alpha-glutamyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 108010023244 Lactoperoxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000045576 Lactoperoxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010074506 Transfer Factor Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- -1 a-lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 1
- 108010067454 caseinomacropeptide Proteins 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000006951 hyperphosphorylation Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000000686 immunotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 1
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 229940057428 lactoperoxidase Drugs 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000006386 memory function Effects 0.000 description 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N methanol Natural products OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000000506 psychotropic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania preparatu peptydowego z siary ssaków hodowlanych, wykazującego aktywność immunostymulacyjną, zawierającego głównie peptydy o masach cząsteczkowych nie przekraczających 10 kDa i charakteryzujących się wysoką zawartością proliny (ok. 20%) oraz aminokwasów kwaśnych (ok. 18%). Peptydy i białka o wysokiej zawartości proliny występują powszechnie zarówno w organizmach zwierzęcych jak i roślinnych. Siara jest gęstym płynem wydzielanym przez matki ssacze przez kilka dni po porodzie i stanowi pierwszy pokarm noworodka. Grupą peptydów bogatych w prolinę jest kompleks kilkudziesięciu peptydów po raz pierwszy wyizolowany z siary owczej i scharakteryzowany w 1974 r. przez zespół Janusz M., Lisowski J., Franek F. (Isolation and characterization of a prolin-rich polypeptide from ovine Colostrums, FEBS Lett. 1974, 49, 276-279). Stwierdzono później, że analogi tego polipetydu są składnikiem siary także innych ssaków, który wraz z laktoferyną, glikomakropeptydem, a-laktoalbuminą, β-laktoglobuliną i lizozymem oraz laktoperoksydazą tworzy w mleku, ważny dla oseska, zespół białek aktywnych biologicznie. Kompleks peptydów bogatych w prolinę występuje w siarze w formie związanej z frakcją immunoglobulin IgG2 wskazując na jego immunotropowe właściwości. Stężenie kompleksu zależy od okresu laktacji i największe jest w pierwszych godzinach po porodzie.
Z patentu amerykańskiego nr US 6268487 pt: „Purification of biologically active peptides from milk” znany jest sposób izolacji składników mleka w wyniku filtracji.
Zastosowanie ultrafiltracji na selektywnych błonach filtracyjnych, w warunkach ustalonego odczynu pH w granicach 6,3 - 7,0 i w temperaturze 30-60°C do izolacji białek serwatkowych ujawniono w patencie amerykańskim nr US 4485040 pt.: „Process for obtaining on alpha-lakctalbumin enriched product from whey, and uses thereof”.
W amerykańskim patencie nr US 4816563 pt.: „Process for obtaining transfer factor from colostrum, transer faktor so obtained and use thereof” ujawniono metodę izolacji składników siary lub mleka przy zastosowaniu ultrafiltracji lub dializy.
W brytyjskim opisie patentowym GB 1179384 pt.: „Extraction of a Therapeutically Active Glycoprotein and Compositions containing it” opublikowano metodę ekstrakcji glikoproteinowych substancji aktywnych ze śliny zwierzęcej lub gruczołów ślinowych zwierząt przy użyciu acetonu.
W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT/GB2004/001014 pt.: „Purification of peptides from colostrum” ujawniono sposób wyodrębniania peptydów z siary przy zastosowaniu ekstrakcji alkoholem w tym głównie alkoholem metylowym lub etylowym.
