PL218708B1

PL218708B1 - Sposób izolacji kompleksu peptydów i białek serwatkowych

Info

Publication number: PL218708B1
Application number: PL388407A
Authority: PL
Inventors: Antoni Polanowski; Tadeusz Wilusz; Włodzimierz Dobrzyński; Stanisław Bodzicz
Original assignee: Geo Poland Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością
Priority date: 2009-06-29
Filing date: 2009-06-29
Publication date: 2015-01-30

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób izolacji kompleksu peptydów i białek serwatkowych z siary ssaków hodowlanych, wykazującego aktywność immunostymulacyjną, zawierającego peptydy o masie cząsteczkowej większej niż 1000 Da. Siara ssaków jest gęstym płynem wydzielanym przez matki ssacze przez kilka dni po porodzie i stanowi pierwszy pokarm noworodka. W skład siary wchodzi grupa charakterystycznych peptydów bogatych w reszty prolinowe, które wraz z laktoferyną, glikomakropeptydem, α-laktoalbuminą, β-laktoglobuliną i lizozymem oraz laktoperoksydazą tworzą w mleku zespół białek aktywnych biologicznie. Stężenie kompleksu zależy od okresu laktacji i największe jest w pierwszych godzinach po porodzie.

Z amerykańskiego patentu nr US 6268487 pt.: „Purification of biologically active peptides from milk” znany jest sposób izolacji składników mleka metodami filtracji.

Zastosowanie ultrafiltracji na selektywnych błonach filtracyjnych w warunkach ustalonego odczynu pH w granicach 6,3 - 7,0 i temperaturze 30 - 60°C do izolacji białek serwatkowych opisano w amerykańskim patencie nr US 4485040 pt.: „Process for obtaining an alpha-lactalbumin enriched product from whey, and uses thereof”.

W amerykańskim patencie nr US4816563 pt.: „Process for obtaining transfer factor from colostrum, transfer factor so obtained and use thereof” opisany został proces pozyskiwania z siary lub mleka wolnych komórek zawierających wydzielany czynnik przenoszenia antygenów.

W patencie europejskim nr EP 1613648 pt: „Purification of peptides from colostrum” opisano sposób wyodrębniania peptydów bogatych w prolinę z siary oraz metodę oczyszczania peptydów z siary z zastosowaniem procesów ekstrakcji alkoholami, korzystnie alkoholem metylowym.

W sposobie izolacji kompleksu peptydów i białek serwatkowych według wynalazku płynną siarę ssaków hodowlanych odtłuszcza się, korzystnie poprzez wirowanie ochłodzonej do temperatury 4°C siary przez 20 minut i rozcieńcza wodnym roztworem kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o stężeniu od 0,05 M do 0,25 M, korzystnie 0,1 M. Ilość roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego użyta do rozcieńczenia siary winna wynosić od 50% do 200% ilości użytej siary. Do powstałego roztworu dodaje się roztworu wodnego chlorku wapnia o takim stężeniu by końcowe stężenie chlorku wapnia w mieszaninie wynosiło od 0,1 M do 2,0 M, najkorzystn iej 0,5 M, a następnie odczyn pH mieszaniny ustala się w zakresie od 6,0 do 10,0, korzystnie 9,5. Wytrącony osad ewentualnie oddziela się, korzystnie przez wirowanie, a klarowny roztwór ogrzewa się w temperaturze od 75°C do 90°C, a wytrącony osad usuwa się, korzystnie poprzez wirowanie w temperaturze 4°C przez 20 minut. Klarowny roztwór poddaje się filtracji w formie dializy w temperaturze 4°C wobec kilkakrotnie zmienianej wody dejonizowanej i klaruje się przez wirowanie lub sączenie albo klarowny roztwór poddaje się ultrafiltracji przez membranę o selektywności 1000 Da (YM1) do uzyskania około 1/5 początkowej objętości i przemywa wodą dejonizowaną, korzystnie trzykrotnie równą ilością wody. Przesączony przez membranę permeat odrzuca się zaś pozostały dializat/retentat, zawierający białka i peptydy o masie większej niż 1000 Da, ewentualnie zagęszcza się i/lub suszy lub liofilizuje uzyskując preparat białkowo peptydowy o aktywności immunostymulacyjnej o składzie aminokwasowym zawierającym od 7% do 12% reszt prolinowych. Do procesu izolacji kompleksu według wynalazku stosować można siarę świeżą, mrożoną lub liofilizowaną po ponownej dehydratacji w stosunku 1:4.