Istotą sposobu wytwarzania preparatu peptydowego z siary ssaków hodowlanych, wykazującego aktywność immunostymulacyjną, zawierającego głównie peptydy o masach cząsteczkowych nie przekraczających 10 kDa i charakteryzujących się wysoką zawartością proliny oraz aminokwasów kwaśnych jest to, że płynną siarę ssaków hodowlanych, świeżą lub mrożoną lub też uzyskaną z rozpuszczenia suszonej siary, chłodzi się i wiruje przez 20 minut przy prędkości obrotowej 8000 obr./min. w celu oddzielenia tłuszczu. Siarę rozcieńcza się dwukrotnie roztworem EDTA o stężeniu od 0,05M do 0,25M, najkorzystniej 0,1M i pozostawia na 30 minut. Mieszaninę następnie doprowadza się do temperatury w zakresie od 0°C do 25°C, korzystnie 5-10°C, a następnie mieszając, dodaje się aceton o tej samej temperaturze. Końcowe stężenie acetonu wynosi od 55% do 80%, najkorzystniej 65%. Mieszaninę ekstrahuje się mieszając przez okres od 5 do 60 minut, najkorzystniej 10 minut. Po ekstrakcji mieszaninę klaruje się poprzez wirowanie w temperaturze od 0°C do 25°C, najkorzystniej 5° przez 10 do 20 minut i prędkości obrotowej ok. 8000 obr./min. Ewentualnie do supernatantu dodaje się octanu amonu w takiej ilości by powstał układ dwóch faz: fazy acetonowej i fazy wodno-białkowej. Oddziela się fazę wodną od fazy acetonowej. Fazę wodno-białkową ogrzewa się, najkorzystniej pod zmniejszonym ciśnieniem, w celu odparowania zawartego w roztworze wodnym acetonu. Po oddzieleniu acetonu roztwór wstępnie klaruje się oddzielając zawiesinę cząstek stałych jednym ze znanych sposobów jak sączenie lub wirowanie i poddaje się procesowi ultrafiltracji przez membranę o granicznej przepuszczalności 1000 Da do uzyskania retentatu w ilości stanowiącej 1/5 objętości początkowej. Retentat przemywa się trzykrotnie równą objętością wody. Alternatywnie fazę wodno-białkową, po oddzieleniu acetonu, poddaje się dializie wobec wody. Dializat klaruje się oddzielając zawiesinę cząstek stałych jednym ze znanych sposobów jak sączenie lub wirowanie. Permeat z ultrafiltracji lub dializy odrzuca się, a retentat (dializat) zagęszcza się przez odparowanie części wody pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy rozpyłowo lub suszy bez wstępnego zagęszczania lub suszy w procesie liofilizacji. Uzyskuje się preparat peptydowy z około 20% zawartością proliny i około 18% zawartością aminokwasów kwaśnych.
PL 218 693 B1
Sposób według wynalazku pozwala wyizolować z siary kompleks peptydów bogatych w prolinę o wysokiej aktywności biologicznej, z dużą wydajnością. Sposób może być stosowany do otrzymywania kompleksu peptydów bogatych w prolinę bez względu na gatunkowe pochodzenie siary. Sposób pozwala stosować siarę zgromadzoną i przechowywaną przez dłuższy czas w formie proszku lub zamrożoną. Kompleksy peptydów bogatych w prolinę wykazują właściwości immunoregulatorowe. Mogą indukować dojrzewanie i różnicowanie tymocytów mysich i tworzenie limfocytów. Są mocnym induktorem wydzielania kluczowych dla układu immunologicznego cytokin mianowicie: interferonu INF-γ, TNF -a jak również interleukiny IL-6 i IL-Ιβ w hodowli komórek pełnej krwi obwodowej. Powyższe właściwości biologiczne w zestawieniu z wiadomościami dotyczącymi patogenezy choroby Alzheimera, a szczególnie potwierdzony hamujący wpływ cytokin oraz interleukin na powstawanie złogów amyloidu β, pozwoliły na sformułowanie hipotezy o terapeutycznych zdolnościach tego kompleksu wobec schorzeń o podłożu neurodegeneracyjnym. Nie poznano dokładnego neuroprotekcyjnego mechanizmu działania peptydów bogatych w prolinę w chorobie Alzheimera. Choroba Alzheimera jest demencją, pod pojęciem której kryje się wiele symptomów towarzyszących chorobom i zaburzeniom, prowadzącym do pogorszenia funkcji mózgu (m.in. pamięć, racjonalność, rutyna). 50 - 70% przypadków demencji jest wynikiem choroby degeneracyjnej wywoływanej neurologicznymi zmianami w strukturze mózgu, takimi jak powstawanie amyloidowych płytek starczych z fragmentów β-amyloidu 1-42 (Αβ1-42) proteolitycznie zwolnionego z białka prekursorowego APP pod wpływem sekretaz oraz tworzenie się splotów neurofibrylarnych (NFT, Neurofibrillary Tangles) na skutek hiperfosforylacji białka TAU.
Udowodniona została aktywność psychotropowa kompleksów bogatych w prolinę in vivo. Podawanie starym szczurom kompleksu peptydów bogatych w prolinę prowadziło do usprawnienia funkcji pamięciowych charakterystycznych dla osobników młodych, a w szczególności polepszenia pamięci przestrzennej i incydentalnej.
Sposób według wynalazku przedstawiono w przykładach.
Na rysunku Fig. 1 przedstawia schemat postępowania według wynalazku.
Kompleks peptydów bogatych w prolinę o ciężarze cząsteczkowym do 10000 Da, otrzymany z siary krowiej sposobem według wynalazku, posiada następujący skład aminokwasowy:
T a b e l a 1
Skład aminokwasowy kompleksów bogatych w prolinę otrzymanych z siary krowiej w porównaniu z kompleksem z siary owczej wg Janusz et. al. (FEBS LETTERS 1974. 49, 276-279) produkt referencyjny
| Reszty amino-kwasowe | Siara owcza wg Janusz et. al. (FEBS LETTERS 1974. 49, 276-279) produkt referencyjny /%/ | Kompleks peptydów bogatych w prolinę otrzymany sposobem według wynalazku /%/ |
| 1 | 2 | 3 |
| Asp/Asn | 2.56 | 4.81 |
| Ser | 5.27 | 6.57 |
| Glu/Gln | 14.90 | 14.01 |
| Gly | 2.32 | 3.76 |
| His | 1.94 | 2.78 |
| Arg | 1.80 | 2.96 |
| Thr | 6.55 | 4.28 |
| Ala | 1.38 | 3.27 |
| Pro | 22.90 | 20.68 |
| Tyr | 1.62 | 2.18 |
| Val | 12.85 | 9.85 |
| Met | 3.93 | 3.24 |
PL 218 693 B1 cd. tabeli 1
| 1 | 2 | 3 |
| Lys | 7.16 | 4.47 |
| Ile | 2.48 | 6.36 |
| Leu | 9.60 | 8.24 |
| Phe | 4.72 | 4.31 |
| Trp | N.D. | N.D. |
| Cys | 1.05 | N.D. |
P r z y k ł a d I
Kompleks peptydów bogatych w prolinę uzyskano z siary krowiej pobieranej w ciągu 24 godzin po porodzie. Siarę wirowano w temp. 4°C przez 20 min przy 8000 obr./min celem usunięcia tłuszczu. Następnie rozcieńczano równą objętością 0,1M roztworu EDTA, i pozostawiono 30 min w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór ochłodzono do temperatury 5°C i dodawano do niego, przy ciągłym mieszaniu, aceton o temperaturze 5°C do końcowego stężenia 65%. Mieszaninę ekstrahowano 10 minut po czym odwirowywano w temp. 5°C przez 20 min przy 8000 obr./min. Osad odrzucono. Supernatant odparowywano pod próżnią do całkowitego pozbycia się acetonu, zakwaszano 1M roztworem kwasu solnego do pH 6 i dializowano w 5°C przez membranę o przepuszczalności granicznej 1 kDa wobec 5 krotnie zmienianej wody. Dializat klarowano poprzez filtrację przez sączek bibułowy. Permeat odrzucano. Retentat (dializat) zawierający peptydy i polipeptydy o masach powyżej 1000 Da po liofilizacji stanowił finalny produkt o zawartości proliny 20,6%.