Sposób według wynalazku pozwala wyizolować z siary ssaków hodowlanych kompleks peptydów i białek wykazujących aktywność immunostymulacyjną z dużą wydajnością. Sposób może być stosowany do otrzymywania kompleksu białek i peptydów bez względu na gatunkowe pochodzenie siary. Sposobem według wynalazku może być wytwarzany kompleks z siary zgromadzonej i zamrożonej lub liofilizowanej w celu konserwacji. Kompleks białek i peptydów wykazuje aktywność immunostymulacyjną na organizmy. Może indukować dojrzewanie i różnicowanie tymocytów i tworzenie limfocytów. Jest induktorem dla wydzielania kluczowych dla układu immunologicznego cytokin interferonu IFN-γ jak również interleukiny IL-6 i IL- 1β w hodowli komórek pełnej krwi obwodowej. Właściwości powyższe w zestawieniu z wiadomościami dotyczącymi patogenezy choroby Alzheimera, a szczególnie potwierdzony hamujący wpływ cytokin i interleukin na powstawanie złogów amyloidu β, pozwoliły na sformułowanie hipotezy o terapeutycznych zdolnościach kompleksu wobec schorzeń o podłożu neurodegeneracyjnym. Stosunkowo łagodny wpływ stosowania kompleksu otrzymanego sposobem według wynalazku na zachowanie komórek predestynuje produkt w szczególności do podawania osobom zdrowym w celu profilaktyki choroby lub zmniejszenia wczesnych objawów chorobowych w formie preparatów spożywczych.

PL 218 708 B1

Sposób według wynalazku przedstawiono w przykładach realizacji. Na rysunku Fig. 1 przedstawiono schemat postępowania według wynalazku.

Kompleks peptydów i białek serwatkowych o ciężarze cząsteczkowym powyżej 1000 Da otrzymany z siary krowiej sposobem według wynalazku posiada następujący skład aminokwasowy:

T a b e l a 1

Skład aminokwasowy kompleksu otrzymanego sposobem według wynalazku.

Reszty aminokwasowe	Produkt I /%/	Produkt II /%/
Asp/Asn	3,64	8,82
Ser	14,81	8,03
Glu/GIn	5,17	22,35
Gly	5,68	2,67
His	2,47	3,03
Arg	3,12	1,96
Thr	11,76	5,42
Ala	4,09	3,30
Pro	7,44	12,72
Tyr	8,59	1,01
Val	8,89	6,24
Met	1,67	1,61
Lys	1,85	7,47
Ile	3,69	5,19
Leu	8,83	7,29
Phe	3,39	3,38
Trp	nie stwierdzono	nie stwierdzono
Cys	nie stwierdzono	nie stwierdzono

P r z y k ł a d I

100 ml świeżej siary odtłuszczono przez wirowanie w temperaturze 4°C przez 20 minut, przy prędkości obrotowej wirówki 8000 obr./minutę. Dodano 100 ml 0,1 M EDTA w temperaturze 20°C. Po 30 minutach dodano 66 ml 2 M roztworu wodnego chlorku wapnia i pozostawiono na kolejne 30 minut. Mieszaninę następnie wirowano 20 minut w temperaturze 20°C przy obrotach 8000 obr./minutę. Uzyskano 240 ml supernatantu. 80 ml supernatantu mętnego dializowano 48 godzin przez membranę 1000 Da do wody. Objętość dializatu - 130 ml. Uzyskano kompleks o zawartości białka BCA w ilości odpowiadającej 58,558 g/1 litr siary.