P r z y k ł a d II
Siarę krowią mrożoną odtłuszczoną jak w przykładzie I rozcieńczano równą objętością 0,05M roztworu EDTA i pozostawiono 30 min w temp. pokojowej. Następnie temperaturę roztworu ustalano na 5°C i dodawano do niego, przy ciągłym mieszaniu, aceton o temperaturze 5°C do końcowego stężenia 75%. Mieszaninę ekstrahowano 60 min, po czym odwirowywano w temp. 4°C przez 10 min przy 8000 obr./min. Osad odrzucono. Celem wydzielenia frakcji wodnej białek do roztworu acetonowego dodawano octanu amonu in substantia do stężenia 8%. Po utworzeniu układu dwufazowego, wodny roztwór białek oddzielano w rozdzielaczu i poddano odparowaniu celem usunięcia resztek acetonu.
Supernatant pozbawiony acetonu zakwaszono 1M roztworem HCl do pH 6, klarowano przez filtrację na sączku bibułowym i poddano ultrafiltracji w temperaturze 5°C, przez membranę o przepuszczalności granicznej 1 kDa (YM1) do uzyskania około 1/5 objętości początkowej, przemywając retentat trzykrotnie równą objętością wody. Permeat odrzucano. Retentat zawierający peptydy i polipeptydy o masach powyżej 1000 Da po wysuszeniu stanowił finalny. Uzyskano produkt o zawartości proliny 21%.
P r z y k ł a d III
Siarę krowią mrożoną, odtłuszczoną jak w przykładzie I rozcieńczano równą objętością 0,25M roztworu EDTA i pozostawiono 30 min w temperaturze pokojowej. Następnie temperaturę roztworu ustalano na 25°C i dodawano do niego, przy ciągłym mieszaniu, aceton o temperaturze 25°C do końcowego stężenia 55%. Mieszaninę ekstrahowano 5 min, po czym odwirowywano w temp. 4°C przez 20 min przy 8000 obr./min. Osad odrzucono. Supernatant poddano odparowaniu pod zmniejszonym ciśnieniem celem usunięcia acetonu.
Do supernatantu pozbawionego acetonu dodano 1M roztworu kwasu solnego do uzyskania pH 6 i klarowano przez filtrację na sączku bibułowym, po czym poddano ultrafiltracji w temperaturze 5°C, przez membranę o przepuszczalności granicznej 1 kDa (YM1), do uzyskania około 1/5 objętości początkowej przemywając retentat trzykrotnie równą objętością zimnej wody. Permeat odrzucano. Retentat zawierający peptydy i polipeptydy o masach powyżej 1000 Da po wysuszeniu stanowił finalny. Uzyskano produkt o zawartości proliny 20,3%.
P r z y k ł a d IV
Kompleksy peptydów bogatych w prolinę wykazują właściwości immunoregulatorowe. Są mocnym induktorem wydzielania kluczowych dla układu immunologicznego cytokin.
Indukcję cytokin in vitro przez kompleks peptydów bogatych w prolinę otrzymany sposobem według wynalazku opisanym w przykładzie I przeprowadzono na próbkach krwi pobranych od zdrowych ochotników. Pełną krew zawierającą 10 jednostek na 1 ml heparyny bez konserwantów rozcieńPL 218 693 B1 czono 1:10 na pożywce hodowlanej. Inkubację prowadzono na tej samej pożywce bez induktorów kontrola, w obecności kompleksu referencyjnego, w obecności kompleksu otrzymanego sposobem według wynalazku, albo w obecności 2 |ig/ml krwi fitohemaglutyniny (PHA) i 2 μο/ml krwi lipopolisacharydu (LPS). Próbki PHA i LPS są kontrolą dodatnią, ponieważ mogą stymulować maksymalną ilość cytokin.
W tabelach 2 i 3 przedstawiono wyniki badań wpływu kompleksu peptydów bogatych w prolinę otrzymanego sposobem według wynalazku na wydzielanie cytokin IL-6 i IL-1 β przez komórki pełnej krwi obwodowej w porównaniu z wpływem kompleksu otrzymanego znanym sposobem wg Janusz et. al. (FEBS LETTERS 1974. 49, 276-279) jako produktem referencyjnym.
T a b e l a 2
Wpływ kompleksu peptydów bogatych w prolinę otrzymanego sposobem według wynalazku, opisanym w przykładzie I, na wydzielanie cytokin IL-1 β przez komórki pełnej krwi obwodowej w porównaniu z wpływem kompleksu otrzymanego znanym sposobem wg Janusz et. al.
(FEBS LETTERS 1974. 49, 276-279) jako produktem referencyjnym.
| Próba | Stężenie ^-1β* |
| Dawka | [pg/ml] |
| kontrola | 4 |
| LPS+PHA | >1000 |
| (2 μg + 2 μg) | |
| Produkt referencyjny | |
| 1 μg | >1000 |
| 10 μg | >1000 |
| 100 μg | >1000 |
| Kompleks peptydów bogatych w prolinę otrzymany sposobem wg wynalazku 1 μg | >1000 |
| 10 μg | >1000 |
| 100 μg | >1000 |
| Medium hodowlane | 0 |
* Wartość średnia z oznaczeń na 5 próbach krwi obwodowej
T a b e l a 3
Wpływ kompleksu peptydów bogatych w prolinę otrzymanego sposobem według wynalazku, opisanym w przykładzie I, na wydzielanie cytokin IL-6 przez komórki pełnej krwi obwodowej w porównaniu z wpływem kompleksu otrzymanego znanym sposobem wg Janusz et. al. (FEBS LETTERS 1974. 49, 276-279) jako produktem referencyjnym.
| Próba | Stężenie IL-6* |
| Dawka | [pg/ml] |
| kontrola | 0 |
| LPS+PHA | |
| (2 μg + 2 μg) | >1700* (1500-2500) |
| Produkt referencyjny | |
| 1 μg | >1500 |
| 10 μg | >1500 |
| 100 μg | >1500 |
| Kompleks peptydów bogatych w prolinę otrzymany sposobem wg wynalazku 1 μg | >1500 |
| 10 μg | >1500 |
| 100 μg | >1500 |
| Medium hodowlane | 0 |
* Wartość średnia z oznaczeń na 5 próbach krwi obwodowej
PL 218 693 B1
Zdolność do indukowania cytokin IL-1 β i IL-6 przez kompleks peptydów bogatych w prolinę, otrzymany sposobem według wynalazku, jest równie wysoki jak w przypadku produktu referencyjnego. Stężenie cytokin indukowanych we krwi obwodowej przez kompleks peptydów osiąga poziom maksymalny, równy stężeniu indukowanemu przez LPS+PHA, który stanowi próbę pozytywną, jako indukującą maksymalną liczbę cytokin. Stężenie indukowanych cytokin IL-1 β i IL-6 jest maksymalne już przy najniższej dawce 1 μg.
Claims (24)
1. Sposób wytwarzania preparatu peptydowego z siary ssaków hodowlanych, wykazującego aktywność immunostymulacyjną, zawierającego głównie peptydy o masach cząsteczkowych nie przekraczających 10 kDa i charakteryzujących się wysoką zawartością proliny oraz aminokwasów kwaśnych, znamienny tym, że płynną siarę ssaków hodowlanych chłodzi się i wiruje przez 20 minut w celu oddzielenia tłuszczu po czym rozcieńcza się roztworem EDTA i pozostawia na 30 minut, następnie mieszaninę chłodzi się, a do ochłodzonej mieszaniny, podczas mieszania, dodaje się ochłodzony aceton i ekstrahuje się mieszając, po czym mieszaninę klaruje się w obniżonej temperaturze, a ewentualnie do supernatantu dodaje się octanu amonu do powstania układu dwufazowego i oddziela się fazę wodno-białkową od fazy acetonowej, a następnie fazę wodno-białkową supernatantu ogrzewa się pod zmniejszonym ciśnieniem w celu usunięcia acetonu, zakwasza i poddaje się procesowi filtracji przez membranę o selektywności 1000 Da, po czym retentat ewentualnie zagęszcza się i/lub suszy, przy czym uzyskuje się preparat peptydowy z około 20% zawartością proliny i około 18% zawartością aminokwasów kwaśnych.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że płynną siarę ssaków hodowlanych chłodzi się do temperatury 4°C.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ochłodzoną, płynną siarę wiruje się przez 20 minut przy prędkości obrotowej 8000 obr./min.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do rozcieńczania siary stosuje się wodny roztwór EDTA o stężeniu od 0,05M do 0,25M.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że do rozcieńczania siary stosuje się wodny roztwór EDTA najkorzystniej o stężeniu 0,1M.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że siarę rozcieńcza się roztworem EDTA dwukrotnie.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozcieńczoną siarę chłodzi się do temperatury w zakresie od 0°C do 25°C.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że rozcieńczoną siarę chłodzi się do temperatury najkorzystniej w zakresie od 5°C do 10°C.