P r z y k ł a d II ml supernatantu otrzymanego sposobem jak w przykładzie I doprowadzono do pHx9,5 i ogrzewano 10 minut w temperaturze 82 - 84°C. Po oziębieniu wirowano wytrącony osad przez 20 minut przy 4000 obr./minutę. Supernatant lekko opalizujący o pHx9,0 doprowadzono do pHx6,0 przy pomocy 1 M roztworu kwasu chlorowodorowego. Następnie roztwór dializowano 48 godzin przez membranę 1000 Da. Objętość dializatu - 85 ml. Uzyskano produkt o zawartości białka BCAA odpowiadającej 0,817 g/1 litr siary.

P r z y k ł a d III

Do 80 ml supernatantu otrzymanego sposobem jak w przykładzie I dodano 1 M bufor fosforanowy o pHx7,2 do stężenia 0,1 M. Po 15 minutach wirowano 10 minut przy prędkości obrotowej 8000 obr./minutę. ogrzewano 10 minut w temperaturze 82 - 84°C. Po oziębieniu wirowano wytrącony osad przez 20 minut przy 4000 obr./minutę. Supernatant klarowny dializowano 48 godzin przez membranę 1000 Da. Otrzymano 105 ml dializatu o zawartości białka BCA odpowiadającej 2,459 g/1 litr siary.

PL 218 708 B1

P r z y k ł a d IV

Kompleks peptydów i białek serwatkowych wykazuje właściwości immunostymulacyjne. Jest mocnym induktorem wydzielania kluczowych dla układu immunologicznego cytokin.

Indukcję cytokin in vitro przez kompleks peptydów i białek otrzymanym sposobem według wynalazku opisanym w przykładzie II przeprowadzono na próbkach krwi pobranych od zdrowych ochotników. Pełną krew zawierającą 10 jednostek na 1 ml heparyny bez konserwantów rozcieńczono 1:10 na pożywce hodowlanej. Inkubację prowadzono na tej samej pożywce bez induktorów - kontrola, albo w obecności 2 μg/ml krwi fitohemaglutyniny (PHA) i + 2 μg/ml krwi lipopolisacharydu (LPS). PHA i LPS są kontrolą dodatnią, ponieważ mogą stymulować maksymalną ilość cytokin. W tabelach 2 i 3 przedstawiono wyniki badań wpływu kompleksu otrzymanego sposobem według wynalazku na wydzielanie cytokin IL-6 i IL-1 β przez komórki pełnej krwi obwodowej w porównaniu z maksymalnym wpływem PHA i LPS.

P r z y k ł a d V

Kompleks według wynalazku może wywierać także wpływ na wydzielanie tlenku azotu przez komórki organizmu. Komórki mysiej linii monocytarno/makrofagowej J774 stymulowane przez IFN-γ lub LPS, wydzielają tlenek azotu w wyniku indukcji ekspresji indukowalnej syntezy tlenku azotu (iNOS). W tabeli 4 przedstawiono wyniki badania hamującego wpływu działania kompleksu na stymulujące niekorzystne wydzielanie tlenku azotu przez dodatek 1 μg LPS.

T a b e l a 2

Wpływ kompleksu otrzymanego sposobem według wynalazku, opisanym w przykładzie II, na wydzielanie cytokin IL-1 β przez komórki pełnej ludzkiej krwi obwodowej w porównaniu z referencyjnym wynikiem LPS + PHA (2 pg+ 2 pg).

Próba	Stężenie ^-1β* /pg/ml/
kontrola	0
LPS + PHA (2 pg + 2 pg)	>328
Kompleks
1 pg	58
10 pg	17
50 pg	162
Medium hodowlane	0

* Wartości średnie z oznaczeń na 5 próbach krwi obwodowej

T a b e l a 3

Wpływ kompleksu otrzymanego sposobem według wynalazku, opisanym w przykładzie II, na wydzielanie cytokin IL-6 przez komórki pełnej ludzkiej krwi obwodowej w porównaniu z referencyjnym wynikiem LPS + PHA (2 pg + 2 pg).

Próba	Stężenie IL-6* /ng/ml/
kontrola	0,5
LPS + PHA (2 pg + 2 pg)	>8,9
Kompleks
1 pg	0,9
10 pg	1,3
50 pg	3,2
Medium hodowlane	0

* Wartości średnie z oznaczeń na 5 próbach krwi obwodowej

Wyniki przedstawione w tabelach 2 i 3 wskazują, że kompleks otrzymany sposobem według wynalazku charakteryzuje się aktywnością immunostymulacyjną poprzez zdolność do indukowania cytokin.

PL 218 708 B1

T a b e l a 4

Oznaczenie poziomu tlenku azotu (NO) wydzielanego przez komórki J774

Preparat	NO /pM/
kontrola	>0,1
LPS 1 pg	4,8
Kompleks 50 pg + LPS 1 pg	4,0
Medium hodowlane	0

Kompleks peptydów i białek serwatkowych posiada zdolność hamowania stymulatorowego efektu LPS do wydzielania tlenku azotu.

Claims

1. Sposób izolacji kompleksu peptydów i białek serwatkowych z siary ssaków hodowlanych wykazującego aktywność immunostymulacyjną, znamienny tym, że płynną siarę ssaków hodowlanych odtłuszcza się, rozcieńcza wodnym roztworem kwasu etylenodiaminotetraoctowego, a do powstałej mieszaniny dodaje roztworu chlorku wapnia, po czym ustala się odczyn pH roztworu w zakresie od 6,0 do 10,0 i ewentualnie oddziela się osad, a następnie ogrzewa się w temperaturze od 75°C do 90°C, po czym usuwa się wytrącone cząstki stałe i klarowny roztwór poddaje się procesowi filtracji przez membranę o selektywności 1000 Da, a powstały retentat ewentualnie zagęszcza się i/lub suszy uzyskując kompleks peptydowo-białkowy o aktywności immunostymulacyjnej i składzie aminokwasowym zawierającym od 7,0% do 12,5% reszt proliny.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że płynną siarę ssaków hodowlanych odtłuszcza się przez wirowanie w temperaturze 4°C przez 20 minut i prędkości obrotowej wirówki 8000 obr./min.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że siarę rozcieńcza się roztworem kwasu etylenodiaminotetraoctowego o stężeniu od 0,05 M do 0,25 M.

4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że roztwór kwasu etylenodiaminotetraoctowego ma stężenie 0,1 M.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że siarę rozcieńcza się równą objętością roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stężenie roztworu chlorku wapnia w mieszaninie wynosi od 0,1 M do 2,0 M.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że stężenie roztworu chlorku wapnia w mieszaninie wynosi 0,5 M.

8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że odczyn pH mieszaniny wynosi 9,5.

9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszaninę ogrzewa się w temperaturze 85°C przez 10 minut.

10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytrącone cząstki stałe usuwa się z mieszaniny przez wirowanie w temperaturze 4°C przez 20 minut, przy prędkości obrotowej wirówki 8000 obr./minutę.

11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces filtracji przez membranę o selektywności 1000 Da stanowi proces dializy w temperaturze 4°C wobec wody.

12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces filtracji przez membranę o selektywności 1000 Da stanowi proces ultrafiltracji przez membranę o selektywności 1000 Da (YM1), a filtrację prowadzi się do uzyskania retentatu stanowiącego ok. 1/5 początkowej objętości roztworu.

13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że retentat z filtracji zagęszcza się przez odparowanie wody pod zmniejszonym ciśnieniem.

14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że retentat z filtracji suszy się rozpyłowo.

15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że retentat z filtracji liofilizuje się.