9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że końcowe stężenie acetonu mieści się w zakresie od 55% do 80%.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że końcowe stężenie acetonu najkorzystniej wynosi 65%.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszaninę ekstrahuje się mieszając przez okres od 5 do 60 minut.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że mieszaninę ekstrahuje się mieszając przez okres najkorzystniej 10 minut.
13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszaninę po ekstrakcji klaruje się poprzez wirowanie.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszaninę po ekstrakcji klaruje się w temperaturze od 0° do 25°C.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że wirowanie mieszaniny po ekstrakcji wykonuje się w temperaturze 5°C.
16. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że czas wirowania mieszaniny po ekstrakcji wynosi od 10 do 20 minut.
17. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że prędkość obrotowa wirowania mieszaniny po ekstrakcji wynosi 8000 obr./min.
PL 218 693 B1
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że końcowe stężenie octanu amonu w mieszaninie wynosi od 4% do 8%.
19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że fazę wodno-białkową zakwasza się 1 roztworem kwasu chlorowodorowego (1M HCl) do pH 6.
20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces filtracji wodnego roztworu stanowi proces dializy w temperaturze 5°C, przez membranę 1000 Da wobec wody, po czym dializat klaruje się oddzielając zawiesinę cząstek stałych jednym ze znanych sposobów.
21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces filtracji wodnego roztworu stanowi proces ultrafiltracji w temperaturze 5°C gdzie roztwór wstępnie klaruje się oddzielając zawiesinę cząstek stałych jednym ze znanych sposobów, a następnie filtruje się przez membranę o granicznej przepuszczalności 1000 Da do uzyskania około 1/5 objętości początkowej i retentat przemywa się równą objętością wody trzykrotnie.
22. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że retentat z filtracji zagęszcza się przez odparowanie wody pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy się rozpyłowo.
23. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że retentat filtracji suszy się rozpyłowo.
24. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że retentat z filtracji liofilizuje się.
PL 218 693 B1
Rysunek
SIARA
Odwirować 8000 obr./min, 30 min., 4°C warstwa tłuszczu ▼
supernatant dodać równą objętość 0, 1 M EDTA, pozostawić 30 minut w temp, pokojowej, następnie dodać acetonu (5-10°C) do końcowego stężenia 65% i po 10 min Odwirować 8000 obr./min
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL388408A PL218693B1 (pl) | 2009-06-29 | 2009-06-29 | Sposób wytwarzania preparatu peptydowego |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL388408A PL218693B1 (pl) | 2009-06-29 | 2009-06-29 | Sposób wytwarzania preparatu peptydowego |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL218693B1 true PL218693B1 (pl) | 2015-01-30 |
Family
ID=52395276
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL388408A PL218693B1 (pl) | 2009-06-29 | 2009-06-29 | Sposób wytwarzania preparatu peptydowego |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL218693B1 (pl) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016072871A1 (en) | 2014-11-04 | 2016-05-12 | Geo-Poland Sp. Z.O.O. | Proline-rich polypeptide complex for use in treatment of bdnf-dependent disorders |
-
2009
- 2009-06-29 PL PL388408A patent/PL218693B1/pl unknown
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016072871A1 (en) | 2014-11-04 | 2016-05-12 | Geo-Poland Sp. Z.O.O. | Proline-rich polypeptide complex for use in treatment of bdnf-dependent disorders |
| JP2018500284A (ja) * | 2014-11-04 | 2018-01-11 | ゲオ−ポーランド スプウカ・ス・オルガニザツィーノン・オトゥポビエジャルノシチョン | Ｂｄｎｆ依存性疾患の治療に使用されるプロリンリッチポリペプチド複合体 |
| US20180036347A1 (en) * | 2014-11-04 | 2018-02-08 | Geo-Poland Sp. Z.O.O. | Proline-rich polypeptide complex for use in treatment of bdnf-dependent disorders |
| CN110934890A (zh) * | 2014-11-04 | 2020-03-31 | 地球波兰股份公司 | 用于治疗bdnf依赖性失调的富含脯氨酸的多肽复合物 |
| JP2021054837A (ja) * | 2014-11-04 | 2021-04-08 | ゲオ−ポーランド スプウカ・ス・オルガニザツィーノン・オトゥポビエジャルノシチョン | Ｂｄｎｆ依存性疾患の治療に使用されるプロリンリッチポリペプチド複合体 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4688092B2 (ja) | 活性型ＴＧＦ−βが濃縮されたタンパク質画分を得る方法、タンパク質画分および治療的適用 | |
| RU2132199C1 (ru) | Способ получения лечебно-профилактического средства из топинамбура, обладающего биологически активным действием на организм | |
| JP5666995B2 (ja) | 抗ロタウィルス感染組成物、およびその製法 | |
| AU2012222312B2 (en) | Method for isolating osteopontin using feeds containing cmp or casein species | |
| CN102746395A (zh) | 从原料乳中分离β-乳球蛋白的方法 | |
| AU5093200A (en) | Peptides | |
| US20030026845A1 (en) | Process for preparing protein isolate from milk, whey, colostrum, and the like | |
| US20090234099A1 (en) | Purification of Peptides from Colostrum | |
| RU2400106C1 (ru) | Способ получения бад "л-пфи" из вторичного молочного сырья и полученная этим способом бад "л-пфи" | |
| PL218693B1 (pl) | Sposób wytwarzania preparatu peptydowego | |
| CN108314704A (zh) | 一种羊乳清蛋白免疫调节肽、其制备方法及其应用 | |
| JPH04330252A (ja) | α−ラクトアルブミン含有量の高い組成物の製造方法 | |
| CN107022593B (zh) | 一种富含脯氨酸多肽的初乳肽及其制备方法 | |
| CN106699842B (zh) | 一种新的抗炎小分子多肽及其应用 | |
| CN119732411A (zh) | 一种富含乳铁蛋白的活性乳清粉及其制备和应用 | |
| RU2416243C2 (ru) | Способ выделения низкомолекулярных пептидов | |
| JPH05269353A (ja) | ガングリオシド含有量の高い組成物の製造方法 | |
| PL218708B1 (pl) | Sposób izolacji kompleksu peptydów i białek serwatkowych | |
| KR101490365B1 (ko) | 겨우살이 비스코사이오닌을 유효성분으로 하는 항당뇨 겨우살이 추출물 또는 이로부터 분리된 비스코사이오닌을 포함하는 항당뇨 조성물 | |
| EP3177636B1 (en) | Process for the preparation of high purity mixtures of protein factors from bovine colostrum | |
| WO2010044095A2 (en) | Novel immunologically active peptide fragments of a proline- rich polypeptide isolated from mammalian colostrums for treatment of viral and non-viral diseases or diseased conditions | |
| WO2005041680A2 (en) | A novel colostral fractionation process | |
| JPH05271295A (ja) | κ−カゼイングリコマクロペプチド含有量の高い組成物の製造方法 | |
| JP6258323B2 (ja) | 血清タンパク質濃縮物の調製方法 | |
| RU2738745C1 (ru) | Бактериологически чистый протеиновый продукт с повышенным содержанием минорных белков |